The protozoan parasite Leishmania (Viannia) braziliensis (L. braziliensis) is the main cause of human tegumentary leishmaniasis in the New World, a disease affecting the skin and/or mucosal tissues. Despite its importance, the study of the unique biology of L. braziliensis through reverse genetics analyses has so far lagged behind in comparison with Old World Leishmania spp. In this study, we successfully applied a cloning-free, PCR-based CRISPR–Cas9 technology in L. braziliensis that was previously developed for Old World Leishmania major and New World L. mexicana species. As proof of principle, we demonstrate the targeted replacement of a transgene (eGFP) and two L. braziliensis single-copy genes (HSP23 and HSP100). We obtained homozygous Cas9-free HSP23-and HSP100-null mutants in L. braziliensis that matched the phenotypes reported previously for the respective L. donovani null mutants. The function of HSP23 is indeed conserved throughout the Trypanosomatida as L. major HSP23 null mutants could be complemented phenotypically with transgenes from a range of trypanosomatids. In summary, the feasibility of genetic manipulation of L. braziliensis by CRISPR–Cas9-mediated gene editing sets the stage for testing the role of specific genes in that parasite’s biology, including functional studies of virulence factors in relevant animal models to reveal novel therapeutic targets to combat American tegumentary leishmaniasis. / Alexander von Humboldt-Stiftung / Revisión por pares

Submitted by Edisangela Bastos (edisangela@ufpa.br) on 2013-04-08T18:20:35Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23898 bytes, checksum: e363e809996cf46ada20da1accfcd9c7 (MD5) Dissertacao_EstudoVitroInfectividade.pdf: 46258236 bytes, checksum: e26a9da2a5c61477542b2e8eb278c3ba (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Rosa Silva(arosa@ufpa.br) on 2013-04-10T15:22:03Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23898 bytes, checksum: e363e809996cf46ada20da1accfcd9c7 (MD5) Dissertacao_EstudoVitroInfectividade.pdf: 46258236 bytes, checksum: e26a9da2a5c61477542b2e8eb278c3ba (MD5) / Made available in DSpace on 2013-04-10T15:22:03Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23898 bytes, checksum: e363e809996cf46ada20da1accfcd9c7 (MD5) Dissertacao_EstudoVitroInfectividade.pdf: 46258236 bytes, checksum: e26a9da2a5c61477542b2e8eb278c3ba (MD5) Previous issue date: 2003 / Os parasitos do gênero Leishmania apresentam variações de infectividade intra e inter específicas. Entretanto, são escassas as informações a respeito da infectividade das espécies de Leishmania do Novo Mundo, principalmente, daquelas encontradas na região Amazônica brasileira, onde, até o presente momento são conhecidas seis espécies pertencentes ao subgênero Viannia causadoras de LTA. Diante disso, o objetivo do presente trabalho foi investigar, in vitro, o comportamento da infectividade de 5 espécies de Leishmania do subgênero Viannia em macrófagos peritoneais de camundongos BALB/c e sua correlação com a produção de óxido nítrico pelos macrófagos infectados. Trinta cepas de Leishmania foram distribuídas em seis grupos iguais, de acordo com as espécies seguintes: I- L. (V) braziliensis/LCL, II- L. (V) braziliensis/LCM, III- L. (V) guyanensis, IV- L. (V) shawi, V -L. (V) naiffi e VI- L. (V) lainsoni. As cepas foram cultivadas em meio RPMI suplementado com 10% de soro bovino fetal e 1% de penicilina-gentamicina, até atingir a fase estacionária de cultivo, quando foram usadas para infectar macrófagos na proporção de 4 parasitos/macrófago. As culturas foram incubadas a 35°C e 5% de CO2 e após 24h, as lamínulas foram coradas com Giemsa para contagem do número de parasitos e determinação do índice de infecção, enquanto a concentração de NO (nitrito) foi calculada pelo método de Griess. Observou-se que as cepas de L. (V) braziliensis/LCM apresentaram o maior índice de infecção (385), sendo este significativamente maior (P<0,005) que as cepas de L. (V) braziliensis/LCL (264), L. (V) naiffi (215) e L. (V) lainsoni (272), porém, não significativamente maior que os índices das espécies L. (V) shawi (292) e L. (V) guyanensis (300). Quanto aos níveis de NO (nitrito), detectou-se maior concentração para a espécie L. (V) naiffi (4,1µM e menor concentração para as cepas de L. (V) braziliensis/LCM (2,15µM). As demais espécies tiveram concentrações de: L. (v:) lainsom (3,14µM), L. (V) shawi (2,96µM), L. (V) guyanensis (2,76µM) e cepas de L. (V) braziliensis/LCL (3,1µM). Diante do exposto, concluímos que cepas de L. (V) braziliensis/LCM são mais infectivas do que as demais espécies estudadas e, também, mais infectivas que cepas homólogas isoladas de casos clínicos de LCL. Além disso, observou-se menor infectividade da espécie L. (V) naiffi. Desse modo, notou-se que os níveis de NO produzidos pelos macrófagos infectados foram inversamente proporcionais ao grau do parasitismo. / Parasites ofthe genus Leishmania show both intra- and inter-specific variations of infectivity. There is little available information, however, regarding the infective behavior of New World species particularly those of the Amazon Region of Brazil, where there occur at six species of the subgenus Viannia causing human cutaneous leishmaniasis (ACL). The aim of the present study was to investigate the infectivity of 5 of these species for the peritoneal macrophages of BALB/c mice, and their role in the host-cell's production of nitric oxide (NO). Thirty strains of Leishmania were divided into 6 groups of the fol1owing species: I-L. (V.) braziliensis (from cases of localized skin lesions-LCL); II- L. (V.) braziliensis (from cases of mucocutaneous lesions- LeM); III- L. (V.) guyanensis; IV- L. (V.) shawi; V- L. (V.) naiffi and VI- L. (V.) lainsoni. They were cultivated in RPMI 1640 medium supplemented with 10% fetal bovine serum and 1% penicillin/gentamicin, until reaching the stationary phase of development. These promastigotes were used to infect the macrophage cell cultures, in the proportion of 4 flagellates/macrophage. The cultures were then incubated at 35°C with 5% CO2 and, after 24 hours following inoculation, the corvelips were stained by Giemsa's method to determine the infection index. The nitric oxide (nitrite) concentration was measured in the culture supernatant by Griess' s method to determine the infection index. The nitric oxide (nitrite) concentration was measured in the culture supernatant by Griess' s method. It was found that LCM strains of L. (V.) braziliensis showed the highest infection index (385), significance p<0.05,compared with L. (V.) braziliensis LCL strains (264). L. (V). naiffi and L. (V.) lansoni had the lowest infection indices of (215) and (272), respectively, but, were not significally different from index of L. (V.) guyanensis (300). Rrgarding the NO levels, the highest was that for L. (V.) naiffi (4,1µM), and the lowest for L. (V.) braziliensis-LCM strains (2, 15µM). The other readings were (3,14µM) for L. (V.) lainsoni, 2,96µM for L. (V.) shawi, 2,76µM for L. (V.) guyanensis and 3,1µM for L. (V.) braziliensis-LCL strains. It is conc1uded that L. (V.) natffi. In this way it may be noted the NO levels for infected macrophage were inversely proportional to the degree of infectivity of the species studied.

Submitted by Anderson Silva (avargas@icict.fiocruz.br) on 2012-07-06T17:37:06Z No. of bitstreams: 1 daniel_m_silva_ioc_bp_0026_2010.pdf: 1427559 bytes, checksum: 532cc287ce2cf619826a2b8055638b91 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-07-06T17:37:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 daniel_m_silva_ioc_bp_0026_2010.pdf: 1427559 bytes, checksum: 532cc287ce2cf619826a2b8055638b91 (MD5) Previous issue date: 2010 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil. / Lutzomyia (Nyssomyia) whitmani é incriminado como vetor de Leishmaniose Tegumentar Americana (LTA), associada à transmissão de duas leishmânias dermotrópicas: Leishmania (Viannia) braziliensis e Leishmania (Viannia) shawi. No entanto, além da competência comprovada para transmitir dois parasitos, diferenças no comportamento entre populações geograficamente distintas têm sugerido que esta não seria uma única espécie e sim um complexo de espécies crípticas. A segura identificação destas populações é de fundamental importância para os estudos eco-epidemiológicos da LTA, possibilitando o entendimento dos ciclos de transmissão, uma vez que esta espécie ocorre na grande maioria dos estados brasileiros. No presente estudo foi avaliada a variabilidade genética de populações L. (N.) whitmani procedentes de Buriticupu (MA), área de transmissão de Le. (V.) shawi e Le. (V.) braziliensis, de Paragominas (PA), de transmissão de Le. (V.) shawi, e de Ilhéus (BA), localidade tipo, e de Meruoca (CE), áreas de transmissão de Le. (V.) braziliensis. A partir das análises por RAPD-PCR e sequenciamento do gene do Citocromo b foi possível observar três agrupamentos, onde os espécimes de Buriticupu e Paragominas compõem o mesmo grupo, os de Ilhéus formaram um segundo grupo e os de Meruoca o terceiro. As análises mostram um alto grau de diferenciação e sugerem que os três agrupamentos possam representar diferentes espécies crípticas do “complexo” whitmani. / Lutzomyia (Nyssomyia) whitmani is incriminated as vectors of leishmaniasis (ACL) associated with the transmission of two leishmania dermotropic: Leishmania (Viannia) braziliensis and Leishmania (Viannia) shawi. However, in addition to proven competence to transmit two parasites, differences in behavior between geographically distinct populations have suggested that this would not be a single species but a complex of cryptic species. The secure identification of these populations is of fundamental importance to the eco-epidemiological studies of LTA, allowing for better understanding of transmission cycles, since this species occurs in most Brazilian states. In this study we evaluated the genetic variability of populations L. (N.) whitmani coming Buriticupu (MA) transmission area of Le. (V.) shawi and Le. (V.) braziliensis, Paragominas (PA), transmission of Le. (V.) shawi, and Ilhéus (BA), type locality, and Meruoca (CE), transmission area of Le. (V.) braziliensis. From the analysis by RAPD-PCR and sequencing of the cytochrome b gene it was possible to observe three clusters, where the specimens Buriticupu and Paragominas comprise the same group, from Ilhéus formed a second group and from Meruoca of the third. The analysis shows a high degree of differentiation and suggests that the three groups may represent different cryptic species “whitmani complex”.

Submitted by Anderson Silva (avargas@icict.fiocruz.br) on 2012-10-15T17:46:51Z No. of bitstreams: 1 amanda_b_r_b_macedo_ioc_bcm_0038_2011.pdf: 6569786 bytes, checksum: 14dd4b1254c99bb75e49af1ca06a9072 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-10-15T17:46:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 amanda_b_r_b_macedo_ioc_bcm_0038_2011.pdf: 6569786 bytes, checksum: 14dd4b1254c99bb75e49af1ca06a9072 (MD5) Previous issue date: 2011 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil. / As Leishmanioses são doenças causadas por diferentes espécies de protozoários do gênero Leishmania, que afetam indivíduos em aproximadamente 88 países. Atualmente, a medida de controle da doença mais aceita é o desenvolvimento de uma vacina profilática; porém, para que uma vacina efetiva seja alcançada, torna-se necessário a compreensão dos fatores que regulam e participam na proteção durante e após a infecção natural. São comuns trabalhos em que a resposta imune do tipo Th1 é medida exclusivamente pela produção in vitro de IFN-γ, porém a avaliação de um só parâmetro nem sempre é suficiente para predizer proteção. O presente trabalho visou estudar a qualidade de resposta Th1 induzida por diferentes antígenos de Leishmania em pacientes com a forma cutânea de leishmaniose tegumentar americana (LTA) provenientes do RJ. Utilizando-se ensaios de citometria de fluxo multiparamétrica para marcadores de superfície, e para as citocinas IL-2, TNF-α e IFN-γ, bem como ELISA para IFN-γ, foram feitas comparações da resposta induzida pelos extratos totais de promastigotas de fase estacionária de L. (V.) braziliensis (LbT) e L. (L.) amazonensis (PH8T), assim como frações enriquecidas em componentes subcelulares de L. (L.) amazonensis, em células mononucleares de sangue periférico de pacientes com LTA, antes e 140 dias após o tratamento, e indivíduos controles sadios. A análise das subpopulações de linfócitos T por citometria de fluxo não identificou alterações significativas nos percentuais de células CD8 +, CD4+ e CD25+ induzidas pelos diferentes estímulos, dentro de um mesmo grupo, nem entre os grupos de pacientes e controles. A avaliação individual da MFI integrada (frequência de células produtoras de uma citocina multiplicada pela intensidade média de fluorescência) para cada citocina estudada, não evidenciou nenhuma diferença marcante na resposta imune do tipo Th1 induzida pelos diferentes estímulos; porém, através da avaliação da contribuição dos fenótipos CD4+ produtores de 3, 2 ou 1 única citocina na resposta imune do tipo Th1 total, observamos diferenças qualitativas bem distintas entre as respostas obtidas antes e após o tratamento, e entre os antígenos estudados. Todos os estímulos apresentaram aumento da porporção de células multifuncionais nos pacientes PT, em relação aos AT. Após o tratamento, LbT foi o estímulo que induziu maior proporção de células multifuncionais (produtoras de IL-2, TNF-α e IFN-γ, simultaneamente; 28%), seguido da fração de membrana de L. (L.) amazonensis (PH8M; 23%), enquanto que, PH8T induziu a menor proporção de células multifuncionais (10%), e a maior proporção de células simples produtoras de IFN-γ (38%). Corroborando alguns outros relatos da literatura, observamos que as células multifuncionais são as que possuem a maior intensidade média de fluorescência para as 3 citocinas estudadas. A avaliação quantitativa da produção de IFN-γ por ELISA, demonstrou que LbT foi o estímulo que induziu significativamente a maior produção desta citocina, em comparação aos demais estímulos, tanto antes como após o tratamento. Este último resultado parece se correlacionar com os dados de citometria já mencionados, em que este mesmo estímulo foi capaz de induzir o maior percentual de células T multifuncionais, células essas com a capacidade de produzir uma quantidade maior de citocinas, do que os outros fenótipos estudados, como evidenciado nos resultados de MFI. Nossos resultados levam a discussão sobre a importância da avaliação da qualidade de uma resposta imune do tipo Th1 medida por mais de um parâmetro, a nível de uma única célula, e sugerem que a avaliação das células multifuncionais é importante para correlacionar com a cura da doença. / Leishmaniasis is a group of disease caused by different species of protozoan parasites from the genus Leishmania, that affects 88 countries around the world. Currently, the most accepted approach to control the disease is a prophylactic vaccine. However, to develop such a vaccine, it becomes necessary to understand the factors that regulate and participate in the healing process as well as protection during and after natural infection. It is well established that Th1-immune response is important for the protection against intracellular parasites. Many studies evaluate this response only by the in vitro IFN-γ production, but the evaluation of this single parameter not always is sufficient to predict protection. The present work assessed the quality of the Th1-immune response induced by different Leishmania antigens in patients affected with the cutaneous form of American Tegumentary Leishmaniasis (ATL) from Rio de Janeiro, Brazil. Using multiparametric flow cytometry to access surface markers and cytokines, such as IL-2, TNF-α and IFN-γ, as well as ELISA to measure IFN-γ in culture supernatants, we evaluated the immune responses induced by total antigens of stationary phase promastigotes of L. (V.) braziliensis (LbT) and L. (L.) amazonensis (PH8T), as well as subcellular components, composed of enriched fractions of L. (L.) amazonensis promastigotes, in peripheral blood mononuclear cells of ATL patients, before and 140 days after antimonial therapy, and healthy controls. Analysis of the T lymphocytes subpopulations by flow cytometry did not show significant variations in the percentage of CD4+, CD8+ and CD25+ cells induced by all different stimuli within the same group, or among the three studied groups. The individual evaluation of integrated MFI (frequency x MFI) for each cytokine assessed did not show any marked difference in the Th1-immune response induced by the different stimuli; however, by assessing the contribution of the CD4+ phenotypes producing 3, 2, or a single cytokine in the total Th1-immune response, we were able to identify very interesting differences. In the group of patients analyzed after treatment, LbT induced the highest proportion of multifunctional CD4+ T cells (producing IL-2, TNF-α and IFN-γ, simultaneously; 28%), followed by the membrane fraction of L. (L.) amazonensis (PH8M; 23%), whereas PH8T induced the lowest proportion of multifunctional CD4+ T cells (10%) and the highest proportion of single positive-cells for IFN-γ (38%). Corroborating previously published data, our results also showed that multifunctional CD4+T cells are those with the highest mean fluorescence intensity for the three cytokines studied. The quantitative evaluation of IFN-γ by ELISA showed that LbT significantly induced the higher production of this cytokine, in comparison to the other stimuli, both before and after treatment. This last result appears to show a relationship with our flow cytometry data, in which the same antigen was able to induce the highest percentage of multifunctional T cells, coincidently the cells that produced the larger amounts of cytokines, in comparison to the other CD4+ T cells phenotypes, as observed by the MFI values. Our results support the actual discussion about the importance of evaluating not only the quantity, but also the quality of a Th1-immune response by more than one parameter at a single-cell level, and indicate the importance of studying multifunctional CD4+ T cells in the cure of of ATL lesions.

Submitted by Anderson Silva (avargas@icict.fiocruz.br) on 2012-10-22T16:59:52Z No. of bitstreams: 1 camila_s_lemos_ioc_bcm_0001_2010.pdf: 5583427 bytes, checksum: e0182171b95abb491ee7c70d18ffe4c1 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-10-22T16:59:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 camila_s_lemos_ioc_bcm_0001_2010.pdf: 5583427 bytes, checksum: e0182171b95abb491ee7c70d18ffe4c1 (MD5) Previous issue date: 2010 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil. / Para desvendar a fisiopatologia da leishmaniose humana, é necessário um melhor entendimento de como a Leishmania é capaz de sobreviver por anos em granulomas imunologicamente ativos. Neste estudo, utilizamos o modelo de infecção macaco Rhesus-Leishmania braziliensis (Macaca mulatta) de leishmaniose cutânea (LC), como um meio de avaliar a utilidade do sistema primata no estudo da resposta inflamatória crônica granulomatosa desenvolvida pelo hospedeiro tanto na forma auto-resolutiva quanto na forma persistente da doença. Nossos achados reforçam a noção de que existe uma interação entre o sistema imune do hospedeiro e a capacidade patogênica do parasita no resultado clínico da infecção por Leishmania. De acordo com os casos documentados de LC em humanos induzida por L.braziliensis, as infecções experimentais neste modelo induzem a célula “T-helper” tipo 1 (Th1) mediando-a inflamação e levando a formação de granulomas bem organizados, consistindo de todos os tipos celulares específicos encontrados nos granulomas humanos. Nós mostramos que os leucócitos polimorfonucleares são decisivos para controle do parasita nos eventos iniciais da inflamação in vivo. Ademais, fagócitos mononucleares que fagocitam granulócitos apoptóticos parasitados parecem ser a chave principal no estabelecimento da infecção nos macacos. A formação do granuloma verificada nos animais é direcionada por diversos mediadores inflamatórios que são importantes para o desenvolvimento das células Th1 e da função de macrófagos efetores. A análise cinética da resposta inflamatória revelou variados marcadores fenotípicos de células positivas para CD3, CD4, CD8, CD20, CD68, Foxp3 e HLA-DR. Digno de nota, agregados de células B CD20+ foram encontrados na lesão crônica, o qual serve como um substrato morfológico para orquestrarem ou modularem o desenvolvimento da resposta duradoura na infecção persistente. Nossos achados indicam que ambos os subgrupos de células regulatórias CD4 Foxp3+ e Foxp3- expressando interleucina-10 previne a erradicação da L. braziliensis da pele inflamada, desse modo, suprimindo uma eventual resposta curativa em macacos com LC persistente. Esses resultados apontam a viabilidade do uso desse modelo para elucidar, totalmente, os mecanismos moleculares das células t regulatórias mediadoras da supressão na resposta imune efetora, resultando assim o crescimento descontrolado do granuloma durante a leishmaniose, o que é necessário ser considerado em qualquer estratégia proposta para o controle terapêutico dessa importante doença inflamatória. / In order to unravel the physiopathology of leishmaniasis in humans, it is necessary to better understand how Leismania are able to survive for years within immunologicallyactive granulomas. In the present study, we used a Leishmania braziliensis-macaque (Macaca mulatta) infection model of cutaneous leishmaniasis (CL) as a means of assessing the usefulness of this primate system to study the host inflammatory granulomatous response involved in both healing and non-healing forms of the disease. Our findings reinforce the notion that an interplay exists between the host immune system and the pathogenic capability of the parasite in the clinical outcome of leishmanial infection. Consistent with documented cases of human L. braziliensis CL, experimental infections induced a T-helper cell type 1 (Th1)-mediated inflammation leading to the formation of well organized granulomas, consisting of all the specific cell types found within human granulomas. We provide evidence that polymorphonuclear neutrophil leukocytes are decisive for parasite containment by early inflammatory events in vivo. Furthermore, scavenger mononuclear phagocytes engulfing most of the parasite-laden apoptotic granulocytes are likely to be key players in establishing the infection in macaques. We show that granuloma formation in macaques is orchestrated by diverse inflammatory mediators that are important for Th1-cell development and macrophage effector functions. A kinetic analysis of the inflammatory response revealed marked variation in the number of positive cells for CD3, CD4, CD8, CD20, CD68, Foxp3, and HLA-DR phenotypes. Of note, CD20+ dense B-cell aggregates were found in chronic lesions, which might serve as a morphological substrate for the orchestration of the enduring host response to persistent infection. Our findings indicate that both Foxp3+ and Foxp3- CD4+ regulatory T-cell (Treg) subsets expressing interleukin-10 might prevent clearance of L. braziliensis from the inflamed skin, thereby eventually suppressing the healing response in macaques with long-standing CL. These results point to the feasibility of using this model to fully elucidate the molecular mechanisms of Treg-mediated suppression leading to the uncontrolled growth of granulomas occurring in leishmaniasis, which will need to be considered in any strategy designed for therapeutic control of this important inflammatory disease.

Leishmaniasis are zoonosis with different clinical manifestations according to the Leishmania species involved and the host immune response. Leishmania braziliensis complex is responsible for the majority of human Tegumentary Leishmaniasis cases in Brazil and it is endemic in the Triângulo Mineiro region. Our aim was to compare the pathogeny of two different isolates of Leishmania braziliensis complex, obtained from cutaneous lesions of patients from Triângulo Mineiro region, with Leishmania (Viannia) braziliensis reference strain (MHOM/BR/75/M2903). Comparision was done by histopathological and ultrastructural analisys of organs of experimentally infected Hamster golden (Mesocricetus auratus). For that, 106 stationary promastigotes of the two isolates and the reference strain were subcutaneously innoculated in the hind forepaw of Hamster that were killed after 15, 30, 60 e 120 days post infection and then were collected fragments of the skin, popliteal lymph node, liver, spleen and bone marrow. The organs were processed for histopathological and ultrastructural analysis. The results showed differents pathogeny between both isolates and the reference strain, characterized for differences in prepatent period of the macroscopy lesions, in the outcome of the histophatological lesions, in the parasitism and in the capacity to produce metastatic lesions in the lymph node, liver and spleen. / As leishmanioses são zoonoses que produzem diferentes manifestações clínicas dependendo da espécie de Leishmania envolvida e da resposta imune do hospedeiro. O complexo Leishmania braziliensis é responsável pela maioria dos casos da leishmaniose tegumentar humana no Brasil e é endêmica na região do Triângulo Mineiro. Este trabalho teve como objetivo comparar a patogenia de dois diferentes isolados do complexo Leishmania braziliensis, provenientes de lesões cutâneas de pacientes da região do Triângulo Mineiro (MG), com a cepa de referência Leishmania (Viannia) braziliensis MHOM/BR/75/M2903, através de análise histopatológica e ultra-estrutural de órgãos de Hamster golden (Mesocricetus auratus) infectados experimentalmente. Para isto, 106 promastigotas na fase estacionária de desenvolvimento de cada isolado e da cepa de referência foram inoculadas em coxim plantar de Hamsters, os quais, após períodos de 15, 30, 60 e 120 dias de infecção, foram sacrificados e destes retirados fragmentos de pele, linfonodo poplíteo, fígado, baço e medula óssea. Os órgãos foram processados para avaliação histopatológica e ultra-estrutural. Os resultados obtidos dessas análises revelaram diferentes patogenias entre os dois isolados e a cepa de referência, caracterizadas por diferenças no período de prepatência das lesões macroscópicas, no aparecimento das lesões histopatológicas, no parasitismo e na capacidade de produzir lesões metastáticas no linfonodo, fígado e baço. / Mestre em Ciências da Veterinárias

Considerando o grave quadro das doenças negligenciadas, no Brasil e no mundo, e as limitações do tratamento empregado, na atualidade, torna-se urgente a pesquisa de novos fármacos, que sejam mais ativos e seguros. Para tanto, a busca de moléculas-protótipo, a partir de espécies vegetais, tem sido importante estratégia. Neste contexto, foi realizado o estudo de Annona crassiflora Mart. (Annonaceae), cujos alcalóides totais (AT) demonstraram promissora atividade antiprotozoária in vitro, em estudo anterior. Em paralelo, outras espécies de Annona mostraram atividade antimicobacteriana in vitro, igualmente, tendo motivado o presente estudo. Cinco das vinte frações alcaloídicas obtidas, por cromatografia em coluna, a partir dos AT das folhas, apresentaram atividade anti-Leishmania in vitro, tendo causado 100% de morte das formas promastigotas de Leishmania (L.) infantum chagasi. Além disto, três delas foram ativas frente ao Mycobacterium tuberculosis. O isolamento de dois alcalóides noraporfínicos foi realizado, por fracionamento biomonitorado em coluna cromatográfica, seguido de cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) semipreparativa. As estruturas dos compostos isolados foram elucidadas empregando-se as análises espectroscópicas de ressonância magnética nuclear, mono e bidimensionais, e por CLAE acoplada à espectrometria de massas (CLAEIES-EM2). Um dos alcalóides foi identificado pela primeira vez, nesta espécie, sendo que o outro apresentou estrutura inédita. Ambos demonstraram significativa atividade anti-Leishmania in vitro (CE50&#8804; 10 &#181; g/ mL) frente às formas promastigotas de L. (L.) infantum chagasi [MHOM/BR/1972/LD]. O primeiro teve maior índice de seletividade (IS: 7,4), em relação à citotoxicidade em células do tecido conjuntivo NCTC Clone 929 de camundongos. Frente ao Mycobacterium tuberculosis (ATCC 27294) e ao M. smegmatis (ATCC 35798), os alcalóides isolados foram inativos (CIM &#8805; 128 &#181;g/ mL). O óleo volátil das folhas foi analisado por cromatografia gasosa acoplada à espectroscopia de massas (CG-EM), tendo sido identificados 41 constituintes, prevalecendo os sesquiterpenos (81,7%) em relação aos monoterpenos (0,8%). Entre os compostos majoritários encontrados no óleo, citam-se os sesquiterpenos &#945;-amorfeno (43,6%), E-cariofileno (17,7%) e o germacreno (5,3%). Nos testes de atividade anti-Leishmania in vitro frente às formas promastigotas de quatro espécies do parasita, o óleo foi mais ativo em L. (L.) infantum chagasi (CE50: 25,97 &#181;g/ mL). Nas formas tripomastigotas do Trypanosoma cruzi mostrou atividade 8,5 vezes superior àquela do fármaco-padrão benznidazol (CE50: 5,31 &#181;g/ mL). Os resultados obtidos ratificaram a importância da prospecção da flora, em particular de A. crassiflora, como fonte potencial de compostos bioativos, que venham a constituir novos fármacos, como alternativa à restrita terapêutica existente para o tratamento das doenças negligenciadas. / Neglected diseases are a serious health problem in Brazil and worldwide. The available drugs are limited in effectiveness with a high toxicity. There is an urgent need of more safe and bioactive compounds. The search of new molecules from plant species is a well known and important strategy to achieve this goal. In a previous work, Annona crassiflora Mart. (Annonaceae) showed a promising antiprotozoal activity. Beside this, other Annona species presented an interesting antimicobacterial action. In this bio-guided study, after the column fractionation of the leaves total alkaloids, in vitro tests were performed and five from twenty fractions were highly active (100% deaths) against promastigotes of Leishmania (L.) infantum chagasi, and only three were active against Mycobacterium tuberculosis. After purification of the bioactive fractions, two noraporphine alkaloids were isolated by HPLC and identified by the usual mono and bidimensional spectroscopic techniques. One of them was isolated from the first time from this species. The other one is a novel chemical entity. Both compounds presented anti- Leishmania activity (CE50 &#8804; 10 &#181;g/ mL) against L. (L.) infantum chagasi [MHOM/BR/1972/LD]. The first one showed a higher selectivity index (SI: 7.4) considering its mice connective tissue cells toxicity [NCTC Clone 929]. However, both were inactive against Mycobacterium tuberculosis (ATCC 27294) and M. smegmatis (ATCC 35798) (CIM &#8805; 128 &#181;g/ mL). In the leaves volatile oil 41 compounds were identified. The sesquiterpenes were in majority (81.7%), followed by monoterpenes (0.8%). The sesquiterpenes &#945;-amorphene (43.6%), E-caryophyllene (17.7%) and germacrene (5.3%) were the main constituents. The oil was little effective against the four tested Leishmania species and slightly more active against L. (L.) infantum chagasi (CE50: 25.97 &#181;g/ mL). However, it was highly active against the trypomastigotes of Trypanosoma cruzi (CE50: 5.31 &#181;g/ mL) showing to be 8.5 times more active than benznidazol. These results stimulate a deeper investigation of those alkaloids as antiprotozoal agents, confirming the importance of the plant species metabolites as a source of new bioactive molecules and their potential as future drugs.

A identificação de espécie de Leishmania é crucial no diagnóstico de leishmaniose cutânea (LC), para terapia e prognóstico, em áreas com diferentes espécies endêmicas. A reação em cadeia de polimerase (PCR) foi usada em amostras de biópsias estocadas em parafina e formol de pacientes com LC, do Espírito Santo, Brasil. Usando sequências de mini-exon do gênero Leishmania, 63,2% (36/57) das amostras em parafina e 46,1% (6/13) das amostras em formol foram positivas. Numa abordagem usando sequências de kDNA e RFLP, 100% (58/58) das amostras de parafina testadas foram identificadas como Leishmania (V.) braziliensis. Estas reações podem ser usadas tanto para diagnóstico como para definição da espécie infectante / The identification of Leishmania species, a crucial step in cutaneous leishmaniasis, had therapeutics and prognostics implications, specially at when several agent species are endemic. Polymerase chain reaction (PCR) was used for analysis of paraffin-embedded and formalin stored skin biopsies from patients with parasitologic confirmed cutaneous formalin stored skin biopsies from patients with parasitologic confirmed cutaneous leishmaniasis, from the Espirito Santo State, Brazil. Tested by PCR targeted to mini-exon genus specific primer, 63,2% (36/57) of parafin and 46,1% (6/13) of formalin stored samples were positive, but using a PCR for kDNA primer followed by RFLP analysis, only Leishamnia (V.) braziliensis was identified in 100% (58/58) of parafin biopsies studied. Those reactions allow either diagnosis or species identification in cutaneous leismaniasis

Considerando o grave quadro das doenças negligenciadas, no Brasil e no mundo, e as limitações do tratamento empregado, na atualidade, torna-se urgente a pesquisa de novos fármacos, que sejam mais ativos e seguros. Para tanto, a busca de moléculas-protótipo, a partir de espécies vegetais, tem sido importante estratégia. Neste contexto, foi realizado o estudo de Annona crassiflora Mart. (Annonaceae), cujos alcalóides totais (AT) demonstraram promissora atividade antiprotozoária in vitro, em estudo anterior. Em paralelo, outras espécies de Annona mostraram atividade antimicobacteriana in vitro, igualmente, tendo motivado o presente estudo. Cinco das vinte frações alcaloídicas obtidas, por cromatografia em coluna, a partir dos AT das folhas, apresentaram atividade anti-Leishmania in vitro, tendo causado 100% de morte das formas promastigotas de Leishmania (L.) infantum chagasi. Além disto, três delas foram ativas frente ao Mycobacterium tuberculosis. O isolamento de dois alcalóides noraporfínicos foi realizado, por fracionamento biomonitorado em coluna cromatográfica, seguido de cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) semipreparativa. As estruturas dos compostos isolados foram elucidadas empregando-se as análises espectroscópicas de ressonância magnética nuclear, mono e bidimensionais, e por CLAE acoplada à espectrometria de massas (CLAEIES-EM2). Um dos alcalóides foi identificado pela primeira vez, nesta espécie, sendo que o outro apresentou estrutura inédita. Ambos demonstraram significativa atividade anti-Leishmania in vitro (CE50&#8804; 10 &#181; g/ mL) frente às formas promastigotas de L. (L.) infantum chagasi [MHOM/BR/1972/LD]. O primeiro teve maior índice de seletividade (IS: 7,4), em relação à citotoxicidade em células do tecido conjuntivo NCTC Clone 929 de camundongos. Frente ao Mycobacterium tuberculosis (ATCC 27294) e ao M. smegmatis (ATCC 35798), os alcalóides isolados foram inativos (CIM &#8805; 128 &#181;g/ mL). O óleo volátil das folhas foi analisado por cromatografia gasosa acoplada à espectroscopia de massas (CG-EM), tendo sido identificados 41 constituintes, prevalecendo os sesquiterpenos (81,7%) em relação aos monoterpenos (0,8%). Entre os compostos majoritários encontrados no óleo, citam-se os sesquiterpenos &#945;-amorfeno (43,6%), E-cariofileno (17,7%) e o germacreno (5,3%). Nos testes de atividade anti-Leishmania in vitro frente às formas promastigotas de quatro espécies do parasita, o óleo foi mais ativo em L. (L.) infantum chagasi (CE50: 25,97 &#181;g/ mL). Nas formas tripomastigotas do Trypanosoma cruzi mostrou atividade 8,5 vezes superior àquela do fármaco-padrão benznidazol (CE50: 5,31 &#181;g/ mL). Os resultados obtidos ratificaram a importância da prospecção da flora, em particular de A. crassiflora, como fonte potencial de compostos bioativos, que venham a constituir novos fármacos, como alternativa à restrita terapêutica existente para o tratamento das doenças negligenciadas. / Neglected diseases are a serious health problem in Brazil and worldwide. The available drugs are limited in effectiveness with a high toxicity. There is an urgent need of more safe and bioactive compounds. The search of new molecules from plant species is a well known and important strategy to achieve this goal. In a previous work, Annona crassiflora Mart. (Annonaceae) showed a promising antiprotozoal activity. Beside this, other Annona species presented an interesting antimicobacterial action. In this bio-guided study, after the column fractionation of the leaves total alkaloids, in vitro tests were performed and five from twenty fractions were highly active (100% deaths) against promastigotes of Leishmania (L.) infantum chagasi, and only three were active against Mycobacterium tuberculosis. After purification of the bioactive fractions, two noraporphine alkaloids were isolated by HPLC and identified by the usual mono and bidimensional spectroscopic techniques. One of them was isolated from the first time from this species. The other one is a novel chemical entity. Both compounds presented anti- Leishmania activity (CE50 &#8804; 10 &#181;g/ mL) against L. (L.) infantum chagasi [MHOM/BR/1972/LD]. The first one showed a higher selectivity index (SI: 7.4) considering its mice connective tissue cells toxicity [NCTC Clone 929]. However, both were inactive against Mycobacterium tuberculosis (ATCC 27294) and M. smegmatis (ATCC 35798) (CIM &#8805; 128 &#181;g/ mL). In the leaves volatile oil 41 compounds were identified. The sesquiterpenes were in majority (81.7%), followed by monoterpenes (0.8%). The sesquiterpenes &#945;-amorphene (43.6%), E-caryophyllene (17.7%) and germacrene (5.3%) were the main constituents. The oil was little effective against the four tested Leishmania species and slightly more active against L. (L.) infantum chagasi (CE50: 25.97 &#181;g/ mL). However, it was highly active against the trypomastigotes of Trypanosoma cruzi (CE50: 5.31 &#181;g/ mL) showing to be 8.5 times more active than benznidazol. These results stimulate a deeper investigation of those alkaloids as antiprotozoal agents, confirming the importance of the plant species metabolites as a source of new bioactive molecules and their potential as future drugs.

A identificação de espécie de Leishmania é crucial no diagnóstico de leishmaniose cutânea (LC), para terapia e prognóstico, em áreas com diferentes espécies endêmicas. A reação em cadeia de polimerase (PCR) foi usada em amostras de biópsias estocadas em parafina e formol de pacientes com LC, do Espírito Santo, Brasil. Usando sequências de mini-exon do gênero Leishmania, 63,2% (36/57) das amostras em parafina e 46,1% (6/13) das amostras em formol foram positivas. Numa abordagem usando sequências de kDNA e RFLP, 100% (58/58) das amostras de parafina testadas foram identificadas como Leishmania (V.) braziliensis. Estas reações podem ser usadas tanto para diagnóstico como para definição da espécie infectante / The identification of Leishmania species, a crucial step in cutaneous leishmaniasis, had therapeutics and prognostics implications, specially at when several agent species are endemic. Polymerase chain reaction (PCR) was used for analysis of paraffin-embedded and formalin stored skin biopsies from patients with parasitologic confirmed cutaneous formalin stored skin biopsies from patients with parasitologic confirmed cutaneous leishmaniasis, from the Espirito Santo State, Brazil. Tested by PCR targeted to mini-exon genus specific primer, 63,2% (36/57) of parafin and 46,1% (6/13) of formalin stored samples were positive, but using a PCR for kDNA primer followed by RFLP analysis, only Leishamnia (V.) braziliensis was identified in 100% (58/58) of parafin biopsies studied. Those reactions allow either diagnosis or species identification in cutaneous leismaniasis