Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / From the aerial parts of Pavonia distinguenda the glycosilated flavonoids, tirosilide and astragalina glycolilated flavonoids were isolated, among free b-sitosterol, lupeol, taraxerol, germanicol and from the roots of Dorstenia brasiliensis Lam, psolaren, bergapten and umbeliferone that were identified by the appliance of NMR 1D and 2D GC-MS techniques. The crude extract of P distinguenda presented a citotoxity index to Artemia salina Leach larvae with LD50 in 6.2 μg/mL, showing potential antitumoural and/or insecticide activity. In the intraperitoneal single dose acute toxicity tests it presented LD50 in 1004.9 mg/kg (confidence limits in 731.8 and 1422.7 mg/kg) and to oral administration one LD50 in 3002.1 mg/kg (lower and upper confidence limits respectively, in 2864.4 and 3153.1 mg/kg).The crude extract, the hexanic, dichloromethane, ethyl acetate, and buthanolic fractions and the tiroliside tested on nine different human tumour cell lines showed moderately cytostatic and/or cytocide in some concentrations, but no one of the samples showed high specificity to a single one type of tumour cell. Relating to the antimicrobial activity of the extracts, fractions and isolated compounds from these two plants , using the bioauthography method, diffusion and microdilution method against Gram-positive, Gram-negative bacteria and fungi one observed that they proved to be very active against the used bacteria only in the concentrations above 50 μg, with o activity against anyone of the tested fungi. The crude extract of P distinguenda presented a significant analgesic activity, of 30 mg/kg doses using the contortion method induced by acetic acid and in the hot plate method in the 30 and 100 mg/kg/dose. Relating to the antioxidant activity the crude extract, the hexanic fraction ,dichloromethane ,ethyl acetate and tirosilide showed themselves as trapping of the free radical DPPH, only in the concentrations above 6.25μg. The tiroliside presented a discrete inhibition on the AChE enzyme activity. / Das partes aéreas de Pavonia distinguenda Saint Hilaire e Naudin foram isolados os flavonóides glicosilados tilirosídeo e astragalina, b-sitosterol livre, lupeol, taraxerol, germanicol e. das raízes de Dorstenia brasiliensis Lam., psolareno, bergapteno, umbeliferona, e sacarose os quais foram identificados pela aplicação de técnicas de RMN 1D e 2D, CG-EM. O extrato bruto de P. distinguenda apresentou um índice de citotoxicidade para larvas de Artemia salina Leach com DL50 em 6,2 μg/mL, demonstrando potencial atividade antitumoral e/ou, inseticida. Nos testes de toxicidade aguda dose única, via intraperitoneal, apresentou DL50 em 1004,9 mg/kg, (limites de confiança em 731,8 e 1422,7 mg/kg), e para administração via oral, uma DL50 em 3002,1 mg/kg (limites de confiança inferior e superior, respectivamente, em 2864,4 e 3153,1 mg/kg). O extrato bruto, as frações hexânica, diclorometano, acetato de etila, butanólica, e o flavonóide tilirosídeo testados frente a nove diferentes linhagens de células tumorais humanas mostraram-se citostáticos e/ou citocidas em algumas das concentrações, porém nenhuma das amostras mostrou-se com elevada especificidade frente a um único tipo de célula tumoral. Em relação à atividade antimicrobiana dos extratos, frações e compostos isolados destas duas plantas, pelos métodos de bioautografia, difusão em ágar e microdiluição em caldo, frente a bactérias gram-positivas, gram-negativas e fungos, observou-se que estes mostraram-se ativos contra as bactérias utilizadas, somente nas concentrações acima de 50 μg, não sendo ativos contra nenhum dos fungos testados. O extrato bruto de P. distinguenda apresentou atividade analgésica significativa, nas doses de 30 mg/kg pelo método das contorções induzidas por ácido acético, e no método da placa quente nas doses de 30 e 100 mg/kg. Com relação à atividade antioxidante, o extrato bruto, as frações hexânica, diclorometano, acetato de etila e o flavonóide tilirosídeo apresentaram-se como bons trapeadores do radical livre DPPH, nas concentrações acima de 6,25 μg.O flavonóide tilirosídeo apresentou discreta inibição na atividade da enzima AChE.

Submitted by TATIANE FERNANDA SYLVESTRE null (thaty_sylvestre@hotmail.com) on 2018-03-09T14:15:45Z No. of bitstreams: 1 Doutorado versão final correções.pdf: 1948063 bytes, checksum: 67732e30851ac4f403a6e63c147faa2f (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Pizzani null (luciana@btu.unesp.br) on 2018-03-09T17:35:41Z (GMT) No. of bitstreams: 1 sylvestre_tf_dr_bot.pdf: 3415633 bytes, checksum: af28727bb056bb44e01fe82328f62eec (MD5) / Made available in DSpace on 2018-03-09T17:35:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 sylvestre_tf_dr_bot.pdf: 3415633 bytes, checksum: af28727bb056bb44e01fe82328f62eec (MD5) Previous issue date: 2018-02-28 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A paracoccidioidomicose (PCM) é uma doença sistêmica causada por fungos termodimórficos do complexo Paracoccidioides brasiliensis - P. brasiliensis e P. lutzii. Pacientes com PCM revelam comprometimento imune celular específico. Apesar do tratamento efetivo, os fungos quiescentes podem levar à recaída, geralmente tardia, cujo diagnóstico sorológico tem se mostrado pouco sensível. A sensibilidade do teste de imunodifusão é de cerca de 90% em pacientes com PCM não tratados, mas de apenas 45% em casos de recaída. Além disso, o soro de pacientes com PCM causada por P. lutzii, freqüente na região Centro-Oeste do Brasil, não reage com o antígeno clássico obtido do Pb B-339. No seguimento dos pacientes, continua a busca de um critério que dê maior segurança à decisão de se suspender o tratamento. Esses achados mostraram a necessidade de métodos alternativos de diagnóstico e seguimento, como os utilizados em proteômica, que constituiram o presente estudo. Assim, proteínas expressas no soro de pacientes com PCM em atividade - não tratada (causada por P. brasiliensis e por P. lutzii), com recaída da doença (causada por P. brasiliensis) e de controles saudáveis foram identificadas usando-se abordagem proteômica, realizada em quatro etapas - quantificação de proteínas, digestão de proteínas em solução, sequenciamento de peptídeos por espectrometria de massa e análise de dados para identificação de proteínas. Foram identificadas 29 proteínas plasmáticas à admissão, cuja comparação entre os grupos de pacientes sugeriu que a presença da immunoglobulin (Ig) alpha-2 chain C region e a ausência de Ig heavy chain V-III TIL indicariam infecção por P. lutzii e que a ausência da proteína complement factor B poderia ser um preditor de recaída. Na análise evolutiva das proteínas identificadas em pacientes com PCM por P. brasiliensis em tratamento, comparando-se aqueles que apresentaram com os que não revelaram recaída, 29 proteínas foram identificadas. As interações observadas entre as proteínas, usando transferrin e haptoglobin como a principal proteína de ligação, foram fortes com todas as demais. O acompanhamento desses pacientes sugere que a presença de cerulosplamin pode ser um marcador de recaída e que a de transferrin e a apolipoprotein A-II podem contribuir para a avaliação da cura e suspensão do tratamento, evitando que esta decisão seja muito precoce. A avaliação das proteínas selecionadas, identificadas por metodologia proteômica, deve ser realizada em um número maior de pacientes, para validar esses achados. / Paracoccidioidomycosis (PCM) is a systemic disease caused by thermodymorphic fungi of the Paracoccidioides brasiliensis complex - P. brasiliensis and P. lutzii. Patients with PCM reveal specific cellular immune impairment. Despite the effective treatment, quiescent fungi can lead to relapse, usually late, whose serological diagnosis has presented low sensitivity. The double agar gel immunodiffusion test shows a 90% sensitivity in untreated PCM patients, but it is much lower (45%) in cases of relapse. In addition, serum from patients with PCM caused by P. lutzii, frequent in the Midwest region of Brazil, do not react with the classical antigen obtained from Pb B-339. In the follow-up of the patients, persists the search of a criterium that gives a higher safety for treatment discontinuation. These findings showed the need for alternative methods for diagnosis and follow-up, such as those based on proteomics, which constituted the present study. Thus, serum expressed proteins from patients with active - untreated PCM (caused by P. brasiliensis and by P. lutzii), from relapsed PCM patients (caused by P. brasiliensis) and from healthy controls were identified using a proteomic approach, performed in four steps - protein quantification, protein digestion in solution, peptide sequencing by mass spectrometry and data analysis for protein identification. A total of 29 plasma proteins were identified at admission (before introduction of the treatment), and the comparison regarding groups suggested that the presence of the immunoglobulin (Ig) alpha-2 chain C region and the absence of heavy chain Ig V-III TIL are indicative of infection by P. lutzii and that the absence of the complement factor B protein may be a predictor of relapse. The evaluation of the proteins during the treatment follow-up of the PCM patients infected by P. brasiliensis, separated regarding the presence of relapse, identified 29 proteins. The interactions observed between the proteins, using transferrin and haptoglobin as the main binding protein, were strong with all the others. Patients’ follow-up suggests that cerulosplamin may be a marker of relapse and that transferrin and apolipoprotein A-II may contribute to the evaluation of cure and discontinuation of treatment, avoiding that this decision is too early. The study of the selected proteins in a higher number of patients should be carried out in order to validate these findings.

Orientador: Maria José Soares Mendes Giannini / Banca: Christiane Pienna Soares / Banca: Paulo Inácio da Costa / Banca: Márcia de Souza Carvalho Melhem / Banca: Gil Bernard / Resumo: Neste trabalho foi realizado um estudo comparativo entre isolados de Pb18 e Pb265, que têm capacidades distintas de adesão às células Hela e Vero, sob influência da temperatura e diversos fatores químicos. Foram também avaliados eventos em células de epitélio pulmonar expostas à gp 43 e células de Pb18, antes e após inoculação animal, representando, respectivamente, isolados menos e mais virulentos. Os resultados mostram que as adesinas fúngicas são termo-lábeis, sugerindo sua natureza protéica. Os açúcares aminados glucosamina e galactosamina foram os mais eficientes para inibir a adesão celular, em relação à manose, glicose e galactose, indicando que esta atividade envolve mecanismos específicos tipo lectina. O estudo com componente da matriz extracelular mostrou que a laminina, assim como seus derivados sintéticos, inibiu a adesão do isolado Pb18, fato não verificado com Pb265, tanto com células Hela, quanto com a linhagem Vero, mas variável sob influência de fatores químicos. As distintas vias de sinalização foram demonstradas pelos eventos Ras-Raf, Rho e AKT verificados, sendo que o isolado menos virulento causou menos estresse citotóxico, comprovado por menor sinal Ras- Raf e AKT de proliferação. Os sinais intensos de proliferação observados nos experimentos com o isolado mais virulento e exposição à gp 43 poderiam ser associados à maior sobrevida do fungo que se internaliza mais facilmente nas células do hospedeiro, dificultando o seu reconhecimento por células do sistema monocítico-fagocitário, antes de causar apoptose, evadir e disseminar-se. A ativação das vias de sobrevida, associada a sinais citosólicos quando o Pb entra na célula epitelial, foi demonstrada de modo inédito neste trabalho. / Abstract: In this work it was accomplished a comparative study between isolates Pb18 and Pb265, which have distinct capacities of adhesion to the cells Hela and Vero under influence of temperature and several chemical factors. Events in pulmonary epithelial cells exposed to gp 43 and in Pb18 cells, before and after animal inoculation, representing, respectively, isolates less and more virulent were evaluated as well. The results show that the fungal adhesins are term-labels, suggesting its proteical nature. The aminated sugars glucosamine and galactosamine were the most efficient, in comparison with manose, glycose and galactose, in inhibiting the cellular adhesion, indicating that this activity involves specific mechanisms lectin-type. The study with extracellular matrix component indicated that the laminin, as well as its synthetic derivatives, inhibited the adhesion of the isolate Pb18 to the cells Vero and Hela, what did not occur with Pb265, but it was variable under influence of chemical factors. The distinct signaling pathways were demonstrated by the Ras-Raf, Rho and AKT events, considering that the less virulent isolate caused minor cytotoxic stress, proved by minor Ras-Raf and AKT proliferation signals. The intense proliferation signals observed in the experiments with more virulent isolate and exposition to gp 43 could be associated to larger time of survival of the fungus that more easily goes inside the host cells, making it difficult to the monocyte-macrophage system cells to recognize it before the apoptosis, the evasion and the dissemination. The Ras-Raf and AKT pathways acted synergetically with the effects of the cell survival. The decrease of the AKT event implied partial loss of the survival signal that intensified, following and in a opposite way, with Ras-Raf decrease. The activation of the survival pathways, associated to citosolic signals when Pb goes inside the epithelial cell, was for the first time demonstrated in this work. / Doutor

Made available in DSpace on 2015-05-14T12:59:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 11268435 bytes, checksum: 7bd73b6e5fc0eab98e26e39c577c5b6b (MD5) Previous issue date: 2013-09-27 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The genera Borreria G. Mey. and Richardia L. belong to Rubiaceae family. Borreria verticillata (vassoura-de-botão) presents indole and isoquinoline alkaloids, iridoids, sesquiterpenes and steroids. It is popularly used for diabetes, bacterial infections, eczema, rheumatism, analgesic and antipyretic. Borreria ocymoides is used to treat fungal infections and eczema and due to morphological and anatomical similarity with B. verticillata is believed that might be being used with the same purposes as B. verticillata. Although there are no reports in the chemical literature, preliminary phytochemical screening revealed the presence of saponins, tannins, glycosides and anthraquinones. Richardia brasiliensis (ervanço and poaia) presents terpenoids, flavonoids and coumarins. Ethnopharmacological studies indicate emetic, antidiabetic, anthelmintic properties and for the treatment of eczema, burns, bronchitis, influenza and hemorrhoid. This work contributed to the phytochemical family Rubiaceae using B. verticillata, B. ocymoides and R. brasiliensis. For this, the plants were collected, identified and deposited in the Prof. Lauro Pires Xavier (JPB) herbarium. Dried and pulverized, the powder plant was subjected to extraction and partitioning. Then, the phase chromatography was subjected to chromatographic and spectroscopic methods for isolation and identification of substances, respectively. B. verticillata revealed the predominance of secondary metabolites belonging to the class of terpenoids (β-sitosterol, stigmasterol, betulinic acid, alcohol betulinic, oleanolic acid, ursolic acid, uvaol and 3β-hydroxyurs-11-en-28,13-β-olide) and as porphyrin derivatives (pheophytin a, pheophytin b and 151-hydroxy-(151-S)-porphyrin lactone a). B. ocymifolia showed a predominance of phenolic substances as coumarins (scopoletin, umbelliferone and cumarieletephyn), anthraquinones (2-hydroxy-3-methoxy-6-metilantracen-9,10-dione and 2-hydroxy-3-metilantracen-9,10-dione), and p-hydroxycinnamic acid and ursolic acid, showing a different chemical profile to morphologically similar Borreria. R. brasiliensis showed the presence of terpenoids: ursolic acid and uvaol. / Os gêneros Borreria G. Mey. e Richardia L. pertencem a família Rubiaceae. Borreria verticillata (vassoura-de-botão) apresenta alcaloides indólicos e isoquinolínicos, iridoides, esteroides e sesquiterpenos e é utilizada popularmente para diabetes, infecções bacterianas, eczema, reumatismo, antitérmica e analgésica. Borreria ocymoides é utilizada no tratamento de micoses e eczemas e em decorrência da semelhança morfo-anatômica com B. verticillata acredita-se que possa estar sendo utilizada com as mesmas finalidades que esta última. Apesar de não haver relato na literatura do ponto de vista químico, triagens fitoquímicas preliminares revelaram presença de saponinas, taninos, glicosídios e antraquinonas. Richardia brasiliensis (ervanço e poaia) apresenta terpenóides, flavonóides e cumarinas. Estudos etnofarmacológicos indicam propriedades emética, antidiabética, vermífuga e para o tratamento de eczema, queimaduras, bronquite, gripe, hemorróida e malária avícola. Este trabalho objetivou contribuir com os estudos fitoquímicos da família Rubiaceae utilizando B. verticillata, B. ocymoides e R. brasiliensis. Para isto, as espécies vegetais foram coletadas, identificadas e depositadas no Herbário Prof. Lauro Pires Xavier (JPB). Após secagem e pulverização, o pó das plantas foi submetido a processos de extração e particionamento. Em seguida, a fase cromatográfica foi submetida a métodos cromatográficos e espectroscópicos para isolamento e identificação das substâncias, respectivamente. B. verticillata revelou o predomínio metabólitos secundários pertencentes à classe dos terpenoides (β-sitosterol, estigmasterol, ácido betulínico, ácool betulínico, ácido oleanólico, ácido ursólico, uvaol e 3β-hidroxiurs-11-en-28,13-β-olídio), bem como, derivados porfirínicos (feofitina a, feofitina b e 151-hidroxi-(151-S)-porfirinolactona a). B. ocymifolia apresentou predomínio de substâncias fenólicas uma vez que foram isoladas cumarinas (escopoletina, umbeliferona e cumarieletefina), antraquinonas (2-hidroxi-3-metoxi-6-metilantraceno-9,10-diona e 2-hidroxi-3-metilantraceno-9,10-diona), além do ácido p-hidroxicinâmico e ácido ursólico, mostrando um perfil químico diferente para essas borrérias morfologicamente semelhantes. R. brasiliensis demonstrou a presença dos terpenóides: ácido ursólico e uvaol.

As intoxicações por Senecio spp. estão entre as principais causas de morte no Sul do Brasil, sendo o controle desse gênero de plantas prioritário para a pecuária local. Uma área de 5,5 hectares severamente infestada por Senecio brasiliensis e Senecio madagascariensis foi roçada e submetida ao pastejo por ovinos e bovinos. Uma população total de 28.629 plantas, entre S. brasiliensis (10.122) e S. madagascariensis (18.507) foi virtualmente eliminada em um período de dois anos. O número de ovinos foi mantido em três unidades por hectare, mas variáveis lotações de bovinos foram associadas com a disponibilidade de forragem. As principais práticas de manejo sanitário aplicadas aos ovinos foram administrações de anti-helmínticos e controle de ectoparasitas. Biópsias hepáticas, colhidas antes e após o período de estudo, não revelaram qualquer alteração histopatológica associável com seneciose. Os níveis de desempenho dos ovinos foram acompanhados através do controle da reprodução, produção de lã e ganho de peso. O desempenho produtivo dos ovinos mantidos sob o pastejo da área infestada por Senecio spp. foi similar ao grupo controle e comparável com o observado em rebanhos manejados em sistemas extensivos tradicionais no Sul do Brasil. / Since poisoning by Senecio spp. is one of the main causes of cattle death in southern Brazil, control of these plants is a priority for the local livestock production. After the pasture has been mowed, grazing by sheep and cattle was efficient for controlling Senecio brasiliensis and Senecio madagascariensis populations in a 5.5-hectare area that had long been severely infested with these species. A total of 28,629 plants among S. brasiliensis (Flower of souls - 10,122) and S. madagascariensis (fireweed - 18,507) were almost completely eliminated in a two year period. The number of sheep was kept at 3.0 stock units/ ha, but a variable number of cattle were temporarily stocked according to pasture availability. The major sanitary practices applied to the sheep were anthelmintic administration and ectoparasites control. Liver biopsies taken from sheep and cattle before and after experimental period didn´t reveal any change associable with seneciosis. The performance levels of the senecio-grazing sheep were similar to the control group and comparable to those observed in flocks managed under traditional extensive grazing systems in southern Brazil.

Paracoccina (PCN) é um constituinte de Paracoccidioides brasiliensis, um patógeno humano que causa a paracoccidioidomicose, micose sistêmica mais prevalente na América Latina. A PCN é uma proteína de função dual, com domínios de atividade lectínica e de N-acetilglicosaminidase. Análises proteômicas da preparação paracoccina revelaram a sua correspondência com uma proteína hipotética de P. brasiliensis do isolado 18 (Pb18), anotada como PADG-3347.1, que tem sequência polipeptídica semelhante a família das endoquitinases 18. Essas endoquitinases apresentam domínios distintos de atividade lectínica e enzimática. O conjunto de exons do gene correspondente, PADG-3347.1, foi clonado e expresso em E. coli, e as características físicas e biológicas da proteína recombinante foram comparadas com as da PCN. Além disso, a PADG-03347.1 recombinante (rPCN) foi avaliada por suas propriedades imunomoduladoras e sua capacidade em conferir proteção contra a infecção por P. brasiliensis. Nesse sentido, investigamos a interferência da administração profilática e terapêutica de rPCN no curso da infecção por P. brasiliensis em camundongos BALB/c. A histopatologia pulmonar dos camundongos tratados com a rPCN, mostrou menor ocorrência de granulomas, e estes também foram menores do que os observados nos animais controles. Consistente com a observação de poucas leveduras no centro dos granulomas, a contagem de UFC a partir do homogenato pulmonar dos camundongos tratados foi inferior ao observado nos animais controles. Além disso, a administração de rPCN, foi associada com altos níveis de IL-12, IFN-, TNF-, NO e IL-10 detectados no homogenato pulmonar. Os altos níveis de citocinas produzidos nos animais tratados com rPCN nos levou a investigar a ocorrência de interação da lectina com receptores presentes em células da imunidade inata, tais como TLR2 e TLR4. Verificamos que a rPCN ativa TLR2, nas formas homo ou heterodimérica, e TLR4, de modo independente dos correceptores CD14 e CD36. Estes dados revelam um possível mecanismo pelo qual rPCN gera proteção nos camundongos contra a PCM. rPCN, administrada terapêutica ou profilaticamente, induz a ativação de TLRs e imunidade Th1, conferindo proteção contra a infecção por P. brasiliensis. / Paracoccin is a constituent of Paracoccidioides brasiliensis, a human pathogen that causes paracoccidioidomycosis, the most prevalent systemic mycosis in Latin America. Paracoccin is a dual function protein exerting lectin and N-acetylglucosaminidase activities. Proteomic analysis of paracoccin preparation revealed its correspondence with a hypothetical protein from P. brasiliensis isolate Pb18 (Pb18), annotated as PADG-3347.1, which has a polypeptide sequence similar to the family 18 endochitinases. These endochitinases have distinct lectin and enzymatic domains. The multi-exon assembly of the correspondent gene (PADG-3347) was cloned and expressed in E. coli, and the physical and biological features of the recombinant protein were compared to those of the native paracoccin. Moreover, recombinant PADG-3347.1 (rPCN) was evaluated for its immunomodulatory properties and its ability to confer protection against murine P. brasiliensis infection. Thus, we investigated the interference of prophylactic and therapeutic administration of rPCN on the course of P. brasiliensis infection in BALB/c mice. The pulmonary histopathology of the treated mice showed lower incidence of granulomas, which were also smaller than those observed in the control animals. Consistently with the observation of few yeasts in the center of the granulomas, the CFU count provided by lung homogenates of treated mice was lower than the provided by control mice. Furthermore, administration of rPCN was associated with higher levels of IL-12, IFN-, TNF-, NO and IL-10, detected in the lung homogenates of animals. The high levels of cytokines produced in the rPCN treated mice prompted us to investigate the occurrence of interaction of the lectin with receptors present in innate immune cells, such as TLR2 and TLR4. We verified that rPCN activates TLR2,in homo or heterodimeric forms, and TLR4, in a manner that does not depend on CD14 and CD36 coreceptors. These data reveal a possible mechanism by which rPCN generates protection in mice against PCM. rPCN, administered therapeutic or prophylactically, induces TLRs activation and Th1 immunity, conferring protection against P. brasiliensis infection.

As intoxicações por Senecio spp. estão entre as principais causas de morte no Sul do Brasil, sendo o controle desse gênero de plantas prioritário para a pecuária local. Uma área de 5,5 hectares severamente infestada por Senecio brasiliensis e Senecio madagascariensis foi roçada e submetida ao pastejo por ovinos e bovinos. Uma população total de 28.629 plantas, entre S. brasiliensis (10.122) e S. madagascariensis (18.507) foi virtualmente eliminada em um período de dois anos. O número de ovinos foi mantido em três unidades por hectare, mas variáveis lotações de bovinos foram associadas com a disponibilidade de forragem. As principais práticas de manejo sanitário aplicadas aos ovinos foram administrações de anti-helmínticos e controle de ectoparasitas. Biópsias hepáticas, colhidas antes e após o período de estudo, não revelaram qualquer alteração histopatológica associável com seneciose. Os níveis de desempenho dos ovinos foram acompanhados através do controle da reprodução, produção de lã e ganho de peso. O desempenho produtivo dos ovinos mantidos sob o pastejo da área infestada por Senecio spp. foi similar ao grupo controle e comparável com o observado em rebanhos manejados em sistemas extensivos tradicionais no Sul do Brasil. / Since poisoning by Senecio spp. is one of the main causes of cattle death in southern Brazil, control of these plants is a priority for the local livestock production. After the pasture has been mowed, grazing by sheep and cattle was efficient for controlling Senecio brasiliensis and Senecio madagascariensis populations in a 5.5-hectare area that had long been severely infested with these species. A total of 28,629 plants among S. brasiliensis (Flower of souls - 10,122) and S. madagascariensis (fireweed - 18,507) were almost completely eliminated in a two year period. The number of sheep was kept at 3.0 stock units/ ha, but a variable number of cattle were temporarily stocked according to pasture availability. The major sanitary practices applied to the sheep were anthelmintic administration and ectoparasites control. Liver biopsies taken from sheep and cattle before and after experimental period didn´t reveal any change associable with seneciosis. The performance levels of the senecio-grazing sheep were similar to the control group and comparable to those observed in flocks managed under traditional extensive grazing systems in southern Brazil.

Defeitos ósseos assumem importância na crescente prevalência de condições crônicas de saúde, agravando-se conforme o envelhecimento da população. O tratamento convencional baseia-se no transplante autólogo e abordagens extremamente invasivas. Uma proposta promissora é a obtenção de tecidos saudáveis em laboratórios utilizando suportes tridimensionais porosos (scaffolds) que atuarão como arcabouço para o crescimento e diferenciação de células tronco mesenquimais (CTMs) podendo ser otimizados para proporcionar adequada vascularização, uma importante característica na regeneração óssea. CTMs apresentam potencial de diferenciação, imunoregulação e angiogênese. O pico proteico F1 do soro do látex da seringueira Hevea brasiliensis apresenta importante atividade angiogênica e cicatrizante. O objetivo deste trabalho foi investigar a influência de scaffolds de policaprolactona (PCL) colonizados com CTMs na osteogênese experimental in vitro e in vivo (xenotransplante), a segurança e a influência do pico F1 do látex em cultura de CTMs aplicadas no scaffold de PCL e PCL reforçado com diferentes concentrações de grafeno (PCL/grafeno) na proliferação e diferenciação osteogênica. Para isso, as CTMs foram isoladas do tecido adiposo humano (ADSCs), caracterizadas por imunofenotipagem e diferenciação in vitro. Scaffolds de PCL, produzidos por técnica de manufatura aditiva, foram avaliados quanto ao potencial de adesão/viabilidade celular (ensaio MTT), diferenciação osteogênica (vermelho de alizarina) e potencial in vivo de osteointegração e osteoindução em defeito crítico de calvária avaliados por histologia e imunoistoquímica. O pico F1 do látex, em diferentes concentrações, foi avaliado em cultura de ADSCs e fibroblastos 3T3 quanto a citotoxicidade (MTT), potencial proliferativo (timidina-tritiada), migratório (scratch assay) e indução osteogênica (fosfatase alcalina). Scaffolds de PCL foram reforçados com grafeno (PCL/grafeno), revestidos com pico F1 (adsorção), avaliados quanto a viabilidade/proliferação celular (Alamar blue) e diferenciação osteogênica (fosfatase alcalina e vermelho de alizarina). A imunofenotipagem das ADSCs demonstrou baixa percentagem para marcadores negativos, alta para os positivos e diferenciação in vitro, comprovando o sucesso do isolamento e manutenção das ADSCs. O scaffold de PCL apresentou não-toxicidade e diferenciação osteogênica induzida pelo meio de cultura. Scaffolds de PCL, pré-colonizado e não colonizado com ADSCs, foram implantados em defeito crítico de calvária de ratos. O grupo que recebeu scaffolds com ADSCs humanas proporcionou melhor formação óssea no animal, com participação direta e indireta das ADSCs neste processo. Nos ensaios in vitro com o pico F1 (cultura 2D), observou-se estímulo proliferativo para as concentrações de 0.00001% e 0.0001%, além de maior percentagem de migração celular para as concentrações de 0.001%, 0.0001% e 0.00001%, diferentes do controle. Os scaffolds de PCL/grafeno demonstraram estimulo proliferativo quando colonizados por ADSCs e este estímulo foi ainda maior em scaffolds revestidos com F1, principalmente na concentração de 0.75% de grafeno. Embora o pico F1 não tenha potencializado a diferenciação osteogênico em cultura 2D, este estímulo foi observado em scaffolds revestidos com F1 com superior atividade da fosfatase alcalina. Este trabalho demonstrou sucesso no emprego de ADSCs humanas e scaffolds in vitro e in vivo (transplante xenogênico) para regeneração óssea, além de apresentar dois promissores produtos para engenharia tecidual como os scaffolds com reforço de grafeno em baixas concentrações e o pico proteico F1 na proliferação e diferenciação celular. / The increment of life expectancy and frequency of chronic diseases in the population has led to an increasing incidence of chronic bone defects. Conventional treatment is based on autologous transplantation, which depends on extremely invasive approaches. A promising proposal is to obtain healthy tissues in laboratories using porous three-dimensional matriz (scaffolds), which enable cellular growth and differentiation of mesenchymal stem cells (MSCs). Scaffolds can be optimized to provide adequate vascularization, a critical event to bone regeneration. MSCs have potential for differentiation, immunoregulation and angiogenesis. F1 natural latex protein from Hevea brasiliensis rubber tree presents important angiogenic and healing activity. The objective of this work was to investigate the influence of pre-colonized polycaprolactone (PCL) scaffolds on experimental in vitro and in vivo osteogenesis (xenotransplantation) and also the safety and influence of F1 protein on MSCs seeded on PCL and PCL reinforced with different concentrations of graphene scaffolds (PCL/graphene) in cell proliferation and osteogenic differentiation. MSCs were isolated from human adipose tissue (ADSCs), characterized by positive and negative markers and also in vitro differentiation. PCL Scaffolds, produced by an additive manufacturing technique, were evaluated for cell adhesion/viability potential (MTT assay), osteogenic differentiation (alizarin red) and in vivo xenogenic grafting potential for osteointegration and osteoinduction evaluated by histology and immunohistochemistry. F1 latex protein, prepared in different concentrations, was evaluated in contact with ADSCs and 3T3 fibroblasts culture in vitro regarding to cytotoxicity (MTT), proliferative potential (tritiated thymidine), migratory (scratch assay) and osteogenic induction (alkaline phosphatase). PCL scaffolds were reinforced with graphene (PCL/graphene scaffolds), coated with F1 protein (adsorption) and evaluated for cell viability/proliferation assay (Alamar blue) and osteogenic differentiation (alkaline phosphatase and alizarin red). ADSCs showed low percentage for negative markers, high percentage for positive markers and differentiation properties in vitro, providing enough information on the successful isolation and maintenance of human ADSCs. PCL scaffolds showed non-toxicity activity and osteogenic differentiation induced by culture medium. PCL scaffolds, pre-colonized and non-colonized with ADSCs, were implanted in a critical calvarial defect in rats. The group of rats which received scaffolds with ADSCs to treat the bone defect had improved bone formation with direct and indirect participation of ADSCs to the bone repair process. To in vitro assays with F1 (2D culture model), proliferative stimulus was observed to F1 0.00001% and 0.0001% samples, in addition to a higher percentage of cell migration to 0.001% and 0.0001%, different from control. PCL/graphene scaffolds demonstrated proliferative stimulation when colonized by ADSCs and this stimulus was even higher to F1 coated PCL/graphene scaffolds, mainly to 0.75% graphene. Although F1 have not enhanced osteogenic differentiation on 2D cell culture model, the stimulus was observed to F1 coated scaffolds with higher alkaline phosphatase activity. This work demonstrated success in the use of ADSCs and scaffolds for bone regeneration and presented two promising products to be applied in tissue engineering field, such as, scaffolds with graphene reinforcement at low concentration and F1 latex protein to improve cell proliferation and differentiation.

Made available in DSpace on 2014-07-29T15:16:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao - Mestrado em Biologia - ICB-UFG - Rodrigo Santos.pdf: 3002708 bytes, checksum: 4989a790c4cb26bc50f51abf0c8cfe16 (MD5) Previous issue date: 2009-05-29 / The fungus Paracoccidioides brasiliensis is a human pathogen with a wide distribution in Latin America. The fungus causes paracoccidioidomycosis when mycelia reachs the lungs. The success of the infection depends on the acquisition of essential micronutrients such as copper, which is required as cofactor for a variety of enzymes important in biological in several processes, such as respiration, growth and acquisition of iron. Previous studies, of the Laboratory of Molecular Biology showed that a high affinity copper transporter (PbCTR3) is a molecule highly expressed and probably necessary for the infection establishment of by P. brasiliensis. In the present study were isolated and characterized the genomic and cDNA sequences encoding for PbCTR3 of P. brasiliensis. The cDNA presented 582 base pairs and encodes for a protein with 193 amino acids, predicted molecular mass of 21.5 kDa and pI of 8.6. The genomic sequence has four exons interrupted by three introns. In silico analysis was performed on the database of the structural genome of P. brasiliensis (http://www.broad.mit.edu/annotation/genome/paracoccidioides_brasiliensisMultiHome.html) , where genes involved in maintaining the homeostasis of copper have been identified and used to design of a model of copper homeostasis in P. brasiliensis. The transcriptional behavior of Pbctr3 and genes involved in copper homeostasis were examined during exposure of yeast cells of P. brasiliensis to copper and iron depletion conditions, by real time qRTPCR. It was demonstrated a significant change in transcription lovel those of genes in the absence of copper, as well as in the combined absence of both metals. qRT-PCR was used to analyze the expression of Pbctr3 and Pbcrp (which encodes a protein responsive to copper) in yeast cells of P. brasiliensis derived from infected lungs and spleen at different time points of infection. The expression of Pbctr3 and Pbcrp was super-regulated during experimental infection. Taken together, these data suggest the importance of PbCtr3 and of absorbing copper / iron during the infectious process / O fungo Paracoccidioides brasiliensis é um patógeno humano com ampla distribuição na América Latina. O fungo causa a paracoccidioidomicose quando propágulos da fase miceliana atingem os pulmões do hospedeiro. O sucesso da infecção depende da aquisição de micronutrientes essenciais como o cobre, o qual é requerido como cofator por uma diversidade de enzimas importantes em processos biológicos essenciais, tais como: respiração, crescimento e aquisição de ferro. Estudos prévios, do Laboratório de Biologia Molecular, demonstraram que um transportador de cobre de alta afinidade (PbCTR3) é uma molécula altamente expressa e provavelmente necessária para o estabelecimento da infecção por P. brasiliensis. No presente estudo foram isoladas e caracterizadas as seqüências genômica e do cDNA que codificam para PbCTR3 de P. brasiliensis. O cDNA apresentou 582 pares de bases e codifica para uma proteína com 193 aminoácidos, massa molecular predita de 21,5 kDa e pI de 8.6. A seqüência genômica apresenta quatro exons interrompidos por três introns. Análises in silico foram realizadas no banco de dados do genoma estrutural de P. brasiliensis (http:www.broad.mit.edu/annotation/genome/paracoccidioides_brasiliensis/ MultiHome.html), onde genes envolvidos na manutenção da homeostase de cobre foram identificados e as seqüências utilizadas para a elaboração de um modelo de fatores envolvidos na manutenção da homeostase de cobre por P.brasiliensis. O comportamento transcricional do gene Pbctr3 e de genes envolvidos na manutenção da homeostase de cobre foram analisados durante a exposição de células leveduriformes de P. brasiliensis em condições de depleção de cobre e ferro por qRT-PCR em tempo real. Foi demonstrada uma alteração significativa no nível de transcrição dos genes na ausência de cobre, assim como na ausência combinada dos dois metais. qRT-PCR em tempo real foi utilizado para analisar a expressão de Pbctr3 e de Pbcrp (que codifica uma proteína responsiva ao cobre) em células leveduriformes de P. brasiliensis derivadas de pulmão e baço infectados, em diferentes tempos. A expressão de Pbctr3 e Pbcrp foi super-regulada durante a infecção experimental. Tomados em conjunto, esses dados sugerem a importância de Pbctr3 e do sistema de absorção cobre/ ferro durante o processo infeccioso

Submitted by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2017-03-27T14:12:27Z No. of bitstreams: 2 Tese - Lilhian Alves de Araújo - 2017.pdf: 5322101 bytes, checksum: 57793fec5ba7f799bab9153daa5b7952 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2017-03-27T14:41:27Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Tese - Lilhian Alves de Araújo - 2017.pdf: 5322101 bytes, checksum: 57793fec5ba7f799bab9153daa5b7952 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-03-27T14:41:27Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Tese - Lilhian Alves de Araújo - 2017.pdf: 5322101 bytes, checksum: 57793fec5ba7f799bab9153daa5b7952 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2017-03-06 / Sepsis is an infectious disease characterized by severe systemic inflammatory response. Rupture of the complex equilibrium between inflammatory mediators in the acute phase of the disease leads to exacerbated production of proinflammatory cytokines, with consequent hypotension, increased capillary permeability, organ lesions and death. Recent research using the Hev b 13 protein derived from natural Hevea brasiliensis (rubber tree) latex has demonstrated important anti-inflammatory and immunomodulating effects. The aim of this study was to investigate the effects of Hev b 13 on the systemic and tissue inflammatory response of septic rats. To that end, cecal ligation and puncture (CLP) was performed on male Wistar rats and after six hours, the animals were randomized into groups and subcutaneously treated with doses of 0.5; 2.0 and 3.0 mg/Kg of Hev b 13. Next, the animals were subdivided into three different times (1, 6 and 24 hours after treatment) for blood sample collection and euthanasia with removal of the lungs and liver. Leukocytes, tumor necrosis factor- alpha (TNF-α) plasma and tissue levels, interleukin (IL)-6, IL-10, and IL-4 and histological slides were analyzed. The results demonstrated that treatment with the Hev b 13 protein prompted a significant decline in total and differential leukocytes, as well as the production of TNF-α and IL-6, associated with an increase in IL-10 and IL-4 in plasma and lung tissue. Moreover, it restricted the morphopathological changes found in the lungs, including neutrophil infiltration, swelling and alveolar thickening. In the liver, it increased IL-10 production and inhibited TNF-α and IL-6, in addition to reducing hemorrhage, sinusoidal inflammatory infiltrates and hydropic degeneration in histological assessment. We conclude that Hev b 13 displays anti-inflammatory and immunomodulating activity capable of attenuating lung and liver lesions in rats during acute sepsis, with potential for clinical applications. / Sepse é uma doença infecciosa caracterizada por uma resposta inflamatória sistêmica grave. A ruptura do complexo equilíbrio entre os mediadores inflamatórios na fase aguda da doença leva a uma produção exacerbada de citocinas pró-inflamatórias, com conseguinte hipotensão, aumento da permeabilidade capilar, lesões de órgãos e morte. Pesquisas recentes utilizando a Hev b 13, proteína derivada do látex natural da Hevea brasiliensis (seringueira), tem demonstrado importantes efeitos anti-inflamatórios e imunomoduladores. O objetivo deste estudo foi investigar os efeitos da Hev b 13 na resposta inflamatória sistêmica e tecidual de ratos com sepse. Para isso, foi realizado ligadura e perfuração do ceco (LPC) em ratos machos Wistar e, após seis horas, os animais foram randomizados em grupos e tratados com as doses 0,5; 2,0 e 3,0 mg/Kg de Hev b 13 subcutâneo. Posteriormente, subdividiu-se os animais em três tempos diferentes (1, 6 e 24 horas após os tratamentos) para coleta de amostras sanguíneas e eutanásia com remoção dos pulmões e fígado. Foram analisados os leucócitos, concentrações plasmáticas e teciduais de fator de necrose tumoral-α (TNF-α), interleucina (IL) 6, IL- 10, IL-4 e lâminas histológicas. Os resultados demonstraram que no tratamento com a proteína Hev b 13 houve redução significativa dos leucócitos totais e diferenciais bem como na produção de TNF-α e IL-6, associado ao aumento de IL-10 e IL-4 no plasma e tecido pulmonar. Além disso, restringiu as alterações morfopatológicas encontradas nos pulmões, incluindo infiltrado de neutrófilos, edema e espessamento alveolar. No fígado, aumentou a produção de IL-10 e inibiu TNF-α e IL-6, além de reduzir hemorragia, infiltrado inflamatório sinusoidal e degeneração hidrópica na avaliação histológica. Concluímos que a Hev b 13 possui atividade anti-inflamatória e imunomoduladora capaz de atenuar lesões nos pulmões e fígado de ratos durante a sepse aguda, com potencialidades para aplicabilidade clínica.