Resumo não disponível

As plantas, por serem organismos sésseis, enfrentam persistentemente perturbações ambientais adversas denominadas estresses abióticos, sendo as mais importantes, a seca, a salinidade do solo, as temperaturas extremas e a presença de metais pesados. Em resposta, as plantas desenvolveram mecanismos de tolerância, resistência e prevenção para minimizar a influência do estresse, utilizando estratégias de curto prazo para readaptar rápida e eficientemente seu metabolismo. Neste sentido, os pequenos RNAs não codificantes (sncRNAs) são fortes candidatos para realizar este tipo de regulação. Através do sequenciamento de nova geração revelou-se o papel dos sncRNAs na regulação da expressão gênica em nível transcricional e póstranscricional. Dentre os sncRNAs, os microRNAs (miRNAs) são os mais conhecidos e os fragmentos derivados dos RNAs transportadores (tRFs) são os mais novos e com maiores perspectivas de descobertas futuras. Os miRNAs desempenham papéis regulatórios essenciais tanto no crescimento das plantas quanto no desenvolvimento e resposta ao estresse, enquanto os tRFs, em sua maioria, têm sido associados a respostas de estresse. Eugenia uniflora L., “pitanga” ou a cereja brasileira é uma árvore frutífera nativa da América do Sul que pertence à família Myrtaceae. Ela cresce em diferentes ambientes; florestas, restingas e ambientes áridos e semi-áridos no nordeste brasileiro, sendo uma espécie versátil em termos de adaptabilidade e que desempenha um papel fundamental na manutenção da vegetação costeira arbustiva. Além disso, é muito conhecida por suas propriedades medicinais que são atribuídas aos metabólitos especializados presentes nas folhas e frutos. E. uniflora representa uma fonte fascinante da biodiversidade do germoplasma e tem um grande potencial como fonte de genes para o melhoramento genético. Portanto, a compreensão dos mecanismos que conferem tolerância ao estresse nesta planta é de particular importância. Nesse contexto, o objetivo do presente trabalho é a identificação de sncRNAs (miRNAs e tRFs) por ferramentas de bioinformática e análise do padrão de expressão destes sob condições de estresse abiótico (seca e salinidade), bem como avaliação dos genes envolvidos nesta resposta. No capítulo 1, bibliotecas de DNA, pequenos RNAs (sRNAs) e RNAseq de folhas foram usadas para identificar pre-miRNAs, miRNAs maduros e potenciais alvos destes miRNAs, respectivamente. A montagem de novo do genoma permitiu identificar 38 miRNAs conservados e 28 novos miRNAs. Após a avaliação da expressão destes, 11 conservados, entre eles miR156 e miR170, mostraram variação significativa nas condições de restinga e de estresse induzido por PEG. A maioria deles foram previamente descritos em processos de estresse em outras espécies. 14 novos miRNAs foram avaliados em diferentes tecidos de pitanga mostrando variação significativa no padrão de expressão. Os alvos destes últimos miRNAs foram preditos e validados por RTqPCR. Eles correspondem a genes de fatores de transcrição e outros genes como transferases ou ATPases e demonstraram o padrão esperado oposto à expressão dos miRNAs. No capítulo 2, as mesmas bibliotecas foram usadas para identificar tRFs conservados na família das Myrtaceae. Para isso, os tRNAs de Eucalyptus grandis e E. uniflora foram anotados e os tRNAs comuns foram utilizados para o ancoramento dos sRNAs. 479 tRFs foram identificados em pitanga, na maioria com 18 nucleotídeos (nt). Um conjunto de 11 tRFs conservados em ambas espécies, assim como seus alvos, foram avaliados em condições de estresse salino e seca demonstrando diferenças significativas dependendo do tipo de estresse. Os alvos identificados correspondem a genes previamente descritos como envolvidos em estresse salino e seca para outras espécies. O presente trabalho apresenta fortes evidências do envolvimento dos miRNAs em processos de desenvolvimento e estresse, assim como dos tRFs na resposta à seca e estresse salino presente em E. uniflora. Além disso, os dados produzidos poderão ser utilizados em estudos funcionais mais aprofundados que servirão para melhor compreensão dos mecanismos de tolerância presentes nesta importante planta. / Plants being sessile organisms, persistently face adverse environmental perturbations termed as abiotic stresses, most important being drought, soil salinity, extreme temperatures, and heavy metals. They developed several strategies such as tolerance, resistance, and avoidance to minimize stress influence, thus require short-term strategies to quickly and efficiently readapt their metabolism. In this sense, small non coding RNAs are strong candidates to do this kind of fine tune regulation. Next generation sequencing technologies have revealed the key role of these sncRNAs in the transcriptional and posttranscriptional gene-expression regulation. Among the myriad of new sncRNAs, miRNAs are the most known ones and the fragments derived from tRNAs (tRFs) are the newest but with high perspective ones. The miRNAs are endogenous small RNAs that play essential regulatory roles in plant growth, development and stress response. In the case of tRFs, they are mainly involved in stress response. Eugenia uniflora L., ‘pitanga’ or Brazilian cherry is a fruit tree native to South America that belongs to Myrtaceae family. It grows in several different harsh environments, including forests, restingas, near the beach, and arid and semiarid environments in the Brazilian northeast. This species is very versatile in terms of adaptability and plays a fundamental role in the maintenance of the shrubby coastal vegetation. However, this species is best-known because its medicinal properties that are attributed to specialized metabolites with known biological activities present in their leaves and fruits. E. uniflora is a fascinating reservoir of germplasm biodiversity and has great potential as a source of genes for plant breeding. Therefore, understanding the mechanisms conferring stress tolerance will be very useful. In this sense, the objective of this work is to identify sncRNAs (miRNAs and tRFs) by bioinformatic tools and to analyze their expression pattern under stress conditions as well as the genes involved in that response. In chapter 1, DNA, small RNA (sRNA) and RNAseq libraries from leaves were used to identify pre-miRNAs, mature miRNAs and potential targets of these miRNAs, respectively. De novo assembly of the genome identified 38 conserved miRNAs and 28 novel miRNAs. After evaluating their expression pattern, 11 11 conserved miRNAs, including miR156 and miR170, showed significant variation in the natural (restinga habitat) and PEG induced stress. Most of them were previously reported in stress processes. 14 novel miRNAs were evaluated in different tissues of pitanga showing significant variation in the expression pattern. The targets of the last miRNAs were predicted and validated by RT-qPCR. They were transcription factor genes and other genes such as transferases or ATPases and showed the expected opposite pattern to miRNA expression. In Chapter 2, the same libraries were used to identify conserved tRFs in the Myrtaceae family. To do this, the tRNAs of Eucalyptus grandis and E. uniflora were annotated and sRNAs mapped into them. 479 tRFs were identified in pitanga with predominance of those with 18 nucleotide length. 11 conserved tRFs in both species, as well as their targets, were evaluated under saline and drought stress conditions showing significant differences depending on the stress type. The targets were genes previously involved in saline and drought stress for other species. The present work shows strong evidences of the involvement of the miRNAs in the development and stress, as well as the tRFs in the tolerance to drought and saline stress of E. uniflora. In addition, the data could be used in more detailed functional studies that will serve to corroborate and better understand the mechanism of tolerance present in this important plant.

Resumo: A espécie Campomanesia guazumifolia (Cambess.) O. Berg, conhecida comumente como sete-capotes, é uma Myrtaceae nativa do Brasil, que vem sendo empregada na medicina popular em distúrbios gastrointestinais e hepáticos. Este trabalho teve como objetivo estudar a morfoanatomia e a composição química de folha e caule dessa espécie, bem como avaliar as atividades biológicas, como contribuição ao seu conhecimento farmacognóstico e visando respaldar o uso popular. O material vegetal foi coletado, identificado e devidamente preparado para as respectivas análises. No estudo morfoanatômico, verificou-se que a folha possui estômatos paracíticos na face abaxial, tricomas tectores unicelulares, mesofilo dorsiventral, cavidades secretoras e nervura central com um único feixe vascular bicolateral em arco aberto e circundado por uma bainha esclerenquimática contínua. O caule, em secção transversal, apresenta epiderme persistente e felogênio originado na região mediana do córtex. Há colênquima angular, parênquima cortical e grupos de fibras. O cilindro vascular constitui-se de floema externo, xilema e floema interno, percorridos por raios estreitos. Idioblastos contendo drusas e cristais prismáticos de oxalato de cálcio, além de compostos fenólicos estão presentes em folha e caule. Na prospecção fitoquímica foliar e caulinar foram observados glicosídeos flavônicos, iridoides, esteroides e/ou triterpenoides e saponinas. Adicionalmente, o extrato de folha revelou taninos, enquanto que o de caule exibiu leucoantocianidinas. O composto miricitrina foi identificado na fração acetato de etila proveniente de folha. Em relação à atividade antioxidante, a fração acetato de etila tanto de folha como de caule foi a mais efetiva na redução do radical DPPH e pelo método do fosfomolibdênio, porém pelo método TBARS, o extrato etanólico bruto e frações de caule exibiram maior inibição da peroxidação lipídica do que as amostras provenientes de folha. Na avaliação da atividade antimicrobiana, o extrato etanólico bruto e as frações acetato de etila e hidroalcoólica de folha reduziram o crescimento de Staphylococcus aureus, sendo que a fração hidroalcoólica de folha também foi eficaz contra Salmonella Typhimurium. Para as amostras provenientes de caule, o extrato etanólico bruto reduziu o crescimento de Candida albicans e a fração acetato de etila apresentou-se eficiente contra Staphylococcus epidermidis. Em testes preliminares de toxicidade, os extratos e as frações de folha e caule não apresentaram atividade frente a Artemia salina e não demonstraram atividade hemolítica. Pelo ensaio de avaliação da motilidade gastrointestinal in vivo, constatou-se que o extrato etanólico bruto de folha reduziu o esvaziamento gástrico nas doses de 500, 100 e 20 mg/kg, e aumentou o trânsito intestinal na dose de 500 mg/kg. Com a avaliação da atividade protetora gástrica in vivo, verificou-se ação antiulcerogênica do extrato bruto de folha na dose de 100 mg/kg, que parece não estar relacionada à inibição de peroxidação lipídica na mucosa gástrica, avaliada pelo método TBARS. Os dados obtidos são relevantes e complementares ao estudo morfoanatômico, fitoquímico e de atividades biológicas dessa planta medicinal e potencial droga vegetal, e confirmam o uso terapêutico indicado pela medicina popular.

Orientadora: Karina Alves de Toledo / Co-orientadora: Catarina dos Santos / Banca: Phileno Pinge Filho / Banca: Valéria Marta Gomes do Nascimento / Resumo: A família Myrtaceae vem sendo estudada quanto ao seu potencial na regulação da menstruação, dor, desordens intestinais, infertilidade, nas suas atividades antifúngica, purgativa e anticâncer, no tratamento de resfriados, tosse e em outras afecções do trato respiratório. Em meio a seus membros, as espécies de Eugenia spp., ricas em compostos fenólicos, parecem apresentar efeitos pró e anti-inflamatórios quando testados in vivo e in vitro. Dentre as células atuantes de forma pioneira na inflamação, estão os neutrófilos. Eles são um alvo de estudo no controle de processos inflamatórios agudos e crônicos, por meio da elucidação de como substâncias agem, por exemplo, nas diferentes etapas de seu recrutamento. Assim, o objetivo principal deste trabalho foi avaliar o potencial efeito anti-inflamatório do extrato hidroetanólico de folhas de Eugenia aurata - EA e Eugenia punicifolia - EP, sobre atividades neutrofílicas. Foram avaliados os processos de adesão e desgranulação celular e a geração das armadilhas extracelulares neutrofílicas (NETs- Neutrophil Extracellular Traps) em neutrófilos humanos. Os resultados mostram que o EA inibe o processo de adesão, enquanto que o EP, a desgranulação, e, ademais, ambos inibem a liberação de DNA (NET), na ausência de efeito citotóxico. Tais resultados corroboram o uso desses extratos na medicina popular. Além disso, sugerem seu potencial no desenvolvimento de medicamentos fitoterápicos com propriedades anti-inflamatórias / Abstract: Myrtaceae family has been studied for its potential in regulating menstruation, pain and intestinal disorders, infertility, as well as antifungal, purgative and anticancer agent, and in addition to treat colds, cough and other respiratory ailments. Amid its members, Eugenia spp species appear to have pro and anti-inflammatory effect once examined in vivo and in vitro. Among the first cells which act on inflammation site, there are the neutrophils. They are a matter of study in the controlling of acute and chronic inflammatory processes, through elucidation of how substances act, for example, in different steps of their recruitment. Therefore, the main aim of this study was to evaluate the potential anti-inflammatory effect of hydroethanolic extract of Eugenia aurata leaves - EA and Eugenia punicifolia - EP, on neutrophil activities. We evaluated the adhesion process and cell degranulation, as well NETs (Neutrophil Extracellular Traps NETs) generation in human neutrophils. The results show that EA inhibits adhesion, while EP degranulation, and further, both inhibit the release of DNA (NET), in the absence of cytotoxic effect. These results give support to the use of these extracts in the popular medicine. Furthermore, they demonstrate a potential of both extracts for the development of phytomedicines with anti-inflammatory properties / Mestre

As plantas, por serem organismos sésseis, enfrentam persistentemente perturbações ambientais adversas denominadas estresses abióticos, sendo as mais importantes, a seca, a salinidade do solo, as temperaturas extremas e a presença de metais pesados. Em resposta, as plantas desenvolveram mecanismos de tolerância, resistência e prevenção para minimizar a influência do estresse, utilizando estratégias de curto prazo para readaptar rápida e eficientemente seu metabolismo. Neste sentido, os pequenos RNAs não codificantes (sncRNAs) são fortes candidatos para realizar este tipo de regulação. Através do sequenciamento de nova geração revelou-se o papel dos sncRNAs na regulação da expressão gênica em nível transcricional e póstranscricional. Dentre os sncRNAs, os microRNAs (miRNAs) são os mais conhecidos e os fragmentos derivados dos RNAs transportadores (tRFs) são os mais novos e com maiores perspectivas de descobertas futuras. Os miRNAs desempenham papéis regulatórios essenciais tanto no crescimento das plantas quanto no desenvolvimento e resposta ao estresse, enquanto os tRFs, em sua maioria, têm sido associados a respostas de estresse. Eugenia uniflora L., “pitanga” ou a cereja brasileira é uma árvore frutífera nativa da América do Sul que pertence à família Myrtaceae. Ela cresce em diferentes ambientes; florestas, restingas e ambientes áridos e semi-áridos no nordeste brasileiro, sendo uma espécie versátil em termos de adaptabilidade e que desempenha um papel fundamental na manutenção da vegetação costeira arbustiva. Além disso, é muito conhecida por suas propriedades medicinais que são atribuídas aos metabólitos especializados presentes nas folhas e frutos. E. uniflora representa uma fonte fascinante da biodiversidade do germoplasma e tem um grande potencial como fonte de genes para o melhoramento genético. Portanto, a compreensão dos mecanismos que conferem tolerância ao estresse nesta planta é de particular importância. Nesse contexto, o objetivo do presente trabalho é a identificação de sncRNAs (miRNAs e tRFs) por ferramentas de bioinformática e análise do padrão de expressão destes sob condições de estresse abiótico (seca e salinidade), bem como avaliação dos genes envolvidos nesta resposta. No capítulo 1, bibliotecas de DNA, pequenos RNAs (sRNAs) e RNAseq de folhas foram usadas para identificar pre-miRNAs, miRNAs maduros e potenciais alvos destes miRNAs, respectivamente. A montagem de novo do genoma permitiu identificar 38 miRNAs conservados e 28 novos miRNAs. Após a avaliação da expressão destes, 11 conservados, entre eles miR156 e miR170, mostraram variação significativa nas condições de restinga e de estresse induzido por PEG. A maioria deles foram previamente descritos em processos de estresse em outras espécies. 14 novos miRNAs foram avaliados em diferentes tecidos de pitanga mostrando variação significativa no padrão de expressão. Os alvos destes últimos miRNAs foram preditos e validados por RTqPCR. Eles correspondem a genes de fatores de transcrição e outros genes como transferases ou ATPases e demonstraram o padrão esperado oposto à expressão dos miRNAs. No capítulo 2, as mesmas bibliotecas foram usadas para identificar tRFs conservados na família das Myrtaceae. Para isso, os tRNAs de Eucalyptus grandis e E. uniflora foram anotados e os tRNAs comuns foram utilizados para o ancoramento dos sRNAs. 479 tRFs foram identificados em pitanga, na maioria com 18 nucleotídeos (nt). Um conjunto de 11 tRFs conservados em ambas espécies, assim como seus alvos, foram avaliados em condições de estresse salino e seca demonstrando diferenças significativas dependendo do tipo de estresse. Os alvos identificados correspondem a genes previamente descritos como envolvidos em estresse salino e seca para outras espécies. O presente trabalho apresenta fortes evidências do envolvimento dos miRNAs em processos de desenvolvimento e estresse, assim como dos tRFs na resposta à seca e estresse salino presente em E. uniflora. Além disso, os dados produzidos poderão ser utilizados em estudos funcionais mais aprofundados que servirão para melhor compreensão dos mecanismos de tolerância presentes nesta importante planta. / Plants being sessile organisms, persistently face adverse environmental perturbations termed as abiotic stresses, most important being drought, soil salinity, extreme temperatures, and heavy metals. They developed several strategies such as tolerance, resistance, and avoidance to minimize stress influence, thus require short-term strategies to quickly and efficiently readapt their metabolism. In this sense, small non coding RNAs are strong candidates to do this kind of fine tune regulation. Next generation sequencing technologies have revealed the key role of these sncRNAs in the transcriptional and posttranscriptional gene-expression regulation. Among the myriad of new sncRNAs, miRNAs are the most known ones and the fragments derived from tRNAs (tRFs) are the newest but with high perspective ones. The miRNAs are endogenous small RNAs that play essential regulatory roles in plant growth, development and stress response. In the case of tRFs, they are mainly involved in stress response. Eugenia uniflora L., ‘pitanga’ or Brazilian cherry is a fruit tree native to South America that belongs to Myrtaceae family. It grows in several different harsh environments, including forests, restingas, near the beach, and arid and semiarid environments in the Brazilian northeast. This species is very versatile in terms of adaptability and plays a fundamental role in the maintenance of the shrubby coastal vegetation. However, this species is best-known because its medicinal properties that are attributed to specialized metabolites with known biological activities present in their leaves and fruits. E. uniflora is a fascinating reservoir of germplasm biodiversity and has great potential as a source of genes for plant breeding. Therefore, understanding the mechanisms conferring stress tolerance will be very useful. In this sense, the objective of this work is to identify sncRNAs (miRNAs and tRFs) by bioinformatic tools and to analyze their expression pattern under stress conditions as well as the genes involved in that response. In chapter 1, DNA, small RNA (sRNA) and RNAseq libraries from leaves were used to identify pre-miRNAs, mature miRNAs and potential targets of these miRNAs, respectively. De novo assembly of the genome identified 38 conserved miRNAs and 28 novel miRNAs. After evaluating their expression pattern, 11 11 conserved miRNAs, including miR156 and miR170, showed significant variation in the natural (restinga habitat) and PEG induced stress. Most of them were previously reported in stress processes. 14 novel miRNAs were evaluated in different tissues of pitanga showing significant variation in the expression pattern. The targets of the last miRNAs were predicted and validated by RT-qPCR. They were transcription factor genes and other genes such as transferases or ATPases and showed the expected opposite pattern to miRNA expression. In Chapter 2, the same libraries were used to identify conserved tRFs in the Myrtaceae family. To do this, the tRNAs of Eucalyptus grandis and E. uniflora were annotated and sRNAs mapped into them. 479 tRFs were identified in pitanga with predominance of those with 18 nucleotide length. 11 conserved tRFs in both species, as well as their targets, were evaluated under saline and drought stress conditions showing significant differences depending on the stress type. The targets were genes previously involved in saline and drought stress for other species. The present work shows strong evidences of the involvement of the miRNAs in the development and stress, as well as the tRFs in the tolerance to drought and saline stress of E. uniflora. In addition, the data could be used in more detailed functional studies that will serve to corroborate and better understand the mechanism of tolerance present in this important plant.

Infecções fúngicas causadas por leveduras oportunistas de Candida não – albicans (CNA) têm aumentado drasticamente nas últimas décadas, podendo estar relacionadas com o elevado número de pacientes imunocomprometidos, mais susceptíveis a essas infecções. CNA possuem maior resistência aos antifúngicos tradicionais como o fluconazol (FLZ), fármaco de escolha para o tratamento de infecções por Candida spp. A resistência antifúngica conduz a falhas na terapia clínica podendo levar ao aumento das taxas de morbidade e mortalidade. Associações entre fármacos e substâncias naturais pode ser uma alternativa viável para superar a resistência antifúngica em CNA. Acca sellowiana (O.Berg) Burret, é uma goiabeira pertencente à família Myrtaceae, possuindo diversas atividades biológicas comprovadas. Assim, o objetivo deste estudo foi determinar a atividade antifúngica de frações ativas obtidas a partir do extrato aquoso liofilizado de folhas de A. sellowiana frente a isolados resistentes de CNA. Como resultado, isolados de Candida glabrata foram os mais susceptíveis as frações ativas quando comparados aos demais isolados. As frações ativas F1, F2 e F3 apresentaram melhor atividade antifúngica comparadas às demais, sendo a fração ativa F2, a mais eficaz. Foi demonstrado efeito sinérgico em 80% dos isolados de C. glabrata entre a combinação de FLZ e a fração ativa F2. Na determinação de compostos fenólicos foi identificada a presença de catequina nas frações ativas. A análise dos espectros no UV dos demais picos cromatográficos encontrados nessas frações indica a presença de flavonoides e compostos fenólicos, correlacionando a possível atividade antifúngica dessas frações com a combinação dessas substâncias. O ensaio do sorbitol indicou que a ação da fração ativa F2 ocorre na parede celular das leveduras, corroborando com o dano estrutural observado através de microscopia eletrônica de varredura (MEV). / Fungal infections caused by opportunistic yeast non - albicans Candida (NAC) have dramatically increased in recent decades and could be related to the high number of immunocompromised patients. NAC have greater resistance to traditional antifungal agents such as fluconazole (FLZ), the drug of choice for the treatment of infections caused by Candida spp. The antifungal resistance leads to failures in clinical therapy and may cause an increase in morbidity and mortality rates. Associations between drugs and natural substances can be a feasible alternative to overcome antifungal resistance in NAC. Acca sellowiana (O.Berg) Burret is a guava tree belonging to the Myrtaceae and has several proven biological activities. Thus, the aim of this study was to evaluate the antifungal activity of fractions obtained from the freeze-dried aqueous extract of leaves of A. sellowiana against resistant isolates of NAC. As a result, Candida glabrata isolates were the most susceptible to active fractions when compared to the others isolates. The F1, F2 and F3 active fractions showed the better antifungal activity and the F2 active fraction was the most effective. Synergistic effect of FLZ with F2 active fraction was demonstrated in 80% of C. glabrata isolates. The UV spectra analysis of the chromatographic peaks found in these other fractions indicate the presence of flavonoids and phenolic compounds, correlating the antifungal activity of these fractions with the combination of these substances. The sorbitol test indicates that the action of F2 active fraction possibly occurs in the cell wall of yeasts, confirming structural damage observed by scanning electron microscopy (SEM).

Pitanga (Eugenia uniflora L.) é uma árvore arbustiva com frutas semelhantes à cereja, que cresce em diferentes tipos de vegetação e ecossistemas como consequência da sua alta capacidade de adaptação a diferentes condições de solo e clima. Esta espécie é de particular interesse econômico devido às suas propriedades medicinais, que são atribuídas aos metabólitos especializados presentes em suas folhas e frutos. Entre os metabólitos, os terpenóides são os mais abundantes dos óleos essenciais que são encontrados nas folhas. A diversidade de terpenos observada em Myrtaceae é determinada pela atividade de diferentes membros das famílias das terpeno sintases e oxidosqualeno ciclases. Por outro lado, os miRNAs são pequenos RNAs endógenos que desempenham papéis regulatórios essenciais no crescimento das plantas, desenvolvimento e resposta ao estresse. Por esta razão, estudos extensivos de miRNAs foram realizados em plantas modelos e outras plantas de importância econômica nos últimos anos. Portanto, o objetivo deste estudo é gerar recursos genômicos para E. uniflora utilizando sequenciamento de nova geração e ferramentas de bioinformática para a identificação de miRNAs conservados e novos, bem como os genes envolvidos na sínteses dos terpenóides. No capítulo 3, bibliotecas de pequenos RNA e RNA-seq foram construídas a partir de folhas de pitanga para identificar miRNAs maduros e pre-miRNAs, respectivamente. De 14.489.131 leituras limpas de pequenos RNA, foram obtidos 1.852.722 sequências de miRNAs maduros que representam 45 famílias conservadas e que foram identificadas em outras espécies de plantas. Análises posteriores, usando contigs montados a partir do RNA-seq, permitiu a predição das estruturas secundárias de 42 pre-miRNAs: 25 conservados e 17 novos. Alvos potenciais foram previstos para os miRNAs maduros mais abundantes nos pre-miRNAs, identificados com base na homologia de sequências. Além disso, a expressão de 27 pre-miRNAs foi validada utilizando ensaios de RT-PCR em diferentes indivíduos de pitanga. Este estudo é o primeiro de identificação em grande escala de miRNAs e seus alvos potenciais de uma espécie da família Myrtaceae, e proporciona mais informação sobre a conservação evolutiva dos vias regulatórias dos miRNAs em plantas com destaques para os miRNAs específicos da pitanga. No capítulo 4, a biblioteca de RNA-seq sequenciada anteriormente foi utilizada para identificar os genes potencialmente envolvidos na via da biossíntese dos terpenos e diversidade dos terpenóides a partir da montagem de novo e a anotação do transcriptoma de E. uniflora. No total, foram identificados 72.742 unigenes com um comprimento médio de 1.048 pb. Destes, 43.631 e 36.289 unigenes foram anotadas com as bases de dados das proteínas não redundantes do NCBI e Swiss-Prot, respectivamente. A ontologia gênica categorizou as sequências em 53 grupos funcionais. A análise das vias metabólicas com KEGG revelou 8.625 unigenes designados a 141 vias metabólicas e 40 unigenes preditos como associados com a biossíntese de terpenóides. Por outro lado, foram identificados quatro genes putativos de terpeno sintases (TPS), de comprimento completo, envolvidos na biossíntese de monoterpenos e sesquiterpenos, e três genes putativos de oxidosqualeno ciclases (OSC), de comprimente completo, envolvidos na biossíntese de triterpenos. Além disso, a expressão destes genes foi validada em diferentes tecidos de E. uniflora. A futura caracterização bioquímica dos diferentes TPS e OSC descritos aqui determinará especificamente o tipo de terpenóide sintetizado em condições ambientais específicas. Os dados produzidos neste estudo servirão como referência para estudos genéticos sobre os mecanismos moleculares que são responsáveis pela composição química dos óleos essenciais em E. uniflora e os aspectos fisiológicos da capacidade de adaptação desta espécie a diferentes habitats. / Pitanga (Eugenia uniflora L.) is a shrubby tree with edible cherry-like fruits that grows in different vegetation types and ecosystems as a consequence of its high adaptability to different soils and climate conditions. This species is of particular interest due to its medicinal properties that are attributed to specialized metabolites present in their leaves and fruits with potential pharmacological benefits. Among these metabolites, the terpenoids are the most abundant in the essential oils found in the leaves. The terpene diversity observed in Myrtaceae is determined by the activity of different members of the terpene synthase and oxidosqualene cyclase families. Furthermore, miRNAs are endogenous small RNAs that play essential regulatory roles in plant growth, development and stress response. For this reason, extensive studies of miRNAs have been performed in model plants and other plants of economic importance in the last years. Therefore, the aim of this study is to generate genomic resources for E. uniflora using next generation sequencing and bioinformatics tools to identify conserved and new miRNAs, and to identify the genes involved in the synthesis of terpenoids. In chapter 3, small RNA and RNA-seq libraries were constructed from leaves to identify mature miRNAs and pre-miRNAs, respectively. From 14.489.131 small RNA clean reads we obtained 1.852.722 mature miRNA sequences, representing 45 conserved families that have been identified in other plant species. Further analysis using assembled contigs from RNA-seq allowed the prediction of secondary structures of 42 pre-miRNAs: 25 conserved and 17 novel. Potential targets were predicted for the most abundant mature miRNAs, which were identified in pre-miRNAs based on sequence homology. In addition, the expression of 27 identified pre-miRNAs was validated using RTPCR assays in different individuals of pitanga. In chapter 4, the previously sequenced RNA-seq library was de novo assembled followed by annotation of the E. uniflora transcriptome and used to identify the genes potentially involved in the terpene biosynthesis pathway and terpenoid diversity. In total, we identified 72.742 unigenes with a mean length of 1.048 bp. Of these, 43.631 and 36.289 unigenes were annotated with the NCBI non-redundant protein and Swiss-Prot databases, respectively. The gene ontology categorized the sequences into 53 functional groups. A metabolic pathway analysis with KEGG revealed 8.625 unigenes assigned to 141 metabolic pathways and 40 unigenes predicted to be associated with the biosynthesis of terpenoids. Furthermore, we identified four putative full-length terpene synthase (TPS) genes involved in sesquiterpenes and monoterpenes biosynthesis, and three putative full-length oxidosqualene cyclase (OSC) genes involved in the triterpenes biosynthesis. In addition, expression of these genes was validated in different E. uniflora tissues. Future biochemical characterization of the different TPS and OSC described here will determine the type of terpenoid specifically synthesized in specific environmental conditions. The data produced in this study will serve as a reference for genetic studies about the molecular mechanisms behind the chemical composition of the essential oils in E. uniflora and about the physiologic aspects of the capacity of adaptation of this specie to different habitats.

Pitanga (Eugenia uniflora L.) é uma árvore arbustiva com frutas semelhantes à cereja, que cresce em diferentes tipos de vegetação e ecossistemas como consequência da sua alta capacidade de adaptação a diferentes condições de solo e clima. Esta espécie é de particular interesse econômico devido às suas propriedades medicinais, que são atribuídas aos metabólitos especializados presentes em suas folhas e frutos. Entre os metabólitos, os terpenóides são os mais abundantes dos óleos essenciais que são encontrados nas folhas. A diversidade de terpenos observada em Myrtaceae é determinada pela atividade de diferentes membros das famílias das terpeno sintases e oxidosqualeno ciclases. Por outro lado, os miRNAs são pequenos RNAs endógenos que desempenham papéis regulatórios essenciais no crescimento das plantas, desenvolvimento e resposta ao estresse. Por esta razão, estudos extensivos de miRNAs foram realizados em plantas modelos e outras plantas de importância econômica nos últimos anos. Portanto, o objetivo deste estudo é gerar recursos genômicos para E. uniflora utilizando sequenciamento de nova geração e ferramentas de bioinformática para a identificação de miRNAs conservados e novos, bem como os genes envolvidos na sínteses dos terpenóides. No capítulo 3, bibliotecas de pequenos RNA e RNA-seq foram construídas a partir de folhas de pitanga para identificar miRNAs maduros e pre-miRNAs, respectivamente. De 14.489.131 leituras limpas de pequenos RNA, foram obtidos 1.852.722 sequências de miRNAs maduros que representam 45 famílias conservadas e que foram identificadas em outras espécies de plantas. Análises posteriores, usando contigs montados a partir do RNA-seq, permitiu a predição das estruturas secundárias de 42 pre-miRNAs: 25 conservados e 17 novos. Alvos potenciais foram previstos para os miRNAs maduros mais abundantes nos pre-miRNAs, identificados com base na homologia de sequências. Além disso, a expressão de 27 pre-miRNAs foi validada utilizando ensaios de RT-PCR em diferentes indivíduos de pitanga. Este estudo é o primeiro de identificação em grande escala de miRNAs e seus alvos potenciais de uma espécie da família Myrtaceae, e proporciona mais informação sobre a conservação evolutiva dos vias regulatórias dos miRNAs em plantas com destaques para os miRNAs específicos da pitanga. No capítulo 4, a biblioteca de RNA-seq sequenciada anteriormente foi utilizada para identificar os genes potencialmente envolvidos na via da biossíntese dos terpenos e diversidade dos terpenóides a partir da montagem de novo e a anotação do transcriptoma de E. uniflora. No total, foram identificados 72.742 unigenes com um comprimento médio de 1.048 pb. Destes, 43.631 e 36.289 unigenes foram anotadas com as bases de dados das proteínas não redundantes do NCBI e Swiss-Prot, respectivamente. A ontologia gênica categorizou as sequências em 53 grupos funcionais. A análise das vias metabólicas com KEGG revelou 8.625 unigenes designados a 141 vias metabólicas e 40 unigenes preditos como associados com a biossíntese de terpenóides. Por outro lado, foram identificados quatro genes putativos de terpeno sintases (TPS), de comprimento completo, envolvidos na biossíntese de monoterpenos e sesquiterpenos, e três genes putativos de oxidosqualeno ciclases (OSC), de comprimente completo, envolvidos na biossíntese de triterpenos. Além disso, a expressão destes genes foi validada em diferentes tecidos de E. uniflora. A futura caracterização bioquímica dos diferentes TPS e OSC descritos aqui determinará especificamente o tipo de terpenóide sintetizado em condições ambientais específicas. Os dados produzidos neste estudo servirão como referência para estudos genéticos sobre os mecanismos moleculares que são responsáveis pela composição química dos óleos essenciais em E. uniflora e os aspectos fisiológicos da capacidade de adaptação desta espécie a diferentes habitats. / Pitanga (Eugenia uniflora L.) is a shrubby tree with edible cherry-like fruits that grows in different vegetation types and ecosystems as a consequence of its high adaptability to different soils and climate conditions. This species is of particular interest due to its medicinal properties that are attributed to specialized metabolites present in their leaves and fruits with potential pharmacological benefits. Among these metabolites, the terpenoids are the most abundant in the essential oils found in the leaves. The terpene diversity observed in Myrtaceae is determined by the activity of different members of the terpene synthase and oxidosqualene cyclase families. Furthermore, miRNAs are endogenous small RNAs that play essential regulatory roles in plant growth, development and stress response. For this reason, extensive studies of miRNAs have been performed in model plants and other plants of economic importance in the last years. Therefore, the aim of this study is to generate genomic resources for E. uniflora using next generation sequencing and bioinformatics tools to identify conserved and new miRNAs, and to identify the genes involved in the synthesis of terpenoids. In chapter 3, small RNA and RNA-seq libraries were constructed from leaves to identify mature miRNAs and pre-miRNAs, respectively. From 14.489.131 small RNA clean reads we obtained 1.852.722 mature miRNA sequences, representing 45 conserved families that have been identified in other plant species. Further analysis using assembled contigs from RNA-seq allowed the prediction of secondary structures of 42 pre-miRNAs: 25 conserved and 17 novel. Potential targets were predicted for the most abundant mature miRNAs, which were identified in pre-miRNAs based on sequence homology. In addition, the expression of 27 identified pre-miRNAs was validated using RTPCR assays in different individuals of pitanga. In chapter 4, the previously sequenced RNA-seq library was de novo assembled followed by annotation of the E. uniflora transcriptome and used to identify the genes potentially involved in the terpene biosynthesis pathway and terpenoid diversity. In total, we identified 72.742 unigenes with a mean length of 1.048 bp. Of these, 43.631 and 36.289 unigenes were annotated with the NCBI non-redundant protein and Swiss-Prot databases, respectively. The gene ontology categorized the sequences into 53 functional groups. A metabolic pathway analysis with KEGG revealed 8.625 unigenes assigned to 141 metabolic pathways and 40 unigenes predicted to be associated with the biosynthesis of terpenoids. Furthermore, we identified four putative full-length terpene synthase (TPS) genes involved in sesquiterpenes and monoterpenes biosynthesis, and three putative full-length oxidosqualene cyclase (OSC) genes involved in the triterpenes biosynthesis. In addition, expression of these genes was validated in different E. uniflora tissues. Future biochemical characterization of the different TPS and OSC described here will determine the type of terpenoid specifically synthesized in specific environmental conditions. The data produced in this study will serve as a reference for genetic studies about the molecular mechanisms behind the chemical composition of the essential oils in E. uniflora and about the physiologic aspects of the capacity of adaptation of this specie to different habitats.

Infecções fúngicas causadas por leveduras oportunistas de Candida não – albicans (CNA) têm aumentado drasticamente nas últimas décadas, podendo estar relacionadas com o elevado número de pacientes imunocomprometidos, mais susceptíveis a essas infecções. CNA possuem maior resistência aos antifúngicos tradicionais como o fluconazol (FLZ), fármaco de escolha para o tratamento de infecções por Candida spp. A resistência antifúngica conduz a falhas na terapia clínica podendo levar ao aumento das taxas de morbidade e mortalidade. Associações entre fármacos e substâncias naturais pode ser uma alternativa viável para superar a resistência antifúngica em CNA. Acca sellowiana (O.Berg) Burret, é uma goiabeira pertencente à família Myrtaceae, possuindo diversas atividades biológicas comprovadas. Assim, o objetivo deste estudo foi determinar a atividade antifúngica de frações ativas obtidas a partir do extrato aquoso liofilizado de folhas de A. sellowiana frente a isolados resistentes de CNA. Como resultado, isolados de Candida glabrata foram os mais susceptíveis as frações ativas quando comparados aos demais isolados. As frações ativas F1, F2 e F3 apresentaram melhor atividade antifúngica comparadas às demais, sendo a fração ativa F2, a mais eficaz. Foi demonstrado efeito sinérgico em 80% dos isolados de C. glabrata entre a combinação de FLZ e a fração ativa F2. Na determinação de compostos fenólicos foi identificada a presença de catequina nas frações ativas. A análise dos espectros no UV dos demais picos cromatográficos encontrados nessas frações indica a presença de flavonoides e compostos fenólicos, correlacionando a possível atividade antifúngica dessas frações com a combinação dessas substâncias. O ensaio do sorbitol indicou que a ação da fração ativa F2 ocorre na parede celular das leveduras, corroborando com o dano estrutural observado através de microscopia eletrônica de varredura (MEV). / Fungal infections caused by opportunistic yeast non - albicans Candida (NAC) have dramatically increased in recent decades and could be related to the high number of immunocompromised patients. NAC have greater resistance to traditional antifungal agents such as fluconazole (FLZ), the drug of choice for the treatment of infections caused by Candida spp. The antifungal resistance leads to failures in clinical therapy and may cause an increase in morbidity and mortality rates. Associations between drugs and natural substances can be a feasible alternative to overcome antifungal resistance in NAC. Acca sellowiana (O.Berg) Burret is a guava tree belonging to the Myrtaceae and has several proven biological activities. Thus, the aim of this study was to evaluate the antifungal activity of fractions obtained from the freeze-dried aqueous extract of leaves of A. sellowiana against resistant isolates of NAC. As a result, Candida glabrata isolates were the most susceptible to active fractions when compared to the others isolates. The F1, F2 and F3 active fractions showed the better antifungal activity and the F2 active fraction was the most effective. Synergistic effect of FLZ with F2 active fraction was demonstrated in 80% of C. glabrata isolates. The UV spectra analysis of the chromatographic peaks found in these other fractions indicate the presence of flavonoids and phenolic compounds, correlating the antifungal activity of these fractions with the combination of these substances. The sorbitol test indicates that the action of F2 active fraction possibly occurs in the cell wall of yeasts, confirming structural damage observed by scanning electron microscopy (SEM).

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