La sécrétion de lipase, la lipolyse extracellulaire et l’absorption des acides gras (AGL) ont été étudiés chez Yarrowia lipolytica (YL) en présence d’huile d’olive et/ou de sucrose. Des mesures d’activité lipase et d’immuno-révélation ont montré que l’activité lipase présente dans le milieu de culture provenait principalement de la lipase YLLIP2. L’huile d’olive induit la production de lipase qui est principalement associée aux cellules pendant les premières heures de cultures. YLLIP2 est ensuite libérée dans le milieu de culture avant d’être totalement dégradée par les protéases. Les triglycérides (TG) sont dégradés alors que la lipase est encore attachée aux cellules. Les produits de lipolyse présents dans le milieu de culture et à l’intérieur des cellules ont été quantifiés par chromatographie TLC-FID et GC. Les niveaux intracellulaires d’AGL et de TG augmentent transitoirement et dépendent de la source de carbone utilisée. Une accumulation maximum de 37,8 % w/w de lipides est observée avec l’huile d’olive seule. Cette étude montre que la levure YL est un modèle intéressant pour étudier la lipolyse extracellulaire et l’absorption des acides gras par les cellules / Lipase secretion, extracellular lipolysis and fatty acid (FFA) uptake were quantified in Yarrowia lipolytica (YL) grown in the presence of olive oil and/or sucrose. Lipase assays and western blot analysis indicated that the lipase activity measured in YL cultures mainly resulted from YLLIP2 lipase. Lipase production was triggered by olive oil and YLLIP2 remained associated with the yeast cells during the first hours of culture. It was then released in the culture medium before it was totally degraded by the alkaline protease. Olive oil triglycerides (TG) were degraded when the lipase was still attached to the cell wall. The fate of lipolysis products in the culture medium and inside the yeast cell were investigated by quantitative TLC-FID and GC analysis. Intracellular levels of FFA and TG increased transiently and were dependent on the carbon sources. A maximum fat storage of 37.8% w/w was observed with olive oil alone. The present study shows that yeasts are interesting models for studying extracellular lipolysis and fat uptake by the cell

L’objectif de notre travail était d’étudier les bascules métaboliques chez Yarrowia li-polytica d’un métabolisme purement oxydatif vers l’accumulation de lipides puis à l’excretion d’acide citrique.Le développement d’un procédé D-stat et d’un mode de conduite fed-batch nous a permis, dans un premier temps, de quantifier les ratios N/C caractéristiques pour chacune des bascules étudiées. Nos résultats montrent que les ratios rN/rC critiques aux bascules métaboliques sont de 0,085 molN.Cmol-1 et de 0,018-0,022 molN.Cmol-1 pour l’accumulation de lipides et production de citrate, respectivement.L’analyse systémique des cultures réalisées nous a permis de mettre en évidence des mécanismes de co-régulation de certaines enzymes du métabolisme lipidique ainsi qu’une prépondérance de mécanismes post-transcriptionnels dans l’établissement des bascules étudiées.Enfin, l’utilisation de souches génétiquement modifiées au niveau de l’ATP citrate lyase, la malate déshydrogénase et de la glycérol-3-phosphate déshydogénase a permis d’évaluer l’impact de ces enzymes sur le métabolisme lipidique / This thesis aimed at studying the metabolic shifts in Yarrowia lipolytica from the pure oxidative metabolism to lipid accumulation and citric acid excretion.The development of a D-stat culture and of a monitoring fed-batch strategy allowed us to determine the N/C ratio characteristic for each of metabolic shifts. rN/rC ratio were determined equal to 0,085 molN.Cmol-1 and 0,018-0,022 molN.Cmol-1 for the lipid accumu-lation and the citric acid production, respectively.Systemic analysis of the cultivations showed coregulation phenomena among some enzymes of the lipidic metabolism and post-transcriptional modifications in the onset of the metabolic shifts.Finally, the impact of enzymes (ATP citrate lyase, malate dehydrogenase and gly-cérol-3-phosphate dehydrogenase) on the lipidic metabolism was evaluated through systemic analysis of 3 genetically modified strains

Les lipases, protéines ubiquitaires, sont les enzymes les plus étudiées et les plus utilisées dans l’industrie. Elles catalysent un très grand nombre de réactions, d’hydrolyse et de synthèse, conduisant à une grande diversité de molécules, acides, esters, amides…. Les domaines d’applications sont nombreux : les bio-énergies, les arômes, bio-lubrifiants, bio-plastifiants, émulsifiants, produits phytosanitaires et détergents, cosmétiques, synthons pour la chimie fine, produits pharmaceutiques… Aujourd’hui, grâce aux outils génétiques, il est possible de modifier leur activité, spécificité et thermostabilité pour les adapter idéalement aux contraintes industrielles. Dans ce travail de doctorat, nous nous sommes intéressés à quatre lipases d’intérêt industriel. Les 3 premières appartiennent à la famille des lipases de Candida rugosa (Lip1, Lip3 et Lip4). Bien que très homologues, leurs spécificités sont très différentes. Elles se distinguent de toutes les autres lipases par un site actif composé d’un long tunnel avec la triade catalytique à l’entrée de celui-ci. Cela en fait une enzyme particulièrement intéressante pour la conversion et la purification d’acides gras à longue chaîne. La quatrième est une nouvelle lipase identifiée chez la levure oléagineuse, Yarrowia lipolytica. Elle est très active sur les acides gras à longue chaîne, active à pH acide et présentant une grande énantiosélectivité sur des molécules d’intérêt pharmaceutique, les esters d’acide 2- halogéno-aryl acide acétique. Dans un premier temps, un nouveau système d’expression, une souche spécifique de Yarrowia lipolytica, a été étudié pour l’expression de variants construits par mutagenèse dirigée. Cette souche JMY1212 permet une intégration ciblée dans le génome de Y. lipoytica. Nous avons démontré qu’il s’agissait du premier système d’expression permettant de comparer statistiquement l’activité de variants directement à partir du surnageant de culture. Trois des lipases de Candida rugosa ont été clonées avec succès dans cette souche et leurs activités et spécificités vis-à-vis de la longueur de chaines des acides gras ont été étudiées. Lip1 et Lip3 présentent une spécificité pour les acides gras à longueur de chaine moyenne (C8-C10) alors que Lip4 préfère les C18:1. De, plus, pour la première fois, la purification, à partir d’un mélange d’esters éthyliques issu d’huile de poissons, d’acides gras poly-insaturés (PUFAs); acides cis-5, 8, 11, 14, 17-eicosapentaenoic (EPA) et cis-4, 7, 10, 13, 16, 19-docosahexaenoic (DHA), molécules bonnes pour la santé, a été réalisée avec les trois lipases séparées de C. rugosa. Quelle que soit l’enzyme, le rendement de récupération du DHA est supérieur à 93 % (97, 100 et 93 % pour Lip1, Lip3 et Lip4 respectivement. Une pureté maximale en DHA de ~60 % a été obtenue avec Lip3 et Lip4, à partir d’un mélange initial d’esters éthyliques contenant 25% de DHA. Une différence remarquable entre ces trois enzymes est que Lip4 est capable de mieux hydrolyser l’ester d’EPA (60% contre 14 et 16% pour Lip1 et Lip3). Lip4 est même capable d’hydrolyser le DHA (7% contre 3 et 0 % pour Lip1 et Lip3). La deuxième partie de ce travail a été consacrée à l’amélioration de l’énantiosélectivité des deux enzymes étudiées vis-à-vis de synthons d’intérêt dans l’industrie pharmaceutique, les esters de 2-bromo aryl acide acétique. La construction raisonnée d’un double variant de la lipase Lip2 de Y. lipolytica, D97AV232F, a permis d’obtenir une enzyme totalement énantiosélective (E >200). Celle-ci reconnaît l’énantiomère R alors que la lipase sauvage avait une faible préférence pour l’énantiomère S (E=5). Par ailleurs, cette exceptionnelle augmentation de l’énantiosélectivité s’accompagne d’une amélioration de l’activité de l’enzyme qui est ainsi multipliée par 4,5. Sur ce même mélange d’énantiomères, les 3 lipases de C. rugosa se sont avérées remarquables. Malgré leur grande homologie, leur spécificité est différente. Lip1 et Lip3 sont totalement S spécifiques (E>200), alors que Lip4 est R spécifique (E=15). Le docking moléculaire des énantiomères S et R dans le site actif des lipases Lip1 et Lip4 a permis de mieux comprendre ces différences de spécificité et de proposer des cibles de mutagenèse dirigée. L’encombrement et la nature de l’acide aminé présent en position 296 sont cruciaux pour la discrimination de l’enzyme / Lipases, ubiquitous proteins, are the most studied enzymes and the most used in industry. They catalyse a great number of reactions, hydrolysis and synthesis, leading to a great diversity of molecules, acids, esters, amides. There are numerous fields of applications: bio-energies, flavours, bio-lubricants, bio-plasticizers, emulsifiers, detergents, cosmetics, synthons for fine chemistry, and pharmaceutical products. Nowadays, thanks to genetic tools, it is possible to modify their activity, specificity and thermostability to ideally adapt enzymes for the industrial constraints. In this work, we were interested in four lipases of industrial interest. The third ones belong to the lipase family of Candida rugosa (Lip1, Lip3 and Lip4). Although they present high homology, their specificities are very different. They are distinct from the other lipases by the active site composed of a long tunnel with the catalytic triad at the entry of the tunnel. It leads to enzymes particularly interesting for the conversion and the purification of long chain fatty-acids. The fourth one is a new lipase identified from oleaginous yeast, Yarrowia lipolytica. It is one of the most active lipase on long chain fatty-acids; it is very active and stable at acid pH and presents a high enantioselectivity on molecules of pharmaceutical interest, the esters of 2- halogeno-aryl acetic acid. In this work, we first tested a new expression system, a specific strain of Y. lipolytica, for expression of variants obtained by site-directed mutagenesis. This strain JMY1212 enables integration to be targeted to a special locus of the Y. lipoytica genome. We demonstrated that it is the first expression system in which it is possible to compare statistically variant activities directly from the supernatant of the culture. Secondly, three lipases of C. rugosa were cloned successfully in this strain and their activities and specificities with respect to fatty acid chain lengths were studied. Lip1 and Lip3 have specificity for the fattyacids of medium chain (C8-C10) whereas Lip4 prefers C18: 1. Moreover, for the first time, purification, from a mixture of ethyl esters issued from fish oil, polyunsaturated fatty acids (PUFAs); cis-5, 8, 11, 14, 17- eicosapentaenoic acid (EPA) and cis-4, 7, 10, 13, 16, 19-docosahexaenoic acid (DHA), molecules with health benefits, was realised with the three C. rugosa lipases, separately. Whatever the enzyme the recovery of DHA is superior to 90 % (97, 100 and 93 % for Lip1, Lip3 and Lip4 respectively. The maximal DHA purity ~60 % was obtained with Lip3 and Lip4, with an initial ethyl ester mixture containing 25% DHA. A remarkable difference between these enzymes lies in the fact that Lip4 is able to better hydrolyse the EPA esters (60% against 13% and 16% respectively for Lip1 and Lip3). Lip4 is also able to hydrolyse DHA (7% against 3 and 0 % for Lip1 and Lip3 respectively). The third part of this work was devoted to the improvement of the enantioselectivity of the two enzymes studied with respect to the resolution of a racemic mixture of pharmaceutical industry, the R, S esters of 2-bromo aryl acetic acid. The rational construction of a double variant of Lip2 lipase from Y. lipolytica, D97A V232F was realized to obtain a total enantioselective enzyme (E > 200). This variant recognizes the enantiomer R whereas wild-type lipase had a weak preference for the enantiomer S (E=5). In addition, this exceptional increase in the enantioselectivity is accompanied by a 4.5 fold improvement of the activity. With the same mixture of enantiomers, the 3 lipases of C. rugosa proved to be remarkable from the point of view of enantioselectivity. In spite of their high homology, their specificity is different. Lip1 and Lip3 are completely specific for the S enantiomer, whereas Lip4 is R specific (E=15). The molecular docking of the S and R enantiomers in the active site of Lip1 and Lip4 lipases enables the observed differences in specificity to be better understood and targets for site-directed mutagenesis to be proposed. We demonstrated that the nature of the amino acid present in position 296 is crucial for the discrimination of these enzymes

La lipase de Yarrowia lipolytica (EC 3.1.1.3) est une enzyme appartenant à la classe des hydrolases. La non pathogénicité et le caractère hyperproducteur en lipase de cette levure lui confèrent une place de choix au sein de lunité de Bio-industries du Centre Wallon de Biologie Industrielle. Ce présent travail sinscrit dans le cadre général du développement industriel de la lipase de Yarrowia lipolytica et concerne plus particulièrement le traitement post-culture de lenzyme afin de réaliser des formes liquides, poudres atomisées, immobilisées et enrobées à laide des polymères acryliques. Latomisation de la lipase en présence ou en absence de poudre de lait a permis lacquisition de poudres fluentes, stables à 4 et 20°C et présentant des températures de transition vitreuse comprises entre 51 et 79°C. Lactivité deau de conservation des poudres était ≤ 0.4. La stabilisation de lenzyme sous forme de liquide concentré réalisée avec le monopropylène glycol (MPG), les inhibiteurs de protéases et lirradiation aux rayons gamma ont révélé que le MPG à 50% et la technique dirradiation au rayon gamma permettaient la stérilisation et la préservation de lactivité enzymatique. Par ailleurs, limmobilisation de cette enzyme par trois techniques (adsorption, inclusion et liaison covalente) a révélé une amélioration de ses propriétés caractéristiques telles que la thermostabilté et la résistance aux solvants. La technique dimmobilisation par adsorption et par liaison covalente a permis une utilisation multiple de lenzyme. Létude préliminaire de faisabilité des formes galéniques à base de la lipase de Y. lipolytica a montré la capacité de cette enzyme à être mise sous forme de comprimés et de poudres encapsulées. La comparaison réalisée in vitro entre le Créon 150mg (produit pharmaceutique) et les formes galéniques à base de la lipase a montré des temps de gastro-résistance et de délitage similaires. Ces différentes formules de la lipase posent des jalons nécessaires pour leurs applications dans des secteurs agroalimentaires, environnementaux et pharmaceutiques. Yarrowia lipolytica lipase (EC.3.1.1.3) is an enzyme which belongs to the class of hydrolases. Nonpathogenicity and the high-lipase producing character of this yeast have emphasised its use within the laboratory of Bio-industry of the Walloon Center of Industrial Biology. The present work lies within the general scope of the industrial development of the lipase from Yarrowia lipolytica. More particularly it relates to the post-culture treatment of the enzyme in order to obtain liquid forms, atomized powders, immobilized and coated enzymes using acrylic polymers. The atomization of lipase in presence or absence of milk powder allowed the achievement of flowing, stable powders at 4 and 20°C, with glass transition temperatures ranging between 51 and 79°C. The water activity of preservation of the powders was ≤ 0.4. Stabilization of the enzyme under the form of concentrated liquid carried out with monopropylen glycol (MPG), proteases inhibitors and gamma irradiation revealed that MPG (50%) and gamma irradiation allowed sterilization and conservation of the enzymatic activity. In addition, the immobilization of the enzyme through three techniques (adsorption, inclusion and covalent bond) revealed an improvement of some properties such as thermostability and resistance to solvents. Immobilization by adsorption and covalent bond allowed multiple uses of the enzyme. The preliminary study of feasibility of galenic forms containing the lipase from Y. lipolytica showed the capacity of this enzyme to be put under the form of tablets and encapsulated powders. The in vitro comparison of Creon 150mg (pharmaceutical product) and galenic forms containing the lipase, showed similar times of acid-resistance and of disintegration. These various formulas of the lipase constitute milestones necessary for their applications in food, environmental and pharmaceutical industries.

La transposition d’un milieu liquide (FML) à un milieu solide (FMS) de la production de γ-décalactones par fermentation par Yarrowia lipolytica a été étudiée pour la première fois. Dans un premier temps, différentes matrices solides (rafles de maïs, éponges de cellulose, éponges de courgette et graines de ricin) ont été utilisées. L'éponge de courgette était le support sur lequel les lactones étaient produites aux concentrations les plus élevées. La production de lactones a donc été réalisée sur ce support et dans trois types de réacteurs FMS sous différentes conditions d’aérations (sans aération, avec aération statique et avec aération forcée). Une concentration élevée de 5 g/L d’hydroxy-lactone a été détectée dans la condition d’aération statique en fiole à col large. Une certaine concentration de lactones était entrainée lors de l’aération forcée au cours de la production en mini-réacteur. Pour calculer la production totale de lactones dans cette condition, un modèle mathématique a été utilisé pour modéliser les pertes. Par ailleurs, un nouveau procédé par injection d’air enrichi en oxygène (20 %, 30 %, 40 % et 50 %) a été mis en place pour étudier les effets de l’oxygène sur la β-oxydation chez Y. lipolytica. Dans cette partie, les résultats ont montré que l’oxygène est nécessaire pour la production d’hydroxy-lactone et la dégradation de γ-décalactone mais pas pour la dernière étape de production de cette dernière. Dans la dernière partie de ce travail, l’effet de l’activité de l’eau (Aw) a été étudié préliminairement sur la croissance en milieu gélosé, et pour la croissance et la production de lactone en FML. / The adaptation of the production of γ-decalactones from submerged fermentation (SmF) to solid state fermentation (SSF) by Yarrowia lipolytica was investigated in this work. First of all, different solid matrices (corncob, cellulose sponge, luffa sponge, and castor seeds) were used for the first adaptation of the production of γ-décalactones. Luffa sponge appeared to be the most interesting solid support on which lactones were produced in higher concentrations than in the other solid matrices used. Then, the production of lactones using luffa sponge as the solid support was carried out in three types of SSF reactors to monitor different aeration conditions (without aeration, with a static aeration and with a forced aeration). A 5 g/L-high concentration of hydroxy-lactone was detected in the condition of static aeration using wide-mouth Erlenmeyer flasks. Furthermore, a concentration of lactones was stripped when forced aeration was used during the production using mini-reactors. To calculate the total production of lactones in this case, a mathematical model was used to evaluate the losses. Moreover, a novel alternative process using oxygen-enriched air (20%, 30%, 40% and 50%) was employed to study the effect of oxygen on β-oxidation in Y. lipolytica. In this part, the results showed that oxygen is required for hydroxy-lactone production and γ-decalactone degradation but not for the last step of production of this latter lactone. In the last part of this work, the effect of water activity (Aw) was preliminary studied on growth in agar medium, and for growth and lactone production in SmF.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / A fisiologia microbiana é uma área promissora da biotecnologia para a síntese de compostos de elevado valor agregado. Os micro-organismos apresentam vantagens devido ao menor período de geração, às facilidades de modificações fisiológicas e genéticas e à grande diversidade de processos metabólicos. O objetivo deste trabalho foi degradar óleos e gorduras de efluente lácteo por lipases produzidas por Yarrovia lipolytica. Planejamentos fatoriais foram utilizados para investigar os efeitos de variáveis em três etapas: em fermentação para produção de lipases, em formulação de bioproduto com atividade lipásica para estabilização da ação catalítica da enzima e em tratamento de soro de queijo para degradação de óleos e gorduras. Na presença de resíduo de refinaria de óleo vegetal a 3 % e cloreto de amônio a 0,2 g.L-1 com 48 h a 28 oC, lipases foram produzidas sob cultivo submerso. O líquido metabólico livre de células com atividade lipásica foi estabilizado com sorbato de sódio a 0,5 %, glicerol a 5 % e RENEX-95 a 10 %. Esse bioproduto apresentou 177 UI.mL-1 da atividade enzimática durante 30 dias sob armazenamento à temperatura ambiente (27 - 30 oC); pH ótimo 5,0 e 7,0, temperatura ótima de 50 oC e estabilidade térmica durante 120 min com retenção de 100 % da atividade enzimática a 50 oC e pH 5,0. A aplicação de 7 % do bioproduto durante 12 h de tratamento de efluente lácteo degradou 98 % dos óleos e gorduras presentes no soro de queijo. As lipases produzidas por Y. lipolytica e formuladas com substâncias estabilizadoras tem potencial para serem aplicadas na degradação de óleos e gorduras. / The microbial physiology is a promising area of biotechnology for the synthesis of compounds of high value. The micro-organisms have advantages because of their shorter generation facilities to physiological and genetic changes and the wide variety of metabolic processes. The aim of this study was to degrade oils and fats from lipases produced by Yarrovia lipolytica. Factorial designs were used to investigate the effects of variables in three stages: fermentation for lipase production, bioproduct formulation for stabilization the catalytic action of lipases and treatment of whey for degradation of fats and oils. In the presence of a vegetable oil residue at 3 % and ammonium chloride at 0,2 g.L-1, during 48 h at 28 oC, lipases were produced under submerged cultivation. The cell-free liquid metabolic was stability with sodium sorbate at 0.5 %, glycerol at 5 %, RENEX-95 at 10 %. This bioproduct presented 177 UI.mL-1 of the lipase activity during 30 days of storage at room temperature (27 - 30 C); it showed optimum pH at 5.0 and 7.0, optimum temperature of 50 oC and thermal stability for 120 min with retention of 100 % of the enzyme activity at 50 oC and pH 5,0. The application of the bioproduct at 7 % during 12 h degraded 98 % of oils and fats present in cheese whey. The lipases produced by Y. lipolytica and formulated with stability agents have potential to be applied in the degradation of oils and fats.

Le but de ce travail de doctorat est de contribuer à l'optimisation de l'accumulation de lipides par les levures oléagineuses, et plus particulièrement par la levure Yarrowia lipolytica à partir du glucose, avec une stratégie d’optimisation dynamique à partir d’une commande basée sur un modèle. L’étude bibliographique permet de faire le bilan des connaissances antérieures pour identifier les différentes méthodologies existantes pour l’optimisation des procédés en structurant trois parties principales: la modélisation, la commande, et le suivi des procédés. Dans ce contexte, cinq modèles ont été proposés pour décrire l'accumulation de lipides. Le premier est un modèle non structuré basé sur des cinétiques de Monod et d’inhibition. Le deuxième s’appuie sur le modèle de Droop (quota) précédemment utilisé pour décrire l’accumulation de lipides dans les microalgues. Les trois derniers sont des modèles métaboliques dynamiques qui combinent les cinétiques avec un réseau métabolique réduit, obtenu à partir des modes élémentaires. Les cinq modèles ont été calibrés et validés en utilisant plusieurs jeux des données expérimentales. Néanmoins, un des avantages des modèles métaboliques dynamiques présentés est la possibilité de décrire les basculements métaboliques. Deux stratégies de commande multi-objective visant à maximiser la productivité des lipides et la fraction en teneur lipidique ont été proposées. Dans la première, les deux objectifs ont été pondérés par le calcul statique des fronts de Pareto, et intégrés à la stratégie de commande avec un modèle dynamique métabolique. La deuxième stratégie est basée sur des fonctions linéaires par morceaux en intégrant le modèle quota. Les simulations de la commande montrent la possibilité d’atteindre des teneurs en lipides entre 0,21 – 0,26 gLIP.gX-1 et productivités entre 0,78 – 1,02 g.(L-h)-1 en diminuant le temps de la culture à 20 h. Des capteurs logiciels ont été proposés afin de pallier le manque de capteurs en ligne en corrélant des mesures en ligne (i.e. pO2 et la base ajoutée pour le pH) par des algorithmes de types machines à vecteurs supports. La validation expérimentale des stratégies de commande est la principale perspective de ce travail. / This PhD thesis aims at optimizing lipid accumulation by oleaginous yeast, and most particularly by the yeast Yarrowia lipolytica from glucose. This optimization is addressed from a mathemantical point of view based on automatic control laws, where model-based control strategies are proposed. The bibliographic review compiles and evaluates previous works to identify the different existing methodologies to attain the optimization, which is divided in three main axes: modeling, control strategies, and monitoring. In this context, five different models are proposed to describe lipid accumulation. The first model is based on Monod and inhibition kinetics (unstructured), and the second on the Droop quota model (quota) previously used for microalgae. The last three are dynamic metabolic models that combine kinetics with metabolic models based on the stoichiometry of metabolism. These three models used a reduced metabolic network decomposed into elementary flux modes. The five models were successfully calibrated and validated with different experimental data. Nonetheless, the dynamic metabolic models presented highlighting features such as the description of metabolic shifts. Two approaches of multi-objective control strategies aiming at maximizing lipid productivity and lipid content fraction were proposed. In the first, the two objectives were weighted by static calculation of Pareto fronts, and integrated to the control strategy by dynamic optimization algorithms with a dynamic metabolic model. The second strategy used a constant weighed objective function solved by piecewise linear functions by integrating the quota model. The simulation results of the optimization attained lipid contents between 0.21 – 0.26 gLIP.gX-1 and productivities between 0.78 – 1.02 g.(L-h)-1 shortening the culture time to 20 h. Soft-sensors were developed by correlating on-line measurements (i.e. pO2 and the added base for pH) through support vector machines in order to overcome the lack of measurements. The perspective is to experimentally validate the control strategies.

En raison des capacités de mélange limitantes, des hétérogénéités au sein des bioréacteurs se produisent régulièrement lors de l’extrapolation à l’échelle industrielle. En conséquence, les microorganismes circulant au sein de ces bioréacteurs sont continuellement exposés à des gradients locaux au niveau des paramètres fondamentaux du procédé tel que le pH, la température, la concentration en substrat et en oxygène dissous. Ces fluctuations micro-environnementales peuvent affecter la croissance, le métabolisme et la morphologie des cellules, en fonction de la nature, de l’intensité, de la durée et/ou de la fréquence de la perturbation rencontrée. L’objectif de ce travail est l’étude quantitative de l’impact des fluctuations de pH et d’oxygène dissous sur le comportement dynamique de Yarrowia lipolytica, une levure avec un potentiel biotechnologique prometteur, aussi bien aux niveaux morphologique que métabolique. Pour répondre à cet objectif, des cultures en bioréacteur en conditions d’environnement contrôlé ont été mises en œuvre afin d’établir un lien de causalité directe entre la perturbation et la réponse observée. L’implémentation de deux modes de cultures différents (batch et chemostat) a permis de caractériser le comportement dynamique des populations cellulaires dans des états physiologiques différents: En mode continu, toutes les cellules sont dans le même état physiologique et se multiplient à la même vitesse de croissance, tandis que des sous-populations de levures dans des états physiologiques distincts peuvent cohabiter dans les cultures en mode batch. Un effort important a été consacré au développement et validation des méthodes pour une quantification rigoureuse des évolutions morphologiques de Y. lipolytica à l’échelle de la population. Le comportement macroscopique de la levure a été caractérisé par l’évaluation des dynamiques de croissance, la viabilité, les vitesses de consommation du glucose et d’oxygène, ainsi que les vitesses de production d’acide organique et de dioxyde de carbone. Trois techniques, à savoir la cytométrie en flux (CYT), la morpho-granulométrie (MG) et la diffraction dynamique de la lumière (DLS) ont été employé pour la quantification du phénomène d’élongation. Les résultats obtenus démontrent qu’il n’y a pas d’effet significatif des fluctuations de pH et d’oxygène dissous sur le comportement macroscopique (vitesses spécifiques, rendements, viabilité) de la levure. Néanmoins, une transition micellaire a été induite en réponse aux deux facteurs de stress (pH and pO2) seulement en conditions d’excès de glucose, suggérant ainsi un impact de la concentration résiduelle de glucose sur la régulation de dimorphisme chez Y. lipolytica. Le contrôle et la régulation de la concentration de glucose dans le milieu peut contribuer à une meilleure maitrise des changements morphologiques de Y. lipolytica en réponse à des stimuli de l’environnement. / Due to limited mixing capacities, heterogeneities regularly occur when scaling-up bioreactors for large-scale production. Microbial cultures are continuously exposed to local gradients in fundamental process parameters such as substrate, pH, temperature and dissolved oxygen DO concentration. These micro-environmental fluctuations may have detrimental effects on cellular growth, metabolism and morphology, depending on the nature, intensity, duration and/or frequency of the fluctuations encountered. The aim of this study was to investigate the impact of pH and DO fluctuations on the dynamic behavior of Yarrowia lipolytica, a microorganism with a promising biotechnological potential, at both morphological and metabolic levels. For this purpose, batch and continuous cultivations modes were preferentially adopted, as it enabled respectively, the study of the stress response of yeast populations growing at their maximum specific rate, and at various controlled specific growth rates in physiological steady-states. In addition, an important effort was devoted to the development and validation of morphological methods in order to acquire quantitative characterization of the response dynamics at the population scale. The macroscopic behavior of Y. lipolytica was assessed through examining the patterns of growth, viability, glucose uptake, oxygen consumption, organic acid and carbon dioxide production rates. Changes in the yeast morphology were characterized at the cell population level by means of flow cytometry, morphogranulometry and diffraction light scattering techniques. The results reflected no significant effect of pH and DO fluctuations on the macroscopic behavior (specific rates, yields, viability) of the yeast. Nevertheless, mycelial growth was induced upon exposure to both stressors, only in glucose-excess environments, suggesting therefore an impact of glucose levels on the regulation of dimorphic transition in Y. lipolytica. Controlling residual glucose concentrations in Y. lipolytica fermentations may contribute to a better monitoring of its morphological changes in response to environmental stimuli. Such data would help to optimize bioprocess performances at the industrial scale since it alleviates physico-chemical impacts due to filamentous cells.

Le métabolisme définit l’ensemble des réactions biochimiques au sein d’un organisme, lui permettant de survivre et de s’adapter dans différents environnements. La régulation de ces réactions requiert un processus complexe impliquant de nombreux effecteurs interagissant ensemble à différentes échelles.Développer des modèles de ces réseaux de régulation est ainsi une étape indispensable pour mieux comprendre les mécanismes précis régissant les systèmes vivants et permettre, à terme, la conception de systèmes synthétiques, autorégulés et adaptatifs, à l'échelle du génome. Dans le cadre de ces travaux interdisciplinaires, nous proposons d’utiliser une approche itérative d’inférence de réseau et d’interrogation afin de guider l’ingénierie du métabolisme de la levure d’intérêt industriel Yarrowia lipolytica.À partir de données transcriptomiques, le premier réseau de régulation de l’adaptation à la limitation en azote et de la production de lipides a été inféré pour cette levure. L’interrogation de ce réseau a ensuite permis de mettre en avant et valider expérimentalement l’impact de régulateurs sur l'accumulation lipidique.Afin d’explorer davantage les liens entre régulation et métabolisme, une nouvelle méthode, CoRegFlux, a été proposée pour la prédiction de phénotype métabolique à partir des profils d’activités des régulateurs dans les conditions étudiées.Ce package R, disponible sur la plateforme Bioconductor, a ensuite été utilisé pour mieux comprendre l’adaptation à la limitation en azote et identifier des phénotypes d’intérêts en vue de l’ingénierie de cette levure, notamment pour la production de lipides et de violacéine.Ainsi, par une approche itérative, ces travaux apportent de nouvelles connaissances sur les interactions entre la régulation et le métabolisme chez Y. lipolytica, l’identification de motifs de régulation chez cette levure et contribue au développement de méthodes intégratives pour la conception de souches assistée par ordinateur. / Metabolism defines the set of biochemical reactions within an organism, allowing it to survive and adapt to different environments. Regulating these reactions requires complex processes involving many effectors interacting together at different scales.Developing models of these regulatory networks is therefore an essential step in better understanding the precise mechanisms governing living systems and ultimately enabling the design of synthetic, self-regulating and adaptive systems at the genome level. As part of this interdisciplinary work, we propose to use an iterative network inference and interrogation approach to guide the engineering of the metabolism of the yeast of industrial interest Yarrowia lipolytica.Based on transcriptomic data, the first network for the regulation of adaptation to nitrogen limitation and lipid production in this yeast was inferred.The interrogation of this network has then allowed to to highlight and experimentally validate the impact of several regulators on lipid accumulation. In order to further explore the relationships between regulation and metabolism, a new method, CoRegFlux, has been proposed for the prediction of metabolic phenotype based on the influence profiles of regulators in the studied conditions. This R package, available on the Bioconductor platform, was then used to better understand adaptation to nitrogen limitation and to identify phenotypes of interest for strain engineering, particularly for the production of lipids and amino acid derivatives such as violacein.Thus, through an iterative approach, this work provides new insights into the interactions between regulation and metabolism in Y. lipolytica, conserved regulatory module in this yeast and contributes to the development of innovative integrative methods for computer-assisted strain design.

Succinat und ihre Derivate werden in vielfältiger Weise in den Bereichen Tenside, Lebensmittel, Pharmazeutika und Polymere angewendet. Aufgrund der derzeit kostenintensiven petrochemischen Synthese ist die aerobe nicht-konventionelle Hefe Yarrowia (Y.) lipolytica für die biotechnologische Succinatsynthese von großem Interesse. In der vorliegenden Arbeit wurde das Potential dieser Hefe für eine industrielle Succinatproduktion unter Betrachtung des Einflusses der enzymatischen Aktivitäten von Succinyl-CoA Synthetase und Pyruvat-Carboxylase auf die Succinatsynthese untersucht. Es wurde eine Steigerung der Succinatausbeute um 40 % durch die Erhöhung der Pyruvat-Carboxylase Aktivität um den Faktor 7-8 gemeinsam mit der Deletion des Gens der β Untereinheit der Succinyl-CoA Synthetase im genetisch veränderten Y. lipolytica Stamm H222-AK10 (mcPYC Δscs2) erzielt. Unter Verwendung von Glycerol als C-Quelle wurde eine Erhöhung der Succinatbildung der Transformande H222 AK10 im Vergleich zum Wildtyp von 5,1 ± 0,7 g/l auf 8,7 ± 1,6 g/l nachgewiesen. Die Raum-Zeit-Ausbeute dieses Hefestammes verdoppelte sich von 11,9 ± 1,3 mg/l*h auf 21,9 ± 2,5 mg/l*h. Eine Erhöhung der Sekretion organischer Säuren gelang hingegen nicht durch den alleinigen Verlust der Succinyl-CoA Synthetase Aktivität in den Stämmen H222-AK4 (scs1::URA3), H222-AK8 (scs2:.URA3) und H222-AK9 (scs1::URA3 Δscs2) oder durch die alleinige Aktivitätserhöhung der Pyruvat-Carboxylase in H222-AK1 (mcPYC). Des Weiteren wurde ein Y. lipolytica Stamm erzeugt, der durch die Überexpression der für die Succinyl-CoA Synthetase kodierenden Gene SCS1 und SCS2 charakterisiert ist. Die Transformande H222 AK2 (mcSCS1 mcSCS2) bildete unter den gleichen Kultivierungsbedingungen durchschnittlich 2 g/l weniger Succinat als der Wildtyp (5,1 ± 0,7 g/l). Auch die zusätzliche Erhöhung der Pyruvat-Carboxylase Aktivität um den Faktor 4 in der Transformande H222 AK3 (mcPYC mcSCS1 mcSCS2) konnte den negativen Effekt der erhöhten Gen-Dosen von SCS1 und SCS2 auf die Succinatsynthese nicht aufheben. Dementsprechend wurden für H222-AK3 eine Succinatausbeute von 3,1 ± 0,3 g/l bestimmt.:Inhaltsverzeichnis Abbildungsverzeichnis VI Tabellenverzeichnis IX Abkürzungsverzeichnis XI 1. Einleitung 1 1.1. Bernsteinsäure, Succinat 1 1.2. Succinat als Zwischenprodukt des Tricarbonsäurezyklus 3 1.2.1. Die Enzyme des TCC in Saccharomyces cerevisiae 5 1.2.2. Succinatbildung im TCC durch die Succinyl-CoA Synthetase 6 1.2.3. Pyruvat-Carboxylase 7 1.3. Succinat als Endprodukt des Glyoxylatzyklus 9 1.4. Biotechnologische Herstellung von Succinat 10 1.4.1. Succinatproduktion mit Actinobacillus succinogenes und Anaerobiospirillum succiniproducens 11 1.4.2. Succinatproduktion mit Corynebacterium glutamicum 12 1.4.3. Succinatproduktion mit Escherichia coli 12 1.4.4. Yarrowia lipolytica als potentieller Succinatproduzent 15 1.5. Yarrowia lipolytica 15 1.6. Zielstellung 18 2. Material und Methoden 20 2.1. Geräte 20 2.2. Chemikalien, Biochemikalien und Nukleinsäuren 21 2.2.1. Feinchemikalien 21 2.2.2. Enzyme 22 2.2.3. Verbrauchsmaterialien und Kitsysteme 23 2.3. Verwendete Plasmide 23 2.4. Konstruierte Plasmide 24 2.5. Oligonukleotide 25 2.6. Mikroorganismen 26 2.6.1. Escherichia coli 26 2.6.2. Yarrowia lipolytica 27 2.7. Kultivierung 27 2.7.1. Kultivierung von Escherichia coli 27 2.7.2. Kultivierung von Yarrowia lipolytica 28 2.8. Gentechnische Methoden 29 2.8.1. Genomische DNA-Isolierung 29 2.8.2. Agarose-Gelelektrophorese 29 2.8.3. Polymerase Kettenreaktion 30 2.8.4. Verdau der DNA mit Restriktionsendonukleasen 31 2.8.5. DNA-Aufreinigung 31 2.8.6. Plasmidisolierung aus Escherichia coli 31 2.8.7. Dephosphorylierung 31 2.8.8. Ligation 32 2.8.9. Transformation elektrokompetenter Escherichia coli Zellen 32 2.9. Plasmidkonstruktion 33 2.9.1. Konstruktion der Expressionskassette für die Überexpression des Pyruvat-Carboxylase kodierenden Gens 33 2.9.2. Konstruktion der Expressionskassetten für die Überexpression der Gene der α- und β-Untereinheit der Succinyl-CoA Synthetase 34 2.9.3. Konstruktion der Deletionskassette des für die α-Untereinheit der Succinyl-CoA Synthetase kodierenden Gens 35 2.9.4. Konstruktion der Deletionskassette des für die β-Untereinheit der Succinyl CoA Synthetase kodierenden Gens 36 2.9.5. Sequenzierung konstruierter Plasmide 36 2.10. Transformation von Yarrowia lipolytica Zellen 37 2.10.1. Transformation von Yarrowia lipolytica mittels der LiAc-Methode 37 2.10.1.1. Herstellung chemisch kompetenter Yarrowia lipolytica Zellen 37 2.10.1.2. Transformation chemisch kompetenter Hefezellen 37 2.10.2. Herstellung elektrokompetenter Yarrowia lipolytica Zellen 38 2.10.3. Elektrotransformation von Yarrowia lipolytica 38 2.11. Southern Blot 39 2.11.1. Transfer der DNA auf eine Nylonmembran 39 2.11.2. Sondenherstellung 39 2.11.3. Immunologische Detektion 40 2.11.4. Strippen der Southern Blot Membran 40 2.12. Biochemische Methoden 41 2.12.1. Ernte und Aufschluss der Hefezellen 41 2.12.2. Aktivitätsbestimmung der Citrat-Synthase 41 2.12.3. Aktivitätsbestimmung der Aconitase 41 2.12.4. Aktivitätsbestimmung der NADP-abhängige Isocitrat-Dehydrogenase 42 2.12.5. Aktivitätsbestimmung der NAD-abhängige Isocitrat-Dehydrogenase 42 2.12.6. Aktivitätsbestimmung der α-Ketoglutarat-Dehydrogenase 43 2.12.7. Aktivitätsbestimmung der Succinyl-CoA Synthetase 43 2.12.8. Enzymatische Mitochondrienpräparation 46 2.12.9. Aktivitätsbestimmung der Succinat-Dehydrogenase 47 2.12.10. Aktivitätsbestimmung der Fumarase 47 2.12.11. Aktivitätsbestimmung der Malat-Dehydrogenase 48 2.12.12. Aktivitätsbestimmung der Isocitrat-Lyase 48 2.12.13. Aktivitätsbestimmung der Pyruvat-Carboxylase 48 2.12.14. Proteinbestimmung 49 2.13. Mikroskopische Bestimmung der Zellmorphologie 49 2.14. Kultivierung 49 2.14.1. Bestimmung der optischen Dichte 50 2.14.2. Animpfen der Hauptkultur 50 2.14.3. Succinatproduktionsmedium 50 2.14.4. Kultivierung unter Thiaminlimitation 51 2.14.5. Kultivierung unter Stickstofflimitation 52 2.14.6. Bestimmung organischer Säuren mittels Ionenchromatographie 52 2.15. Bioinformatik 53 3. Ergebnisse 54 3.1. Überexpression des Pyruvat-Carboxylase kodierenden Gens 54 3.2. Überexpression der Succinyl-CoA Synthetase kodierenden Gene 58 3.2.1. Bestimmung der Succinyl-CoA Synthetase Enzymaktivität 61 3.2.2. Bestimmung der spezifischen Aktivität weiterer Enzyme 61 3.3. Überexpression der für die Pyruvat-Carboxylase und Succinyl-CoA Synthetase kodierenden Gene 63 3.3.1. Bestimmung der spezifischen Aktivitäten der Enzyme des TCC und der PYC sowie der ICL 66 3.4. Deletion der Succinyl-CoA Synthetase Gene 68 3.4.1. Bestimmung der Succinyl-CoA Synthetase Enzymaktivität 72 3.4.2. Bestimmung weiterer spezifischer Enzymaktivitäten 73 3.5. Überexpression des Gens der Pyruvat-Carboxylase gemeinsam mit der Deletion des Gens für die β Untereinheit der Succinyl-CoA Synthetase 74 3.5.1. Bestimmung der spezifischen Aktivitäten von Enzymen des TCC, sowie der PYC und ICL 76 3.6. Morphologische Veränderungen der Transformanden 78 3.7. Produktion organischer Säuren im Succinatproduktionsmedium 80 3.9.1 Bestimmung der PYC-, ICL- und SDH-Aktivitäten während der Kultivierung im Succinatproduktionsmedium 87 3.8. α-Ketoglutarat-, Pyruvat- und Fumaratproduktion unter Thiaminlimitation 90 3.9. Citrat- und Isocitratproduktion unter Stickstofflimitation 96 4. Diskussion 100 4.1. Auswahl einer geeigneten C-Quelle für die Succinatproduktion 101 4.2. Reduktion der Succinatproduktion von Yarrowia lipolytica 102 4.3. Genetische Veränderungen, für die kein Einfluss auf die Succinatproduktion von Yarrowia lipolytica nachgewiesen wurde 106 4.3.1. Überexpression des Pyruvat-Carboxylase kodierenden Gens 107 4.3.2. Deletion der Succinyl-CoA Synthetase Gene 108 4.4. Erhöhung der Succinatproduktion von Yarrowia lipolytica 112 4.5. Auswirkungen auf die Produktion anderer organischer Säuren 119 4.5.1. α-Ketoglutarat-, Pyruvat- und Fumaratproduktion unter Thiaminlimitation 119 4.5.2. Citrat- und Isocitratproduktion unter Stickstofflimitation 121 4.6. Morphologische Veränderungen 122 4.6.1. Koloniemorphologie 122 4.6.2. Zellmorphologie 124 Literaturverzeichnis 126