Orientador: Marcos Antonio Machado / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-23T15:02:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Oliveira_TiagoSilva_M.pdf: 9792911 bytes, checksum: ad5dca1b90e42dd95db47317b65cb9be (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: O resumo poderá ser visualizado no texto completo da tese digital / Abstract: The abstract is available with the full electronic document / Mestrado / Genetica Vegetal e Melhoramento / Mestre em Genética e Biologia Molecular

Made available in DSpace on 2016-01-26T18:56:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao.pdf: 324266 bytes, checksum: 7cb8130236c8d36814fc6baebf56c4e4 (MD5) Previous issue date: 2011-03-17 / Plants are always exposed to aggression of biotic and abiotic agents. Their protection pathway is essential, and it would increase the food production. Navy beans (Phaseolus vulgaris L) are of high economic importance and of agronomic value. It is a susceptible crop to temperature and to water stress, what could lead to metabolic alterations as the synthesis of protein defences. The objective of this work was to study the effect of salicylic acid and the cold shock applied to germinating seeds over the water deficit tolerance, during the beginning of the germination process by means of physiological variables and soluble protein expression. Seeds were embedded in moistened paper substrate, half of the sample in water and half in the salicylic acid (0.01mM) in the first 24 hours. Part of both treatments was then subjected to cold shock 24 hours at 7°C. After that all seeds, from both treatments were subjected to different mannitol induced water potentials: 0;-0.3; -0.6 and -1.2 MPa. Water was considered the zero potential. Four combinations were considered: without shock and salicylic acid (SCHSAS), with shock and without salicylic acid (CCHSAS), without shock with salicylic acid (SCHCAS) and with shock and salicylic acid (CCHCAS). Treatments were evaluated by germination, vigour classification, shoot and root dry weight and length, as by the rate shoot/root. After germination evaluation, five normal seedlings were used to protein and another five to proline extraction. Proline was determined in the whole seedling and protein in shoot and in the root, being compared by SDS-PAGE. Results were analyzed as a completely random design in a factorial design (4x4 as a combination of salicylic acid cold shock with the water restriction) by the Tukey s test (P< 5%) for average comparisons and with polynomial regression for water deficit. Electrophoretic patterns were analyzed by absence presence of bands. Germination was not affected by salicylic acid or by the cold shock treatments, but by the increase in the water deficit. Vigour was altered by salicylic acid and by the shock, being the last one affecting positively and the cold shock negatively. Salicylic acid increased length and weight, especially in the intermediary levels of water deficit. Protein expression of the treatments CCHCAS and SCHCAS showed the same electrophorectical patterns for shoot and root, with an increase in the expression for the lower potentials. The pattern of CCHSAS and SCHSAS treatments exhibited some different bands. / As condições ambientais desfavoráveis fazem com que os vegetais passem por adaptações e a forma como se protegem é essencial, podendo aumentar a produção e qualidade dos alimentos. O feijão (Phaseolus vulgaris L) é de grande valor econômico e de relevante interesse agronômico. Tratando-se de uma cultura de sensibilidade à temperatura e deficiência hídrica, podem ocorrer aclimatações e alterações no metabolismo celular, entre elas a síntese de proteínas de defesa. O objetivo deste trabalho foi estudar o efeito do ácido salicílico e do choque frio aplicados às sementes para a possível tolerância à restrição hídrica, durante o início do processo de germinação, por meio de variáveis fisiológicas e expressão de proteínas solúveis. As sementes foram embebidas em substrato papel a temperatura constante de 25°C em água ou solução aquosa correspondente a 2,5 vezes o peso do substrato seco, sendo parte das sementes em água e parte em solução de ácido salicílico à concentração de 0,01 Mm, pelas primeiras 24 horas. Metade das sementes embebidas em água como as embebidas em ácido salicílico foram transferidas para o choque frio, por 24 horas, à temperatura de 7°C. A seguir todas as sementes foram transferidas para um substrato simulando diferentes potenciais osmóticos: 0,0; -0,3; -0,6; -1,2 MPa induzidos por manitol, sendo considerado potencial zero o substrato umedecido com água, compondo quatro combinações sem choque sem ácido salicílico (SCHSAS), com choque sem ácido salicílico (CCHSAS), sem choque com ácido salicílico (SCHCAS) e com choque com ácido salicílico (CCHCAS). Os tratamentos foram avaliados por germinação, classificação de vigor, comprimento de parte aérea e raiz, massa seca da parte aérea e raiz e relação raiz/parte aérea. Após a avaliação da germinação, duas amostras de cinco plântulas normais, por repetição, foram utilizadas para determinação de prolina (plântula toda) e extração de proteínas totais e análise por eletroforese SDS PAGE de parte aérea e raiz. Os resultados foram analisados considerando o delineamento inteiramente casualizado em arranjo fatorial de 4x4 (combinação dos tratamentos com ácido salicílico e choque frio e níveis de deficiência de água no substrato), empregando-se Tukey (5% de probabilidade) para comparação de médias dos tratamentos qualitativos e análise de regressão polinomial para os níveis de deficiência. As análises de eletroforese foram avaliadas por imagem detectando-se presença e ausência de bandas. A germinação não foi influenciada pelos tratamentos com ácido salicílico e choque, mas diminuiu com a progressão da deficiência de água. O vigor foi alterado pelos tratamentos de ácido salicílico e choque, sendo que o tratamento com ácido salicílico influiu positivamente enquanto o choque negativamente. O tratamento com ácido salicílico proporcionou maiores comprimentos e massas secas de parte aérea e total das plântulas, principalmente nos níveis intermediários de deficiência de água. A expressão de proteínas dos tratamentos CCHCAS e SCHCAS revelou o mesmo padrão eletroforético tanto para parte aérea quanto para raiz com maior intensidade de expressão nos potenciais osmóticos menores. O perfil de bandas dos tratamentos CCHSAS e SCHSAS apresentou alteração revelando algumas bandas diferenciadoras.

Made available in DSpace on 2016-07-18T17:51:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao.pdf: 324266 bytes, checksum: 7cb8130236c8d36814fc6baebf56c4e4 (MD5) Previous issue date: 2011-03-17 / Plants are always exposed to aggression of biotic and abiotic agents. Their protection pathway is essential, and it would increase the food production. Navy beans (Phaseolus vulgaris L) are of high economic importance and of agronomic value. It is a susceptible crop to temperature and to water stress, what could lead to metabolic alterations as the synthesis of protein defences. The objective of this work was to study the effect of salicylic acid and the cold shock applied to germinating seeds over the water deficit tolerance, during the beginning of the germination process by means of physiological variables and soluble protein expression. Seeds were embedded in moistened paper substrate, half of the sample in water and half in the salicylic acid (0.01mM) in the first 24 hours. Part of both treatments was then subjected to cold shock 24 hours at 7°C. After that all seeds, from both treatments were subjected to different mannitol induced water potentials: 0;-0.3; -0.6 and -1.2 MPa. Water was considered the zero potential. Four combinations were considered: without shock and salicylic acid (SCHSAS), with shock and without salicylic acid (CCHSAS), without shock with salicylic acid (SCHCAS) and with shock and salicylic acid (CCHCAS). Treatments were evaluated by germination, vigour classification, shoot and root dry weight and length, as by the rate shoot/root. After germination evaluation, five normal seedlings were used to protein and another five to proline extraction. Proline was determined in the whole seedling and protein in shoot and in the root, being compared by SDS-PAGE. Results were analyzed as a completely random design in a factorial design (4x4 as a combination of salicylic acid cold shock with the water restriction) by the Tukey s test (P< 5%) for average comparisons and with polynomial regression for water deficit. Electrophoretic patterns were analyzed by absence presence of bands. Germination was not affected by salicylic acid or by the cold shock treatments, but by the increase in the water deficit. Vigour was altered by salicylic acid and by the shock, being the last one affecting positively and the cold shock negatively. Salicylic acid increased length and weight, especially in the intermediary levels of water deficit. Protein expression of the treatments CCHCAS and SCHCAS showed the same electrophorectical patterns for shoot and root, with an increase in the expression for the lower potentials. The pattern of CCHSAS and SCHSAS treatments exhibited some different bands. / As condições ambientais desfavoráveis fazem com que os vegetais passem por adaptações e a forma como se protegem é essencial, podendo aumentar a produção e qualidade dos alimentos. O feijão (Phaseolus vulgaris L) é de grande valor econômico e de relevante interesse agronômico. Tratando-se de uma cultura de sensibilidade à temperatura e deficiência hídrica, podem ocorrer aclimatações e alterações no metabolismo celular, entre elas a síntese de proteínas de defesa. O objetivo deste trabalho foi estudar o efeito do ácido salicílico e do choque frio aplicados às sementes para a possível tolerância à restrição hídrica, durante o início do processo de germinação, por meio de variáveis fisiológicas e expressão de proteínas solúveis. As sementes foram embebidas em substrato papel a temperatura constante de 25°C em água ou solução aquosa correspondente a 2,5 vezes o peso do substrato seco, sendo parte das sementes em água e parte em solução de ácido salicílico à concentração de 0,01 Mm, pelas primeiras 24 horas. Metade das sementes embebidas em água como as embebidas em ácido salicílico foram transferidas para o choque frio, por 24 horas, à temperatura de 7°C. A seguir todas as sementes foram transferidas para um substrato simulando diferentes potenciais osmóticos: 0,0; -0,3; -0,6; -1,2 MPa induzidos por manitol, sendo considerado potencial zero o substrato umedecido com água, compondo quatro combinações sem choque sem ácido salicílico (SCHSAS), com choque sem ácido salicílico (CCHSAS), sem choque com ácido salicílico (SCHCAS) e com choque com ácido salicílico (CCHCAS). Os tratamentos foram avaliados por germinação, classificação de vigor, comprimento de parte aérea e raiz, massa seca da parte aérea e raiz e relação raiz/parte aérea. Após a avaliação da germinação, duas amostras de cinco plântulas normais, por repetição, foram utilizadas para determinação de prolina (plântula toda) e extração de proteínas totais e análise por eletroforese SDS PAGE de parte aérea e raiz. Os resultados foram analisados considerando o delineamento inteiramente casualizado em arranjo fatorial de 4x4 (combinação dos tratamentos com ácido salicílico e choque frio e níveis de deficiência de água no substrato), empregando-se Tukey (5% de probabilidade) para comparação de médias dos tratamentos qualitativos e análise de regressão polinomial para os níveis de deficiência. As análises de eletroforese foram avaliadas por imagem detectando-se presença e ausência de bandas. A germinação não foi influenciada pelos tratamentos com ácido salicílico e choque, mas diminuiu com a progressão da deficiência de água. O vigor foi alterado pelos tratamentos de ácido salicílico e choque, sendo que o tratamento com ácido salicílico influiu positivamente enquanto o choque negativamente. O tratamento com ácido salicílico proporcionou maiores comprimentos e massas secas de parte aérea e total das plântulas, principalmente nos níveis intermediários de deficiência de água. A expressão de proteínas dos tratamentos CCHCAS e SCHCAS revelou o mesmo padrão eletroforético tanto para parte aérea quanto para raiz com maior intensidade de expressão nos potenciais osmóticos menores. O perfil de bandas dos tratamentos CCHSAS e SCHSAS apresentou alteração revelando algumas bandas diferenciadoras.

[ES] En respuesta a estreses de tipo biótico y abiótico, las plantas sintetizan proteínas de defensa y compuestos químicos de diversa naturaleza. Estos compuestos pueden actuar de manera directa, a través de propiedades antioxidantes, antifúngicas o antibacterianas, o actuar como metabolitos defensivos indirectos. Dentro de este último grupo de compuestos defensivos, cabe destacar a los compuestos fenólicos y los compuestos orgánicos volátiles (VOCs). En nuestro grupo de investigación se ha profundizado en el estudio de estos metabolitos secundarios implicados en la respuesta defensiva de las plantas. Por una parte, se identificó el ácido gentísico (GA) como una molécula señal que actúa de manera complementaria al ácido salicílico (SA) en infecciones de tipo sistémico. Además, se ha tratado de profundizar en el estudio de la biosíntesis del GA a través de la enzima salicilato 5-hidroxilasa (S5H), encargada de la conversión de SA a GA. Para ello, se ha llevado a cabo la caracterización fenotípica, molecular y química de plantas transgénicas de tomate que tienen silenciado el gen S5H mediante la técnica de RNA de interferencia (RNAi_S5H) frente a infecciones de tipo bacteriano y viroidal. Las plantas de tomate RNAi_S5H presentaron un aumento de resistencia frente a Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 (Pst DC3000) y el viroide de la exocortis de los cítricos (CEVd). Del mismo modo, se llevaron a cabo análisis metabolómicos de estas plantas transgénicas RNAi_S5H tras ambas infecciones, observándose diferencias relacionadas con el metabolismo del SA, que parecen indicar que la homeostasis del SA es específica para cada interacción tomate-patógeno. Por otra parte, se identificaron algunos ésteres de (Z)-3-hexenol que eran emitidos de manera diferencial tras la infección bacteriana con la cepa avirulenta de Pst DC3000 en plantas de tomate cv. Rio Grande. Concretamente, tratamientos exógenos con el compuesto volátil butanoato de (Z)-3-hexenilo (HB) fueron capaces de inducir de manera significativa el cierre de estomas, la activación de genes defensivos y un aumento en la resistencia frente a la infección bacteriana. La eficacia de este compuesto como inductor de cierre estomático fue comprobada en diferentes cultivos agronómicos, como Arabidopsis, Medicago, Zea, Citrus y Nicotiana, confirmando su papel como un inductor de cierre estomático universal. Dado el potencial de este compuesto en agricultura, se emplearon aproximaciones genéticas, bioquímicas y farmacológicas para descifrar el mecanismo de señalización del cierre estomático mediado por HB. Una vez el volátil es percibido por los receptores de la planta, se activan diferentes componentes de la cascada de señalización defensiva, como canales permeables de Ca2+ o la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS). Asimismo, el HB es capaz de desencadenar la activación de las proteínas quinasas activadas por mitógenos MPK3 y MPK6, induciendo el cierre estomático de una manera independiente a la síntesis y señalización mediada por ácido abscísico (ABA). Por último, la eficacia del HB fue evaluada en condiciones de campo frente a estreses tanto de tipo biótico como abiótico y en procesos de desarrollo como la maduración, proponiendo un uso del HB como un nuevo compuesto fitoprotector natural para el control de estreses de forma sostenible en agricultura. / [CA] En resposta a estressos de tipus biòtic i abiòtic, les plantes sintetitzen proteïnes de defensa i compostos químics de diversa naturalesa. Aquests compostos poden actuar de manera directa, a través de propietats antioxidants, antifúngiques o antibacterianes, o actuar com a metabòlits defensius indirectes. Dins d'aquest últim grup de compostos defensius, cal destacar als compostos fenòlics i els compostos orgànics volàtils (VOCs). En el nostre grup d'investigació s'ha aprofundit en l'estudi d'aquests metabòlits secundaris implicats en la resposta defensiva de les plantes. D'una banda, es va identificar l'àcid gentísic GA) com una molècula senyal que actua de manera complementària a l'àcid salicílic (SA) en infeccions de tipus sistèmic. A més, s'ha tractat d'aprofundir en l'estudi de la biosíntesi del GA a través d l'enzim salicilato 5-hidroxilasa (S5H), encarregada de la conversió de SA a GA. Per a això, s'ha dut a terme la caracterització fenotípica, molecular i química de plantes de transgèniques de tomaca que tenen silenciat el gen S5H mitjançant la tècnica d'RNA d'interferència (RNAi_S5H) enfront d'infeccions de tipus bacterià i viroidal. Les plantes de tomaca RNAi_S5H van presentar un augment de resistència enfront de Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 (Pst DC3000) i el viroide de la exocortis dels cítrics (CEVd). De la mateixa manera, es van dur a terme anàlisi metabolómics d'aquestes plantes transgèniques RNAi_S5H després de totes dues infeccions, observant-se diferències relacionades amb el metabolisme del SA, que sembla indicar que l'homeòstasi del SA és específica per a cada interacció tomaca-patògena. D'altra banda, es van identificar alguns èsters de (Z)-3-hexenol que eren emesos de manera diferencial després de la infecció bacteriana amb el cep avirulent de Pst DC3000 en plantes de tomaca cv. Rio Gran. Concretament, tractaments exògens amb el compost volàtil butanoato de (Z)-3-hexenilo (HB) van ser capaces d'induir de manera significativa el tancament d'estomes, l'activació de gens defensius i un augment en la resistència enfront de la infecció bacteriana. L'eficàcia d'aquest compost com a inductor de tancament estomàtic va ser comprovada en diferents cultius agronòmics, com Arabidopsis, Medicago, Zea, Citrus i Nicotiana, confirmant el seu paper com un inductor de tancament estomàtic universal. Donat el potencial d'aquest compost en agricultura, es van emprar aproximacions genètiques, bioquímiques i farmacològiques per a desxifrar el mecanisme de senyalització del tancament estomàtic mediat per HB. Una vegada el volàtil és percebut pels receptors de la planta, s'activen diferents components de la cascada de senyalització defensiva, com a canals permeables de Ca2+ o la producció d'espècies reactives d'oxigen (ROS). Així mateix, el HB és capaç de desencadenar l'activació de les proteïnes cinases activades per mitógens MPK3 i MPK6, induint el tancament estomàtic d'una manera independent a la síntesi i senyalització mediada per l'àcid abscísic (ABA). Finalment, l'eficàcia del HB va ser avaluada en condicions de camp enfront d'estressos tant de tipus biòtic com abiòtic, i en processos de desenvolupament com la maduració, proposant un l'ús del HB com a nou compost fitoprotector natural per al control d'estressos de manera sostenible en agricultura. / [EN] In response to biotic and abiotic stress, plants synthesize defence proteins and chemical compounds from diverse nature. These compounds can act directly, trough antioxidant, antifungal or antibacterial properties, or indirectly as defensive metabolites. Among these group of defensive metabolites, phenolic compounds and volatile organic compounds (VOCs) present a major role. Our research group have a strong background in studying the role of plant secondary metabolites in plant defence mechanisms. On one hand, gentisic acid (GA) was first described as a signal molecule that acts complementary to salicylic acid (SA) in systemic infections. Furthermore, SA conversion to GA trough the salicylate 5-hydroxylase enzyme (S5H) has received much attention. For this purpose, S5H-silenced transgenic tomato plants (RNAi_S5H) have been phenotypically, molecularly, and chemically characterized against both, bacterial and viroidal inoculations. RNAi_S5H tomato plants resulted in enhanced resistance to both Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 (Pst DC3000) and Citrus Exocortis Viroid (CEVd). Moreover, metabolomics analysis of these transgenic plants upon bacterial and viroid infections revealed differences related to SA metabolism, suggesting that SA homeostasis is specific for each tomato-pathogen interaction. On the other hand, some esters of (Z)-3-hexenol were identified to be differentially emitted by tomato cv. Rio Grande plants upon infection with the avirulent strain of the bacterium Pst DC3000. Particularly, treatments with the volatile (Z)-3-hexenyl butyrate (HB) resulted in significant stomatal closure, defence genes induction and enhanced resistance to the bacteria. Moreover, the efficacy of this compound as a stomata closer was tested in different agronomic crop as Arabidopsis, Medicago, Zea, Citrus y Nicotiana plants, postulating HB as a new universal stomata closer. Due to its potent properties, the signalling pathway of the HB-mediated stomata closure has been deciphered by using different genetic, biochemical, and pharmacological approaches. The perception of this volatile by plant receptors appeared to initiate different defence signalling events, including the activation of Ca2+ permeable channels or reactive oxygen species (ROS) burst. Moreover, HB triggered the activation of the mitogen-activated protein kinases MPK3 and MPK6, inducing stomatal closure independently of abscisic acid (ABA) biosynthesis and signalling. Additionally, HB efficacy has been also tested in field conditions and against both biotic and abiotic stresses, and also during ripening, proposing HB as a new natural phytoprotector for the sustainable control of stresses in agriculture. / This work was funded by Grant AICO/2017/048 from the Generalitat Valenciana and by Grant INNVAL10/18/005 from the Agència Valenciana de la Innovació (Spain). / Payá Montes, C. (2023). Secondary Metabolites in Plant Defence Mechanisms [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/193041

Neste trabalho, enzimas álcool-desidrogenases provenientes de fungos marinhos e a lipase imobilizada de Candida antarctica foram utilizadas para produção de compostos de interesse sintético e biológico. No capítulo 1, enzimas álcool-desidrogenases de fungos isolados da alga marinha Bostrychia radicans foram empregadas em reações de redução de cetonas fluoradas 1-5. Os fungos identificados como Botryosphaeria sp. CBMAI 1197, Eutypella sp. CBMAI 1196, Hidropisphaera sp. CBMAI 1194 e Xylaria sp. CBMAI 119 atuaram como biocatalisadores nestas reações levando à produção de álcoois com elevada pureza enantiomérica. O fungo Botryosphaeria sp. CBMAI 1197 destacou-se frente aos demais microrganismos, produzindo os álcoois (S)-2,2,2-trifluoro-1-feniletanol (1a) e (R)-1-(2,4,5-trifluorofenil)etanol (3a) com excelentes conversões (100% e 97%) e excessos enantioméricos (ee >99%). Este fungo também apresentou enzimas álcool-desidrogenases ativas frente a cetonas dicarboniladas 4-5, produzindo os álcoois 4,4,4-trifluoro-1-fenil-1,3-butanodiol (4a) e 4,4,4-trifluoro-1-(2-naftalenil)-1,3-butanodiol (5a) com 100% de conversão em ambos os casos e com purezas enantioméricas respectivas a 99% e 97%. Este foi o primeiro estudo realizado no Brasil com fluorocetonas dicarboniladas e com os fungos isolados da alga marinha Bostrychia radicans. No capítulo 2, a lipase comercial de Candida antarctica foi o biocatalisador empregado em reações de aminólise entre os ésteres linoleato de etila (1) e salicilato de etila (3), a amina graxa N-dodecilamina (2) e os aminoálcoois (4-9). A amina graxa N-dodecilamina (2) também foi utilizada em reações com o linoleato de etila (1), onde a lipase de Candida antarctica produziu a respectiva amida graxa 10 com rendimentos superiores a 95%. Os aminoálcoois foram selecionados para reações com o salicilato de etila (3), onde a lipase exibiu quimiosseletividade pelo grupo amino, produzindo predominantemente amidas fenólicas (12-19) com rendimentos entre 23-68%. A enzima CALB apresentou quimiosseletividade reduzida na reação com o 5-aminopentanol (6) onde os produtos amida 14 e éster 15 foram obtidos com rendimentos de 44 e 33%, respectivamente. O produto 2-hidroxi-N-(2-hidroxipropil)benzamida (19) foi obtido com rendimento superior a 90% a partir da reação catalisada pela lipase de Candida antarctica. Este produto foi selecionado como intermediário para a síntese de uma molécula hidrofóbica 21 que apresenta o éster oleato de etila em sua constituição. O produto 21 foi obtido com 75% de rendimento. As amidas fenólicas 12-21 produzidas neste trabalho são derivadas do ácido linoleico (ômega 6) e do ácido salicílico, os quais apresentam propriedades emolientes e antioxidantes. Estes compostos são interessantes para a formulação de produtos cosméticos de aplicação cutânea. Neste processo biotecnológico as reações foram conduzidas na ausência de solventes orgânicos, evitando o tratamento de solventes voláteis e a formação de subprodutos. Os compostos foram analisados por Cromatografia líquida de alta eficiência e caracterizados por RMN (1H, 13C), EMAR e IV. A aplicação de reações de biocatálise seja através de células microbianas ou de enzimas isoladas foram muito promissoras na síntese de compostos orgânicos de interesse como álcoois enantiomericamente puros ou amidas graxas. / In this work, alcohol dehydrogenase (ADHs) enzymes from marine fungi and immobilized lipase from Candida antarctica were employed for the production of compounds of biological and synthetic interest. In chapter 1, ADHs of fungi isolated from the marine alga Bostrychia radicans were used in reduction reactions of fluorinated ketones 1-5. The fungi identified as Botryosphaeria sp. CBMAI 1197, Eutypella sp. CBMAI 1196, Hidropisphaera sp. CBMAI 1194 and Xylaria sp. CBMAI 119 acted as biocatalysts in these reactions leading to production of alcohols with high enantiomeric purity. The fungus Botryosphaeria sp. CBMAI 1197 presented highlighted compared to other microorganisms producing the alcohols (S)-2,2,2-trifluoro-1-phenylethanol (1a) and (R) -1 - (2,4,5-trifluorophenyl) ethanol (3a) with excellent conversions (100% and 97%) and enantiomeric excesses (ee > 99%). This fungus also exhibited ADHs enzymes active with dicarbonylateds ketones, leading to the production of the alcohols 4,4,4-trifluoro-1-phenylbutane-1,3-diol (4a) and 4,4,4-trifluoro-1-(naphthalen-2-yl)butane-1,3-diol -1,3-butanediol (5a) with conversions of 100% in both cases and enantiomeric excess of 99%-97%, respectively. This was the first study conducted with dicarbonilated fluoroketones 4-5 and with fungi isolated from the marine alga Bostrychia radicans in Brazil. In chapter 2, immobilized lipase from Candida antarctica was used as biocatalyst in the aminolysis reaction between esters of ethyl linoleate (1) and ethyl salicylate (3), the fatty amine N-dodecylamine (2) and the aminoalcohols (4-8). Six aminoalcohols were selected for reactions with ethyl salicylate (3), where the lipase exhibited chemoselectivity by the amino groups, producing predominantly phenolic amides in yields of 23-63%. The CALB exhibited um reduction in chemoselectivity in the reaction with 5-aminopentanol (6) where the amide 14 and ester 15 products were obtained with 44% and 33% yields. The product 2-hydroxy-N-(2-hydroxypropyl) benzamide (19) was obtained in yield greater than 90% from the reaction catalyzed by lipase from Candida antarctica. This product was selected as reagente for the synthesis of a hydrophobic molecule 21 presenting ester ethyl oleate in its constitution. The product 21 was obtained in 75% yield. The phenolic amides 12-21 produced in this work are derived from linoleic acid (omega 6) and salicylic acid, which presents emollient and antioxidants properties. These compounds are interesting for the formulation of cosmetic products for skin application. In this biotechnological process, the reactions were carried out under solvent-free conditions and vacum, avoiding the treatment of volatile solvents and by-product formation. The compounds were analyzed by high performance liquid chromatography and characterized by NMR (1H, 13C), IR and HRMS. Applying biocatalysis reactions, either through microbial cells or isolated enzymes were promising for the synthesis of organic compounds such as enantiomerically pure alcohols and fatty phenolic amides.

A cromatografia por injeção sequencial com extração em fase sólida (EFS) em linha foi explorada para a determinação de ácido salicílico em amostras vegetais. Uma mini coluna de polietileno, preenchida com sílica funcionalizada C18, foi utilizada para EFS, com tampão fosfato pH 5,2 como eluente. O eluato foi diretamente transferido para a separação cromatográfica em uma coluna monolítica C18, utilizando solução de acetonitrila/tampão acetato pH 4,75 (5:95, v/v) como fase móvel. A detecção foi realizada por fluorescência com excitação em 298 nm e emissão em 406 nm. Os sinais analíticos foram baseados na altura do pico cromatográfico referente ao ácido salicílico em um tempo de retenção de 9.0 min. Os limites de detecção (99,7% de confiança) e quantificação foram estimados em 80 e 240 ?g L-1, respectivamente. A precisão foi estimada através do coeficiente de variação intradia (n = 10) em 0,99% e interdia (3 dias) em 3,6%. A resposta foi linear até 8,0 mg L-1 (r = 0,996). A resolução em relação aos demais componentes da matriz, o número de pratos e a altura equivalente a um prato foram estimados em 6,0; 3980 e 12,6 ?m, respectivamente. Utilizando calibração pelo método das adições de padrão, foram estimadas recuperações entre 74,2 e 96,4% em 4 amostras de folhas de soja. Com estes resultados conclui-se que o procedimento é adequado à determinação de ácido salicílico nos materiais vegetais com a remoção de interferentes em linha, tendo as vantagens de ser um procedimento rápido (ca. 17 min por determinação), limpo (consumo de ca. 320 ?L de acetonitrila por determinação), de custo relativamente baixo, suficientemente sensível e seletivo / Sequential injection cromatography with on-line solid phase extraction (SPE) was explored for the determination of salicylic acid in vegetable samples. A polyethylene column filled with C18-bonded silica was used for SPE, with a phosphate buffer pH 5.2 as eluent. The treated extract was directly sent towards chromatographic separation in a C18 monolithic column with an acetonitrile/acetate buffer solution, pH 4,75 (5:95, v/v) as mobile phase before fluorescence detection (excitation at 298 nm and emission at 406 nm). The analytical signals were based on peak height at the 9.0 min retention time. Limits of detection (99.7% confidence level) and quantification were estimated at 80 and 240 ?g L-1. Precision was estimated through intraday coefficient of variation (n = 10) at 0.99% and interday (3 days) at 3.6 %. A linear response up to 8.0 mg L-1 was estimated (r = 0.996). Resolution, number of plates and the height equivalent to one plate were estimated at 6.0, 3980 and 12,6 ?m, respectively. With calibration by the standard additions method recoveries within 74.2 and 96.4 % were estimated to four soy leaves samples. Thus, the procedure is suitable for the determination of salicylic acid in the extracts with on-line removal of interferences, being a rapid (ca. 17 min per determination), clean (ca. 320 ?L of acetonitrile by determination), inexpensive, and suitably sensitive and selective

A cromatografia por injeção sequencial com extração em fase sólida (EFS) em linha foi explorada para a determinação de ácido salicílico em amostras vegetais. Uma mini coluna de polietileno, preenchida com sílica funcionalizada C18, foi utilizada para EFS, com tampão fosfato pH 5,2 como eluente. O eluato foi diretamente transferido para a separação cromatográfica em uma coluna monolítica C18, utilizando solução de acetonitrila/tampão acetato pH 4,75 (5:95, v/v) como fase móvel. A detecção foi realizada por fluorescência com excitação em 298 nm e emissão em 406 nm. Os sinais analíticos foram baseados na altura do pico cromatográfico referente ao ácido salicílico em um tempo de retenção de 9.0 min. Os limites de detecção (99,7% de confiança) e quantificação foram estimados em 80 e 240 ?g L-1, respectivamente. A precisão foi estimada através do coeficiente de variação intradia (n = 10) em 0,99% e interdia (3 dias) em 3,6%. A resposta foi linear até 8,0 mg L-1 (r = 0,996). A resolução em relação aos demais componentes da matriz, o número de pratos e a altura equivalente a um prato foram estimados em 6,0; 3980 e 12,6 ?m, respectivamente. Utilizando calibração pelo método das adições de padrão, foram estimadas recuperações entre 74,2 e 96,4% em 4 amostras de folhas de soja. Com estes resultados conclui-se que o procedimento é adequado à determinação de ácido salicílico nos materiais vegetais com a remoção de interferentes em linha, tendo as vantagens de ser um procedimento rápido (ca. 17 min por determinação), limpo (consumo de ca. 320 ?L de acetonitrila por determinação), de custo relativamente baixo, suficientemente sensível e seletivo / Sequential injection cromatography with on-line solid phase extraction (SPE) was explored for the determination of salicylic acid in vegetable samples. A polyethylene column filled with C18-bonded silica was used for SPE, with a phosphate buffer pH 5.2 as eluent. The treated extract was directly sent towards chromatographic separation in a C18 monolithic column with an acetonitrile/acetate buffer solution, pH 4,75 (5:95, v/v) as mobile phase before fluorescence detection (excitation at 298 nm and emission at 406 nm). The analytical signals were based on peak height at the 9.0 min retention time. Limits of detection (99.7% confidence level) and quantification were estimated at 80 and 240 ?g L-1. Precision was estimated through intraday coefficient of variation (n = 10) at 0.99% and interday (3 days) at 3.6 %. A linear response up to 8.0 mg L-1 was estimated (r = 0.996). Resolution, number of plates and the height equivalent to one plate were estimated at 6.0, 3980 and 12,6 ?m, respectively. With calibration by the standard additions method recoveries within 74.2 and 96.4 % were estimated to four soy leaves samples. Thus, the procedure is suitable for the determination of salicylic acid in the extracts with on-line removal of interferences, being a rapid (ca. 17 min per determination), clean (ca. 320 ?L of acetonitrile by determination), inexpensive, and suitably sensitive and selective

Neste trabalho, enzimas álcool-desidrogenases provenientes de fungos marinhos e a lipase imobilizada de Candida antarctica foram utilizadas para produção de compostos de interesse sintético e biológico. No capítulo 1, enzimas álcool-desidrogenases de fungos isolados da alga marinha Bostrychia radicans foram empregadas em reações de redução de cetonas fluoradas 1-5. Os fungos identificados como Botryosphaeria sp. CBMAI 1197, Eutypella sp. CBMAI 1196, Hidropisphaera sp. CBMAI 1194 e Xylaria sp. CBMAI 119 atuaram como biocatalisadores nestas reações levando à produção de álcoois com elevada pureza enantiomérica. O fungo Botryosphaeria sp. CBMAI 1197 destacou-se frente aos demais microrganismos, produzindo os álcoois (S)-2,2,2-trifluoro-1-feniletanol (1a) e (R)-1-(2,4,5-trifluorofenil)etanol (3a) com excelentes conversões (100% e 97%) e excessos enantioméricos (ee >99%). Este fungo também apresentou enzimas álcool-desidrogenases ativas frente a cetonas dicarboniladas 4-5, produzindo os álcoois 4,4,4-trifluoro-1-fenil-1,3-butanodiol (4a) e 4,4,4-trifluoro-1-(2-naftalenil)-1,3-butanodiol (5a) com 100% de conversão em ambos os casos e com purezas enantioméricas respectivas a 99% e 97%. Este foi o primeiro estudo realizado no Brasil com fluorocetonas dicarboniladas e com os fungos isolados da alga marinha Bostrychia radicans. No capítulo 2, a lipase comercial de Candida antarctica foi o biocatalisador empregado em reações de aminólise entre os ésteres linoleato de etila (1) e salicilato de etila (3), a amina graxa N-dodecilamina (2) e os aminoálcoois (4-9). A amina graxa N-dodecilamina (2) também foi utilizada em reações com o linoleato de etila (1), onde a lipase de Candida antarctica produziu a respectiva amida graxa 10 com rendimentos superiores a 95%. Os aminoálcoois foram selecionados para reações com o salicilato de etila (3), onde a lipase exibiu quimiosseletividade pelo grupo amino, produzindo predominantemente amidas fenólicas (12-19) com rendimentos entre 23-68%. A enzima CALB apresentou quimiosseletividade reduzida na reação com o 5-aminopentanol (6) onde os produtos amida 14 e éster 15 foram obtidos com rendimentos de 44 e 33%, respectivamente. O produto 2-hidroxi-N-(2-hidroxipropil)benzamida (19) foi obtido com rendimento superior a 90% a partir da reação catalisada pela lipase de Candida antarctica. Este produto foi selecionado como intermediário para a síntese de uma molécula hidrofóbica 21 que apresenta o éster oleato de etila em sua constituição. O produto 21 foi obtido com 75% de rendimento. As amidas fenólicas 12-21 produzidas neste trabalho são derivadas do ácido linoleico (ômega 6) e do ácido salicílico, os quais apresentam propriedades emolientes e antioxidantes. Estes compostos são interessantes para a formulação de produtos cosméticos de aplicação cutânea. Neste processo biotecnológico as reações foram conduzidas na ausência de solventes orgânicos, evitando o tratamento de solventes voláteis e a formação de subprodutos. Os compostos foram analisados por Cromatografia líquida de alta eficiência e caracterizados por RMN (1H, 13C), EMAR e IV. A aplicação de reações de biocatálise seja através de células microbianas ou de enzimas isoladas foram muito promissoras na síntese de compostos orgânicos de interesse como álcoois enantiomericamente puros ou amidas graxas. / In this work, alcohol dehydrogenase (ADHs) enzymes from marine fungi and immobilized lipase from Candida antarctica were employed for the production of compounds of biological and synthetic interest. In chapter 1, ADHs of fungi isolated from the marine alga Bostrychia radicans were used in reduction reactions of fluorinated ketones 1-5. The fungi identified as Botryosphaeria sp. CBMAI 1197, Eutypella sp. CBMAI 1196, Hidropisphaera sp. CBMAI 1194 and Xylaria sp. CBMAI 119 acted as biocatalysts in these reactions leading to production of alcohols with high enantiomeric purity. The fungus Botryosphaeria sp. CBMAI 1197 presented highlighted compared to other microorganisms producing the alcohols (S)-2,2,2-trifluoro-1-phenylethanol (1a) and (R) -1 - (2,4,5-trifluorophenyl) ethanol (3a) with excellent conversions (100% and 97%) and enantiomeric excesses (ee > 99%). This fungus also exhibited ADHs enzymes active with dicarbonylateds ketones, leading to the production of the alcohols 4,4,4-trifluoro-1-phenylbutane-1,3-diol (4a) and 4,4,4-trifluoro-1-(naphthalen-2-yl)butane-1,3-diol -1,3-butanediol (5a) with conversions of 100% in both cases and enantiomeric excess of 99%-97%, respectively. This was the first study conducted with dicarbonilated fluoroketones 4-5 and with fungi isolated from the marine alga Bostrychia radicans in Brazil. In chapter 2, immobilized lipase from Candida antarctica was used as biocatalyst in the aminolysis reaction between esters of ethyl linoleate (1) and ethyl salicylate (3), the fatty amine N-dodecylamine (2) and the aminoalcohols (4-8). Six aminoalcohols were selected for reactions with ethyl salicylate (3), where the lipase exhibited chemoselectivity by the amino groups, producing predominantly phenolic amides in yields of 23-63%. The CALB exhibited um reduction in chemoselectivity in the reaction with 5-aminopentanol (6) where the amide 14 and ester 15 products were obtained with 44% and 33% yields. The product 2-hydroxy-N-(2-hydroxypropyl) benzamide (19) was obtained in yield greater than 90% from the reaction catalyzed by lipase from Candida antarctica. This product was selected as reagente for the synthesis of a hydrophobic molecule 21 presenting ester ethyl oleate in its constitution. The product 21 was obtained in 75% yield. The phenolic amides 12-21 produced in this work are derived from linoleic acid (omega 6) and salicylic acid, which presents emollient and antioxidants properties. These compounds are interesting for the formulation of cosmetic products for skin application. In this biotechnological process, the reactions were carried out under solvent-free conditions and vacum, avoiding the treatment of volatile solvents and by-product formation. The compounds were analyzed by high performance liquid chromatography and characterized by NMR (1H, 13C), IR and HRMS. Applying biocatalysis reactions, either through microbial cells or isolated enzymes were promising for the synthesis of organic compounds such as enantiomerically pure alcohols and fatty phenolic amides.

La comprensión de los mecanismos moleculares que controlan la resistencia de la planta frente a patógenos biotrofos es un campo de investigación complejo y en expansión donde se impone la identificación de nuevos reguladores. Previamente se había descrito en nuestro laboratorio el gen P69C que codifica una proteasa con homología a subtilisinas y cuya expresión se induce en el transcurso de la interacción planta-patógeno. Con el fin de estudiar nuevos componentes de la planta implicados en la señalización de la respuesta defensiva, se procedió al escrutinio de mutantes de Arabidopsis thaliana que de forma constitutiva y sin la existencia de ningún estímulo externo se encontrara activada la expresión del gen GUS dirigida por el promotor P69C. En la presente memoria de tesis se describe ampliamente la identificación y caracterización del mutante, csb3 (constitutive subtilisin3). Las plantas csb3 poseen elevados niveles de ácido salicílico (SA) y además expresan genes dependientes de la ruta de SA tales como PR-1, PR-2 y GST6. Por otra parte, el mutante csb3 exhibe una elevada resistencia al oomiceto patógeno Hyaloperonospora parasitica de naturaleza biotrofa y a la bacteria patógena también biotrofa Pseudomonas syringae pv.tomato DC3000 (Pst) DC3000. Sin embargo, la resistencia a patógenos necrotrofos tales como Botrytis cinerea y Plectosphaerella cucumerina permanece inalterada en las plantas csb3. Para analizar la participación de los distintos componentes de la ruta de señalización dependiente de SA en la manifestación del fenotipo de resistencia de csb3, se procedió al análisis epistático entre csb3 y pad4, sid2, eds5, nahG, npr1, dth9 y cpr1. Estos estudios indican que la elevada resistencia frente a patógenos biotrofos de las plantas csb3 requiere de todos y cada uno de los componentes de la ruta de señalización dependiente del SA estudiados. El gen CSB3 identificado por clonaje posicional codifica la 1-hidroxi-2-metil-2-butenil 4-difosfato (HDS) sin / Gil Morrió, MJ. (2005). Disección genética del mecanismo de resistencia frente a patógenos biotrofos mediado por el gen CSB3 en Arabidopsis thaliana [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/1870

En Arabidopsis, el momento en que se produce la transición a la floración viene determinado por la interacción entre la competencia de la planta para su desarrollo interno y las señales medioambientales que determinan las condiciones favorables para el suceso reproductivo. Sin embargo, plantas expuestas a condiciones de estrés medioambiental pueden activar el programa de floración prematuramente. Algunos factores de estrés capaces de alterar el tiempo de floración, como la infección por patógenos, temperaturas extremas o altas irradiaciones, conllevan un incremento en los niveles de algunos metabolitos como etileno, ácido abcísico y ácido salicílico (SA) (Blee, 2002; Dempsey et al., 1999; Ni et al., 1996; Pastori y Foyer, 2002; Raskin, 1992). Estudios recientes sugieren que SA pueda ser un regulador de la transición a la floración en plantas de Arabidopsis thaliana sometidas a estrés (Martínez et al., 2004). Para que se produzca un adelanto en el tiempo de floración en plantas sometidas a irradiación con luz UV-C es necesaria tanto la síntesis como la acumulación de SA, ya que no se produce en plantas transgénicas nahG, que no acumulan SA ya que lo degradan rápidamente a catecol. Sin embargo, se desconoce en gran medida el mecanismo mediante el cual el SA regula el tiempo de floración. Mediante el uso de plantas transgénicas en las que el promotor de BGL2, gen PR inducible por SA, está fusionado al gen reportador GUS, se determinó el espacio temporal en el que se correlacionan cambios en los niveles endógenos de SA con la activación de la expresión de genes que inducen la transición floral. Bajo nuestras condiciones de cultivo, el décimo día tras la siembra se da un aumento tanto de los niveles de tinción GUS, asociados al tejido vascular, como de la expresión del gen ICS1/SID2 que codifica la isocorismato sintasa 1 encargada de sintetizar SA en Arabidopsis (Wildermuth et al., 2001) y del gen activador de la floración FT, cuya proteína ha sido recientemente caract / Segarra Manzano, S. (2007). Función del ácido salicílico en la floración acelerada por estrés en Arabidopsis thaliana [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/1965