Esta tese foi conduzida para avaliar os efeitos da suplementação de diferentes enzimas exógenas e suas combinações em dietas milho e farelo de soja para frangos de corte. Dois experimentos (Exp.) de digestibilidade e um experimento de desempenho foram conduzidos utilizando um total de 2616 frangos de corte, machos Cobb 500. No Exp. 1, as aves foram alimentadas com uma ração basal milho-farelo de soja ou uma dieta com 60% da ração basal milho-soja + 40% de milho. Ambas dietas foram suplementadas com níveis crescentes de beta-xilanase [0, 50, 100, 150 e 200 unidades de β- xilanase fúngica (FXU)/kg de ração], distribuídas em 10 tratamentos com 8 repetições e 6 aves cada. O Exp. 2 consistiu do fornecimento de dietas milhosoja, formuladas com ou sem fitase [1000 unidades de fitase fúngica (FYT)/kg] e suplementadas com amilase [80 kilo-Novo unidades (KNU) de alfaamilase/ kg], xilanase (100 FXU/kg) ou a combinação de amilase + xilanase, em 6 tratamentos com 8 repetições e 7 aves cada. Nestes dois estudos foi utilizada a mesma formulação da ração basal milho-soja, mesmo milho e metodologia de análises. As aves foram avaliadas dos 14 aos 25 d, com coleta de excretas de 21 a 24 d e coleta de conteúdo ileal aos 25 d. Por fim, o Exp. 3 foi realizado para avaliar o desempenho de frangos de corte e a biodisponibilidade da energia até 40 d. Foram utilizados os mesmos produtos enzimáticos, e estes foram suplementados na mesma quantidade dos estudos anteriores. Não foram observadas interações entre xilanase e as dietas no Exp. 1 ou entre carboidrases e fitase no Exp. 2. A utilização da energia e a digestibilidade da proteína bruta e matéria seca aumentaram (P < 0,05) com a suplementação de 100 FXU/kg de xilanase em dietas milho-soja. Frangos de corte alimentados dos 14 aos 25 d com dietas formuladas com fitase ou suplementadas com amilase + xilanase tiveram maior ganho de peso (P < 0,05) e menor conversão alimentar (P < 0,05), quando comparados aos frangos que receberam dietas sem carboidrases de 14 a 25 d. A EMAn e a digestibilidade do amido no jejuno e no ileo aumentaram (P < 0,05), respectivamente, em 99 kcal/kg, 3,5% e 2,4% quando os frangos receberam dietas suplementadas com amilase + xilanase. No Exp. 3, no período de 1 a 40 d, a EMAn estimada para GP foi 99, 83 e 136 kcal/kg e para CA foi 40, 26 e 42 kcal/kg, respectivamente para amilase, xilanase e amilase + xilanase. Resultados destes experimentos mostraram que dietas milho-soja formuladas com fitase e suplementadas com xilanase, amilase e amilase + xilanase resultaram em melhor desempenho produtivo e maior EMAn e digestibilidade do amido para frangos de corte. / This thesis was conducted to evaluate effects of different exogenous enzyme supplementation and its combinations in corn-soybean meal diets for broilers. Two experiments (Exp.) of digestibility and one experiment of performance were done using a total of 2,616 Cobb 500 male broiler chickens. In Exp. 1, birds were fed a corn-soy basal diet or a diet with 60% corn-soy basal + 40% corn. Both diets were supplemented with increasing levels of beta-xylanase [0, 50, 100, 150, and 200 fungal β-xylanase units (FXU)/kg of feed], distributed in 10 treatments with 8 replications and 6 birds each. The Exp. 2 consisted of corn-soy diets formulated without or with phytase [1,000 fungal phytase units (FYT/kg)] and supplemented with amylase [80 kilo- Novo α-amylase units (KNU)/kg] or the combination of amylase + xylanase, to 6 treatments with 8 replications and 7 birds each. In these two studies, the same corn-soy basal diet was formulated and the same corn and methodology analysis were used. Birds were evaluated from 14 to 25 d, with excreta collection from 21 to 24 d and ileal content collection at 25 d. Finally, the Exp. 3 was done to evaluate broiler growth performance and energy equivalency until 40 d. The same enzyme products supplemented at the same amount of earlier studies were used. No interactions were found between xylanase and diets in Exp. 1 or between carbohydrases and phytase in Exp. 2. Energy utilization and digestibility of crude protein and dry matter increased (P < 0.05) with 100 FXU/kg xylanase supplementation in corn-soy diets. Broilers fed diets from 14 to 25 d formulated whit phytase or supplemented with amylase + xylanase had higher body weight gain (P < 0.05) and lower feed conversion rate (P < 0.05) when compared to broilers fed diets without carbohydrases. The AMEn and starch digestibility in jejum and ileum increased (P < 0.05), respectively by 99 kcal/kg, 3.5% and 2.4% when broilers were fed diets supplemented with amylase + xylanase. In Exp. 3, from 1 to 40 d, AMEn estimated for BWG was 99, 83, and 136 kcal/kg and for FCR was 40, 26, and 42 kcal/kg, respectively for amylase, xylanase, and amylase + xylanase. Results from these experiments show that corn-soy diets having phytase and supplemented with xylanase, amylase, and amylase + xylanase led to improved growth performance, and increased AMEn and starch digestibility in broiler chickens.

O pão é um dos alimentos mais consumidos na dieta humana, estando presente na mesa de diferentes povos e classes sociais. Além do seu aspecto apetitoso, o pão apresenta importante valor nutricional, uma vez que é fonte de carboidratos, proteínas, vitaminas e sais minerais. Na medida em que a panificação se estendeu do processo artesanal para a escala industrial, a utilização de agentes melhoradores de farinha vem se ampliando em função da necessidade de melhorar as características de processo e a vida útil dos produtos obtidos. Durante décadas, enzimas foram adicionadas à farinha na produção de pães com a finalidade de melhorar seu volume, sabor, aroma, estrutura da casca e do miolo, maciez e vida-deprateleira. O presente trabalho teve como objetivo avaliar a influência da adição de enzimas na qualidade de pães brancos e pães ricos em fibras através do uso de associações enzimáticas de transglutaminase, xilanase e amilase. Foram preparadas 17 formulações para cada tipo de pão, com diferentes concentrações das enzimas, de acordo com o planejamento experimental 23 e para análise foi utilizada a metodologia de superfície de resposta. As etapas básicas da produção dos pães foram: pesagem e amassamento; divisão, boleamento e descanso; modelagem; fermentação; forneamento e resfriamento. As farinhas com a adição da associação enzimática e padrão foram submetidas às análises de umidade, cinzas, teor de glúten, cor, absorção de água, estabilidade, elasticidade e extensibilidade. Todas as 17 formulações e a formulação padrão para pão branco e pão rico em fibra foram analisadas sensorialmente, através da Análise Descritiva Quantitativa (ADQ), e físico-quimicamente, através das análises de umidade, cinzas, textura, cor, altura das fatias e volume específico. Os resultados obtidos no presente trabalho mostraram que a adição destas enzimas não é necessária para se ter um pão com boa qualidade e com características exigidas pelos consumidores. Observou-se que o efeito da associação das três enzimas testadas não foi significativo, pois na maioria das características avaliadas o melhor resultado foi o apresentado na amostra padrão, sem adição de enzimas. / Bread is one of the most consumed foods in the human diet. It is found on the table of people from different cultures and social classes. Besides its appetizing aspect, bread also presents important nutritional value, since it is a source of carbohydrates, proteins, vitamins and mineral salts. As bread-making has gone from the handmade process to the industrial scale, the usage of bread enhancements has increased in order to attend the necessity of improving process’s characteristics and lifespan of the obtained product. Throughout many decades, enzymes were added to the flour during bread’s production with the objective of increasing its volume, taste, aroma, crust’s and crumb’s structure, softness and lifespan. The present work is proposed to evaluate how the addition of enzymes can influence on the quality of white and wholemeal bread through the use of enzymatic associations of transglutaminase, xylanase and amylase. 17 formulations have been prepared for each type of bread, each one with different enzyme concentrations, according to the experimental planning 2³. The methodology used for the analysis was the Response Surface Methodology – RSM. The basic steps of production were: weighing and kneading; dividing, ball making and resting; molding; fermenting; baking and cooling. Both the standard flours and the ones with the addition of enzymatic associations were submitted to humidity, ashes, gluten level, color, water absorption, stability, elasticity, and extensibility analysis. All 17 formulations and the standard formulation for white bread and wholemeal bread have been submitted to sensorial evaluation using Quantitative Descriptive Analysis. They have also been physically and chemically tested through the analysis of humidity, ashes, texture, color, height of the slices and specific volume. The results obtained from this research proved that the addition of those enzymes is not necessary in order to make good quality bread with characteristics demanded by its consumers. It has been observed that the effect of the association of the 3 tested enzymes was not significant. The standard sample - free of enzyme addition - presented the best results for most of the evaluated characteristics.

Submitted by Alisson Mota (alisson.davidbeckam@gmail.com) on 2015-07-10T19:10:27Z No. of bitstreams: 1 Tese - Cynara da Cruz Camo.pdf: 966382 bytes, checksum: a67fb541e220aa0f3c790fac1deff0db (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2015-07-10T20:15:05Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Tese - Cynara da Cruz Camo.pdf: 966382 bytes, checksum: a67fb541e220aa0f3c790fac1deff0db (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2015-07-10T20:19:36Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Tese - Cynara da Cruz Camo.pdf: 966382 bytes, checksum: a67fb541e220aa0f3c790fac1deff0db (MD5) / Made available in DSpace on 2015-07-10T20:19:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese - Cynara da Cruz Camo.pdf: 966382 bytes, checksum: a67fb541e220aa0f3c790fac1deff0db (MD5) Previous issue date: 2011-09-28 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Pycnoporus sanguineus are excellent decomposers of organic matter, presenting important role in its habitat. In this study, a strain of Pycnoporus sanguineus isolated from soil of rural area of Parintins, Amazonas, Brazil, was grown on solid medium of malt, 35 0C for 8 days to obtain a pure culture and malt liquid medium plus 2% glucose and 120 rpm for a period of 10 days to produce the enzyme xylanase, β-xylosidases, β-glucosidase, CMCase, and laccase avicelase. Among these enzymes, the production of xylanase was evaluated and the enzyme was partially purified and characterized. Optimum yield was obtained at pH 6.5 at 35 °C, 120 rpm and 196h of cultivation. The culture filtrate (200 mL), obtained under the conditions optimized in the previous steps, was precipitated at 70% ammonium sulfate and centrifuged for 60 min at 4 0C and rotation of 4000 rpm. One mL of the fraction precipitated in which xylanolytic activity was detected, was filtered using a filter Millex GV 0.22 micrometre (Durapore Membrane PYDF) and subsequently injected into a chromatograph type AKTA Purifier UPC 900, 5:11 UNICORN system, using an anion exchange column HiTrap SP XL 1 mL capacity, equilibrated in 50 mM Tris-HCl pH 7.4. The degree of purity, the fractions that showed xylanase activity, as well as their protein profiles were analyzed by electrophoresis on SDS-PAGE (12% polyacrylamide), where the molar mass of 39.44 kDa was determined. The optimal conditions for enzyme activity were 75 °C and pH 8.0. The thermal stability of the xylanase enzyme from P. sanguineus was partially purified high 65 to 85 ºC, being more stable 75 0C. The stability at different pHs was high between 4.5 and 8.8. With birchwood xylan (2.0 to 50 mg / mL), the Km value of the enzyme was 0.32786 mg / ml, and the Vmax value was 12.70648 mol min-1 mL-1 when the reaction was performed at 75 °C and pH 8.0. These results indicate the possible use of this enzyme complex industrial processes that require the use of xylanases at alkaline pH and high stability in different pHs and high temperatures. / Pycnoporus sanguineus são excelentes degradadores de matéria orgânica, apresentando importante papel em seu habitat. No presente trabalho, uma linhagem de Pycnoporus sanguineus isolada do solo de área rural do Município de Parintins, Amazonas, Brasil, foi cultivada em meio sólido de malte, a 350C, por 8 dias, para obtenção da cultura pura e meio líquido de malte acrescido de 2% de glicose e 120 rpm por um período de 10 dias para produção das enzimas xilanase, β-xilosidase, β-glicosidase, CMCase, avicelase e lacase. Entre essas enzimas, a produção de xilanase foi avaliada e a enzima foi parcialmente purificada e caracterizada. Produção ótima foi obtida em pH 6,5 a 35 °C, 120 rpm e 196h de cultivo. O filtrado de cultura (200 mL), obtido nas condições otimizadas nas etapas anteriores, foi precipitado a 70% de sulfato de amônia e centrifugado por 60 minutos a 40C e rotação de 4 000 rpm. Um mL da fração precipitada na qual detectou-se atividade xilanolítica, foi filtrado utilizando um filtro Millex GV 0,22μm (durapore PYDF Membrane) e posteriormente injetada em um cromatógrafo tipo AKTA Purifier UPC 900, sistema UNICORN 5.11; utilizando uma coluna de troca aniônica HiTrap SP XL, capacidade 1mL, previamente equilibrada no tampão Tris-HCl 50mM pH 7,4. O índice de pureza, das frações que apresentaram atividade xilanase, bem como seus perfis protéicos, foram analisadas eletroforeticamente em PAGE-SDS (12% de poliacrilamida), onde a massa molar determinada foi de 39,44 kDa. As condições ótimas para atividade da enzima foram 75 °C e pH 8,0. A estabilidade térmica da enzima xilanase de P. sanguineus parcialmente purificada foi alta de 65 a 85ºC, sendo mais estável a 750C. A estabilidade em diferentes pHs foi alta entre 4,5 e 8,8. Com xilano de birchwood (2,0 a 50 mg/mL), o valor de Km da enzima foi de 0,32786 mg/ml, e o valor de Vmax foi de 12,70648 μmol min-1 mL-1 quando a reação foi realizada a 75ºC e pH 8,0. Esses resultados indicam o possível emprego desse complexo enzimático em processos industriais que requeiram o uso de xilanases em pH alcalino e alta estabilidade em diferentes pHs e altas temperaturas.

Submitted by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2016-09-01T14:42:20Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Danielle Pires Nogueira - 2016.pdf: 2016091 bytes, checksum: eb50931397d77906f88aaeec4a5fa5d0 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2016-09-01T14:42:33Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Danielle Pires Nogueira - 2016.pdf: 2016091 bytes, checksum: eb50931397d77906f88aaeec4a5fa5d0 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-01T14:42:33Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Danielle Pires Nogueira - 2016.pdf: 2016091 bytes, checksum: eb50931397d77906f88aaeec4a5fa5d0 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2016-04-18 / Due to the recent research for new fuels from renewable sources ethanol has been gaining momentum, because it can be produced from diverse raw materials, such as agro-industrial residues. The objective with this work was to study the production of reducing sugar by dilute acid, and enzymatic hydrolysis of the orange bagasse from juice industry. The orange bagasse was collected, cut into pieces, and crushed. Granulometry, and the contents of moisture, ashes, holocellulose, cellulose, hemicelulose, soluble and insoluble lignin were determined. The pre-treatment was done with calcium hydroxide following what was previously tested by Silva et al. (2013). A pre-test of the enzymes combination was done using 2 g of pre-treated biomass, in dry base, using 3 FPU/mL of cellulase, and 0 U/g and 3 U/g of xylanase. For the hydrolysis two central composite factorial 2³ designs were done, with the answer in total reducing sugars (ART). For the dilute acid hydrolysis the factors were HCl concentration, temperature, and time, and for the enzymatic the concentrations of cellulase and xylanase and time. The granulometry showed that 47.75% of the biomass with diameter over 0.833 mm, 32.84% of the biomass with an average diameter of 0.564 mm, and 19.41% of the biomass with diameter under 0.295 mm. The moisture content prior to drying was 84.69% and 7.38%, the ashes content was 3.79%. The cellulose content was 22.90% and the hemicellulose was 3.39%. The lignin content was 9.90%. The reducing sugar results for the acid hydrolysis varied from 9.32±0.68 mg ART per g of biomass to 30.15±0.31 mg ART per g biomass, the most significant factor was temperature, and the least was time. It was not possible to find the optimum region with the studied factors. The reducing sugar results for the enzymatic hydrolysis varied from 75.33±3.82 mg ART per g biomass to 99.66±0.62 mg ART per g biomass, the most significant factor was the cellulase concentration, and the least significant the xylanase concentration. The studied factors did not show the optimum region to maximize the reducing sugars content. The enzymatic hydrolysis produced larger concentrations of reducing sugars than the acid hydrolysis. / Frente as recentes buscas por novos combustíveis de fontes renováveis o etanol de segunda geração tem ganhado força, por poder ser produzido a partir de diversas matérias primas lignocelulósicas, como os resíduos agroindustriais. Objetivou-se com este trabalho estudar a geração de açúcares redutores por hidrólises ácida diluída e enzimática do bagaço de laranja proveniente da indústria de suco. O bagaço de laranja foi coletado, cortado, seco e moído. Granulometria, umidade, cinzas, concentrações de holocelulose, celulose, hemicelulose e lignina solúvel e insolúvel foram determinadas. O pré-tratamento foi realizado com hidróxido de cálcio de acordo com o previamente testado por Silva et al. (2013). Foi realizado um pré-teste da combinação das enzimas. Para as hidrólises foram feitos dois planejamentos fatoriais do tipo composto central 2³, com resposta em açúcares redutores totais (ART). Para a hidrólise ácida diluída os fatores estudados foram concentração de HCl, temperatura e tempo de hidrólise, na enzimática as concentrações de celulase e hemicelulase e o tempo. Na análise granulométrica encontrou-se 47,75% da biomassa com diâmetro superior a 0,833 mm, 32,84% de biomassa com diâmetro médio de 0,564 mm e 19,41% com diâmetro inferior a 0,295 mm. A umidade da biomassa antes da secagem foi de 84,69%, depois da secagem de 7,38% e as cinzas 3,79%. O conteúdo de celulose foi de 22,90% e o de hemicelulose 3,39%. O conteúdo de lignina foi de 9,90%. Houve uma perda de massa média de 30,03% no pré-tratamento. O pré-teste indicou um efeito positivo na combinação das enzimas para geração de açúcares redutores. Os resultados de açúcares redutores da hidrólise ácida variaram de 9,32±0,68 mg ART por g de biomassa a 30,15±0,31 mg ART por g biomassa, o fator mais significativo foi a temperatura e o menos o tempo, não foi possível encontrar a região ótima com os fatores estudados. Os resultados de açúcares redutores da hidrólise enzimática variaram de 75,33±3,82 mg ART por g biomassa a 99,66±0,62 mg ART por g biomassa, o fator mais significativo foi a concentração de celulase e o menos a concentração de xilanase. Com os fatores estudados não foi possível encontrar a região ótima de geração de açúcares redutores. A hidrólise enzimática gerou maiores concentrações de açúcares redutores que a hidrólise ácida.

A dinâmica estrutural fundamentando a função das xilanases GH11 ainda não está clara. Novo conhecimento sobre a dinâmica catalítica dessas enzimas é crucial para a engenharia de novas enzimas melhoradas beneficiando, assim, diversas indústrias biotecnológicas e de química verde. Com base nesse fato, esse trabalho teve por objetivo obter novas informações acerca da dinâmica catalítica de uma xilanase GH11, através do uso de um conjunto de diversas técnicas avançadas de biofísica molecular em nível bulk e em nível de molécula única (inglês single molecule ou sm). Para isso, foram projetadas xilanases GH11 de Bacillus subtilis ssp. subtilis 168 (XynA) com mutações únicas de cisteína para a marcação dos resíduos D119 e R122 no domínio polegar, do resíduo N54 no domínio dedos, e do resíduo N151 na alfa-hélice, seguidas pela sua construção e produção por métodos de biologia molecular. Esses mutantes foram marcados em seus respectivos grupos tióis com a sonda fluorescente sensível à polaridade Acrylodan, com a sonda de spin MTSSL, e com a sonda fluorescente fotoestável AttoOxa11. A xilanase tipo selvagem for marcada em seu N-terminal com a sonda fotoestável Alexa Fluor® 488 5-SDP Ester. Foram utilizados ensaios de espectrofotometria de fluorescência em nível bulk e de espectroscopia de ressonância paramagnética eletrônica para investigar como a dinâmica do domínio polegar da xilanase GH11, temperatura, e ligação ao substrato se correlacionam um com o outro. Os resultados atestaram que um estado do domínio polegar controlado por temperatura, aberto, dinâmico e flexível tem mais chances de se ligar efetivamente ao substrato de uma maneira produtiva, o que está em completo acordo com estudos anteriores de simulação de dinâmica molecular, cristalografia, desnaturação térmica, e análise funcional por desenho racional de mutantes de domínio polegar de xilanases GH11. Com base nas evidências adquiridas e em estudos anteriores, nós propomos um conjunto de hipóteses e modelos para a dinâmica catalítica da xilanase, focando no papel do domínio polegar nesse processo. No intuito de determinar a constante de afinidade da xilanase por seu substrato e os tempos de relaxamento e constantes de velocidade dos movimentos do domínio polegar, foram feitas medidas de espectroscopia de correlação de fluorescência simples e combinada com transferência eletrônica fotoinduzida, usando as xilanases marcadas com as sondas fluorescentes fotoestáveis, na presença e na ausência de substrato. Os resultados mostraram tempos de difusão muito maiores para as xilanases na presença de substrato, como efeito da afinidade da enzima pelo mesmo. Entretanto, não foi verificada nenhuma curva de decaimento como efeito de supressão dinâmica da sonda por PET. Esses mesmos conjugados foram aplicados com sucesso em microscopia por imagem de tempo de vida de fluorescência, no intuito de analisar sistematicamente a afinidade da xilanase por partículas insolúveis e filmes de substrato, e por fragmentos insolúveis de frações de processos de deslignificação e desestruturação de bagaço de cana-de-açúcar, assim como para a análise da composição, estrutura e topologia desses materiais. Foi possível verificar a presença de xilano na maioria das frações desse bagaço tratado, mas em quantidades variáveis / The structural dynamics underlying the function of GH11 xylanases is still unclear. New insights into the catalytic dynamics of these enzymes are crucial for engineering novel improved enzymes benefiting biotechnological and green chemistry industries. The objective of this work was to obtain new information concerning the catalytic dynamics of a GH11 xylanase, by using a combination of advanced molecular biophysics techniques, both at the bulk level and at the single molecule level (sm). Mutant GH11 xylanases from Bacillus subtilis ssp. subtilis 168 (XynA) were designed with single point cysteine mutations for labeling the residues D119 and R122 on the thumb domain, N54 on the fingers domain, and N151 on the alpha helix, followed by their construction and production by molecular biology methods. These mutants were labeled at their respective thiol groups by the polarity sensitive fluorescent probe Acrylodan, by the electron spin probe MTSSL, and by the photostable fluorescent probe AttoOxa11. The wild-type xylanase was labeled at its N-terminus by the photostable fluorescent probe Alexa Fluor® 488 5-SDP Ester. Bulk fluorescence spectrophotometry and electron paramagnetic resonance assays were used to investigate how the thumb domain dynamics of the GH11 xylanase, temperature and substrate binding were correlated. These results demonstrated that a temperature controlled, open, dynamical and flexible thumb domain state is more likely to effectively bind the substrate in a productive way, which is in complete agreement with previous studies from molecular dynamics simulations, crystallography, thermal denaturation, and function analysis by the rational design of thumb mutants for GH11 xylanases. Based on this evidence and previous studies, we proposed a hypothesis for the xylanase catalytic dynamics, focusing on the role of the thumb domain. In order to determine the xylanase affinity constant for its substrate and the relaxation times and rate constants of the thumb domain movements, fluorescence correlation spectroscopy measurements were performed. Both simple and combined measurements with photoinduced electron transfer were performed, using the xylanases labeled with photostable fluorescent probes, in the presence and absence of substrate. The results have shown longer diffusion times for the xylanases in the presence of substrate, as an effect of the enzyme affinity for it. However, it was not verified any decay curve as an effect of the dynamic suppression of the probe via PET. The same conjugates were successfully applied to fluorescence-lifetime imaging microscopy, aiming to systematically analyze the affinity for xylanase of substrates in the form of insoluble particles and films, and for water insoluble fractions from sugarcane bagasse delignification processes. In addition, the composition, structure and topology of these materials was examined. It was possible to verify the presence of xylan in most fractions of this treated bagasse, although in variable quantities

As dietas de vacas em lactação são compostas principalmente por carboidratos que não estão totalmente disponíveis para fermentação microbiana no rúmen, o que pode ser um fator crítico para a obtenção de energia em ruminantes. O objetivo do presente estudo foi avaliar o efeito da adição de enzima fibrolítica (Fibrozyme&reg;, Alltech Inc., Springfield, KY) e amilolítica (Amaize, Alltech Inc., Springfield, KY) nas dietas sobre o consumo de nutrientes, índice de seleção de partículas, digestibilidade aparente total, fermentação ruminal, metabolismo de nutrientes, produção e composição do leite de vacas em lactação. Para o experimento, 32 vacas multíparas da raça Holandesa com 181.3 &#177; 35.3 (média &#177; SD) dias em lactação (DEL), 571 &#177; 72.7 kg de peso vivo (PV) e 29.6 &#177; 5.24 kg/d de produção de leite (PL), foram distribuídas em 8 quadrados Latinos 4×4. Os tratamentos foram obtidos por esquema fatorial 2×2 pela combinação de enzima fibrolítica e amilolítica, como segue: 1) Controle (CONT): dieta basal sem adição de enzimas exógenas; 2) Enzima fibrolítica (FIB): dieta basal com adição de 1 g/kg de Fibrozyme&#177; no concentrado da dieta (51 UI de atividade xilanase/kg de matéria seca (MS) da dieta; Alltech, Nicholasville, KY, USA; batch#: 417990-2); 3) Enzima amilolítica (AMI): dieta basal com adição de 0,66 g/kg de Amaize no concentrado da dieta (203 FAU/kg MS da dieta; Alltech Nicholasville, KY, USA; batch: 432715-1); e 4) FIB+AMI: adição de 1 e 0,66 g/kg de Fibrozyme® e Amaize, respectivamente. As enzimas foram aplicadas para atender um consumo de 12 g/dia de Fibrozyme&reg; e 8 g/dia de Amaize, de acordo com as recomendações do fabricante. A enzima foi adicionada ao concentrado durante a preparação na fábrica de ração (toda semana). Não foram observados efeitos das enzimas sobre o consumo e digestibilidade dos nutrientes. Contudo, houve efeito de interação entre FIB e AMI para o consumo de partículas entre 19 e 8 mm. A enzima amilolítica aumentou o consumo de partículas entre 19 e 8 mm nos animais que não recebiam FIB. Além disso, AMI reduziu o consumo de partículas maiores que 19 mm. Outro efeito observado foi a interação entre FIB e AMI sobre a concentração de butirato ruminal. A enzima amilolítica aumentou a concentração de butirato apenas nos animais tratados com FIB. Houve tendência de interação entre enzimas sobre a excreção de nitrogênio (N) no leite, em que FIB reduziu a excreção de N no leite apenas nos animais não tratados com AMI. Ainda, AMI reduziu a excreção de N na urina. Ainda, houve interação entre os efeitos de enzima fibrolítica e amilolítica sobre a concentração de colesterol e a atividade enzimática da aspartato aminotransferase (AST) e gama glutamiltransferase (GGT). A enzima fibrolítica reduziu a concentração de colesterol e aumentou a atividade da enzima GGT nos animais não tratados com enzima amilolítica. No entanto, a enzima amilolítica aumentou a concentração de colesterol e a atividade da AST nos animais alimentados com enzima fibrolítica. Houve interação entre enzimas exógenas sobre a produção de proteína e lactose no leite. A enzima fibrolítica reduziu a produção de proteína e lactose nos animais não alimentados com AMI. Não houve mudanças na produção de leite com a suplementação de enzimas exógenas. Em nosso estudo foram encontrados efeitos no consumo de partículas, fermentação ruminal, excreção de N e mudanças na composição do leite, contudo não foram observadas alterações no desempenho produtivo dos animais. / Lactating cows diets are comprised mostly of carbohydrates which are not fully available for microbial fermentation in the rumen, critical factor for to obtain energy in ruminants. The aimed of this study was to evaluate the effect of fibrolytic enzyme (Fibrozyme&reg;, Alltech Inc., Springfield, KY) on nutrient intake, sorting index, total tract digestion, ruminal fermentation, nitrogen utilization, metabolic profile, milk yield and composition in diets with or without amylolytic enzyme (Amaize, Alltech Inc., Springfield, KY) of mid-lactating dairy cows. Thirty-two multiparous Hostein cows with 181.3 &#177; 35.3 (mean &#177; SD) days in milk (DIM), 571 &#177; 72.7 kg of body weight (BW) and 29.6 &#177; 5.24 kg/d of milk yield, were blocked and randomly allocated to a sequence of treatments in a 4 × 4 Latin square experimental design. Treatments were obtained in a 2 × 2 factorial arrangement, as follows: 1) Control (CONT), basal diet without exogenous enzymes; 2) Fibrolytic enzyme (FIB), provision of Fibrozyme&reg; (batch#: 417990-2; Alltech, Nichollasvile, KY) at 1 g/kg of concentrate (51 IU of xylanase activity/kg diet DM); 3) Amylolytic enzyme (AMY), provision of AmaizeTM (batch#: 432715-1; Alltech) at 0.66 g/kg of concentrate (203 FAU/kg diet DM); and 4) Fibrolytic enzyme plus amylolytic enzyme (FIB+AMY), enzymes added at the same rate in FIB and AMY treatments. The enzymes were applied to meet the intake of 12 and 8 g/cow/day of Fibrozyme&reg; and AmaizeTM, respectively. Enzymes products were added to concentrate during its preparation (once a week). Enzymes no effects on intake and digestibility of nutrients. However, there was FIB and AMY interaction effect on selection index of particle size between 19 and 8 mm. Amylolytic enzyme increase selection index of particles with 19 and 8 mm, only treatments without FIB. Furthermore, AMY decreased the sorting for feed with particle size greater than 19 mm. There was FIB and AMY interaction effect on butyric acid concentration. Amylolytic enzyme increased on butyrate concentrations in cows treated with fibrolytic enzyme. Fibrolytic and amylolytic enzyme interaction effect tended on N excreted in milk, in which FIB decrease N excreted in milk only on animals non-treated with AMY. Whereas AMY reduced urinary N excretion. There was interaction effects of fibrolytic and amylolytic enzymes on cholesterol concentration and the enzymatic activity of AST and GGT. The fibrolytic enzyme reduced cholesterol concentration and increased GGT enzyme activity in animals not treated with amylolytic enzyme. There was FIB and AMY interaction effect on lactose and protein production. Fibrolytic enzyme decreased lactose and protein production, only on animals non-treated with AMY. Exogenous enzymes had no impact on milk production of dairy cows. Enzymes exogenous affected on particle size greater, ruminal fermentation and milk composition. This study did not show evidences that fibrolytic and amylolytic enzymes can alter total tract nutrient digestibility and performance of mid-lactating cows.

Orientadores: Florencia Cecilia Menegalli, Franciele Maria Pelissari Molina / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-25T00:00:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tibolla_Heloisa_M.pdf: 30429584 bytes, checksum: 643238deef75b3825c3b74575e11f722 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: A presente dissertação objetivou estudar o potencial da técnica de hidrólise enzimática na produção de nanofibras de celulose (NFCs) a partir da casca de bananas verdes da variedade "Terra" (Musa paradisiaca). Na primeira etapa do trabalho, o farelo da casca da banana foi caracterizado com base em suas propriedades físico-químicas, funcional e estrutural. Na segunda etapa, testou-se combinações de tratamentos (químico, hidrólise enzimática e tratamento mecânico) para isolar nanofibras de celulose. Na terceira etapa do trabalho avaliou-se a influência das condições de processo (pH, temperatura, concentração de enzima e concentração de substrato) na hidrólise enzimática com xilanase. Os experimentos foram realizados empregando-se um planejamento fatorial fracionado 24-1 com três pontos centrais. As NFCs foram caracterizadas quanto ao diâmetro, distribuição do comprimento, potencial zeta, grupos funcionais por FTIR, cristalinidade por difração de raios-X (DRX), concentração de NFCs produzidas e característica morfológica por microscopia eletrônica de transmissão (MET). A quarta e última etapa, foi realizada com o intuito de estudar a adição de mais uma hidrólise enzimática, usando o complexo celulolítico, na produção de NFCs. O farelo apresentou uma estrutura irregular, com teor de celulose de 7,5% e índice de cristalinidade de 15%. A presença de componentes amorfos (hemicelulose e lignina) foi constatada no farelo através da análise de grupos funcionais. Como resultados da segunda etapa, foram obtidas partículas de celulose em dimensões micro e nanométricas, evidenciando que o tratamento com potencial para produzir NFCs foi o branqueamento do farelo com KOH 5%, hidrólise enzimática com xilanase e celulase e após, desintegração das fibrilas com homogeneização mecânica, obtendo-se partículas com diâmetro médio de 14,9 nm. Na terceira etapa da pesquisa, as imagens da microscopia confirmaram que o tratamento com a enzima xilanase foi eficaz no isolamento de fibras de celulose na escala nanométrica. O diâmetro médio apresentado pelas mesmas foi de 8,8 nm. Em água neutra, as suspensões de nanofibras apresentaram potencial zeta alto e negativo, na faixa de -22,8 e -29,5, o que minimiza as interações que levam à formação de agregados de nanofibras, colaborando para a formação de uma suspensão coloidal mais estável. O índice de cristalinidade do farelo foi de 15,0% e das nanofibras variou entre 48,5 e 61,0%, demonstrando que o tratamento utilizado promoveu a remoção das frações amorfas. Os resultados obtidos a partir do planejamento fatorial mostrou que a enzima xilanase opera sobre o isolamento do NFCS em uma ampla faixa de condições do processo, dentro do intervalo de estudo. Os resultados encontrados na quarta etapa demonstraram que as cadeias de celulose das nanofibras foram reduzidas à monômeros de açúcares, principalmente glicose, visto que o complexo celulolítico atua de forma sinérgica na degradação total da celulose. O farelo da casca de banana é um resíduo agroindustrial com potencial uso para produção de nanopartículas. A hidrólise enzimática com xilanase mostrou-se ser uma técnica promissora na produção de nanofibras de celulose com alto desempenho como material de reforço em compósitos, sendo desnecessária a realização de um tratamento com a enzima celulase / Abstract: This dissertation aimed to study the potential use of the technique of enzymatic hydrolysis in the production of cellulose nanofibers (CNFs) from peel unripe bananas of the variety "Terra" (Musa paradisiaca). In the first stage of the work, the bran of the peel banana was characterized on the basis of their physicochemical, structural and functional properties. In the second stage, to isolate cellulose nanofibers, we tested combination of treatments (chemical, enzymatic hydrolysis and mechanical treatment). In the third stage of the study was evaluate the influence of process conditions (pH, temperature, enzyme concentration and substrate concentration) on enzymatic hydrolysis with xylanase. The experiments were performed employing a fractional factorial design 24-1 with three center points. The NFCS were characterized by diameter, length distribution, zeta potential, functional groups by FTIR, crystallinity by X-rays diffraction (XRD) and morphology features by transmission electron microscopy (TEM). The fourth and final stage was performed in order to study the efficiency of further enzymatic hydrolysis using cellulolytic complex to produce NFCS. The bran presented an irregular structure, with amount of cellulose of 7.5% and the crystallinity index of 15%. The presence of amorphous components (hemicellulose and lignin) was noted in the bran by functional groups analysis. As a result of the second stage, cellulose particles in micro and nanometric dimensions were obtained, indicating that the treatment with the potential to produce NFCS was bleaching bran with KOH 5%, enzymatic hydrolysis with cellulase and xylanase and after mechanical homogenization for disintegration of the fibrils, yielding particles with an average diameter of 14.9 nm. In the third step of research, the images of the microscope confirmed that the treatment with enzyme xylanase was effective in the isolation of cellulose fibers in the nanoscale. The average diameter presented by the same was 8.8 nm. In neutral water, suspensions of nanofibers showed high and negative zeta potential in the range of -22.8 and -29.5, which minimizes the interactions that lead to the formation of aggregates of nanofibers, contributing to the formation of a colloidal suspension more stable. The crystallinity index of the bran was 15.0% and the nanofibers was between 48.5 and 61.0%, demonstrating that the treatment promoted the removal of the amorphous fractions. Results obtained from the factorial design showed that xylanase enzyme operates on the isolation of the NFCS in a wide range of process conditions, within the evaluated range. The results found in the fourth step showed that the cellulose chains of the nanofibers were reduced to monomers sugars, especially glucose, since the cellulolytic complex acts synergistically in overall degradation of cellulose. The bran banana peel is an agricultural waste with potential use for production of nanoparticles. The enzymatic hydrolysis with xylanase was shown to be a promising technique for producing cellulose nanofibers with high performance as reinforcing material in composites, due to its ability to make it unnecessarily performing a treatment with cellulase enzyme, which was detrimental to the formation of NFCS / Mestrado / Engenharia de Alimentos / Mestra em Engenharia de Alimentos

Orientadores: Francisco Maugeri Filho, Gonçalo Amarante Guimarães Pereira / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-25T00:15:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Andrade_CristianeContePaimde_D.pdf: 8118229 bytes, checksum: e37327c8c0a8a32ecfc89552e46cbd0d (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: Xilanases são enzimas que hidrolisam as ligações glicosídicas entre as unidades de xilose que compõem a xilana, o principal constituinte hemicelulósico. Devido à grande disponibilidade desse tipo de material na natureza, as xilanases podem ser empregadas em diversos ramos, como nas indústrias têxtil, de alimentos e de rações, na bioconversão de resíduos lignocelulósicos, no clareamento de papel e polpa, e no tratamento de resíduos. Visando descrever novas enzimas para futuras aplicações, este trabalho teve como objetivo purificar e caracterizar a xilanase produzida pelo basidiomiceto Cryptococcus sp. LEB-AY10, uma levedura previamente isolada da Mata Atlântica e selecionada pela produção de enzima termoestável. Para tanto, o micro-organismo foi inicialmente identificado em nível de espécie e depositado como C. flavescens LEB-AY10 (CCT 7725); em sequência, foi estudada a produção da enzima utilizando, como substrato, bagaço de cana-de-açúcar, pré-tratado por explosão a vapor em três diferentes condições, bem como suas respectivas frações solúveis, e suplementados com melaço ou componentes sintéticos. Tendo sido definida a metodologia de tratamento do bagaço, técnicas de planejamento experimental foram utilizadas para estudar a influência das variáveis de cultivo e aumentar a atividade da xilanase produzida. Nas condições otimizadas, obteve-se aumento de 5,6 vezes na atividade em relação aos testes iniciais, atingindo 4,67 U/mL (a 50°C) ou 8,33 U/mL (a 80°C) em 96 h de incubação. Posteriormente, realizou-se a purificação da xilanase em duas etapas cromatográficas (troca iônica e permeação em gel), sendo possível recuperar 45% da atividade inicial. A massa molecular média foi estimada em 48 kDa. A enzima apresentou atividade ótima a 77,5°C e maior estabilidade em pH próximo a 5,3. Neste pH, as meias-vidas desta enzima foram estimadas em 9,2 minutos a 77,5°C e 33,74 h a 67°C. Os parâmetros cinéticos Km e vmax utilizando xilana de bétula (birchwood) como substrato foram 4,13 g/L e 2,32 U/mL, respectivamente. A xilanase purificada apresentou baixas atividades de ?-xilosidase em 4-nitrofenil-?-D-xilopiranosídeo (0,02 U/mg) e de celulase em carboximetilcelulose (0,99 U/mg). Os produtos de hidrólise da xilana de faia (beechwood) pela xilanase de C. flavescens LEB-AY10 foram, principalmente, xilobiose e xilotriose. Para identificação do gene responsável pela produção da xilanase, foram utilizadas três estratégias: amplificação com primers degenerados, identificação de peptídeos por espectrometria de massas e sequenciamento do genoma da levedura. Um único gene (1265 pb) denominado Xyn10Cf foi identificado e o correspondente cDNA (1035 pb) foi clonado em Escherichia coli DH10B. O gene é interrompido por 6 íntrons, codifica um peptídeo sinal composto por 13 aminoácidos e a proteína madura é formada por 331 aminoácidos, tendo sua massa molecular estimada em 37,1 kDa (podendo conter cerca de 11 kDa de glicosilação). Com base na sequência de nucleotídeos e na caracterização da enzima purificada, a proteína foi classificada como membro da família GH10. Por fim, para comprovar a funcionalidade do gene identificado Xyn10Cf foi realizada a expressão na linhagem de Pichia pastoris GS115 sob o controle dos promotores álcool oxidase 1 (AOX1) ou gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH), atingindo 5,66 U/mL e 7,67 U/mL, respectivamente, para 84 h de indução em frascos agitados / Abstract: Xylanases are enzymes that hydrolyze the glycosidic bonds between the xylose units of xylan, the main hemicellulosic compound. Due to the high availability in nature of this kind of material, the xylanases may be used in a wide range of industrial plants, including: textile, food and feed industries, bioconversion of lignocellulosic wastes, biobleaching of paper and pulp, and waste treatment. In order to describe novel enzymes for future applications, the goal of this work is to purify and characterize the xylanase produced by the basidiomycete Cryptococcus sp. LEB-AY10, a yeast previously isolated in the Atlantic Forest and selected by the production of a thermostable enzyme. First, the microorganism was identified at the species level and deposited as C. flavescens LEB-AY10 (CCT 7725); then, enzyme production was studied using the substrate sugarcane bagasse, pretreated by steam explosion in three different conditions, as well their corresponding soluble fractions, and supplemented with molasses or synthetic compounds. After selection of the treatment, experimental design techniques were used to assess the influence of cultivation variables and to increase the activity of produced xylanase. At optimized conditions, it was possible to increase activity by 5.6 times from initial assays, reaching 4.67 U/mL (at 50°C) or 8.33 U/mL (at 80°C) after 96 h of incubation. Later, the purification of the xylanase was performed in two chromatographic steps (ion exchange and gel permeation), in which it was possible to recover 45% of initial activity. The average molecular weight was estimated at 48 kDa. The enzyme showed optimal activity at 77.5°C and it was most stable at pH values near 5.3. At this pH, the half-lives of this enzyme were 9.2 min at 77.5°C and 33.74 h at 67°C. The kinetic parameters Km and vmax for Birchwood xylan were 4.13 g/L and 2.32 U/mL, respectively. The purified xylanase showed low activity of ?-xylosidase on 4-nitrophenyl-?-D-xilopiranosídeo (0.02 U/mg) and also showed some cellulase activity on carboxymethylcellulose (0.99 U/mg). The hydrolysis products of Beechwood xylan by the xylanase from C. flavescens LEB-AY10 were mainly xylobiose and xylotriose. For identification of the gene responsible for xylanase production, three strategies were used: amplification of degenerated primers, identification of peptides by mass spectrometry and yeast genome sequencing. A single gene (1265 pb) named Xyn10Cf was identified and the corresponding cDNA (1035 pb) was cloned into Escherichia coli DH10B. The gene is interrupted by 6 introns, it codifies a signal peptide of 13 amino acids and the mature protein is composed by 331 amino acids, with an estimated molecular mass of 37.1 kDa (it may contain around 11 kDa of glycosilation). Based on nucleotide sequencing and on characterization of the purified enzyme, the protein was classified as a member of GH10 family. Finally, to prove the functionality of the identified gene Xyn10Cf, the expression in Pichia pastoris GS115 strain was performed under the control of alcohol oxidase 1 (AOX1) and glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) promoters, reaching 5.66 U/mL and 7.67 U/mL, respectively, after 84 h of incubation in shaker flasks / Doutorado / Engenharia de Alimentos / Doutora em Engenharia de Alimentos

In the forest products industry the opportunity exists to extract currently under-utilised compounds from the process or waste streams and thereby derive more value from the wood entering the process. A big portion of the hemicellulose content of wood does not form part of the final product. Extracting the hemicelluloses from the waste streams or other locations in the process would allow them to be used more effectively. The predominant hardwood hemicellulose, xylan, is polymeric xylose. Xylose is an important platform sugar in bioconversion strategies and can be converted to fuels and other valuable chemicals. The xylan polymer can be hydrolysed to its xylose monomers by a number of conversion strategies; the most widely known being chemical and enzymatic digestion. Chemical conversion is usually done using acid at elevated temperatures, but high yields are often offset by degradation of the product. On the other hand, enzymatic hydrolysis can be better regulated to prevent unwanted degradation of the monomeric sugar products. Enzymatic hydrolysis has been pronounced the environmentally friendly choice of technology, although it is hampered by low conversions and high cost of enzymes. To date commercial enzymes for biomass conversion are not readily available most of which are still in development. In understanding how to best utilise a xylan, recovered from the pulping process, the potential to convert hardwood xylan to xylose with enzymes currently available on the market was studied. A hardwood xylan extracted from fully bleached Eucalyptus pulp with a chelating agent, Nitren, was used as substrate to evaluate the ability of some commercial enzymes to degrade the extracted xylan to xylose monomers. The enzymes used in this study were not dedicated biomass conversion enzymes, but rather chosen for their xylan degrading potential, i.e. xylanase content. By means of hydrolysis profiles on commercial Birchwood and Oat Spelts xylan as substrates and enzyme characterisation, Multifect xylanase was identified as most promising enzyme for xylan conversion. Multifect contained high levels of xylanase and xylosidase activity in the enzyme preparation. Commercial Birchwood xylan and the extracted Eucalyptus xylan were found to be chemically similar, both composed predominantly of xylose. The hydrolysis profiles obtained on Birchwood xylan could therefore serve as a benchmark against which the hy-drolysis of Eucaluptus xylan could be compared. Full conversion of the Eucalyptus xylan with Multifect could not be achieved, although Multifect completely degraded the Birchwood xylan. The maximum xylose yield that could be obtained on Eucalyptus xylan was 80 % and it was concluded that the remaining 20% was unhydrolysable by the enzyme, most likely due to the limitations in the employed extraction method. It was however noted that up to the point of 80 % conversion higher hydrolysis rates were observed on Eucalyptus xylan than Birchwood xylan with equal charges of Multifect. The differences in hydrolysis rates may have indicated that the Eucalyptus xylan is more accessible to enzyme attack than the Birchwood xylan, likely as a result of the extraction methods used to prepare the xylans. A simple economic evaluation illustrated the weight of various costs in process profitability. The most economic operation of a continuous steady state reactor is at a low enzyme charge, 17 IU/ℓ, and a long retention period, five days, due to the high cost of the enzyme compared to other factors. For a reduced retention time, an investigation into enzyme immobilisation and the use of a packed-bed type reactor is recommended. / Dissertation (MEng)--University of Pretoria, 2009. / Chemical Engineering / unrestricted

Les oomycètes représentent un groupe de microorganismes eucaryotes filamenteux distincts phylogénétiquement des champignons incluant de nombreuses espèces phytopathogènes. CBEL est une glycoprotéine pariétale de Phytophthora parasitica constituée d'une répétition de deux régions séparées par un linker. Chaque région protéique est constituée d'un domaine protéique de liaison à la cellulose (CBM1) et un motif PAN /Apple impliqué dans des interactions protéines-protéines ou protéines-polysaccharides. Cette étude doctorale porte sur la caractérisation de la protéine CBEL et plus particulièrement de ses CBM1s ainsi que sur l'évaluation et optimisation du potentiel de cette protéine à : (i) stimuler les défenses naturelles des plantes (ii) augmenter l'activité de glycosides hydrolases. Dans la première partie de ce travail doctoral différents tests visant à reproduire un traitement éliciteur externe sur plante entière ont pour cela été développés. Ces tests ont permis de mettre en évidence que formulée en présence de surfactants CBEL est capable d'induire diverses réponses de défense chez A. thaliana. Une production en masse de cette protéine a été réalisée dans la levure Pichia pastoris et la bactérie Escherichia coli dans l'optique d'une future application agronomique. Les protéines recombinantes CBELcol et CBELpic produite dans ces différents systèmes d'expression présentent des profils de glycosylation différents de celui de la protéine native CBELnat. Alors que ces protéines semblent se lier de manière identique à la cellulose les différents tests d'élicitation développés au cours de ce travail mettent en évidence des variations dans leur activité élicitrice suggérant que la nature des résidus glucidiques présents sur cette glycoprotéine peut avoir un impact sur sa capacité induire des réponses de défenses en application externe. Lors de la deuxième partie de ce travail de thèse la capacité de CBEL à interagir avec différents substrats cellulosiques a été caractérisée. Les résultats obtenus ont permis de montrer que CBEL se lie avec une haute affinité à la cellulose cristalline avicel et que la présence de CBM1 fonctionnels est nécessaire à cette interaction. De manière intéressante, le CBM1-1 et CBM1-2 ne semblent pas contribuer de manière égale à cette interaction. Par ailleurs la laison de CBEL à la cellulose induit des perturbations structurales sur le substrat et permet d'améliorer l'activité de la xylanase XynB de Talaromyces versatilis sur paille de blé. En outre une xylanase chimère possédant dans sa séquence le CBM1-1 de CBEL possède également une activité augmentée sur paille blé. L'ensemble de ces résultats met en évidence le potentiel de CBEL et de son CBM1-1 pour l'amélioration de l'activité de glycoside hydrolases utilisables par exemple en bioraffinerie. En dernier lieu un travail de caractérisation structurale de la protéine CBEL a également été entamé au cours de cette étude. L'enveloppe de la protéine CBEL en solution à notamment été déterminée par SAXS (Small Angle X-ray Scattering) et un modèle 3D de cette protéine a été obtenu. / Oomycetes are fungal like microorganisms evolutionary distinct from true fungi that include pathogens of plants. CBEL is a cell wall glycoprotein isolated from the oomycete Phytophthora parasitica that is composed of two distinct regions linked by a threonine/proline rich linker. Each region owns a cellulose binding module (CBM1) and a PAN-Apple domain involved in protein-protein or proteins-polysaccharides interactions. Since CBEL is able to induce defense responses in numerous plant species, its use for the development of products able to protect crops has been envisaged. For this purpose we analysed the effect of an external CBEL treatment on plants. We found that in the presence of surfactants CBEL is able to induce cytosolic calcium changes, defense gene expression, and cell death on A. thaliana. CBEL application for crop protection requires the development of economically reliable production processes. In the case of proteinaceous elicitors, an attractive strategy to obtain large amount of elicitors is to express them in heterologous hosts such as bacteria or yeasts. CBELcol and CBELpic were produced respectively in E. coli and in P. pastoris. CBELcol is unglycosylated whereas CBELpic displays a glycosylation profile distinct from the native protein (CBELnat). We found that all these proteins are able to bind crystalline cellulose. On the other side we found that the elicitor activity of CBELpic is distinct from CBELnat and CBELcol suggesting that the glycosylation on CBEL can have an impact on its ability to induce plant defense responses after external treatment on A. thaliana. In the second part of this work the two CBMs (1-1 and 1-2) that form part of CBEL have been submitted to detailed characterization, first to better quantify their interaction with cellulose and second to determine whether these CBMs can be useful for biotechnological applications, such as biomass hydrolysis. A variety of biophysical techniques were used to study the interaction of the CBMs with various substrates and the data obtained clearly indicate that CBEL's CBM1-1 exhibits much greater cellulose binding ability than CBM1-2. Engineering of the family 11 xylanase from Talaromyces versatilis (TvXynB), an enzyme that naturally bears a family 1 CBM, has produced two variants. The first one lacks a CBM, whereas the second contains the CBEL CBM1-1 in the place of the natural CBM1. The study of these enzymes has revealed that wild type TvXynB binds to cellulose, probably via its CBM1, and that the substitution of its CBM by oomycetal CBM1-1 does not affect its activity on this substrate. Moreover, the presence of CBEL during the hydrolysis of wheat straw actually potentiates the action of TvXynB, a result that is consistent with the hypothesis that CBM1-1 can alter cellulose surface fibres rather like some other members of CBM family 1.