Yes / Metabolic syndrome is a global public health problem and predisposes individuals to obesity, diabetes and cardiovascular disease. Although the underlying mechanisms remain to be elucidated, accumulating evidence has uncovered a critical role of adipokines. Chemerin, encoded by the gene Rarres2, is a newly discovered adipokine involved in inflammation, adipogenesis, angiogenesis and energy metabolism. In humans, local and circulating levels of chemerin are positively correlated with body mass index and obesity-related biomarkers. In this review, we discuss both peripheral and central roles of chemerin in regulating body metabolism. In general, chemerin is upregulated in obese and diabetic animals. Previous studies by gain or loss of function show an association of chemerin with adipogenesis, glucose homeostasis, food intake and body weight. In the brain, the hypothalamus integrates peripheral afferent signals including adipokines to regulate appetite and energy homeostasis. Chemerin increases food intake in seasonal animals by acting on hypothalamic stem cells, the tanycytes. In peripheral tissues, chemerin increases cell expansion, inflammation and angiogenesis in adipose tissue, collectively resulting in adiposity. While chemerin signalling enhances insulin secretion from pancreatic islets, contradictory results have been reported on how chemerin links to obesity and insulin resistance. Given the association of chemerin with obesity comorbidities in humans, advances in translational research targeting chemerin are expected to mitigate metabolic disorders. Together, the exciting findings gathered in the last decade clearly indicate a crucial multifaceted role for chemerin in the regulation of energy balance, making it a promising candidate for urgently needed pharmacological treatment strategies for obesity.

Yes / Hypothalamic tanycytes in median eminence (ME) are emerging as a crucial cell population that regulates endocrine output, energy balance and the diffusion of blood-born molecules. Tanycytes have recently been considered as potential somatic stem cells in the adult mammalian brain, but their regenerative and tumorigenic capacities are largely unknown. Here we found that Rax+ tanycytes in ME of mice are largely quiescent but quickly enter the cell cycle upon neural injury for self-renewal and regeneration. Mechanistically, Igf1r signaling in tanycytes is required for tissue repair under injury conditions. Furthermore, Braf oncogenic activation is sufficient to transform Rax+ tanycytes into actively dividing tumor cells that eventually develop into a papillary craniopharyngioma-like tumor. Together, these findings uncover the regenerative and tumorigenic potential of tanycytes. Our study offers insights into the properties of tanycytes, which may help to manipulate tanycyte biology for regulating hypothalamic function and investigate the pathogenesis of clinically relevant tumors.

Yes / Chemerin is an adipokine involved in inflammation, adipogenesis, angiogenesis and energy metabolism, and has been hypothesized as a link between obesity and type II diabetes. In humans affected by obesity, chemerin gene expression in peripheral tissues and circulating levels are elevated. In mice, plasma levels of chemerin are upregulated by high-fat feeding and gain and loss of function studies show an association of chemerin with body weight, food intake and glucose homeostasis. Therefore, chemerin is an important blood-borne mediator that, amongst its other functions, controls appetite and body weight. Almost all studies of chemerin to date have focused on its release from adipose tissue and its effects on peripheral tissues with the central effects largely overlooked. To demonstrate a central role of chemerin, we manipulated chemerin signaling in the hypothalamus, a brain region associated with appetite regulation, using pharmacological and genetic manipulation approaches. Firstly, the selective chemerin receptor CMKLR1 antagonist α-NETA was administered i.c.v. to rats to test for an acute physiological effect. Secondly, we designed a short-hairpin-RNA (shRNA) lentivirus construct targeting expression of CMKLR1. This shRNA construct, or a control construct was injected bilaterally into the arcuate nucleus of male Sprague Dawley rats on high-fat diet (45%). After surgery, rats were maintained on high-fat diet for 2 weeks and then switched to chow diet for a further 2 weeks. We found a significant weight loss acutely and inhibition of weight gain chronically. This difference became apparent after diet switch in arcuate nucleus-CMKLR1 knockdown rats. This was not accompanied by a difference in blood glucose levels. Interestingly, appetite-regulating neuropeptides remained unaltered, however, we found a significant reduction of the inflammatory marker TNF-α suggesting reduced expression of CMKLR1 protects from high-fat diet induced neuroinflammation. In white and brown adipose tissue, mRNA expression of chemerin, its receptors and markers of adipogenesis, lipogenesis and brown adipocyte activation remained unchanged confirming that the effects are driven by the brain. Our behavioral analyses suggest that knockdown of CMKLR1 had an impact on object recognition. Our data demonstrate that CMKLR1 is functionally important for the central effects of chemerin on body weight regulation and neuroinflammation. / This work was funded in part by the Academy of Medical Sciences, the Wellcome Trust, the Government of Business, Energy and Industrial Strategy and the British Heart Foundation and Diabetes United Kingdom [SBF004/1063] (GH), the Society for Endocrinology Equipment Grant (GH, RD), the University of Bradford (GH, KP, SK) and Nottingham Trent University (RD).

Les mécanismes neurologiques responsables du déclenchement et de l’homéostasie du sommeil, et du sommeil paradoxal (SP) en particulier, sont l’objet d’un nombre toujours plus important d’études du fait notamment de l’attention croissante portée aux pathologies associées. Les travaux rapportés dans cette thèse s’inscrivent parfaitement dans cette dynamique puisqu’ils ont pour objectif de mieux caractériser les populations neuronales mises en jeu dans la régulation du SP ainsi que leurs interactions. Dans cette optique, nous avons combiné différentes approches techniques complémentaires à savoir : neuroanatomie fonctionnelle, polysomnographie et pharmacologie sur animal libre de se mouvoir. Nous avons ainsi pu démontrer pour la première fois la nature glutamatergique des neurones du SLD, région pontique jouant un rôle central dans la mise en place du SP. De plus, s’il est généralement admis que ces neurones du SLD sont sous le contrôle de neurones GABAergiques situés au niveau de la partie ventrolatérale de la substance grise périaqueducale (VLPAG), le contrôle de ces derniers est encore soumis à controverse. Les résultats que nous avons obtenus suggèrent fortement que l’aire latérale de l’hypothalamus (LH) serait responsable de ce contrôle et donc de celui du SP. En effet, la LH est l’afférence majeure à la VLPAG activée lors d’une hypersomnie de SP. En outre, son inactivation par application locale de muscimol entraine la disparition totale du SP et l’activation des neurones GABAergiques de la VLPAG projetant sur le SLD. En parallèle, nous avons étudié le rôle du noyau réticulé paragigantocellulaire dorsal (DPGi) dans la genèse du SP. Bien que le DPGi fût déjà connu pour être responsable de l’inhibition du locus coeruleus (LC) durant les phases de SP, nous apportons ici un certain nombre d’arguments suggérant que le DPGi pourrait être responsable de l’inhibition, non seulement du LC, mais également de l’ensemble des neurones adrénergiques et noradrénergiques. Cela suggère donc que ce noyau joue également un rôle majeur dans la régulation du SP. Les données rapportées dans cette thèse permettent donc de mieux appréhender les mécanismes neuronaux contrôlant la survenue et la régulation du SP. En particulier, ils apportent de nouvelles données en faveur d’un rôle central de l’hypothalamus dans la régulation du SP puisqu’il constituerait le générateur principal de cet état. / A growing number of studies investigate the neurological mechanisms responsible for paradoxical sleep (PS) genesis and homeostasis. The work presented in this thesis aims to better characterize the neuronal populations implicated in PS regulation and their interrelations. To this purpose, we combined complementary techniques such as functional neuroanatomy, polysomnography and pharmacological approaches on freely moving animals. We thus demonstrated for the first time the glutamatergic nature of SLD neurons which are known to be responsible for muscle atonia and cortical activation characterizing PS. Moreover it is well established that SLD neurons are inhibited by GABAergic cells located inside the ventrolateral part of the periaqueductal gray (VLPAG). Consequently, the control of theses neurons, a crucial step for PS genesis is still a matter of debate. The results we obtained strongly suggest that the lateral hypothalamus (LH) would be responsible for this control and thus for PS. Indeed, LH is the main activated afferent to VLPAG during PS-hypersomnia and its inhibition by muscimol application totally suppresses PS and activates VLPAG GABAergic cells projecting to SLD. We also analyzed the implication of the dorsal part of the paragigantocellular reticular nucleus in PS regulation. Even if it was known that DPGi is responsible for locus coeruleus (LC) inactivation during PS, we brought new evidences showing that DPGi would actually inhibits all noradrenergic and adrenergic cells and not only LC suggesting that DPGi could be of importance for PS genesis. All our data allow us to better understand the PS neuronal network and suggest that, contrary to the classical view that PS is generated by the pons, LH would be the primary PS generator.

Les travaux de cette thèse ont porté sur le contrôle des neurones à GHRH dans des conditions physiologiques et pathologiques. Le but étant de caractériser les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans le fonctionnement ou dérégulations du réseau de neurones à GHRH. Ces neurones sont les principaux stimulateurs de la libération de l’hormone de croissance (GH). Nous avons d’abord montré que l’axe de la croissance et de l’appétit peuvent être régulés indépendamment au niveau de l’hypothamus. En effet, la ghréline, seule hormone produite par le tractus gastro-intestinal et connue pour stimuler la libération de GH en agissant principalement sur les neurones GHRH, stimule ces derniers de manière uniquement directe. Ces effets sont indépendants de ceux qu’elle exerce sur les neurones voisins à NPY, orexigéniques. De plus, la ghréline et les GHS (agonistes sélectifs du récepteur de la ghréline) ne changent pas le mode de décharge électrique des neurones à GHRH ni ne les synchronise. Enfin, ces effets ne présentent pas de dimorphisme sexuel. Dans un second temps, la somatostatine, principal inhibiteur de l’axe GH, induit un rythme d’activité électrique des neurones à GHRH médié par les récepteurs de sous-type SST1 et SST2. Ces effets sont donc temps-dépendants, et aussi sexuellement dimorphiques. Ils sont probablement impliqués dans la modulation de la pulsatilité ultradienne de la libération de GH. Enfin, après un traumatisme crânien, nous observons un déficit de la libération de GH qui apparaît tôt et est soutenu, comme ceux observés chez l’humain. Aucune inflammation ni changement histologique n’a été observe dans l’hypophyse. Cependant, l’inflammation, impliquant une réaction tanycytaire, microgliale, astrocytaire, est présente dans le noyau arqué et l’éminence médiane (EM), ou sont respectivement présents les corps cellulaires et terminaisons des neurones à GHRH. Ceci est lié à des changements morpho-fonctionnels de l’EM (augmentation perméabilité, rupture des barrières tanycytaires). Aucun changement n’a été observé dans le noyau périventriculaire, où sont localisés les neurones à somatostatine. Enfin, les propriétés électriques passives des neurones à GHRH ne sont pas modifiées. En conclusion, une dérégulation de leur activité au niveau des terminaisons nerveuses doit expliquer les défauts posttraumatiques de libération de GH. / The works of this thesis were interested in the control of the hypothalamic GHRH neurons in physiological and pathological conditions. The goal was to clarify the molecular and cellular mechanisms involved in the control or impairments of GHR neuronal network functions. These neurons are the main stimulators of the GH release. We first showed that the hypothalamic growth axis could be regulated independently from the feeding network. Indeed, GHRH neurons are directly stimulated by ghrelin, which is the only hormone produced by the gastrointestinal tract known to stimulate the GH release through acting mainly on GHRH neurons. These effects are independent from its orexigenic effects exerted on the neighbourings NPY neurons. In addition, ghrelin and GHS (synthetic ghrelin receptor agonists) don’t change neither the firing rate of GHRH neurons, nor synchronize them. These effects are not gender-dependant; by contrast, Somatostatin, the major GH axis inhibitor, generates a sexual dimorphic and rhythmic inhibition of the GHRH neurons electrical activity mediated by its SST1 and SST2 receptors subtypes. These effects are so time-dependant direct and indirect effects and can probably be involved in the generation of the ultradian rhythm of the GH release. After a traumatic brain injury, we found an early and sustained deficiency of the GH release, like those observed in human. No pathological changes are visible in the pituitary gland. Inflammation occurs at the arcuate nucleus, and mainly at the median eminence levels; it involves a strong astrocyte reaction, tanycytes, and microglial and (or) infiltrated immune cells activations. These changes elicit morpho-functional impairments of the median eminence, permeability and leakage of the tanycyte barrier between the blood, CSF and Arc; at the opposite, nothing occur at the periventricular level, where are located SST neurons. Neither the number of GHRH neurons, neither their passive electrophysiological properties changed. Impairments of the activities of the GHRH nerve terminals, maybe associated to impairments of their regulated activity, must explain a GH deficiency.

Thesis (M.S.)--West Virginia University, 1999. / Title from document title page. Document formatted into pages; contains viii, 138 p. : ill. (some col.). Vita. Includes abstract. Includes bibliographical references (p. 105-134).

Chez les mammifères, l'attachement pour la mère, est caractérisé par un effet sécurisant de la présence de cette figure qui permet au jeune d'explorer son environnement. Plusieurs études ont suggéré qu’un attachement pouvait se développer pour des substituts maternels tels qu’un congénère ou un objet. Cette thèse sur l'agneau montre, au travers de l'évaluation des caractéristiques de l'attachement, l'absence d'un tel lien en absence de figure maternelle pour un congénère de même âge ou un objet. L'altération de l'attachement chez ces individus est associée à une modification de l'axe corticotrope (HPA) et du système ocytocinergique : les agneaux élevés en absence de figure maternelle montrent un stress accru à 24 heures de vie, traduit au niveau central par une réduction du nombre de neurones contenant de la corticolibérine et une augmentation de ceux contenant l'ocytocine à 21 jours. Cette étude suggère un rôle apaisant de la figure maternelle pouvant faciliter la mise en place de l'attachement et influençant le développement de l'axe HPA. Ce travail suggère par ailleurs l'implication de l'ocytocine dans l'adaptation du jeune à un contexte social stressant. / In mammals, attachment to the mother is characterized by a secure effect of the presence of such figure which allows the young to explore its environment. Several studies have suggested that attachment bond could develop for mother surrogates such as peers or objects. This thesis shows through the evaluation of attachment key features in lambs, the absence of attachment in motherless lambs for a same-aged peer or an object. The alteration of attachment in these individuals is associated with a modification of the hypothalamic-pituitaryadrenal (HPA) axis and the oxytocinergic system: peer- and object-reared lambs show physiological sign of stress 24h after birth, reflected at the central level by a decrease of the number of neurons containing corticoliberin and increase of those containing oxytocin at 21 days of age. This study suggests a soothing effect of the mother figure that could facilitate the establishment of attachment and influence the development of the HPA axis. This work also suggests the involvement of oxytocin in the young to cope with stressful early social context.

La sociabilité de l’homme est un phénomène complexe. Les théories dominantes essayant d'expliquer les mécanismes neurobiologiques de cette sociabilité ont largement impliqué l'ocytocine (OXT), un neuropeptide qui facilite de nombreuses fonctions et comportements sociaux. L'hypothalamus, parmi ses nombreuses fonctions, synthétise et sécrète l’OXT via son noyau supraoptique (SON) et le noyau paraventriculaire (PVN), faisant de lui un candidat intéressant pour comprendre les bases neurales de cette sociabilité. Dans cette thèse, qui combine trois études en imagerie par résonance magnétique (IRM), nous avons examiné 1) les différences anatomiques au sein de l'hypothalamus entre des participants contrôles et des patients autistes; 2) l’activité de l'hypothalamus, et plus spécifiquement des sous-régions hypothalamiques incluant le SON et le PVN, en réponse à des visages portant différents niveaux de sociabilité; 3) les connections fonctionnelles que ces sous-régions hypothalamiques entretiennent avec d'autres réseaux cérébraux. Nos résultats révèlent une spécificité, tant dans leur activité fonctionnelle que dans leurs connections anatomiques, des deux sous-régions hypothalamiques (SON et PVN) en fonction du niveaux de sociabilité. Ce travail de thèse fournit donc non seulement de nouvelles méthodes pour explorer les petites sous-régions hypothalamiques mais confirme également le rôle de l’hypothalamus dans la sociabilité et ses anomalies, apportant ainsi un nouvel éclairage sur l’origine des dysfonctionnements sociaux dans l’autisme et d'autres pathologies. / Human sociality is a complex phenomenon. Prevailing theories attempting to explain the neurobiological mechanisms of human sociality have implicated neuropeptide oxytocin (OXT), which facilitates numerous social functions and behaviors. The hypothalamus, among its many functions, also synthesizes and secretes OXT via its supraoptic nucleus (SON) and the paraventricular nucleus (PVN), making them viable candidates to understand the underpinnings of various social processes. This thesis combines three magnetic resonance imaging (MRI) studies investigating 1) anatomical difference of the hypothalamus between neurotypics and patients with Autism Spectrum Disorders (ASD); 2) functional MRI of the hypothalamus, specifically in hypothalamic subregions containing SON and PVN in response to faces of individuals with varying social significance; 3) functional connectivity of these hypothalamic subregions to other brain networks. Results revealed differential activity of hypothalamic subregions in response to various faces and distinctive patterns of connectivity to other brain areas that are involved in social cognition, as well as anatomical abnormalities of the hypothalamus in ASD. Altogether, the work in this thesis provides novel methods of measuring small hypothalamic subregions and supporting evidence of hypothalamic involvement in social functions that may also shed some light on social dysfunctions in ASD and other pathologies.

En 2015, la revue Nature a publié la plus grande étude d’association pangénomique à ce jour reliant des variants génétiques à l’indice de masse corporelle. Cette étude a mis en avant le rôle du système nerveux central dans la vulnérabilité à l’obésité, et soutient un concept original selon lequel la plasticité cérébrale jouerait un rôle important dans le contrôle de la balance énergétique. Ainsi, des capacités de plasticité cérébrale réduites pourraient favoriser des comportements alimentaires inadaptés, ce qui augmenterait le risque de prise de poids sous pression calorique. Les neurones anorexigènes POMC et les neurones orexigènes AgRP qui composent le système à mélanocortine et qui contrôlent la balance énergétique, conservent effectivement des propriétés de plasticité synaptique dans le cerveau adulte. Celles-ci se manifestent en réponse à des fluctuations hormonales intenses, induites par des manipulations génétiques, chirurgicales ou nutritionnelles drastiques. Cependant le rôle physiologique de cette plasticité synaptique au sein du système à mélanocortine n’a pas encore été démontré. Nos résultats montrent que des phénomènes de plasticité cérébrale sont récapitulés à l’échelle des repas chez la souris, en fonction de l’état prandial, en réponse à des changements métaboliques et hormonaux modérés. En effet, une exposition à 1h de régime standard augmente l’activité électrique des neurones POMC, ce qui est corrélé à une rétractation de la couverture astrocytaire autour des somas POMC, sans changement de configuration synaptique par rapport à l’état préprandial. A l’opposé, une exposition à 1h de régime riche en lipides ne modifie pas l’activité électrique des neurones POMC et n’entraine pas de rétractation de la couverture astrocytaire. De plus, par blocage pharmacologique de l’hyperglycémie post-prandiale, nous avons montré que le glucose était nécessaire pour initier la rétractation gliale post-prandiale. Enfin, par une approche pharmacogénétique, nous avons montré que l’inactivation des astrocytes modifie le comportement alimentaire et diminue la couverture astrocytaire autour des neurones POMC. Ces résultats suggèrent que l’astrocyte jouerait un rôle inhibiteur sur l’activité électrique des neurones POMC et que la rétractation astrocytaire post-prandiale, autour des somas POMC lèverait l’inhibition des neurones POMC et favoriserait la sensation de satiété. Ce mode de régulation ne serait pas déclenché lors d’un repas riche en graisses, ce qui expliquerait le faible pouvoir satiétogène de ce type de repas. / In 2015, Nature published the largest pangenomic association study to date linking genetic variants to body mass index. This study highlighted the role of the central nervous system in vulnerability to obesity and supports an original concept that cerebral plasticity plays an important role in the control of energy balance. Thus, reduced cerebral plasticity capacities could lead to inadequate dietary behaviors, which would increase the risk of weight gain under caloric pressure. The anorectic neurons POMC and the orexigenic neurons AgRP of the melanocortin system, which control the energy balance, actually show synaptic plasticity properties in the adult brain. These phenomena are shown in response to intense hormonal fluctuations induced by drastic genetic, surgical or nutritional manipulations. However, the physiological role of this synaptic plasticity within the melanocortin system has not been demonstrated yet. This study shows that cerebral plasticity phenomena are recapitulated at the meal scale in mice, depending on the prandial state, in response to moderate metabolic and hormonal changes. Indeed, 1 h standard diet exposure increases the electrical activity of the POMC neurons, which is correlated with a retraction of the astrocytic coverage around the POMC somas, with no change in synaptic configuration compared to the preprandial state. In contrast, 1 hour of high fat diet exposure does not modify the electrical activity of the POMC neurons and does not involve retraction of the astrocytic coverage. In addition, by pharmacological blockade of postprandial hyperglycemia, we showed that glucose is required for postprandial glial retraction. Finally, by a pharmacogenetic approach, we have shown that the inactivation of astrocytes modifies the feeding behavior and decreases the astrocytic coverage around the POMC neurons. These results suggest i)that astrocytes would play an inhibitory role on the electrical activity of POMC neurons ii) and that the post-prandial astrocytic retraction around POMC somas might remove inhibition of POMC neurons and might promote the sensation of satiety. This mode of regulation would not be activated during a high-fat meal, which would explain the low satietogenic properties of this type of meal.

L'holoprosencéphalie (HPE) est une maladie rare due à une anomalie du développement précoce du prosencéphale. Les gènes impliqués appartiennent à des voies de signalisation cruciales pour le développement embryonnaire telles que les Nodal, Shh et Fgf. Des mutations de ces gènes n'expliquent que 30% des cas d'HPE. Différentes stratégies ont été mises en œuvre pour déterminer de nouveaux gènes responsables de l'HPE. Récemment, des délétions du gène DLL1, un ligand du récepteur Notch ont été identifiées chez des patients HPE. L'objectif de mon travail de thèse était de tester l'hypothèse d'un rôle de la voie Notch au cours du développement précoce du prosencéphale. Dans ce but, une inhibition de la voie Notch a été réalisée en utilisant une culture ex ovo d'embryon de poulet. Grâce à cela, j'ai pu identifier une activité de la voie Notch au niveau de l'hypothalamus présomptif, une structure ventrale du cerveau antérieur. Une approche transcriptomique a ensuite permis d'identifier les dérégulations survenant lors de l'inhibition pharmacologique de la voie Notch. Les expressions des cibles trancriptionnelles de la voie Notch telles que Hes5, Hey1, Ascl1 ou Nhlh1 m'ont permis de suggérer un modèle d'action par inhibition latérale lors de la neurogénèse de l'hypothalamus en développement. Les données transcriptomiques générées m'ont permis d'identifier de nouveaux gènes marqueurs de l'hypothalamus dont l'expression est sous l'influence de la voie Notch. Nos résultats suggèrent que ces gènes appartiennent à une boucle de régulation comprenant la voie Notch et des facteurs de neurogénèse tels que les gènes proneuraux. Mon travail a également permis de montrer que l'expression du gène majeur de l'HPE, le gène Shh, requérait une activité de la voie Notch précisément au niveau de l'hypothalamus. En conclusion, mes résultats montrent que la voie Notch contribue au développement précoce du cerveau. Ce constat ajoute un autre niveau de complexité à l'apparition de l'HPE et apporte de nouveaux arguments en faveur d'un modèle « multi-hit » pour cette pathologie. / Holoprosencephaly (HPE) is a rare disease corresponding to a failure of early prosencephalon development. Genes involved in HPE, belong to crucial signalling pathways for embryonic development as Nodal, Shh and Fgf. Mutations in these genes could explain only 30% of HPE cases. Different strategies were used to identify new genes in HPE. Recently, deletions of DLL1, a ligand of Notch receptor, have been identified in HPE patients. The aim of my thesis was to test hypothesis that Notch pathway has a role during the early prosencephalon development. First, I performed a pharmacological inhibition of Notch pathway in embryos that were cultured ex ovo. Thus, I could identify Notch activity at the level of primordium hypothalamus, a ventral structure of prosencephalon. Then, transcriptomic analyses were performed to identify deregulations occurring during Notch inhibition. Expressions of well known transcriptional targets of Notch pathway, Hes5, Hey1, Ascl1 and Nhlh1, indicated that Notch pathway might act by lateral inhibition in the neurogenesis of developing hypothalamus. From transcriptomic data, we identified novel markers of developing hypothalamus that will be regulated by Notch pathway. Our results suggest that these novel genes could be involved in the regulatory loop associating with Notch pathway and proneural genes. Then, I demonstrated that Notch activity is required to maintain Shh expression, a major gene involved in HPE, particularly in the hypothalamus. To conclude, adding the Notch pathway in the signalling pathway network involved in prosencephalon development, we provide other complexity level in the HPE appearance. Thus, these results support the hypothesis of a « multi-hit » model of HPE.