O peptídeo liberador da gastrina (GRP) é o homologo mamífero da bombesina (BN). Ambos GRP e seus receptores têm sido encontrados na sinóvia de pacientes com artríte reumatoide. O receptor do peptídeo liberador da gastrina (GRPR) pode ser considerado como um alvo terapêutico para doenças inflamatórias. RC-3095 é um antagonista do receptor de GRP. Este estudo avaliou os efeitos anti-inflamatórios do RC-3095, um antagonista específico do receptor do peptídeo liberador da gastrina, em dois modelos experimentais de artrite: induzida por colágeno do tipo II e induzida por adjuvante (CIA e AIA, respectivamente) e os mecanismos envolvidos. O RC-3095 foi administrado aos camundongos com CIA ou com AIA provocado por albumina bovina metilada (mBSA), diariamente. A incidência e severidade da doença foram avalidos por escore clínico e achados histológicos. A imunohistoquímica para o receptor do peptídeo liberador da gastrina (GRPR) na CIA. Migração de neutrófilos, determinação de glicosaminoglicanos (GAGs) e ensaio de linfoproliferação usando MTT em AIA. As citocinas: IL-17, IL-1 e TNF sobre os joelhos em AIA e CIA foram avaliados usando o ensaio imunoenzimático (ELISA). Analise da população de células T regulatórias por citometria de fluxo em AIA. Os resultados demonstraram que o RC-3095 reduziu a migração de neutrófilos, a hipernocicepção mecânica e a perda de proteoglicanos nos camundongos com AIA. Estes resultados estão associados com a inibição das citocinas pró-inflamatórias (IL-17, IL-1 e TNF-) e os níveis de proliferação de linfócitos e aumento do número de células T reguladoras (Treg). No modelo da CIA, o RC-3095 apresentou uma redução significativa nos escores da artrite e gravidade da doença, determinada histologicamente. A Inflamação sinovial, hiperplasia sinovial, formação de pannus e alterações erosivas foram drasticamente reduzidas nos camundongos artríticos tratados com RC-3095. Além disso, o RC-3095 demonstrou redução significativa no conteúdo das citocinas próinflamatórias, como IL-17, IL-1 e TNF-, e reduziu a expressão de receptores GRP nos animais doentes. Estes achados sugerem que via GRP tem um papel significativo na artrite crônica, e sua inibição pode ser explorado como uma estratégia terapêutica. / Background: The gastrin-releasing peptide (GRP) is the mammalian homolog of bombesin (BN). Both GRP and their receptors have been found in synovium of patients with rheumatoid arthritis. GRPR may be considered as a therapeutic target for inflammatory diseases. RC-3095 is a GRP receptor antagonist. Objective: To evaluate the anti-inflammatory effects of RC-3095 in two experimental models of arthritis, collagen and antigen-induced arthritis (CIA and AIA, respectively) and the mechanism involved. Methods: RC-3095 was administered daily to mice with CIA or with AIA provoked by methylated bovine serum albumin (mBSA). Disease incidence and severity were assessed by a clinical index and histologic features. Immunohistochemistry for GRPR in CIA. Migration of neutrophils, determination of glycosaminoglycans (GAG's) and Lymphoproliferation assay using MTT in AIA. The cytokines: IL-17, IL-1β, TNF on his knees in AIA and CIA were evaluated using enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Analysis of regulatory T cells by flow cytometry in AIA. Results: The RC-3095 reduced neutrophil migration, mechanical hypernociception and the proteoglycan loss in mice with AIA. These findings are associated with the inhibition of proinflammatory cytokines (IL-17, IL-1β and TNF-α) levels and lymphocyte proliferation and increase of T regulatory cell number. In the CIA model, RC-3095 exhibited significant reduction in arthritic scores and the severity of disease determined histologically. Synovial inflammation, synovial hyperplasia, pannus formation and extensive erosive changes were all dramatically reduced in the arthritic mice treated with RC-3095. Furthermore, the mice treated with RC-3095 showed significant reduction in contents of proinflammatory cytokines, such as IL-17, IL-1β and TNF-α. Conclusion: Moreover RC-3095 diminished the GRP receptor expression in arthritic mice. These findings suggest that GRP pathway has a significant role in chronic arthritis, and its inhibition can be explored as a therapeutic strategy.

O câncer compreende uma doença multifatorial responsável por altíssimos indíces de mortalidade globalmente. Embora atualmente tenhamos resultados positivos em relação ao tratamento do câncer principalmente voltados à imunoterapia, dados alarmantes ainda são encontrados. Assim, desenvolvemos linhagens tumorais geneticamente modificadas para expressarem ovalbumina (mOVA ou cOVA) e luciferase, a fim de estudarmos as interações do sistema imune com o tumor. Em nossos resultados, a presença da ovalbumina indicou: Alteração no perfil de crescimento tumoral em animais previamente imunizados com OVA e posteriormente desafiados com o tumor, ativação de células TCD8+ citóxicas anti-OVA além de demonstrar também a capacidade imunogênica das linhagens tumorais quando estas são administradas nos animais em estado necrótico. Ao todo, nosso modelo demonstrou que estratégias de vacinação anti-tumorais possuem a capacidade de ativação do sistema imune para na otimização do reconhecimento e resposta anti-tumoral. / Cancer is characterized as a multifactorial disease responsible for many deaths globally. Although nowadays we can find positive perspectives regarding cancers treatment, it is still very common to notice some alarming data. Therefore, our group developed some genetically modified tumoral lineages expressing ovalbumin (mOVA or cOVA) together with luciferase, in order to elucidate the relationship between tumor and the immune system. In our results, the presence of ovalbumin demonstrated: Changes in tumoral growth when animals were previously immunized with OVA and then challenged with our tumoral lineages; TCD8+ lymphocytes anti-OVA activation thus ovalbumin immunogenic potential when lineages were exposed to necrotic death followed by in vivo administration. In summary, our model showed that anti-tumoral vaccinations are indeed capable of promoting immune systems activation and consequently, improving the anti-tumor immunity.

Orientador: Joyce Maria Annichino-Bizzacchi / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-11T19:16:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Alessio_AnaClaudiaMorandi_D.pdf: 3316449 bytes, checksum: 10f07774d2dd3d9f4bda9f95e7910eb6 (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: Nosso estudo teve o objetivo de analisar o efeito da hiperhomocisteinemia (HHcy) leve e controlada no desenvolvimento da aterosclerose em modelos murinos normais, deficientes de apolipoproteína E (apoE-/-), deficientes dos receptores de LDL (LDLR-/-) ou hemofílicos B. Foi realizada a quantificação das lesões ateroscleróticas no seio aórtico e análise do estresse do retículo endoplasmático (RE) pela técnica de western-blot. As concentrações de ácido fólico e vitamina B12 foram determinadas por radioimunoensaio e, a concentração da homocisteína (Hcy) plasmática por HPLC-MS/MS. Os camundongos receberam dietas enriquecidas em metionina por gavage com baixos ou altos níveis de ácido fólico, vitamina B12 e B6 (dietas B e C, respectivamente), e dieta com baixos níveis de ácido fólico, vitamina B12 e B6 (dieta D), para induzir uma HHcy leve. Os animais alimentados com dietas B, C e D apresentaram níveis de Hcy 3 a 5 vezes maiores que os encontrados nos animais normais alimentados com dieta padrão (dieta A), o que é proporcional à definição de HHcy leve em humanos. Os camundongos normais e hemofílicos B não desenvolveram lesão aterosclerótica, mesmo na presença da HHcy. Entretanto, os camundongos normais com dieta B por 24 semanas apresentaram aumento na expressão das proteínas Grp78 e Grp94, representando um estresse do RE. Os camundongos apoE-/- e LDLR-/- com dietas B, C e D por 8 e 20 semanas apresentaram aumento progressivo da lesão aterosclerótica, comparados aos camundongos alimentados com dieta A. Os camundongos apoE-/- com dieta B por 20 semanas apresentaram maior lesão quando comparados aos camundongos com dietas C e D. Esses resultados sugerem que a interação de fatores de risco podem ter um efeito aditivo e/ou sinérgico sobre o desenvolvimento da aterosclerose. Os camundongos apoE-/- tratados com dieta enriquecida em ácido fólico, vitamina B12 e B6 (dieta C) por 20 semanas mostraram menor desenvolvimento de lesões ateroscleróticas que os camundongos apoE-/- tratados com dieta deficiente destas vitaminas (dieta B), ambos submetidos a uma sobrecarga de metionina. Estes resultados corroboram o efeito protetor das vitaminas, particularmente a longo prazo. Como já sugerido em outros estudos, a metionina parece ter um efeito tóxico sobre a vasculatura arterial, evidenciado neste estudo pelo maior grau de lesão nos grupos de animais que tiveram como diferença na dieta a presença deste aminoácido (grupo B vs grupo D). Como os animais hemofílicos morreram muito precocemente, em decorrência de hemorragias, a análise dos resultados ficou comprometida, apenas permitindo demonstrar que não houve formação de lesão aterosclerótica com 8 semanas de exposição às dietas, apesar do aumento da Hcy / Abstract: This study evaluated the effect of controlled mild hyperhomocysteinemia (HHcy) in the development of atherosclerosis using normal, apolipoprotein E-deficient (apoE-/-), LDL receptor-deficient (LDLR-/-), or hemophilia B mice. We quantified atherosclerotic lesions at the aortic sinus and analyzed endoplasmic reticulum (RE) stress by western-blot technique. Concentrations of folic acid and vitamin B12 were determined using radioimmunoassay and homocysteine (Hcy) plasma levels were determined using HPLC-MS/MS. Mice received diets enriched in methionine with low or high levels of folic acid, vitamin B12, and B6 (diets B and C, respectively), and diet only with low levels of folic acid, vitamin B12, and B6 (diet D), to induce mild HHcy. Mice that received diets B, C, and D presented Hcy levels of about 3 to 5 fold the concentration found in wild-type mice fed on standard rodent chow (diet A), representing the same proportional increase of mild HHcy defined in humans. Normal mice and hemophilia B mice did not develop atherosclerotic lesions, even in the presence of mild HHcy. However, normal mice fed on diet B for 24 weeks presented increases in protein Grp78 and Grp94 expressions, representing RE stress. The apoE-/- and LDLR-/- mice fed on diets B, C, and D for 8 and 20 weeks presented a progressive increase in arteriosclerotic lesions, compared to mice fed on diet A. The apoE-/- mice fed on diet B for 20 weeks presented a greater area of the lesion than mice fed on diets C and D. These results suggest that an interaction of risk factors may have a synergic or additive effect in the development of atherosclerosis. The apoE-/- mice fed on the diet enriched in folic acid, vitamin B12, and B6 (diet C) for 20 weeks showed a lower development of atherosclerotic lesions than apoE-/- mice fed on a diet with low levels these vitamins (diet B), both subjected to an overload of methionine. These results corroborated the protective effect of vitamins, particularly in the long term. As suggested in other studies, methionine may have a toxic effect on arterial vasculature, demonstrated in this study by greater lesions in the animal groups that presented this amino acid in the diet (group B vs group D). Since hemophilia B mice died very early, due to hemorrhage, the analysis of the results was compromised. We could only demonstrate that they did not develop atherosclerotic lesions with 8 weeks of exposure to diets, in spite of increase of Hcy levels / Doutorado / Medicina Experimental / Doutor em Fisiopatologia Medica

A mucosite oral é um efeito colateral de quimioterapia e radioterapia de cabeça e pescoço e consiste de uma comorbidade severa com a presença de xerostomia, lesões ulcerativas, infecções secundárias e dor, passíveis de alterar e até interromper a terapia antineoplásica, diminuindo a possibilidade de controle da doença. A mucosite oral pode ser tratada com variados esquemas terapêuticos, incluindo a utilização de laser de baixa intensidade, que diferem em tipo de laser, densidade de energia, comprimento de onda utilizados, entre outros parâmetros de irradiação. Este trabalho utilizou mesmos parâmetros de irradiação laser (30 mW, 7,5 J/cm2, 0,04 mm diâmetro do feixe, 10 s por ponto, 3 pontos no dorso e 2 pontos no ventre da língua, com distância de 1 mm da superfície, 48/48 h por até 20 dias), diferindo apenas o comprimento de onda utilizado, &lambda; = 660 nm e &lambda; = 780 nm. Em seguida, os efeitos da irradiação foram comparados entre si e em relação ao grupo controle não tratado. Foi feita a padronização de modelo animal de mucosite oral em ratos utilizando radiação gama de fonte panorâmica, em dose única de 20 Gy, para avaliação uniforme dos grupos. Para tanto, foi elaborado escore clínico detalhado ponto a ponto, com correlação estatística, que se mostrou eficiente na avaliação clínica desta comorbidade. Após análise estatística dos dados coletados (p < 0,05), pode-se verificar que existem diferenças entre as terapias com laser, além de sua superioridade em relação ao grupo Controle. Os animais do grupo laser &lambda; = 660 nm apresentaram maior produção de colágeno em mucosa e fechamento de feridas mais rapidamente nos dias 14 e 20 quando comparados ao grupo laser &lambda; = 780 nm. Ambos os tratamentos foram superiores em relação ao grupo Controle. Os tratamentos laser também se mostraram superiores ao Controle na modulação da inflamação, formação de pseudomembrana e estimulação de angiogênese. Estes resultados indicam que os benefícios obtidos pelos dois comprimentos de onda, nas mesmas condições de irradiação, são diferentes, podendo ser utilizados de forma complementar em pacientes. / A well-known side effect of head and neck chemotherapy and radiotherapy is oral mucositis. This severe comorbidity presents xerostomya, ulcers, secondary infections and pain that can alter and even force to interrupt tumor-targeted therapies. Various treatments currently exist such as in particular low-level laser therapies (LLT) with different parameters including laser type, energy density, or wavelength. In the present study we propose to compare the effects of LLT at two different wavelengths, &lambda;= 660 nm and &lambda; = 780 nm, on an animal model. For this purpose we separated rats in three groups: one control group and one group for each wavelength. Apart from the wavelengths, the other laser irradiation parameters were identical: 30 mW, 7,5 J/cm2, 0,04 mm diameter, 10 s per point, 3 points on the upper side and 2 points on the lower side of the tongue , 1 mm away from the surface, 48/48 h until 20 days. An animal model of oral mucositis in rats was established by irradiation with a panoramic source of 60Co, single dose of 20 Gy, to ensure uniform evaluation of the groups. In addition, I elaborated a novel clinical point-to-point score scheme with statistical correlation that is proven to be efficient for clinical evaluation of this comorbidity. After statistical analysis using p < 0,05, we observed differences between each laser therapies and also in relation to the control group. The animals treated with &lambda; = 660 nm presented a higher amount of collagen in the mucosal region and faster wound healing when compared to the animals treated with &lambda; = 780 nm. Both laser treatments showed superior efficiency than the control group for collagen generation and wound healing speed, as well as in the inflammatory modulation, pseudomembrane production and angiogenesis stimulation. These results indicate that both laser treatments are beneficial in the wound healing process, with complementary effects depending on the wavelength. This suggests that laser therapies at various wavelengths could be simultaneously used for oral mucositis treatment.

Objetivos: Verificar alterações na mecânica e parâmetros de morfometria pulmonar em um estudo temporal sobre enfisema em um modelo animal. Métodos:Setenta camundongos Balb / c receberam instilação nasal de solução de papaína ou salina e foram estudados no 1º, 3º, 15º, 28º e 40º dias após a instilação. Resistência das vias aéreas (Raw), Resistência do tecido (Gtis) e elastância tecidual (Htis), foram analisados. Intercepto Linear Médio (Lm), a proporção do volume de fibras elásticas e colágenas, macrófagos (MAC), o número de células que expressam MMP12 e a expressão de -isoprostano 8 no parênquima pulmonar, foram medidos. Resultados: Comparando os grupos papaína e solução salina ao longo do tempo, foi observado um aumento de Lm após o dia 28, associado a uma diminuição no Htis e Gtis. Houve um aumento na proporção do volume das fibras colágenas a partir do dia 15 até o dia 40, enquanto a proporção do volume de fibras elásticas foi aumentada somente no dia 40. Analisando o número de macrófagos, houve um aumento no dia 1 e manteve-se crescente até o dia 40. A expressão de MMP12 aumentou a partir do dia 3 até o dia 40. No entanto, a expressão de isoprostano 8 foi maior apenas no dias 1 e 3. Conclusão: Um aumento significativo no intercepto linear médio (Lm) após o dia 28 de instilação de papaína foi associado a uma piora na função pulmonar caracterizando assim o enfisema pulmonar. No entanto, no dia 40, as diferenças na morfometria foram mantidos, mas não houve diferenças na mecânica respiratória. O remodelamento da matriz extracelular observada no parênquima pulmonar no dia 40 poderia explicar estes resultados / Objectives: To verify how mechanical and morphometry parameters change in a temporal study of emphysema in an animal model. Methods: Balb/c mice received either a nasal drop of papain solution (Papa) or saline (Sal) and were studied on the 1st, 3rd, 15th, 28th and 40th days after instillation. We evaluated airway resistance (Raw), tissue damping (Gtis) and tissue elastance (Htis). Using morphometry, we measured mean linear intercept (Lm), volume proportion of elastic and collagen fibers, number of macrophages (MAC), number of cells expressing MMP12 and the expression of 8-isoprostane in parenchyma. Results: Comparing Papain and Saline groups in each time window, we observed an increase in Lm after the 28th day associated to a decrease in Htis and Gtis. The volume proportion of collagen fibers increased from the 15th to the 40th day, while the volume proportion of elastic fibers increased only on the 40th day. Analyzing the macrophages number, there was an increase on the 1st day, and it continued increasing until the 40th day. The expression of MMP12 increased from the 3rd until 40th day. However, the expression of 8-isoprostane increased only on the 1st and the 3rd day. Conclusions: A significant increase in mean linear intercept (Lm) after the 28th day of papain instillation was associated to a worsening in lung function. However, on the 40th day, differences in morphometry maintained but there were no differences in respiratory assessment. The extracellular matrix remodeling observed in lung parenchyma on the 40th day could explain these results

Introdução: A esquizofrenia é um dos principais transtornos mentais e promove distúrbios comportamentais e cognitivos. Apesar do grande impacto social, pouco se conhece sobre a patofisiologia e etiologia da esquizofrenia. Pacientes com desordens psicóticas têm aumentado risco de desenvolver epilepsia, e pacientes com epilepsia do lobo temporal tem alta frequência de psicoses. A utilização de modelos experimentais animais de esquizofrenia e epilepsia pode ajudar a entender a neurobiologia dessas doenças e ter papel importante no desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas. As interações complexas das crises epilépticas e quadros psicóticos tem sido aos poucos desvendadas. O óxido nítrico (NO) é um importante modulador da neurotransmissão e doadores de NO como o nitroprussiato de sódio (NPS) tem efeitos promissores em pacientes com esquizofrenia. Em modelos animais de epilepsia, NO pode ter efeito pró ou anticonvulsivante, sugerindo que o uso de NPS em pacientes com epilepsia e psicose pode não ser tão simples. Objetivos: Desenvolver um modelo animal de epilepsia e psicose comórbida, e compará-lo do ponto de vista comportamental e neuropatológico com modelos animais puros de epilepsia e esquizofrenia. Além disso, verificar a possível modulação desencadeada pelo tratamento com NPS nos modelos citados. Metodologia: Ratos Wistar machos (260-300g) foram divididos em grupos controle (SAL+SAL), epilepsia puro (PILO+SAL), esquizofrenia (SAL+QUET), epilepsia e psicose comórbida (PILO+QUET) e suas versões tratadas com NPS (SAL+SAL+NPS, PILO+SAL+NPS, SAL+QUET+NPS e PILO+QUET+NPS). Esses animais foram avaliados em diferentes aspectos comportamentais (campo aberto, teste de inibição pré- pulso, memória de reconhecimento de objeto e memória de trabalho), e filmados ao longo de 71 dias para o monitoramento de crises epilépticas espontâneas recorrentes. Também foram avaliadas a perda neuronal e a expressão de nNOS em diferentes regiões cerebrais. Resultados: NPS reduziu a frequência de crises nos animais com epilepsia e psicose comórbida quando comparados a animais não tratados. NPS também teve efeito ansiolítico no modelo animal de epilepsia com e sem psicose, e diminuiu os correlatos comportamentais de sintomas positivos dos animais no modelo de psicose e no de epilepsia + psicose, além de reverter o prejuízo no filtro sensório motor nos animais que receberam pilocarpina e quetamina. No reconhecimento de objeto o modelo de epilepsia e epilepsia+psicose o tratamento com NPS não interferiu no desempenho de memória de curto prazo, porém NPS melhorou a memória de longo prazo no modelo de psicose. NPS preservou regiões como o córtex entorrinal e subiculum nos animais epilépticos, mas a camada granular e córtex pré-límbico revelaram perda significativa nos animais controles. Alta expressão de nNOS em diferentes regiões cerebrais foram visualizadas nos animais com epilepsia, com destaque para aqueles que receberam tratamento com NPS. Conclusão: O tratamento com NPS foi efetivo na amenização de sintomas correlatos comportamentais de psicose no modelo puro de esquizofrenia e no comórbido VIII com epilepsia. Além disso, não exacerbou crises e contribuiu para diminuição delas nos animais do modelo de epilepsia e psicose, que apresentou grandes similaridades com o que é encontrado em casos clínicos. Nossos resultados sugerem que o uso do NPS pode ter resultados na melhoria dos sintomas da psicose interictal humana, assim como já observado para a esquizofrenia. / Introdution: Schizophrenia is a major mental disorder that affects 1% of young adults and has a great impact on quality of life, behavior, and cognition. Despite the high social burden, little is known about the pathophysiology and etiology of schizophrenia. Patients with psychotic disorders have increased risk of developing epilepsy, and patients with temporal lobe epilepsy have a high frequency of psychoses. The use of experimental animal models of epilepsy and schizophrenia may help to better understand the neurobiology of these diseases and play an important role in the development of potential new therapeutic strategies. The complex interactions of seizures and psychotic symptoms are being unveiled. Nitric oxide (NO) is an important modulator of neurotransmission and NO donors such as sodium nitroprusside (SNP) have shown promising effects in schizophrenic patients. In animal models of epilepsy, NO may exert pro- or anticonvulsant effects, suggesting that the use of SNP in patients with epilepsy and psychosis may not be so straightforward. Objectives: To develop an animal model of epilepsy and comorbid psychosis, and compare it from the behavioral and neuropathological point of view with pure animal models of epilepsy and schizophrenia. It was hoped, to verify the possible modulation triggered by the treatment with SNP. Metodology: Males Wistar rats weighing 260-300g were divided in controls group (SAL+SAL), pure epilepsy (PILO+SAL), schizophrenia (SAL+QUET), comorbid psychosis (PILO+KET) and their versions treated with SNP (SAL+SAL+SNP, PILO+SAL+SNP, SAL+KET+SNP and PILO+KET+SNP). These animals were evaluated in a variety of behavioral tests (open field, prepulse inhibition startle reflex, object recognition and working memory), and were filmed over 71 days to monitor spontaneous recurrent seizures. We also evaluated neuronal loss and nNOS expression in different brain regions. Results: SNP reduced seizure frequency in animals with epilepsy and psychosis when compared to those not treated with SNP. SNP also showed anxiolytic effects in the animal model of epilepsy with or without psychosis, decreased behavioral correlates of positive symptoms in the animal model of epilepsy + psychosis, and prevented sensorimotor gating deficits in epilepsy + psychosis IX model, The object recognition test showed that in epilepsy and epilepsy + psychosis models the treatment with SNP did not interfere with short-term memory performance, but SNP improved long-term memory in the psychosis model. SNP preserved brain regions like entorhinal cortex and subiculum in epileptic animals, but the granular layer and prelimbic cortex revealed significant loss in controls animals. High expression of NOS in same brain regions was observed in the animal model of epilepsy, especially in the animals receiving SNP. Conclusion: Treatment with SNP was effective in ameliorating symptoms of behavioral correlates of psychosis in the pure model of schizophrenia and the model comorbid with epilepsy. Moreover, SNP did not exacerbate seizures and reduced seizure frequency in the animal model of epilepsy + psychosis, which showed striking similarities to clinical cases. Our results suggest that the use of SNP could ameliorate symptoms of human interictal psychosis, such as those observed in schizophrenia.

Apesar do grande avanço da laringologia nas últimas décadas, o tratamento da rigidez da prega vocal continua sendo um desafio. A rigidez da prega vocal pode estar associada a alterações estruturais mínimas como no sulco vocal profundo ou decorrente da fibrose cicatricial como nos casos de cicatriz pós-operatória. Em ambos os casos, há perda dos elementos da matriz extracelular da camada superficial da lâmina própria (Espaço de Reinke) que se encontra substituída por tecido cicatricial. O objetivo do tratamento é recuperar a deficiência volumétrica e restabelecer a microarquitetura histológica da prega vocal. O tecido areolar perifascial constitui uma excelente alternativa por suas propriedades viscoelásticas semelhantes à da camada superficial da lâmina própria, por sua fácil obtenção e baixo custo. O objetivo deste estudo foi avaliar as alterações histológicas que ocorrem no enxerto e na prega vocal enxertada e comparar os resultados encontrados com a prega vocal contralateral, submetida apenas à manipulação cirúrgica. Trinta coelhos foram submetidos ao procedimento cirúrgico que consistiu na confecção de um bolsão na lâmina própria de ambas as pregas vocais. O enxerto foi colocado na prega vocal direita e a prega esquerda utilizada como controle. Os animais foram divididos randomicamente em três grupos diferindo no tempo da análise histológica: 15 dias (Grupo I), três meses (Grupo II) e seis meses (Grupo III). As lâminas foram coradas com hematoxicilina-eosina e pelo Sírius-red, uma coloração específica para fibras colágenas. Observou-se uma mudança gradual do enxerto com aumento progressivo da densidade das fibras colágenas no interior do enxerto e uma mudança progressiva do padrão de birrefringência das mesmas, de um predomínio de fibras colágenas amarelo-esverdeadas para um predomínio de fibras laranja-avermelhadas. A laplicação do teste estatístico Anova one-way mostrou um aumento estatisticamente significativo da densidade de colágeno total no interior do enxerto entre os animais dos Grupos I e II (p=0,004) e um aumento significativo da porcentagem de fibras laranja-avermelhadas entre o Grupo II e III (p=0,011). A densidade do colágeno na região adjacente ao enxerto na prega vocal enxertada foi estatisticamente maior que a densidade de colágeno na incisão cirúrgica na prega vocal controle em todos os grupos de estudo (p 0,001). A aplicação do Teste de Fisher na análise semiquantitativa do processo inflamatório não evidenciou diferença estatisticamente significativa entre a prega vocal enxertada e a prega vocal controle em nenhum dos tempos estudados. Entretanto, quando avaliamos o processo inflamatório temporalmente para cada prega vocal evidenciamos uma diminuição significativa do processo inflamatório entre os animais do grupo de 15 dias e três meses (p=0,032 para o grupo enxertado e p=0,035 para o grupo controle). Nossos achados sugerem que o tecido areolar perifascial apresenta baixa tendência a promover reação inflamatória e permanece na prega vocal do coelho por pelo menos seis meses. Entretanto, há uma importante mudança da composição do colágeno dentro do enxerto e no tecido ao redor deste sugerindo não ser um tecido ideal para substituir a lâmina própria. Outros estudos devem ser realizados para avaliar o seu papel no tratamento da rigidez da prega vocal. / Besides the great development of phonosurgery over the previous decades, vocal fold stiffness is a difficult disease that remains a therapeutic challenge. It may be either caused by cicatricial fibrosis or be associated with minor structural alterations of the vocal fold mucosa, mainly represented by deep sulcus vocalis. In both cases, there is loss and disorganization of extracellular matrix components of the superficial layer of the lamina propria (Reinkes Space), which is replaced by fibrotic tissue. The treatment goal is to re-establish the physical volume and the microarchitecture of the vocal folds. The perifascial tissue consists of a loose areolar tissue with viscoelasticity properties close to those of the superficial layer of the lamina propria. Thus, the aim of this experiment was to evaluate the histological changes of the graft and in the host tissue after placing a strip of this tissue into rabbits vocal folds. Thirty rabbits were operated. The graft was implanted in pockets surgically created in the right vocal fold. The left vocal fold was used as control. The animals were randomically divided in three groups for evaluation at 15 days (Group I), 3 months (Group II) and 6 months (Group III) and their larynx reviewed histologically. Histological sections underwent hematoxylin-eosin and specific staining method to quantify collagen fibers (Picrosirius-polarization method). Histological changes of the graft were observed since 15 days post-operatively and were characterized by a progressive increase of the density of collagen fibers and decrease of vascularization. Examination of Picrosirius-red stained section with polarizing microscopy revealed a gradual change of collagen fibers pattern with a predominance of greenish-yellow range observed in the original tissue and in Group I and mostly redish-orange range in the grafts of Group II and III. Statistical analysis (Anova one-way) showed a significant increase of the liitotal collagen density in the graft between Group I and II (p=0.004) and a significant predominance of redish-orange pattern between Groups II e III (p=0.011). The collagen density of the surrounding area of the graft in the implanted vocal fold was significantly increased when compared to control in all periods (p 0.001). The inflammatory process was not statistically different between the implanted vocal folds and controls according to Fisher´s test for any of the studied groups. Nonetheless, when the inflammatory process of each vocal fold was individually assessed on a long-term basis, a significant decrease of the inflammatory process was seen in the host (p=0.032) and control vocal fold (p=0.035) between Group I and II. Our findings suggest that the PAT has some advantages as a substance for vocal fold augmentation: it has low tendency to promote inflammatory response and low rate of absorption since it remains in the vocal fold for at least six months. However, the histological changes that take place in the graft and in the host tissue suggest that the PAT is not an ideal material as a substitute for the lamina propria and new studies are needed to determine its role on the treatment of vocal fold scarring.

Des modifications du gène PMP22 (Peripheral Myelin Protein 22) sont responsables de neuropathies du système nerveux périphérique : l’Hypersensibilité à la Pression (HNPP : Hereditary Neuropathy with liability to Pressure Palsy) lorsqu’il est délété, CMT1A (Charcot-Marie-Tooth type 1A) lorsqu’il est dupliqué et CMT1E ou HNPP lors de mutations ponctuelles. Cependant, le rôle de la protéine PMP22 dans ces neuropathies demeure obscur. Dans un premier temps, nous nous sommes intéressés aux partenaires d’interactions potentiels de PMP22 : l’intégrine α6β4 (un récepteur des laminines), pourrait être impliqué dans le CMT1A. Dans cette étude, nous avons utilisé un modèle de rat transgénique portant des copies supplémentaires de PMP22 de souris. Chez ce modèle, nous avons mis en évidence des variations d’expression génique des intégrines, ainsi qu’une mauvaise localisation cellulaire de celles-ci. Ces variations des niveaux d’expression des intégrines sont les témoins d’un retard de la maturation des cellules de Schwann myélinisantes, expliquant la diminution de l’épaisseur des gaines de myéline, observée chez les rats CMT1A. Dans un second temps, nous avons étudié le cas particulier d’un patient sans expression de PMP22, en raison de deux mutations composites sur les deux allèles de PMP22. Nous avons observé que l’absence de PMP22 chez l’homme entraine une absence complète de myéline due à un blocage de l’initialisation de la myélinisation lors de la formation du mésaxone. Dans un troisième temps, nous avons effectué une étude comparative de modèles animaux et de patients atteints de CMT1A / 1E et d’HNPP permettant de valider l’utilisation de tels modèles dans l’étude de ses neuropathies. Enfin, nous nous sommes intéressés d’un point de vue informatique à la structure tridimensionnelle de différentes protéines dont PMP22 grâce à la dynamique moléculaire. Ce modèle tridimensionnel de PMP22 est le point de départ de l’étude des mutations ponctuelles ainsi que des interactions de PMP22 avec son environnement. Grâce aux animaux modèles et à l’étude de patients, nous avons montré le rôle indispensable de PMP22 dans l’initialisation de la myélinisation ainsi que son effet sur les intégrines dans le CMT1A. L’utilisation de modèles informatiques tridimensionnels créés de PMP22 permettra de comprendre les effets des mutations ponctuelles sur sa structure, et ses interactions. / Interactions study of PMP22 protein with integrins in Charcot-Marie-Tooth disease type 1A pathogenesisChanges in the PMP22 gene (Peripheral Myelin Protein 22) are responsible for peripheral nervous system neuropathies: Hereditary Neuropathy with liability to Pressure Palsy (HNPP) when PMP22 is deleted, Charcot Marie Tooth disease subtype 1A (CMT1A) when PMP22 is duplicated and CMT1E or HNPP when point mutations are present on the PMP22 gene. However, the PMP22 role in these neuropathies remains unclear. Firstly, we studied one of the PMP22 interaction partner: the α6β4 integrin (a laminin receptor), which could be involved in the CMT1A. During this study, we used a transgenic rat model carrying supplementary copies of PMP22 gene from mouse. With this model, we showed variations of expression of integrins genes and a mislocalization of integrins proteins. These variations of integrins witnesses a delay in myelinating Schwann cells maturation, explaining the reduction of myelin sheath thickness observed on CMT1A rats. In a second time, we studied the case of a patient without PMP22 expression, carrying compound mutations one the two alleles of PMP22. We showed that the lack of PMP22 on human leads to a complete lack of myelin due to a blocking in mesaxon formation. In a third time, we conducted a comparative study of animal models and patients with CMT1A / 1E and HNPP. This study allows us to validate the use of such models in the study of neuropathies. Finally, thanks to computational tools we studied the three-dimensional structure of different protein, including PMP22 by using molecular dynamics. This three-dimensional model is the starting point of point mutations study as well as PMP22 interactions with its environments. With animal models and through the study of patients, we have demonstrated the indispensable role of PMP22 in myelin initiation as well as, its effect on integrins expression in CMT1A. The use of PMP22 three-dimensional computational model will help us to understand effects of point mutation on PMP22 structure and interactions.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Bovine herpesvirus type 5 (BoHV-5) is an alphaherpesvirus associated with meningoencephalitis, an important disease of cattle in South America. Alphaherpesvirus recombinants have been used to study the function of gene products and also for vaccine production. In particular, the gene encoding the enzyme thymidine kinase (tk) has been deleted to produce attenuated strains. Thymidine kinase is required for efficient replication of these viruses in the central nervous system (CNS), and its deletion or inactivation is associated with reduction of virulence. Thus, the present study aimed to investigate the pathogenesis and to characterize clinically and virologically the acute and latent infection by BoHV-5 (strain SV-507/99) and by tk-deleted recombinant (BoHV-5tkΔ) in lambs. Chapter 1 reports the characterization of latent by BoHV-5 infection in lambs. During acute infection, lambs inoculated with BoHV-5 (SV-507/99) shed virus in nasal secretions during up to 11 days and developed viral neutralizing antibodies in titers ranging from 16 to 128. Administration of corticosteroids during latency (day 65 pi) resulted in virus reactivation and shedding for 3 to 8 days in titers up to 64. Thus, it is proposed that sheep can be used as animal models for studying the biology of latent infection by BoHV-5. In Chapter 2, was investigated the ability of BoHV-5tkΔ to establish and reactivate latent infection in lambs. After viral inoculation, the recombinant virus retained the ability to replicate in the nose of the lambs. At day 40 pi, latent viral DNA was detected in the trigeminal ganglia (TG) in all inoculated animals. However real time PCR demonstrated a significantly reduced amount of recombinant DNA (9.7-fold less, p<0.001) compared to the parental virus. Following dexamethasone (Dx) treatment, infectious virus was not detected in nasal secretions of the animals inoculated with the recombinant virus, contrasting with virus shedding by lambs inoculated with the parental virus. Nevertheless, some nasal swabs from animals inoculated with BoHV-5tkΔ were positive for viral DNA, indicating low levels of reactivation. Thus, BoHV-5 TK activity is not required for the establishment of latency, but seems critical for efficient virus reactivation. Chapter 3, reports the ability of BoHV-5 and BoHV-5tkΔ to establish and reactivate latent infection in lymphoid tissues. During latent infection, viral DNA was detected in TGs, pharyngeal and palatine tonsils and in retropharyngeal lymph node of all sheep inoculated with both viruses (parental and recombinant). At day 40 pi, Dx was administered to the animals to induce viral reactivation. Viral mRNA of BoHV-5 glycoprotein B was detected in TGs, retropharyngeal lymph node and tonsils of lambs inoculated with the parental virus. In animals inoculated with BoHV-5tkΔ, gB mRNA was detected only in tonsils. Therefore, it is suggested that lymphoid tissues are also sites of latency by BoHV-5 and the recombinant BoHV-5tkΔ, and that viruses can be reactivated from these sites. However, reactivation of recombinant virus appears to occur only in lymphoid tissues and not in neural tissues. In summary, the presented results contribute for the understanding of the pathogenesis and characterization of infection by BoHV-5 and BoHV-5tkΔ. / O herpesvírus bovino tipo 5 (BoHV-5) é um alfaherpesvírus associado com meningoencefalite, uma doença de grande importância em bovinos na América do Sul. Recombinantes de alfaherpesvírus defectivos em genes não essenciais vem sendo utilizados para o estudo da função de produtos gênicos e também para a produção de vacinas. O gene da enzima timidina quinase (tk) tem sido deletado para produzir cepas atenuadas com fins vacinais. A enzima timidina quinase (TK) é necessária para a replicação eficiente desses vírus no sistema nervoso central (SNC), e a sua deleção ou inativação está associada com a redução da virulência. Assim, o presente trabalho teve como objetivo estudar a patogenia e caracterizar aspectos clínicos e virológicos da infecção aguda e latente pelo BoHV-5 (cepa SV-507/99) e por um recombinante com deleção no gene da tk (BoHV-5tkΔ) em ovinos. O capítulo 1 relata a caracterização da infecção pelo BoHV-5 em ovinos. Durante a infecção aguda, cordeiros inoculados com o BoHV-5 (SV-507/99), excretaram vírus em secreções nasais por até 11 dias pós inoculação (pi) e desenvolveram anticorpos neutralizantes em títulos de 16 até 128. A administração de corticoides durante a latência (dia 65 pi) resultou em reativação e excreção viral durante 3 a 8 dias. Sugere-se, assim, que ovinos podem ser utilizados como modelos animais para o estudo da biologia da infecção latente pelo BoHV-5. No capítulo 2, investigou-se a capacidade do BoHV-5tkΔ em estabelecer e reativar a infecção latente em ovinos. Após inoculação viral, o vírus recombinante manteve a capacidade de replicar na cavidade nasal. No dia 40 pi, DNA viral latente foi detectado nos gânglios trigêmeos (TG) de todos os animais, porém demonstrou-se, uma significativa redução (9,7 vezes; p<0,001) na quantidade de DNA do vírus recombinante em relação ao vírus parental, determinado por PCR em tempo real. Após tratamento com dexametasona (Dx), não foi detectado vírus nas secreções nasais dos animais inoculados com o vírus recombinante, contrastando com a excreção viral nos ovinos inoculados com o vírus parental. Porém, alguns suabes nasais dos animais inoculados com o BoHV-5tkΔ foram positivos para o DNA viral, indicando assim, baixos níveis de reativação. Logo, a atividade da TK no BoHV-5 não é necessária para o estabelecimento de latência, mas é crucial para uma reativação eficiente. O capítulo 3, relata uma investigação da capacidade do BoHV-5 e BoHV-5tkΔ em estabelecer e reativar a infecção latente em tecidos linfoides. Durante infecção latente, DNA viral foi detectado nos TGs, tonsilas faringeal e palatina e no linfonodo retrofaríngeo de todos ovinos inoculados com ambos os vírus (parental e recombinante). No dia 40 pi, foi administrada Dx nos animais para induzir reativação viral. Foi detectado RNA mensageiro (mRNA) da glicoproteína B (gB) do BoHV-5, no TG, linfonodos retrofaríngeos e tonsilas dos cordeiros inoculados com o vírus parental. Nos animais inoculados com o BoHV-5tkΔ, mRNA foi detectado apenas nas tonsilas. Logo, sugere-se que tecidos linfoides também são sítios de latência para o BoHV-5 e do recombinante BoHV-5tkΔ, podendo estes vírus serem reativados à partir destes locais. A reativação do recombinante, no entanto parece ocorrer apenas em tecidos linfoides e não em tecidos neurais. Em resumo, os resultados deste estudo contribuem para o conhecimento da patogenia e caracterização da infecção pelo BoHV-5 e pelo recombinante.

Les douleurs neuropathiques sont secondaires à une maladie ou à une lésion affectant le système nerveux somatosensoriel et sont mal soulagées par les antalgiques usuels. Dans notre travail préclinique, nous avons étudié l’effet de différentes molécules, dont des antidépresseurs et antiépileptiques recommandés dans le traitement des douleurs neuropathiques. Dans un modèle murin de neuropathie traumatique, nous avons étudié l’influence de la période de traitement, précoce ou tardif, sur l’allodynie mécanique. Un traitement précoce par gabapentine ou par carbamazépine permet d’observer un effet préventif sur la chronicisation de l’allodynie. Dans un modèle murin de neuropathie diabétique, nous avons caractérisé l’action anti-allodynique d’un traitement par nortriptyline et par terbutaline. En clinique, nous avons réalisé un travail d’enquête rétrospective sur des patients opérés par thoracotomie. L’analyse des résultats montre une diminution significative du risque de présenter des douleurs chroniques avec des caractéristiques neuropathiques chez les patients traités par β2-agonistes au long cours. / Neuropathic pain is caused by a lesion or disease of the somatosensory nervous system and is badly relieved by usual antalgics. In our preclinical work, we studied the effect of various molecules, in particular antidepressant and anticonvulsant drugs wich are recommended in the treatment of neuropathic pain. In a murine model of traumatic neuropathy, we studied the influence of the period of treatment, early or late, on the mechanical allodynia. An early treatment with gabapentin or carbamazepine leads to a preventive effect on sustained allodynia. In a murine model of diabetic neuropathy, we characterized the antiallodynic action of nortriptyline and terbutaline. In our clinical work, we realized a retrospective survey on patients operated by thoracotomy. The analysis of the results show a significant decrease of the risk to suffer from chronic pain with neuropathic characteristics in patients treated with long-term β2- agonists.