Nesse trabalho avaliamos a proteção que o anticorpo monoclonal (AcM) contra CMH e contra Hsp60 fornecem aos animais infectados com as leveduras de Paracoccidioides brasiliensis e P. lutzii em modelo profilático. O tratamento com os AcMs de isotipos IgG2a e IgG2b foram protetores, induzindo a secreção das citocinas IL-12p70, IFN-<font face=\"Symbol\">g e TNF-<font face=\"Symbol\">a, padrão de resposta imune Th1. Nós mostramos por imunomarcação que moléculas de CMH e Hsp60 estão acessíveis na célula. E o anticorpo monoespecífico contra CMH e os anticorpos policlonais contra melanina, gerados nesse trabalho foram eficazes nos ensaios in vitro de proteção. Foram gerados anticorpos monoclonais contra glicoproteina extraída de Pb18, o AcM reconheceu, por imunomarcação, estruturas internas e a parede celular da levedura. Avaliamos um novo modelo de hospedeiro, com o uso da larva Galleria mellonella, o que pode servir de triagem e reduzir desta forma o uso excessivo de camundongos, as leveduras P. lutzii e H. capsulatum são letais para as larvas e evocam resposta celular que se organizam semelhante a um granuloma. / In this work we evaluated the protection that the monoclonal antibody (MAb) against Hsp60 and against CMH provides the animals infected with the yeast Paracoccidioides brasiliensis and P. lutzii in prophylactic model. The treatment with the MAbs of IgG2a and IgG2b isotypes were protective, inducing the secretion of IL-12p70, IFN-<font face=\"Symbol\">g and TNF-<font face=\"Symbol\">a, Th1 pattern of immune response. We show by immunogold that Hsp60 and MHC molecules are accessible on the cell. And the monospecific antibody against HCM and polyclonal antibodies against melanin, generated in this study were effective in in vitro assays of protection. Monoclonal antibodies were generated glycoprotein extracted from Pb18, Mab recognized by immunogold, internal structures and cell wall material. Evaluated a new type of host, using the larvae Galleria mellonella, which can serve as a screening and reduce thus the overuse of mice, yeast P. lutzii and H. capsulatum are lethal to larvae and evoke cellular responses that are organized like a granuloma.

O presente estudo visou avaliar os possiveis efeitos imunotóxicos e imunoteratogênicos da integerrimina N-óxido presente no resíduo butanólico (RB) do ,Senecio brasiliensis, uma planta hepatotóxica que contém alcalóides pirrolizidínicos (APs). Tem sido relatado o uso de APs como fitoterápicos em todo o mundo e também como contaminantes de pastagens e alimentos, sendo assim responsáveis por intoxicações em animais de produção e humanos; porém, até o momento, não há relatos de sua ação sobre o sistema imune. Assim, após a extração da planta, quantificou-se no RB de Senecio brasiliensis, por meio de análise elementar e de espectro (1H e 13C), cerca de 70% de integerrimina N-óxido. O RB foi administrado a ratos Wistar machos adultos, nas doses de 3, 6 e 9 mg/kg, por gavagem, durante 28 dias. Foram avaliados o ganho de peso, o consumo de alimento, os órgãos linfóides e a fenotipagem de sua células, a atividade de fagócitos, as respostas imunes humoral e celular e atividade proliferativa de linfócitos. Já ratas gestantes, receberam as mesmas doses do RB do 6º ao 20º dia de gestação. No final da gestação, parte das fêmeas foi destinada à cesariana e as restantes prosseguiram à termo até o nascimento, para a análise das proles aos 60 dias de idade. Os fetos provenientes da cesariana foram avaliados quanto ao tamanho, peso, viabilidade e malformações externas e também submetidos à análise óssea. As mães tiveram seu desempenho reprodutivo avaliado. Naquelas proles avaliadas até 60 dias de idade, procedeu-se a avaliação dos órgãos linfóides e dos parâmetros hematológicos. O presente estudo revelou que integerrimina N-óxido promoveu diminuição no ganho de peso corporal de ratos machos adultos, redução na atividade proliferativa das células T e interfência na contagem de células sanguíneas destes animais. Por outro lado, esses mesmos animais não apresentaram diferenças na atividade de fagócitos, na fenotipagem de linfócitos e nas respostas imunes estudadas. Em ratas gestantes, o RB causou hepatotoxidade, diminuição do ganho de peso materno, diminuição no tamanho das placentas. A análise fetal revelou menor ossificação. Quando da avaliação da prole aos 60 dias de idade, não foram observados efeitos no ganho de peso atribuídos ao RB, nos órgãos linfóides, e também parâmetros hematológicos e bioquímicos. Concluindo, os estudos aqui realizados permitem sugerir que as doses baixas de integerrimina N-óxido ora empregadas, não promovem efeitos imunotóxicos significantes, bem como não apresentaram potencial teratogênico, seja por meio das avaliações clássicas de teratologia quanto naqueles protocolos de imunoteratogenicidade. / The aim of this study was to evaluate the possible immunotoxic and immunoteratogenic effects of integerrimine N-oxide content in the butanolic residue (BR) of Senecio brasiliensis, a hepatotoxic plant that contained pyrrolizidine alkaloids (PAs). PAs have been reported as a pasture and food contaminant and as herbal medicine used worldwide and are related to promote poisoning events in livestock and human beings. After the plant extraction, BR residue from Senecio brasiliensis was submitted to elemental and spectral analyses (1H and 13C ) and was found to contain approximately 70% of integerrimine N-oxide by, which was administered to adult male Wistar rats at doses of 3, 6 and 9 mg/kg for 28 days, by gavage. Body weight gain, food consumption, lymphoid organs and their cell phenotype, phagocyte analysis, humoural and cellular immune responses, and lymphocyte proliferation were evaluated. In addition, pregnant rats received the same doses of BR from the 6th to the 20th gestational day. In late pregnancy, some of the dams were destined for cesarean section and the other females followed the pregnancy until the birth for offspring analysis at 60 days old. Fetuses from cesarean section were evaluated for size, weight, viability and external malformations and also subjected to bone analysis. The reproductive performance of females were performed. The present study showed that integerrimine N-oxide could promote in adult male Wistar rats, body weight gain impairment, interference with blood cell counts and a reducing T cell proliferative; however, no differences in phagocyte activities, lymphocytes phenotyping and immune responses here evaluated were observed. In pregnant rats, BR caused hepatotoxicity, decreased body weight gain and reduced placental size. Fetus analysis showed lower ossification. When 60-days old offspring were it was not observed any toxic effects resulted from BR exposition in body weight gain, lymphoid organs, haematological and biochemical parameters of these rats. It is concluded that low doses of integerrimine N-oxide here employed did not produce marked immunotoxic effects and seems to be a teratogenic signs by both methods, the classical evaluations or by immunoteratological protocols.

A esporotricose caracteriza-se como uma micose subcutânea causada por fungos dimórficos do gênero Sporothrix, capazes de acometer o homem e uma grande variedade de animais, dentre eles os felinos. A princípio, Sporothrix schenckii era a única espécie conhecida como responsável pela esporotricose. Após estudos genotípicos e fenotípicos de isolados ambientais, clínicos humanos e animais, verificou-se alta variabilidade entre os isolados e estabeleceu-se a existência de um Complexo Sporothrix. Dentro deste, a maior causadora de surtos epidêmicos, justificada por uma maior virulência e capacidade de evasão da resposta imune, é a espécie Sporothrix brasiliensis. Nesse sentido, dada a ausência de estudos direcionados a está espécie, objetivou-se avaliar a importância de receptores Toll like-2 (TLR-2) e Toll like-4 (TLR-4) na infecção por S. brasiliensis. Além disso, utilizando técnicas de proteômica, procurou-se elucidar proteínas diferencialmente expressas em S. brasiliensis quando comparado à espécie S. schenckii. Para avaliação da resposta imune utilizaram-se modelos in vitro e in vivo de infecção, e para a investigação das proteínas diferencialmente expressas, utilizou-se a técnica de proteômica Bottom-up. A investigação da resposta imune in vitro mostrou a dependência dos receptores TLR-2 e TLR-4 no desencadeamento da resposta imune. Os ensaios in vivo mostraram a importância desses receptores no controle da infecção e dependência dos mesmos na produção de citocinas, principalmente nos primeiros 14 dias de infecção. Na ausência do receptor TLR-2, houve a polarização de resposta Th17 na tentativa de controle da infecção. Quando avaliadas as diferenças entre as espécies S. brasiliensis e S. schenckii, em termos de proteínas expressas, verificou-se que S. brasiliensis expressa diferencialmente 60 proteínas. Dentre essas, 9 são relatadas na literatura, como importantes na virulência e escape imunológico dos principais fungos de importância médica. Os resultados encontrados no presente trabalho permitem concluir que reconhecimento de S. brasiliensis é dependente dos receptores TLR-2 e TLR-4. Estudos que investiguem a utilização de outras vias de sinalização como mecanismos compensatórios, bem como, o sinergismo desses receptores no contexto da infecção por S. brasiliensis são fundamentais na compreensão da fisiopatologia dessa doença. No que tange a caracterização proteica, estudos com mutantes para cada uma das proteínas descritas nesse trabalho devem ser avaliados. / Sporotrichosis is a subcutaneous mycosis caused by dimorphic fungi of the genus Sporothrix that affects humans and animals, predominantelly felines. Inicially, Sporothrix schenckii was the only specie associated to sporotrichosis. However, after genotypic and phenotypic studies of human and animal clinical isolates, a high variability among the isolates was found and was concluded the existence of a complex: the Sporothrix Complex. Inside the Sporothrix complex, the major cause of epidemic outbreaks, justified by a greater virulence and ability to evade the immune system, is Sporothrix brasiliensis. Concerning this, the absence of studies directed to this specific specie, the aim was to evaluate the importance of Toll like receptor-2 (TLR-2) and Toll like receptor-4 (TLR-4) during S. brasiliensis infection. In addition, was look using proteomics techniques, the proteins differentially expressed in S. brasiliensis when compared to S. schenckii. To evaluate the immune response, in vitro and in vivo tecniques were used, and for the investigation of differentially expressed proteins, the Bottom-up proteomics technique was used. The investigation of the in vitro immune response showed the dependence of TLR-2 and TLR-4 receptors on phagocytosis and the production of inflammatory mediators, such as cytokines and NO. In vivo assays showed the importance of these receptors to control the infection and their dependence on cytokine production during the first 14 days of infection. In the absence of the TLR-2 receptor, the Th17 response was polarized in an attempt to control the infection. Evaluating the differences between S. brasiliensis and S. schenckii, in terms of expressed proteins, it was verified that S. brasiliensis differentially expressed 60 proteins. Among these, 9 are reported in the literature, as important in the virulence and immune evasion among the most important medical fungi. The results found in the present study allow to conclude that S. brasiliensis recognition is dependent on TLR-2 and TLR-4 receptors. Studies investigating the use of other signaling pathways as compensatory mechanisms, as well as the synergism of these receptors in the context of S. brasiliensis infection, are fundamental to understand the pathophysiology of this disease. Regarding the protein characterization, studies with mutants for each of the proteins described in this work should be evaluated.

As repetições ricas em leucina (LRR) são domínios presentes em diversas famílias de proteínas com diferentes funções, sendo responsáveis pela formação de uma estrutura capaz de estabelecer interações protéicas. Em decorrência do projeto de caracterização de um segmento do cromossomo 17 de L. amazonensis, identificamos um gene que codifica uma proteína de 72 kDa, contendo em sua região central, seis motivos LRR. Genes ortólogos estão presentes nos genomas de L. major e L. braziliensis. Observamos que o gene LRR17 é regulado de forma distinta ao longo dos ciclos biológicos de L. braziliensis e L. amazonensis. A proteína LRR17 de L. braziliensis e secretada tanto nos estágios promastigota como amastigota. Identificamos também a secreção da proteína LRR17 em promastigotas de L. amazonensis. Obtivemos mutantes hiperexpressores da proteína LRR17 em L. braziliensis e L. amazonensis. As linhagens mutantes foram mais infectivas em infecções de macrófagos in vitro quando comparadas com a linhagem selvagem. A proteína LRR17 parece estar envolvida no processo de invasão do parasita em infecções in vitro e no estabelecimento da infecção da forma amastigota de Leishmania. / Leucine-rich repeats (LRRs) are versatile binding motifs found in a variety of proteins involved in protein-protein interactions. The LaLRR17 gene, identified initially in the L. amazonensis genome, encodes a protein with 6 LRR in its central region, that is secreted to the cytoplasm of L. amazonensis-infected macrophages. An orthologue to LaLRR17 was identified in L. braziliensis chromosome 17. LRR17 gene expression is regulated differentially during the life cycle of L. braziliensis and L. amazonensis. The LbLRR17 protein is secreted in L. braziliensis promastigotes and amastigotes. To characterize the function of the LRR17 protein we obtained transgenic parasite lines of L. amazonensis overexpressing the LaLRR17 gene and of L. braziliensis overexpressing the LbLRR17 gene. The mutants were more infective to macrophages in vitro when compared with the wild type strains, indicating that the LRR17 protein may interact with macrophage molecules, modulating the cellular response to increase parasite survival.

Paracoccidioidomicose (PCM), micose sistêmica prevalente na América Latina, é uma doença granulomatosa causada pelo fungo termodimórfico do gênero Paracoccidioides spp. O maior número de casos dessa doença tem sido reportado no Brasil, Colômbia, Venezuela e Argentina. A existência de extensas áreas endêmicas, alto potencial incapacitante devido a fibroses pulmonares, grande quantidade de mortes prematuras, faz com que a PCM seja considerada um grave problema de Saúde Pública. Apesar do tratamento medicamentoso ser relativamente eficiente, o tempo longo de uso das drogas e os efeitos colaterais provocados podem levar a diminuição da adesão ao tratamento diminuindo assim eficácia. O uso de vacinas terapêuticas pode ser uma importante ferramenta no controle da PCM. Uma das modalidades investigadas pelo nosso grupo é a utilização de células dendríticas (DCs) pulsadas com o peptídeo P10 como vacina terapêutica no controle da PCM. Resultados apresentados por nosso grupo, demonstraram que DCs diferenciadas a partir de células de medula óssea de camundongos saudáveis pulsadas com o peptídeo 10 (P10) podem ser utilizadas como adjuvante no tratamento da paracoccidioidomicose experimental em camundongos imunocompetentes e imunossuprimidos. Assim sendo, nossa proposta no presente trabalho foi avaliar se DCs diferenciadas de células de medula óssea (BMDCs) ou de monócitos circulantes (MoDCs) de camundongos (BALB/c) infectados apresentam modulação prévia devido à exposição a antígenos fúngicos, avaliamos in vitro a capacidade das células dendríticas diferenciadas a partir de monócitos circulantes de camundongos infectados com Pb18 estimular proliferação de linfócitos CD8+ e CD4+, analisamos a capacidade de células dendríticas derivadas de monócitos circulantes de camundongos infectados com Pb18 pulsadas com P10 em induzir uma resposta protetora. Nossos resultados obtidos são promissores e reforçam dados já publicados pelo grupo os quais demonstraram a eficiência do peptídeo P10 no tratamento da paracoccidioidomicose experimental; apontam que o P10 é capaz de modular ativamente células dendríticas diferenciadas de monócitos circulantes e diferenciadas de células de medula óssea; demonstram que BMDCs e MoDCs pulsadas ou não com P10 tem a capacidade de estimular proliferação de linfócitos T CD4+ e CD8+; confirmaram que BMDC e MoDCs pulsadas ou não com P10 diminuem a carga fúngica no tecido pulmonar, estimulando um padrão de citocinas misto, porém com predominância de citocinas pró-inflamatórias que incitam resposta imune celular do tipo Th1, que é protetora na PCM. Estes dados foram respaldados com a análise dos cortes histológicos onde os pulmões dos camundongos tratados com BMDCs ou MoDCs pulsadas com P10 apresentaram parênquima pulmonar mais conservado em comparação com os pulmões dos grupos que não receberam tratamento com BMDCs ou MoDCs, com diminuição significativa de células fúngicas viáveis / Paracoccidioidomycosis (PCM), a systemic mycosis prevalent in Latin America, is a granulomatous disease caused by the thermodymorphic fungus of the genus Paracoccidioides spp. The highest number of cases of this disease has been reported in Brazil, Colombia, Venezuela and Argentina. The existence of extensive endemic areas, a high incapacitating potential due to pulmonary fibroses, and a large number of premature deaths, makes the PCM considered a serious public health problem. Although the drug treatment is relatively efficient, the long time of use of the drugs and the side effects provoked can lead to the decrease of the adherence to the treatment thus diminishing their effectiveness. The use of therapeutic vaccines can be an important tool in the control of PCM. One of the modalities investigated by our group is the use of dendritic cells (DCs) pulsed with the peptide P10 as therapeutic vaccine in the control of PCM. Results presented by our group demonstrated that DCs differentiated from bone marrow cells of healthy mice pulsed with peptide 10 (P10) can be used as an adjuvant in the treatment of experimental paracoccidioidomycosis in immunocompetent and immunosuppressed mice. Thus, our proposal in the present study evaluated the capacity of differentiated DCs of bone marrow cells (BMDCs) or circulating monocytes (MoDCs) of infected mice (BALB/c) exhibited previous modulation due to exposure to fungal antigens, we evaluated in vitro the ability of differentiated dendritic cells from circulating monocytes from Pb18 infected mice to stimulate proliferation of CD8+ and CD4+ lymphocytes, we analyzed the ability of dendritic cells derived from circulating monocytes from mice infected with P. brasiliensis pulsed with P10 to induce a protective response. Our results are promising and reinforce data already published by the group which demonstrated the efficiency of the peptide P10 in the treatment of experimental paracoccidioidomycosis; suggest that P10 is capable of actively modulating differentiated dendritic cells from circulating and differentiated monocytes from bone marrow cells; demonstrate that BMDCs and MoDCs pulsed or not with P10 have the ability to stimulate proliferation of CD4+ and CD8+ T lymphocytes; confirmed that BMDC and MoDCs pulsed or not with P10 decrease the fungal load in lung tissue, stimulating a pattern of mixed cytokines but with a predominance of pro-inflammatory cytokines that stimulate Th1-type cellular immune response that is protective in PCM, these data were supported with analysis of the histological sections where the lungs of the mice treated with BMDCs or MoDCs pulsed or not with P10 showed more conserved pulmonary parenchyma compared to the lungs of the groups that did not receive treatment with BMDCs or MoDCs, with significant decrease of viable fungal cells

Defeitos ósseos assumem importância na crescente prevalência de condições crônicas de saúde, agravando-se conforme o envelhecimento da população. O tratamento convencional baseia-se no transplante autólogo e abordagens extremamente invasivas. Uma proposta promissora é a obtenção de tecidos saudáveis em laboratórios utilizando suportes tridimensionais porosos (scaffolds) que atuarão como arcabouço para o crescimento e diferenciação de células tronco mesenquimais (CTMs) podendo ser otimizados para proporcionar adequada vascularização, uma importante característica na regeneração óssea. CTMs apresentam potencial de diferenciação, imunoregulação e angiogênese. O pico proteico F1 do soro do látex da seringueira Hevea brasiliensis apresenta importante atividade angiogênica e cicatrizante. O objetivo deste trabalho foi investigar a influência de scaffolds de policaprolactona (PCL) colonizados com CTMs na osteogênese experimental in vitro e in vivo (xenotransplante), a segurança e a influência do pico F1 do látex em cultura de CTMs aplicadas no scaffold de PCL e PCL reforçado com diferentes concentrações de grafeno (PCL/grafeno) na proliferação e diferenciação osteogênica. Para isso, as CTMs foram isoladas do tecido adiposo humano (ADSCs), caracterizadas por imunofenotipagem e diferenciação in vitro. Scaffolds de PCL, produzidos por técnica de manufatura aditiva, foram avaliados quanto ao potencial de adesão/viabilidade celular (ensaio MTT), diferenciação osteogênica (vermelho de alizarina) e potencial in vivo de osteointegração e osteoindução em defeito crítico de calvária avaliados por histologia e imunoistoquímica. O pico F1 do látex, em diferentes concentrações, foi avaliado em cultura de ADSCs e fibroblastos 3T3 quanto a citotoxicidade (MTT), potencial proliferativo (timidina-tritiada), migratório (scratch assay) e indução osteogênica (fosfatase alcalina). Scaffolds de PCL foram reforçados com grafeno (PCL/grafeno), revestidos com pico F1 (adsorção), avaliados quanto a viabilidade/proliferação celular (Alamar blue) e diferenciação osteogênica (fosfatase alcalina e vermelho de alizarina). A imunofenotipagem das ADSCs demonstrou baixa percentagem para marcadores negativos, alta para os positivos e diferenciação in vitro, comprovando o sucesso do isolamento e manutenção das ADSCs. O scaffold de PCL apresentou não-toxicidade e diferenciação osteogênica induzida pelo meio de cultura. Scaffolds de PCL, pré-colonizado e não colonizado com ADSCs, foram implantados em defeito crítico de calvária de ratos. O grupo que recebeu scaffolds com ADSCs humanas proporcionou melhor formação óssea no animal, com participação direta e indireta das ADSCs neste processo. Nos ensaios in vitro com o pico F1 (cultura 2D), observou-se estímulo proliferativo para as concentrações de 0.00001% e 0.0001%, além de maior percentagem de migração celular para as concentrações de 0.001%, 0.0001% e 0.00001%, diferentes do controle. Os scaffolds de PCL/grafeno demonstraram estimulo proliferativo quando colonizados por ADSCs e este estímulo foi ainda maior em scaffolds revestidos com F1, principalmente na concentração de 0.75% de grafeno. Embora o pico F1 não tenha potencializado a diferenciação osteogênico em cultura 2D, este estímulo foi observado em scaffolds revestidos com F1 com superior atividade da fosfatase alcalina. Este trabalho demonstrou sucesso no emprego de ADSCs humanas e scaffolds in vitro e in vivo (transplante xenogênico) para regeneração óssea, além de apresentar dois promissores produtos para engenharia tecidual como os scaffolds com reforço de grafeno em baixas concentrações e o pico proteico F1 na proliferação e diferenciação celular. / The increment of life expectancy and frequency of chronic diseases in the population has led to an increasing incidence of chronic bone defects. Conventional treatment is based on autologous transplantation, which depends on extremely invasive approaches. A promising proposal is to obtain healthy tissues in laboratories using porous three-dimensional matriz (scaffolds), which enable cellular growth and differentiation of mesenchymal stem cells (MSCs). Scaffolds can be optimized to provide adequate vascularization, a critical event to bone regeneration. MSCs have potential for differentiation, immunoregulation and angiogenesis. F1 natural latex protein from Hevea brasiliensis rubber tree presents important angiogenic and healing activity. The objective of this work was to investigate the influence of pre-colonized polycaprolactone (PCL) scaffolds on experimental in vitro and in vivo osteogenesis (xenotransplantation) and also the safety and influence of F1 protein on MSCs seeded on PCL and PCL reinforced with different concentrations of graphene scaffolds (PCL/graphene) in cell proliferation and osteogenic differentiation. MSCs were isolated from human adipose tissue (ADSCs), characterized by positive and negative markers and also in vitro differentiation. PCL Scaffolds, produced by an additive manufacturing technique, were evaluated for cell adhesion/viability potential (MTT assay), osteogenic differentiation (alizarin red) and in vivo xenogenic grafting potential for osteointegration and osteoinduction evaluated by histology and immunohistochemistry. F1 latex protein, prepared in different concentrations, was evaluated in contact with ADSCs and 3T3 fibroblasts culture in vitro regarding to cytotoxicity (MTT), proliferative potential (tritiated thymidine), migratory (scratch assay) and osteogenic induction (alkaline phosphatase). PCL scaffolds were reinforced with graphene (PCL/graphene scaffolds), coated with F1 protein (adsorption) and evaluated for cell viability/proliferation assay (Alamar blue) and osteogenic differentiation (alkaline phosphatase and alizarin red). ADSCs showed low percentage for negative markers, high percentage for positive markers and differentiation properties in vitro, providing enough information on the successful isolation and maintenance of human ADSCs. PCL scaffolds showed non-toxicity activity and osteogenic differentiation induced by culture medium. PCL scaffolds, pre-colonized and non-colonized with ADSCs, were implanted in a critical calvarial defect in rats. The group of rats which received scaffolds with ADSCs to treat the bone defect had improved bone formation with direct and indirect participation of ADSCs to the bone repair process. To in vitro assays with F1 (2D culture model), proliferative stimulus was observed to F1 0.00001% and 0.0001% samples, in addition to a higher percentage of cell migration to 0.001% and 0.0001%, different from control. PCL/graphene scaffolds demonstrated proliferative stimulation when colonized by ADSCs and this stimulus was even higher to F1 coated PCL/graphene scaffolds, mainly to 0.75% graphene. Although F1 have not enhanced osteogenic differentiation on 2D cell culture model, the stimulus was observed to F1 coated scaffolds with higher alkaline phosphatase activity. This work demonstrated success in the use of ADSCs and scaffolds for bone regeneration and presented two promising products to be applied in tissue engineering field, such as, scaffolds with graphene reinforcement at low concentration and F1 latex protein to improve cell proliferation and differentiation.

Diversos dados na literatura têm demonstrado a participação de linfócitos B-1 em diferentes fenômenos imunológicos, tanto na resposta imune inata quanto na resposta imune adaptativa. Para melhor entendermos a ativação da resposta imune eficaz contra fungos patogênicos, pesquisamos a interação entre os linfócitos B-1 e o Paracoccidioides brasiliensis (P. brasiliensis), uma vez que este expressa moléculas antigênicas que podem ser reconhecidas pelo sistema imune. Utilizamos preparação antigênica do P. brasiliensis obtida de sua superfície leveduriforme denominada de CFA (antígeno livre da parede do fungo) e células leveduriforme do fungo. Observou-se que a maioria das células do sobrenadante da cultura celular de 4 dias de células totais aderentes peritoneais eram constituídos por linfócitos B-1; estas células expressam altos níveis de MHC-II (100%) e CD80 (90%). Contudo, não houve expressão significativa da molécula co-estimuladora CD86. Pela análise fenotípica, os linfócitos B-1 podem atuar como células apresentadoras de antígeno pois expressam CD80, CD86 e MHC-II; então realizamos o ensaio de proliferação celular utilizando linfócitos B-1 como células apresentadoras de antígenos e observamos proliferação celular de linfócitos TCD4+ significativa. Em relação às citocinas, analisamos a secreção de IL-10 e TNF-&#945; do sobrenadante da cultura de linfócitos B-1 sem nenhum estímulo e observamos que estas células secretam tanto IL-10 quanto TNF-&#945;; após estímulo de CFA, os valores aumentam significantemente. Analisamos a expressão de TLR-2, TLR-4, MyD88 e IL-10, por RT-PCR, dos linfócitos B-1 na presença de CFA. Encontramos expressão de TLR-2, MyD88 e IL-10 nas células com e sem estímulo. Analisamos a migração dos linfócitos B-1 da cavidade peritoneal de camundongos BALB/c após estímulo intraperitoneal (ip) com leveduras de PB. Decorridas 5 horas, foi observada grande diminuição dos linfócitos B-1 na cavidade peritoneal, que permanecia por 24 horas e 7 dias pós-infecção. Para melhor compreendermos a migração dos linfócitos B-1, foram utilizados camundongos CBA/N Xid (desprovidos de linfócitos B-1), cujo o peritônio foi reconstituído com linfócitos B-1, sendo infectados ip com leveduras de P brasiliensis. Os resultados demonstram que, após a infecção, os linfócitos B-1 migram da cavidade peritoneal para o baço. Também, observou-se aumento no número de células T com fenótipo de célula regulatória (CD4+CD25+Foxp3+). Nossos resultados sugerem que a elevada produção de IL-10 por células B-1, mediada provavelmente pela ligação de TLR-2, juntamente com a capacidade dos linfócitos B-1 em ativar linfócitos T, com a capacidade de migrar do peritônio para o baço e ativar células T regulatórias, poderia favorecer a sobrevivência do fungo no hospedeiro. / Innumerous data published in the literature have shown the involvement of B-1 cells in different immunological phenomena, both in the innate immnune response and the adaptive immune response. To better understand the activation of effective immune response against pathogenic fungi, we researched the interaction between B-1 cells and Paracoccidioides brasiliensis (P. brasiliensis), since it expresses that antigenic molecules can be recognized by the immune system. We used antigenic preparation of P. brasiliensis obtained from the surface of yeast called CFA (cell free antigen) and yeast cells of the fungus. It was observed that most cells in the cell culture supernatant 4 days of total adherent peritoneal cells consisted of B-1 cells, these cells express high levels of MHC-II (100%) and CD80 (90%). However, no significant expression of co-stimulatory molecule CD86 was observed. After phenotypic analysis, the B-1 cells can act as anyigen-presenting cells because they express C80, CD86 and MHC-II, then realized proliferation assay using B-1 cells as antigen presenting cells inducing was performed, and our results showed the significant proliferation of CD4 T cells. Regarding cytokines, we analyzed the IL-10 secretion and TNF-&#945; in culture supernatant of B-1 cells without stimulation and found that these cells secrete both IL-10 and TNF-&#945;, after stimulation of CFA. We analyzed the expression of TLR-2, TLR-4, MyD88 and IL-10 by RT-PCR, of the B-1 cells in the presence of CFA. We found expression of TLR-2, MyD88 and IL-10 cells with and without stimulus. We analyzed the migration of peritoneal B-1 cells after intraperitoneal (ip) infection with yeast from P. brasiliensis. After 5 hours, high decrease of B-1 cells in the peritoneal cavity was observed, which remained for 24 hours and 7 days post-infection. To better understand the migration of B-1 cells, we used mice CBA/N Xid (destitute of B-1 cells), reconstituted with B-1 cells, and infected with yeast P. brasiliensis. The results show that after the infection, the B-1 cells migrate from the peritoneal cavity to the spleen. Also, there was an increase in the number of T cells with regulatory cell phenotype (CD4+CD25+Foxp3+). Our results suggest that high production of IL-10 by B-1 cells, probably mediated by the binding of TLR-2, along with the ability of B-1 cells in activating T lymphocytes, with the ability to migrate from the peritoneum to the spleen and activate T regulatory cells, could favor the survival of the fungus in the host.

Paracoccidioidomicose é adquirida pela via respiratória e a enzima indolamina-2,3-dioxigenase (IDO) e o catabolismo do triptofano estão envolvidos no controle da imunidade inata e adaptativa contra patógenos. Investigamos o papel da IDO na doença em animais suscetíveis (B10.A) e resistentes (A/J). Caracterizamos o efeito do tratamento com 1-Metil-DL-Triptofano (1MT) no fenótipo e comportamento de células dendríticas (DCs) e T reguladoras (Tregs) de A/J e B10.A quanto à expressão de IDO. IDO controla a carga fúngica de A/J e B10.A, reduzindo a imunidade de TCD4 e TCD8 e aumentando Tregs. Constatamos que IDO diminuiu a migração de DCs para o pulmão de A/J e B10.A e a inibição da atividade anti-inflamatória de IDO por 1MT tem um efeito deletério somente em B10.A cuja suscetibilidade é ligada à excessiva atividade pró-inflamatória. A infecção de A/J e B10.A parece induzir as funções catalítica e sinalizadora de IDO.Grande parte da função de IDO nos mecanismos imunorreguladores na paracoccidioidomicose se faz através da modulação da função de DCs em A/J e B10.A. / Paracoccidioidomycosis is acquired by the respiratory route and the enzyme indoleamine-2,3-dioxygenase (IDO) and tryptophan catabolism are involved in the control of innate and adaptive immunity against pathogens. We investigated the role of IDO in the infection in susceptible (B10.A) and resistant (A/J) mice. We characterized the effect of treatment with 1-Methyl-DL-Tryptophan (1MT) in the behavior and phenotype of dendritic cells (DCs) and regulatory T cells (Tregs) from A/J and B10.A for expression of IDO. IDO controls the fungal load in A/J and B10.A, reducing the immunity of CD4 and CD8 T cells and Tregs increased. IDO decreased the migration of DCs to the lung of A/J and B10.A and inhibition of anti-inflammatory activity of IDO by 1MT has a deleterious effect only in B10.A whose susceptibility is linked to excessive proinflammatory activity. Infection of A/J and B10.A appears to induce catalytic functions of IDO. Much of the function IDO immunoregulatory mechanisms paracoccidioidomycosis is done by modulating the function of DCs in A/J and B10.A.

Paracoccina (PCN) é um constituinte de Paracoccidioides brasiliensis, um patógeno humano que causa a paracoccidioidomicose, micose sistêmica mais prevalente na América Latina. A PCN é uma proteína de função dual, com domínios de atividade lectínica e de N-acetilglicosaminidase. Análises proteômicas da preparação paracoccina revelaram a sua correspondência com uma proteína hipotética de P. brasiliensis do isolado 18 (Pb18), anotada como PADG-3347.1, que tem sequência polipeptídica semelhante a família das endoquitinases 18. Essas endoquitinases apresentam domínios distintos de atividade lectínica e enzimática. O conjunto de exons do gene correspondente, PADG-3347.1, foi clonado e expresso em E. coli, e as características físicas e biológicas da proteína recombinante foram comparadas com as da PCN. Além disso, a PADG-03347.1 recombinante (rPCN) foi avaliada por suas propriedades imunomoduladoras e sua capacidade em conferir proteção contra a infecção por P. brasiliensis. Nesse sentido, investigamos a interferência da administração profilática e terapêutica de rPCN no curso da infecção por P. brasiliensis em camundongos BALB/c. A histopatologia pulmonar dos camundongos tratados com a rPCN, mostrou menor ocorrência de granulomas, e estes também foram menores do que os observados nos animais controles. Consistente com a observação de poucas leveduras no centro dos granulomas, a contagem de UFC a partir do homogenato pulmonar dos camundongos tratados foi inferior ao observado nos animais controles. Além disso, a administração de rPCN, foi associada com altos níveis de IL-12, IFN-, TNF-, NO e IL-10 detectados no homogenato pulmonar. Os altos níveis de citocinas produzidos nos animais tratados com rPCN nos levou a investigar a ocorrência de interação da lectina com receptores presentes em células da imunidade inata, tais como TLR2 e TLR4. Verificamos que a rPCN ativa TLR2, nas formas homo ou heterodimérica, e TLR4, de modo independente dos correceptores CD14 e CD36. Estes dados revelam um possível mecanismo pelo qual rPCN gera proteção nos camundongos contra a PCM. rPCN, administrada terapêutica ou profilaticamente, induz a ativação de TLRs e imunidade Th1, conferindo proteção contra a infecção por P. brasiliensis. / Paracoccin is a constituent of Paracoccidioides brasiliensis, a human pathogen that causes paracoccidioidomycosis, the most prevalent systemic mycosis in Latin America. Paracoccin is a dual function protein exerting lectin and N-acetylglucosaminidase activities. Proteomic analysis of paracoccin preparation revealed its correspondence with a hypothetical protein from P. brasiliensis isolate Pb18 (Pb18), annotated as PADG-3347.1, which has a polypeptide sequence similar to the family 18 endochitinases. These endochitinases have distinct lectin and enzymatic domains. The multi-exon assembly of the correspondent gene (PADG-3347) was cloned and expressed in E. coli, and the physical and biological features of the recombinant protein were compared to those of the native paracoccin. Moreover, recombinant PADG-3347.1 (rPCN) was evaluated for its immunomodulatory properties and its ability to confer protection against murine P. brasiliensis infection. Thus, we investigated the interference of prophylactic and therapeutic administration of rPCN on the course of P. brasiliensis infection in BALB/c mice. The pulmonary histopathology of the treated mice showed lower incidence of granulomas, which were also smaller than those observed in the control animals. Consistently with the observation of few yeasts in the center of the granulomas, the CFU count provided by lung homogenates of treated mice was lower than the provided by control mice. Furthermore, administration of rPCN was associated with higher levels of IL-12, IFN-, TNF-, NO and IL-10, detected in the lung homogenates of animals. The high levels of cytokines produced in the rPCN treated mice prompted us to investigate the occurrence of interaction of the lectin with receptors present in innate immune cells, such as TLR2 and TLR4. We verified that rPCN activates TLR2,in homo or heterodimeric forms, and TLR4, in a manner that does not depend on CD14 and CD36 coreceptors. These data reveal a possible mechanism by which rPCN generates protection in mice against PCM. rPCN, administered therapeutic or prophylactically, induces TLRs activation and Th1 immunity, conferring protection against P. brasiliensis infection.

Le caoutchouc naturel produit du latex d'Hevea brasiliensis a des propriétés remarquables qui n'ont jamais été égalées par ses homologues synthétiques. Toutefois, ce matériau d'origine naturel présente un désavantage : la variabilité non négligeable de ses propriétés. Cette dernière est partiellement attribuée aux 3 à 5 % de composés non isoprènes (lipides, protéines, sucres et minéraux) présents dans le caoutchouc naturel. Parmi les facteurs pouvant être tenus comme responsables de cette variabilité, l'origine clonale semble prépondérante. L'objectif principal de cette étude était d'évaluer l'impact de l'origine clonale sur la variabilité en composition biochimique du latex (lipides, protéines, sucres et éléments minéraux) et sur les caractéristiques mésostructurales du caoutchouc naturel; puis d'étudier les relations pouvant exister entre le génotype, la composition biochimique du latex et la mésostructure du caoutchouc. Cette étude a été conduite sur 5 clones d'Hevea brasiliensis : GT1, RRIM600, PB235, PB217 et PB260. Des études préalables à la caractérisation clonale ont permis de déterminer les conditions d'échantillonnage à mettre en œuvre pour pratiquer des prélèvements de latex clonaux les plus représentatifs possible des clones. Le latex étant un matériau instable, il été choisi de travailler sur du latex lyophilisé pour l'analyse de tous les composés biochimiques du latex (autres que les lipides) et pour l'étude de la mésostructure du caoutchouc naturel. Des protocoles d'extractions des protéines et des sucres sur lyophilisat de latex ont été développés en se basant sur les propriétés de solubilisation du caoutchouc naturel en milieu organique. L'extraction des lipides a été réalisée en suivant le protocole mis au point sur plantation sur latex frais par Liengrayoon (Liengprayoon, 2008). Les différents résultats obtenus au niveau de la composition biochimique du latex et de la mésostructure du caoutchouc ont permis de mettre en évidence l'importante de l'origine clonale des latex. L'étude des relations entre le génotype et la composition biochimique du latex (ACP) a clairement montré que l'origine clonale jouait un rôle important dans la variabilité totale des données biochimiques du latex. Les analyses des relations entre la biochimie du latex et la mésostructure du caoutchouc naturel ont permis de mettre en évidence des corrélations intéressantes des lipides et des protéines avec la mésostructure (essentiellement Mn et I). Cette analyse biochimique clonale des latex s'est révélée pertinente pour étudier la diversité clonale et ses répercutions sur la mésostructure du caoutchouc naturel. Cette approche de la diversité clonale d'Hevea brasiliensis, ainsi que les connaissances acquises lors de cette étude constituent une base de données solide à compléter par des études futures sur des plantations différentes, des clones différents et des analyses biochimiques et structurales plus poussées. / Natural rubber produced from Hevea brasiliensis latex possesses remarkable properties which have not been matched by its synthetic counterparts. However, this natural origin material presents a disadvantage: the significant variability of its properties. This variability has been partly ascribed to the 3 to 5% non isoprene components (lipids, proteins, sugars and minerals) present in the natural rubber. Among the factors that could be held responsible for this variability, clonal origin seems to be decisive.The main aim of this study was to evaluate the impact of clonal origin on the biochemical latex composition and on natural rubber mésostructural characteristics and also to study relationships between genotype, latex biochemical composition and rubber mesostructure. This study was conducted with five Hevea brasiliensis clones: GT1, RRIM600, PB235, PB217 and PB260. Before clonal characterization, preliminary studies were performed to determine the suitable sampling conditions in order to get the latex samples that represented as much as possible the clones. Fresh latex is an unstable material. It was decided to work on freeze-dried latex for the biochemical components analysis (except lipids) and for the natural rubber mesostructure study. Protocols for proteins and sugars' extractions on freeze-dried latex have been developed on the natural rubber solubilizing properties in organic media. Lipids extractions was performed according to the protocol developed by Liengrayoon (Liengprayoon , 2008) on fresh latex.The different results obtained on the latex biochemical composition and the natural rubber mesostructure allowed to clearly observe the clonal origin importance. Study of relationships between genotype and latex biochemical composition (PCA) has clearly shown that the clonal origin played an important role in the total variability of latex biochemical data. Analysis of relationships between latex biochemistry and natural rubber mesostructure helped highlight interesting correlations of lipids and proteins with mesostructure (mainly Mn and I).This biochemical analysis of clonal latex has proved to be appropriate for studying the clonal diversity and its repercussions on the natural rubber mesostructure. This approach of Hevea brasiliensis clonal diversity, and the knowledge gained from this study, provides a solid basis to be completed by further studies on different plantations, different clones and further biochemical and structural analyses.