Made available in DSpace on 2015-03-26T13:36:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 356172 bytes, checksum: 1bf067e3c244857d7b3d148e43e244b1 (MD5) Previous issue date: 2008-02-27 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / The Strelitzia reginae Aiton is known popularly by bird-of-paradise and due to its wide use as cut flower there are still few the studies to evaluate the post-harvest handling and longevity. With the objective of evaluating the vascular occlusion that might take place at the base of the stem, post-harvest solutions containing inhibitors polyphenoloxidase and peroxidase, and reduction of bacterial population were applied. Flowers were pulsed with 10 mM 2-mercaptoethanol, 1 mM AgNO3, 5 mM catechol, 5 mM p-nitrophenol, 10 mM sodium metabissulfite and distilled water without pH adjustment or the pH of the solutions was adjusted for 6.0. Flowers were pulsed with AgNO3 at concentrations of 0.5, 1, 1.5 and 2 mM, sodium metabissulfite and ascorbic acid, both containing 2.5, 5, 7.5 and 10 mM and distilled water. The floral stems of each treatment were evaluated at every 48 hours, period in which were submitted to cuts of 2 cm in their stem base, until the end of the longevity of the flowers. At this time, it was determined the activity polyphenoloxidase and peroxidase. The total fresh matter, relative water content of the sepals, number of open flowers, longevity of the flowers and number of colony forming units per mL (CFU/mL) were evaluated. The activity of the polyphenoloxidase and peroxidase measured from the second to the eighth day after harvest showed that the sodium metabissulfite at 10 mM presented the highest reduction of enzymes activities at the second day of analysis. It was also observed that the solutions containing AgNO3 was not capable to inhibit the growth of the bacterial population in the base of floral stem. Together, the activity of the oxidative enzymes and the high number of colonies of bacteria influenced negatively in the weight of the fresh matter, in the relative water content, in the number of open flowers and in its longevity, because they promoted the precocious senescence of the flowers due to the water stress happened by the low hydraulic conductance of the elements of vase of the xylem. / A Strelitzia reginae Aiton é popularmente conhecida como ave-do-paraíso e devido ao seu amplo uso como flor de corte ainda são poucos os estudos realizados na avaliação dos problemas ocorridos em sua pós-colheita. Com o objetivo de avaliar a oclusão vascular ocorrida no local cortado dos escapos florais, soluções pós-colheita contendo inibidores da atividade das enzimas polifenoloxidase e peroxidase e do crescimento da população bacteriana foram aplicadas em três etapas. Aplicou-se 2-mercaptoetanol 10 mM, AgNO3 1 mM, catecol 5 mM, p-nitrofenol 5 mM, metabissulfito de sódio 10 mM e água destilada sem correção do pH, ou com pH ajustado para 6,0. Aplicou-se também AgNO3 às concentrações 0,5; 1; 1,5 e 2 mM, metabissulfito de sódio e ácido ascórbico, ambos às concentrações 2,5; 5; 7,5 e 10 mM, e água destilada. Os escapos florais de cada tratamento foram avaliados a cada 48 horas, período no qual eram submetidos a cortes de 2 cm em suas bases, até o fim da longevidade das flores. Nesse material coletado avaliou-se a atividade das enzimas polifenoloxidase e peroxidase. As outras observações foram: peso da matéria fresca, teor relativo de água, número de flores abertas, longevidade das flores e número de unidades formadoras de colônias por mL (UFC/mL). A atividade da polifenoloxidase e da peroxidase foi determinada do segundo ao oitavo dia após a colheita e, dos tratamentos aplicados, o metabissulfito de sódio 10 mM apresentou a maior redução da atividade das enzimas após o segundo dia da aplicação. As soluções contendo AgNO3 não foram capazes de inibir o crescimento da população bacteriana nos escapos florais. Em conjunto, a atividade das enzimas oxidativas e o alto número de colônias de bactérias influenciaram negativamente no peso da matéria fresca, no teor relativo de água, no número de flores abertas e na sua longevidade, pois promoveram a senescência precoce das flores devido ao estresse hídrico ocorrido pela baixa condutância hidráulica dos elementos de vaso do xilema.

Xylella fastidiosa é uma bactéria limitada ao xilema de plantas, sendo transmitida principalmente por cigarrinhas da subfamília Cicadellinae (Hemiptera: Cicadellidae). No Brasil, é o agente causal da Clorose variegada dos citros (CVC), doença que afeta laranja-doce [Citrus sinensis (L.) Osbeck]. O objetivo deste trabalho foi caracterizar o comportamento alimentar da cicadelíneo vetor Bucephalogonia xanthophis (Berg) em citros e correlacionar suas atividades estiletares com a transmissão de X. fastidiosa. Inicialmente, testes de escolha e análises de excreção de honeydew foram realizadas para determinar os locais e períodos preferidos para alimentação em mudas de citros. B. xanthophis preferiu a haste dos ramos novos, na parte superior da muda. Esta cigarrinha ingeriu seiva do xilema e apresentou maior volume médio de excreção e maior percentual de indivíduos que excretaram durante a fotofase. Assim, estudou-se a penetração estiletar do vetor na haste de brotações cítricas, durante a fotofase, pela técnica de \"Electrical Penetration Graph\" (EPG, sistema DC). Os principais padrões de EPG foram correlacionados com análises histológicas e de \"honeydew\" para determinação da posição exata dos estiletes no tecido vegetal e atividades envolvidas. Seis padrões foram descritos: (S) secreção de bainha salivar e caminhamento dos estiletes através de células da epiderme ou parênquima; (R) estiletes inseridos na planta, porém sem nenhuma atividade aparente; (X) contato dos estiletes com os vasos do xilema; (Xi) ingestão ativa no xilema; (I) breve interrupção durante X ou Xi; (W) retirada dos estiletes da planta. Durante uma prova, a seqüência de eventos com maior probabilidade de ocorrência foi penetração estiletar através da epiderme e parênquima (S) (100% dos insetos), seguida de contato com o xilema (X) (67,6%). Entre os indivíduos que exibem o padrão X, 88,3% passam para Xi. Os vasos do xilema foram localizados pelo inseto após uma média de 2,2 provas. O tempo médio para atingir o xilema (X) e iniciar ingestão (Xi) após o início da primeira prova foi 27.8 min e 34,2 min, respectivamente. Entretanto, verificou-se ingestão prolongada no xilema (Xi > 5 min) somente após 39,8 min, em média. Em um outro estudo, investigou-se a relação dos padrões S, X e Xi com os processos de aquisição e inoculação de X. fastidiosa em citros. B. xanthophis adquiriu X. fastidiosa somente no padrão Xi. Após 1 h de ingestão no xilema, esta cigarrinha transmitiu a bactéria para plantas-teste com uma eficiência de 7,7%. A inoculação ocorreu durante os padrões S, S+X e S+X+Xi, com eficiência de 3,5; 7,1 e 7,4%, respectivamente. Um fato intrigante foi a ocorrência de inoculação de X. fastidiosa pelo inseto antes de atingir os vasos do xilema, durante o padrão S. Contudo, as maiores taxas de transmissão ocorreram após o contato com o xilema (S+X ou S+X+Xi). Por fim, estudou-se o efeito da infecção sintomática e assintomática por X. fastidiosa em plantas cítricas sobre a penetração estiletar de B. xanthophis. O comportamento alimentar foi semelhante em plantas sadias e infectadas sem sintomas. A infecção sintomática não afetou a capacidade de B. xanthophis localizar os vasos do xilema, mas reduziu o tempo gasto por este inseto ingerindo seiva dos mesmos. Estes resultados sugerem que a aquisição de X. fastidiosa pode ser mais eficiente em plantas infectadas assintomáticas do que em plantas com sintomas severos de CVC. As informações sobre penetração estiletar do vetor B. xanthophis em citros são importantes para estudos mais avançados de mecanismos de transmissão de X. fastidiosa, bem como para estabelecer estratégias que visem interferir neste processo. / Xylella fastidiosa is a xylem-limited bacterium transmitted mainly by leafhoppers (Hemiptera: Cicadellidae) in the subfamily Cicadellinae. In Brazil, it is the causal agent of Citrus variegated chlorosis, a disease that affects sweet orange [Citrus sinensis (L.) Osbeck]. The goal of this research was to characterize the feeding behavior of the cicadeline vector Bucephalogonia xanthophis (Berg) in citrus and correlate its feeding activities with transmission of X. fastidiosa. Initially, choice tests and honeydew excretion analyses were carried out to determine preferred feeding sites and periods on citrus nursery trees. B. xanthophis preferred the stems of young shoots, in the upper part of the plant. This species ingested sap from the xylem vessels and showed larger excretion volume and higher proportion of excreting individuals during the day. Thus, vector stylet penetration was studied on the stem of citrus shoots in the photophase, by using the Electrical Penetration Graph (EPG, DC system) technique. The main EPG waveforms were correlated with histological and honeydew excretion analyses to determine the precise stylet position in the plant tissue and feeding activities. Six waveforms and proposed activities are described: (S) secretion of salivary sheath and intracellular pathway; (R) stylets inserted into the plant, without any apparent activity; (X) contact of stylets with xylem vessels; (Xi) active xylem ingestion; (I) interruption between X and Xi; and (W) stylet withdrawal from the plant. During a probe, the most likely sequence of events is stylet pathway (S) through epidermal and parenchymal cells (all individuals), followed by contact with xylem (X) (67.6% of all individuals) and then active ingestion (Xi) (88.3% of those that exhibit waveform X). The xylem was reached after an average of 2.2 probes. The mean time to contact the xylem (X) and initiate ingestion (Xi) after onset of the first probe was 27.8 and 34.2 min, respectively. However, sustained xylem ingestion (Xi > 5 min) was established only after 39.8 min, on average. In a second study, the waveforms S, X and Xi were correlated with X. fastidiosa acquisition and inoculation in citrus. Acquisition of X. fastidiosa from infected plants occurred only after onset of the pathogen to 7.7% of test plants. In healthy plants, inoculation took place during waveform Xi (xylem ingestion); but with just 1 h in Xi, B. xanthophis subsequently transmitted waveforms S (salivary sheath formation and stylet pathway), S+X (X= first xylem contact by stylets) and S+X+X1, with efficiencies of 3.5, 7.1 and 7.4%, respectively. Although higher transmission rates were recorded after the first contact with xylem (S+X and S+X+Xi), it is intriguing the fact that inoculation of this xylem-limited bacterium also occurred before that (during S). Finally, the effect of X. fastidiosa infection on the feeding behavior of B. xanthophis was studied by comparing stylet penetration on: a) healthy citrus; b) symptomless infected citrus; c) infected citrus with CVC symptoms. Based on the analysis of 26 EPG parameters, no significant differences were found in stylet penetration on healthy versus asymptomatic infected citrus. Symptomatic infection did not affect the ability of B. xanthophis to locate xylem vessels, but reduced the time spend by this vector ingesting xylem sap. These results suggest that X. fastidiosa acquisition may be more efficient on symptomless infected plants than on citrus with severe CVC symptoms. Information on vector feeding behavior is basic for future studies on transmission mechanisms of X. fastidiosa and to establish control strategies aimed to interfere with this process.

Conhecer o uso da água pelas árvores é fundamental para entender as interações entre o ambiente e as florestas e compreender seu crescimento por meio do entendimento dos processos que o governa. Objetivou-se com o trabalho determinar as taxas de transpiração, o crescimento e a eficiência do uso da água de árvores de Eucalyptus, por meio do método de Granier, em parcelas com e sem irrigação, além de compará-lo ao modelo de Penman-Monteith para estimativa da transpiração. O experimento foi realizado em um plantio de clone de Eucalyptus, instalado em março de 2001, no município de Eunápolis, BA. Para determinação da transpiração, foi avaliado o fluxo xilemático no período de agosto a dezembro de 2005, por meio de sondas instaladas no tronco das árvores. Para avaliação do crescimento das plantas, estimouse o incremento de biomassa nos tratamentos a cada quatro meses, enquanto que a eficiência do uso da água (EUA) foi obtida pela razão entre o incremento de biomassa e quantidade de água transpirada no período. Adicionalmente, foi avaliada a variação da umidade no perfil do solo pelo sistema TDR nos dois tratamentos. Foi necessário calibrar o método de Granier, pois se observou que a equação original subestimou significativamente o uso de água. A densidade mensal do fluxo de seiva variou de 16,4 a 35,5 cm³ cm-2 hora-1, sem diferir entre os tratamentos. Enquanto a transpiração média das árvores irrigadas foi igual ou superior às não irrigadas, atingindo valores da ordem de 68 a 79 L arv-1 dia-1, o incremento de biomassa foi superior no tratamento irrigado (16 kg planta-1) em relação ao não irrigado (10 kg planta-1), ou seja, o eucalipto não apresentou consumo de luxo de água, pois a água a mais transpirada pela árvores irrigadas foi efetivamente usada para auxiliar a fixação de carbono no tronco. A EUA não diferiu entre os tratamentos, com média de 1,0 g L-1. Observou-se que, independentemente do tratamento, árvores com maior biomassa inicial apresentaram EUA superior às árvores de menor porte durante o período do estudo. Obteve-se uma relação não linear entre condutância da copa e déficit de pressão de vapor, indicando que o eucalipto apresenta um controle estomático que limita a transpiração. Quando avaliado na escala mensal, o modelo de Penman-Monteith estimou com precisão a transpiração do eucalipto. / Estimating the water use by trees is fundamental to understand the interactions between environment and plants and to know more about the processes that governs it. This work aimed to determine the transpiration rates, the growth and the water use efficiency of clonal Eucalyptus trees, using the Granier method, with or without irrigation, besides comparing it to the Penman-Monteith model for estimating transpiration. The experiment was accomplished in a Eucalyptus clonal plantation installed in March of 2001, in Eunapolis city, State of Bahia, Brazil. For determination of transpiration, the sap flow was evaluated in the period of August to December of 2005, using probes installed in the trees stems. To evaluate tree growth the biomass increment was considered in the treatments every four months, while the water use efficiency (WUE) was obtained by the ratio between the biomass increment and amount of water transpired in the period. Additionally, the variation of humidity was evaluated in the soil profile by the TDR system in both treatments. It was necessary to calibrate the Granier method because it was observed that the original equation underestimated the water use. The monthly sap flow density ranged from 16,4 to 35,5 cm³ cm-2 hour-1 and not differing between treatments. While the average transpiration of the irrigated trees was equal or superior to the no irrigated ones, with values varying from 68 to 79 L day-1 per tree, the biomass increment was superior in the irrigated treatment (16 kg tree-1) in relation to the no irrigated (10 kg tree-1). This results points that the Eucalyptus did not present luxury consumption of water, because the additional water transpired by the irrigated trees was used to allocate more carbon to the stem. The WUE did not differ between treatments, with average of 1,0 g L-1. It was observed that, independently of the treatment, trees with larger initial biomass presented highest WUE in relation to the smaller trees during the studied period. It was obtained a no linear relationship between canopy conductance and vapor pressure deficit, indicating that Eucalyptus presents a strong stomatal control that limit the transpiration. When used at monthly scale, Penman-Monteith model evaluated the transpiration of the Eucalyptus accurately.

Abiotic and biotic stresses affect tree growth and play a major role in determining the geographic distribution of species. The objective of this study is to elucidate the following questions: (1) are GABA aminoacid and stomatal control good indicators of tolerance to water stress in Eucalyptus clones? In addition, what are the anatomical differences between drought-tolerant and drought-sensitive clones of Eucalyptus? (2) Are there differences of xylem vulnerability to cavitation in Pinus flexilis families susceptible and resistant to white pine blister rust (WPBR) and with different origins (high and low altitudes)? Two studies were carried out to elucidate the issues above. On chapters 1, eight Eucalyptus clones from different geographical and climatological conditions, three drought-sensitive (CNB, FIB and JAR), three drought-tolerant (GG, SUZ and VM), and two plastics (VER and COP), were studied in normal water supply (control treatment) and in water stress conditions (stress treatment). The first chapter concluded that GABA is an aminoacid very sensitive to water stress, but there was no relation between GABA concentration and tolerance to water stress of the clones. In addition, all clones decreased stomatal conductance with increasing vapor pressure deficit, and plastics and drought-tolerant clones (except GG) presented lower stomatal sensitivity to vapor pressure deficit under stress conditions than drought-sensitive clones. Besides, all clones showed differences on the anatomical parameters between, and only COP (plastic) and SUZ (drought-tolerant) showed homogeneous mesophyll and amphi-hipostomatic leaves. All clones increased the number of stomata and reduced leaf thickness of the leaves formed after water stress period. On the chapter 2, we studied 12 families of Pinus flexilis originating from high and lower altitudes, in which six families previously shown to contain the dominant C4 allele (resistant to WPBR) and six families without C4 allele (susceptible to WPBR). This study showed that the mean cavitation pressure (MCP) of Pinus flexilis varying between 3.63 a -4.84 Mpa, although there was a significant difference in vulnerability to cavitation comparing all families, this variable was not related to WPBR and origin region. These studies highlight that the physiological responses of plants under water stress conditions are important tools that can be used to complement the strategies of genotype selection in forest breeding programs. / Estresses abióticos e bióticos podem afetar o crescimento das árvores e desempenham um papel importante na determinação da distribuição geográfica das espécies. O objetivo deste estudo, foi elucidar as seguintes questões: (1) o aminoácido GABA e o controle estomático são bons indicadores da tolerância ao estresse hídrico em clones de Eucalyptus? E quais são as diferenças anatômicas entre clones de Eucalyptus tolerantes e sensíveis ao estresse hídrico? (2) existem diferenças de vulnerabilidade a cavitação do xilema entre famílias de Pinus flexilis suscetíveis e resistentes à ferrugem do pinho branco (WPBR) e com diferentes procedências (elevada e baixa altitudes)? Dois estudos foram desenvolvidos para elucidar as questões acima descritas. No capítulo 1, oito clones de Eucalyptus de diferentes procedências e condições climáticas, sendo três clones sensíveis ao estresse hídrico (CNB, FIB e JAR), três clones tolerantes ao estresse hídrico (GG, SUZ e VM) e dois clones plásticos (VER e COP), foram estudados sob duas condições distintas: sob adequado suprimento de água (tratamento controle) e sob condições de estresse hídrico (tratamento estresse). Do primeiro capítulo concluiu-se que o GABA é um aminoácido que possui alta sensibilidade ao estresse hídrico, no entanto, não houve relação entre a concentração de GABA e os níveis de tolerância ao estresse hídrico dos clones. Além disso, todos os clones reduziram a condutância estomática em relação ao aumento do déficit de pressão de vapor (DPV), sendo que, sob condições de estresse hídrico, os clones plásticos e tolerantes à seca (exceto o clone GG) apresentaram menor sensibilidade estomática ao DPV do que os clones sensíveis ao estresse hídrico. Além disso, todos os clones apresentaram diferenças anatômicas, sendo que, diferentemente dos demais, os clones COP (plástico) e SUZ (tolerante) apresentaram mesofilo homogêneo e folhas anfi-hipoestomáticas. Todos os clones aumentaram a quantidade de estômatos e reduziram a espessura foliar das folhas formadas após períodos de estresse hídrico. No segundo capítulo foram avaliadas 12 famílias de Pinus flexilis procedentes de regiões de baixa e alta altitudes, sendo seis famílias contendo um alelo dominante C4 (resistente à WPBR) e seis famílias sem o alelo C4 (suscetíveis à WPBR). Este estudo apresentou uma variação da pressão média da cavitação (MCP) para Pinus flexilis de -3,63 a -4,84 Mpa, e embora tenha havido uma diferença significativa da susceptibilidade a cavitação entre todas as famílias estudadas, esta variável não relacionou-se com a susceptibilidade a doença WPBR e com a região de procedência das famílias. Estes estudos comprovam que a avaliação das respostas fisiológicas das plantas sob condições de estresse hídrico são importantes ferramentas que podem ser utilizadas para complementar as estratégias da seleção de genótipos em programas de melhoramento florestal.

Orientadores: Gonçalo Amarante Guimarães Pereira, Johana Rincones Peres / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-19T06:30:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Barau_JoanGrande_D.pdf: 15458099 bytes, checksum: 72a1f6ed8ef42544b91f989494fb4ce2 (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: A introdução da doença vassoura de bruxa do cacaueiro no Sul da Bahia representa um dos maiores exemplos da magnitude de impacto sócio econômico que uma fitopatologia pode aflingir a uma região ou país com um predominante perfil agroexportador. Com a execução do projeto genoma do fungo causador da vassoura de bruxa, o Basidiomiceto Moniliopthora perniciosa, uma série de trabalhos de caracterização morfológica, fisiológica e genética da doença foram inciados. Em um primeiro momento, em paralelo com a caracterização das alterações bioquímicas da doença, buscamos entender as diferenças de expressão gênica através de microarranjos de DNA e bibliotecas ESTs comparando as duas fases morfo-genéticas do fungo reproduzidas in vitro. Apesar de esse esforço pioneiro ter permitido a formação de um modelo panorâmico das alterações genéticas do fungo e fornecido importantes diretrizes para a pesquisa futura, ficou claro a necessidade de se explorar em maior detalhe a interação in vivo. Dentre os aspectos importantes investigados, o estudo do metabolismo do glicerol durante a fase biotrófica da interação através de marcadores de expressão mostrou que essa fonte de carbono em potencial pode ter um papel importante no início da infecção e participar da sinalização de stress através da modulação do shuttle mitocondrial de glicerol 3-fosfato. No entanto, a necessidade de se entender melhor o panorama das fontes de carbono disponíveis no apoplasto, o microambiente ocupado pelo fungo nas fases iniciais da interação, nos motivou a caracterizar as alterações nutricionais desse espaço ao longo da doença. Foi possível demonstrar que a vassoura de bruxa quebra o ciclo de carbono normal do apoplasto e que induz o corte da comunicação vascular com as partes sadias da planta ao final da fase biotrófica. Uma correlação entre a sinalização por carbono e a expressão de genes de patogenicidade secundária foi explorada. Com a expansão dos dados de genoma e transcriptoma utilizando sequenciamento de DNA de terceira geração (Illumina e 454 Life Sciences), dezenas de genes-alvo com potencial participação em vias de patogenicidade e desenvolvimento da doença foram identificados. Nesse contexto, dentre as ferramentas para análises de genômica funcional nesse modelo, a inativação ou nocaute de genes por gene targeting e o estudo da atividade de proteínas através de fusões com genes repórteres são essenciais ao teste das hipóteses geradas como fruto da pesquisa genômica da Vassoura-de-bruxa. Transformantes de M. perniciosa carregando uma cópia do gene marcador de autofagia MpATG8 fusionado ao marcador GFP apresentaram um padrão de fluorescência característico da biologia celular de ATG8, permitindo acompanhar o processo de autofagia sob condições de deprivação de nutrientes, demonstrando a possibilidade da aplicação de fusões com repórteres fluorescentes para experimentos de localização subcelular de proteínas desse fitopatógeno. Por fim, uma estratégia baseada na seleção de recombinantes através da técnica split marker em conjunto com um silenciamento transiente do sistema de reparo NHEJ por RNAi foi traçada e executada de modo a obter o nocaute do gene MpKu70, essencial a essa via de reparo, cuja inativação está associada a um aumento da eficiência de recombinação homóloga e gene targeting / Abstract: Cocoa's Witches Broom Disease (WBD) is caused by the hemibiotrophic interaction between the Basidiomycete fungus Moniliopthora perniciosa and plants of Theobroma cacao. One remarkable feature of WBD is its unusual long biotrophic phase in which the fungal growth is restricted to the apoplastic space of plants. We compared differential gene expression between biotrophic and saprotrophic-like hyphae in vitro and proposed based on microarray and EST results that the maintenance of biotrophic-like cultures of M. perniciosa in vitro is subject to Carbon source regulation, especially regarding the use of glycerol as a preferential carbon source for biotrophy. To further gain insight into the carbon source regulation of WBD biotrophic phase in vivo, we characterized glycerol utilization using fungal expression markers during the initial phases of infection. We also characterized the carbon source fluctuations in the apoplast of healthy and infected cocoa seedlings. We showed that healthy cocoa plants possess a rhythmic carbon cycle in the apoplast that is in fine tune with periodical leaf flushing, expansion and photosynthetic maturation. WBD completely disrupts the carbon cycle in the apoplast of infected plants and also arrests leaf photosynthesis at pre sink-to-source transition levels. It was also possible to distinguish two different phases of carbon availability in the apoplast. The two phases correlated with fungal growth rates, the expression of a characterized necrosis inducing gene and the development of a tumor-like callus at the base of infected stems that completely disrupted normal vascular communication between healthy and diseased parts of the plant. A possible correlation between carbon starvation and phase switch from biotrophic to necrotrophic was explored and the evolution of the vascular-disrupting callus was discussed in the view of the tradeoff between the physiological behavior of infected tissues as sinks and the avoidance of nutrient remobilization during infected tissue senescence. Finally, we focused on the development of functional genomic tools for the study of gene function in this pathogen. As a proof-of-concept, we successfully obtained fungal strains expressing the autophagy related gene MpATG8 fused with GFP reporter, in which was possible to visualize the autophagy process in vivo by fluorescence imaging. In addition we also obtained the first successful gene targeting knockout of MpKu70, an M. perniciosa homologous of a gene essential to NHEJ in Eukaryotes. MpKu70 knockouts strains have reported phenotypes of increased homologous recombination, and the M. perniciosa strain may be an important platform for future functional studies of genes important in witches broom disease pathogenesis / Doutorado / Genetica de Microorganismos / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

Interés del estudio: el desarrollo vascular de las plantas, y más concretamente del xilema es un proceso determinante en el correcto desarrollo de las plantas, y vital para la formación de los recursos madereros de los mismos. Objetivos: los dos objetivos principales de esta tesis son: a) establecer los mecanismos moleculares por los cuales la termoespermina controla la correcta formación del xilema. b) encontrar las diferencias estructurales entre las diversas aminopropil transferasas, que les confieren a cada una de ellas su actividad específica. Elementos de la metodología a destacar: Para esta tesis se han empleado técnicas generales de biología molecular como PCR, digestiones, transformación de bacterias, expresión y purificación de proteínas; y otras técnicas más específicas de la biología molecular de plantas como son la generación de plantas transgénicas y el cartografiado de plantas mutantes generadas por tratamiento químico. Además se han empleado técnicas de cromatografía para el manejo de HPLC y GC-MS. Resultados logrados: las dos principales conclusiones de esta tesis son: a) el papel de ACL5 y/o de la termoespermina es impedir la muerte prematura durante la diferenciación del xilema. El mecanismo más probable es la promoción de la traducción de los genes AJAX, que codifican factores de transcripción bHLH. b) la discriminación de sustratos por parte de las aminopropil transferasas y putrescina-N-metil transferasas no se explica únicamente por diferencias en los centros activos. / Vera Sirera, FJ. (2011). Bases moleculares de la síntesis de termoespermina y sus implicaciones en el desarrollo vascular de Arabidopsis thaliana [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/10689

Teak tree (Tectona grandis L.f.) has a high value in the timber trade for fabrication of woody products due to its extraordinary qualities of color, density and durability. Despite the importance of this species, genetic and molecular studies available are limited. Also, the lack of molecular information about secondary xylem and tree maturation has hindered genetic exploration of teak. Therefore, gene expression studies and transcriptomic profiling are essential to explore wood formation and lignin biosynthesis through the development and aging of vascular plants. Aiming the gene expression studies, it was essential to identify and clone reference genes for teak. Eight genes were tested, commonly used in qRT-PCR, including TgRP60S, TgCAC, TgACT, TgHIS3, TgSAND, TgTUB, TgUBQ and TgEF1a. Expression profiles of these genes were evaluated by qRT-PCR in six tissue and organ samples (leaf, flower, seedling, root, stem and branch secondary xylem). Stability validation by NormFinder, BestKeeper, geNorm and Delta Ct programs showed that TgUBQ and TgEF1a are the most stable genes to use as qRT-PCR reference genes in teak in the conditions tested. Due to the availability of 12- and 60-year-old teak trees, RNA-seq was performed in diferent organs (seedlings, leaves, flowers, root, stem and branch secondary xylem). A total of 462,260 transcripts were obtained by assembling with \"Trinity\" software. Also, 1,502 and 931 genes differentially expressed were identified for stem and branch secondary xylem, respectively, using DESeq program, and MYB transcription factors, which were characterized. TgMYB1 amino acid sequence displayed a predicted coiled-coil (CC) motif while TgMYB2, TgMYB3 and TgMYB4 showed R2R3-MYB domain. All of them were phylogenetically grouped with several gymnosperms and flowering plants. High expression of TgMYB1 and TgMYB4 in lignified tissues of 60-year-old trees was observed. In this work, the Cinnamyl Alcohol Dehydrogenase (CAD) gene family was also studied. One complete (TgCAD1) and three partial (TgCAD2 to TgCAD4) members were characterized. The four enzymes presented residues for catalytic and structural zinc action, NADPH binding and substrate specificity, consistent with the mechanism of alcohol dehydrogenases. TgCAD3 and TgCAD4 were highly expressed in young and mature sapwood and seem to be duplicated and highly related with lignin biosynthesis. Tree genetic improvement, marker-assisted selection and plant transformation seem to be promising lines of research for the data obtained from this research. This is the first study addressing gene characterization and expression, phylogeny and transcriptomic profiling in teak. / A árvore de teca (Tectona grandis L.f.) tem alto valor no comércio de madeira para a fabricação de produtos lenhosos, devido às suas qualidades extraordinárias de cor, densidade e durabilidade. Apesar da importância desta espécie, são poucos os estudos genéticos e moleculares disponíveis. Também, a falta de informação molecular sobre xilema secundário e maturação da árvore tem dificultado a exploração genética de teca. Assim, estudos de expressão gênica e perfis transcricionais são relevantes para explorar a formação da madeira e a biossíntese de lignina durante o desenvolvimento e envelhecimento das plantas vasculares. Visando os estudos de expressão gênica, foi essencial identificar e clonar genes de referencia para a teca. Foram testados oito genes comumente usados em qRT-PCR, TgRP60S, TgCAC, TgACT, TgHIS3, TgSAND, TgTUB, TgUBQ e TgEF1a. Perfis de expressão destes genes foram avaliados por qRT-PCR em seis amostras de tecidos e órgãos (folhas, flores, plântulas, raiz, xilema secundário de caule e ramo). A validação da estabilidade pelos programas NormFinder, BestKeeper, geNorm e Delta CT mostrou que TgUBQ e TgEF1a são os genes mais estáveis para usar como genes de referência em teca nas condições testadas. Em virtude da disponibilidade de árvores de teca de diferentes idades, entre 12 e 60 anos, foi realizado o RNAseq de diferentes órgãos (plântulas, folhas, flores, raiz, ramos e caules de árvores de 12 e 60 anos). Obteve-se um total de 462.260 transcritos pela montagem com o software \"Trinity\". Foram identificados 1.502 e 931 genes diferencialmente expressos para xilema secundário de caule e ramo, respectivamente, utilizando o programa DESeq e fatores de transcrição MYB, que foram posteriormente caracterizados. A sequência de aminoácidos do TgMYB1 exibiu um motivo \"coiled-coil\" (CC), enquanto TgMYB2, TgMYB3 e TgMYB4 mostraram domínio R2R3-MYB. Todos eles foram filogeneticamente agrupados com várias gimnospermas e angiospermas. Observou-se alta expressão do TgMYB1 e TgMYB4 em tecidos lignificados de árvores de 60 anos de idade. Neste trabalho também foi estudada a família gênica Cinamil álcool desidrogenase (CAD). Foi caracterizado um membro completo (TgCAD1) e três parciais (TgCAD2 a TgCAD4). As quatro enzimas apresentaram resíduos de ação catalítica e estrutural de zinco, de ligação ao NADPH e de especificidade de substrato, em conformidade com o mecanismo conservado de álcool desidrogenases. TgCAD3 e TgCAD4 foram altamente expressos no alburno jovem e maduro e parecem estar duplicados e relacionados com a biossíntese de lignina. O melhoramento genético de árvores, a seleção assistida utilizando marcadores moleculares e a transformação de plantas parecem ser linhas promissoras de pesquisa, a partir dos dados obtidos nesta pesquisa. Este é o primeiro estudo sobre caracterização e expressão gênica, filogenia e perfis transcricionais em teca.

A dendrocronologia constitui-se no estudo dos anéis de crescimento e sua sequencia cronológica, que pode trazer importantes informações a respeito do crescimento dos vegetais lenhosos e seu ambiente. No presente trabalho foram analisados os anéis de crescimento de Podocarpus lambertii em uma população situada em sua zona limite de distribuição, no município de Morro do Chapéu, estado da Bahia. O local apresenta condições diferenciadas, sendo uma elevação em meio a caatinga com afloramentos rochosos que formam estreitos corredores onde os exemplares da espécie se distribuem. Através da dendrocronologia foi construída uma cronologia de 73 anos com 19 indivíduos e 43 raios da população, comprovando a anualidade dos anéis da espécie e sua capacidade de intercorrelação e boa sensitividade, embora a presença de anéis confluentes e falsos tenha ocasionado dificuldades na datação. Essa cronologia é a primeira realizada com P. lambertii. Os resultados mostraram um lento desenvolvimento da espécie no local, como no exemplo de um indivíduo de apenas 12 cm de diâmetro de tronco e 104 anos de idade. Com relação ao clima, os anéis apresentaram grande influência deste fator, com o crescimento sendo negativamente influenciado pela temperatura e precipitação na estação de crescimento (novembro a abril) e positivamente pela insolação. Na avaliação das reservas presentes no xilema de P. lambertii, os resultados mostraram uma distribuição aparentemente homogênea por todo o lenho, não permitindo relacioná-las diretamente com a formação dos anéis de crescimento, sugerindo grande capacidade de acúmulo de reservas pela árvore. A análise da condução de seiva pelo xilema ativo permitiu identificar que os anéis de crescimento mais jovens (próximos ao câmbio) são os maiores responsáveis pela condução, em um possível alburno, já que esta diferenciação não é obtida visualmente. / The Dendrochronology is the science that studies of annual growth rings present in the xylem. It allows to access information stored during the life tree. One of its basic requirements is the annual nature of growth ring formation, a feature usually present in conifers. In Brazil there are two genus of conifers, Araucaria and Podocarpus, but just the first was studied dendrochronology. Podocarpus lambertii, target species of this study was analyzed in a growing population living at Morro do Chapeu, Bahia State, Brazil, located at the Northern limit of species distribution. A total of 19 individuals were sampled, they were polished and this growth rings were measured. Missing and confluent rings difficulted to determine precise ages but after dendrochronological analysis it was possible to built good chronology, with significative intercorrelation and sensivity. A series of 73 years (1935-2008), confirmed the annual nature of growth rings of this species by dendrochronology. The history of local weather informations was compared with the chronology and allowed a good understanding the species growth, which respond negatively to higher temperatures (December and January) and also negatively to higher solar radiation (January), that suggests that heatstroke is an important point of activation and formation of the ring\'s growth.

A partir do sequenciamento do genoma da bactéria Xylella fastidiosa, agente causal da clorose variegada dos citros (CVC), estudos sobre os mecanismos de patogenicidade expressos durante a doença foram iniciados em projetos de genômica funcional, com o objetivo de confirmar a função das sequências gênicas identificadas no projeto Genoma de X. fastidiosa. Dentre esses mecanismos destacam-se as enzimas envolvidas no processo de ataque da bactéria. O presente trabalho teve como alvo de estudo a seqüência gênica denominada Xf-0818, clonada em Escherichia coli através da inserção em plasmídeo pET 28b(+), que presumivelmente codifica uma celulase de cerca de 60 kDa, possivelmente envolvida na degradação de fibras de celulose presentes nas membranas dos vasos pontuados do xilema de plantas de citros. A degradação desta membrana permitiria a movimentação de células bacterianas entre os vasos do xilema, o que é determinante para o desenvolvimento dos sintomas da CVC. A proteína foi superexpressada em E. coli por meio de indução com lactose e purificada através de ultrafiltração associada à cromatografia de afinidade a metal. A enzima apresentou alta atividade sobre a celulose carboximetilada 1%, avaliada através da quantificação de açúcares redutores. A obtenção de anticorpos foi realizada mediante injeção da enzima purificada em camundongos, os quais foram avaliados através de ELISA. A atividade da enzima sobre celulose carboximetilada foi reduzida após prévia incubação com os anticorpos. Esses anticorpos representam uma poderosa ferramenta em pesquisas visando à identificação das condições que favoreçam a expressão desta enzima "in vivo". A presença de partículas de ouro coloidal em seções de tecido provenientes de plantas infectadas com X. fastidiosa indica a atuação da celulase durante a infecção, porém fazse necessária a confirmação do papel da proteína Xf-0818, através de novas análises com imunolocalização, além de estudos utilizando linhagens mutantes de X. fastidiosa para o gene que codifica esta celulase. / From the genome sequencing of the bacteria Xylella fastidiosa, the agent responsible for the citrus variegated chlorosis (CVC), studies on the pathogenicity mechanisms expressed during the occurrence of the disease were started in genomic function projects, aiming to confirm the function of the genic sequences identified in the project X. fastidiosa Genome. Among these mechanisms, the enzymes involved in the bacterium attaching process are highlighted. The present study had, as a goal, the orf denominated Xf-0818, cloned in Escherichia coli by means of the insertion into pET 28b(+) plasmid, which codifies a cellulase of a size nearly 60 kDa, possibly involved in the degradation of cellulose fibers present in the membranes of the xylem vessels of citrus plants. The degradation of this membrane would allow for the movement of bacterial cells among the xylem vessels, which would be important for the development of CVC symptoms. The enzyme was over expressed into E. coli by means of their induction using lactose and purified using ultra-filtration associated to metal affinity chromatography. The enzyme presented high activity over 1%-carboximethyl cellulose (CMC), which was evaluated through quantification of released reduced sugars. The antibodies were obtained by injection of the purified enzyme into mice, which were evaluated by using the ELISA. The enzyme activity over CMC was reduced after previous incubation with the antibodies. These antibodies represent a tool for the researches aiming the identification of conditions that favor the expression of this enzyme in vivo. The presence of gold particles on the citrus diseased tissue samples indicate the participation of this cellulase on the disease, but other studies using immunocytochemistry and mutants of X. fastidiosa are necessary to confirm this hypothesis.

Os elementos celulares que constituem o tecido xilemático de várias espécies vegetais são amplamente utilizados em diversos setores industriais, com inúmeras aplicações, como por exemplo, a geração de energia e produção de celulose e papel. A parede celular das células vegetais é formada basicamente por celulose, hemiceluloses e lignina. A formação dos polímeros de celulose e hemicelulose dependem exclusivamente do suprimento de precursores chamados de nucleotídeos-açúcares, tais como UDP-glicose, UDP-glucuronato, UDP-xilose, UDP-arabinose, UDP-manose e UDP-galactose. A biossíntese da parede celular é altamente regulada do ponto de vista metabólico, e envolve a participação de várias enzimas que catalisam uma série de reações. Estratégias para alterar o fluxo metabólico destes precursores, podem originar modificações na deposição dos polissacarídeos na parede celular. Em particular, para o setor de celulose e papel tal estratégia pode resultar em fibras com determinadas características, melhorando a qualidade da polpa celulósica ou do papel produzido. O UDP-glucuronato é um dos principais precursores de polissacarídeos hemicelulósicos da parede celular, sendo formado a partir de UDP-glucose pela ação da enzima UDP-glicose desidrogenase (EC. 1.1.1.22). Esta enzima é chave na regulação da biossíntese das pentoses e hexoses da parede celular de plantas superiores. Com o objetivo de modular a síntese dos polissacarídeos hemicelulósicos na parede celular, o presente trabalho analisou o impacto da superexpressão do gene ugdh em plantas transgênicas de tabaco. Foram realizadas análises da composição química da parede celular primária e secundária de folhas e caules, bem como avaliações morfológicas das fibras do tecido xilemático, e também cortes histológicos da região basal do caule. Da parede secundária do tecido xilemático determinou-se o conteúdo de lignina klason e solúvel, bem como a concentração dos carboidratos via HPAE-PAD. No tecido xilemático, todas as plantas transgênicas apresentaram aumento do conteúdo de xilose, embora não significativo. Juntamente, ocorreu um aumento de arabinose significativo em três linhagens transgênicas. Paralelamente, todas as plantas transgênicas tiveram redução do conteúdo de lignina klason, embora significativo em apenas uma linhagem. A relação hexoses/pentoses reduziu em todas as linhagens transgênicas, sendo significativa em três linhagens. As análises histológicas do caule mostraram que os transformantes apresentaram um aumento do tecido xilemático em relação às plantas controles. As análises morfológicas das fibras mostraram que todas as plantas transgênicas apresentaram reduções significativas no comprimento, em relação às plantas controles. No tecido foliar, o conteúdo de polissacarídeos da parede celular primária apresentou uma redução significativa em todas as plantas transgênicas. / The cellular elements that constitute the xylematic tissue of various plant species are widely used in diverse industrial sectors, with numerous applications, for example, the generation of energy and production of cellulose and paper. Plant cell walls are basically formed by cellulose, hemicellulose and lignin. The formation of cellulose and hemicellulose polymers depend exclusively on the supply of the precursors called nucleotide sugars, such as UDPglucose, UDP-glucuronate, UPD-xylose, UDP-arabinose, UDP-mannose and UDP-galactose. The biosynthesis of the cell wall is highly regulated from the metabolic point of view and involves the participation of various enzymes that catalyse a series of reactions. Strategies to alter the metabolic flux of these precursors could give rise to modifications in the deposition of polysaccharides in the cell wall. In particular, for the cellulose and paper sector these strategies could result in fibers with determined characteristics, improving the quality of the cellulose pulp or the paper produced. UDP-glucuronate is one of the principal precursors of the hemicellulose polysaccharides of the cell wall, which is formed from UDP-glucose by the action of UDPglucose dehydrogenase (EC1.1.1.22). This is a key enzyme in the regulation of the biosynthesis of the pentoses and hexoses in the cell walls of higher plants. With the objective of modulating the synthesis of the hemicellulose polysaccharides in the cell wall, the present study analysed the impact of the superexpression of the ugdh gene in transgenic tobacco plants. Chemical analyses were performed to determine the chemical composition of the primary and secondary cell walls of leaves and stems, as well as morphological evaluations of the fibers of the xylematic tissue and histological cuts through the base of the stem. The Klason and soluble lignin content as well as the carbohydrate concentrations (using HPAE-PAD) were determined in the secondary cell walls of the xylematic tissue. All of the transgenic plants showed an increase in xylose content, albeit not significant. A significant increase in arabinose content was observed in three transgenic lines. In parallel all the transgenic plants presented a reduction in Klason lignin, but only significant in one line. The ratio hexose/pentose was reduced in all transgenic lines, being significant in three. Histological analyses on the stem showed that the transformants presented an increase in the xylematic tissue when compared to the controls. The morphological analyses of the fibers showed that all the transgenic plants presented significant reductions in length when compared to the controls. In the leaf tissue, the polysaccharide content of the primary cell wall showed a significant reduction in all of the transgenic plants.