La BPCO (bronchopathie pulmonaire chronique obstructive) est un problème majeur de santé publique et représentera la 3ème cause de mortalité dans le monde en 2030. L’âge, le tabagisme, ainsi que la pollution atmosphérique via l’exposition aux particules de diesel mais également la pollution domestique – majoritairement représentée par la combustion domestique de biomasse – sont des facteurs de risque bien identifiés d’apparition d’une BPCO. Il n’existe à ce jour aucun traitement curatif pouvant interférer avec l’histoire naturelle de la maladie.Les cellules souches pluripotentes, et notamment les cellules souches humaines pluripotentes induites (hiPSCs), sont définies par deux propriétés fondamentales : l’auto-renouvellement et la capacité à se différencier en tous les types cellulaires de notre corps. Elles offrent une opportunité sans précédent de modéliser le développement humain normal et pathologique de l’appareil respiratoire.Ce projet de recherche a pour objectif de modéliser in vitro les trajectoires de la BPCO, en lien avec une origine développementale (racines pédiatriques) et/ou une susceptibilité au tabac. Afin d’élucider les mécanismes qui sous-tendent la pathogénie de la BPCO et de la susceptibilité au tabac, nous avons constitué deux groupes caricaturaux : i) 4 patients atteints d’une forme sévère de la BPCO, constituant le groupe « hautement susceptibles », ii) 4 patients fumeurs indemnes de BPCO ou tout autre comorbidité liée au tabac « hautement résistants » au tabac.Nous avons utilisés deux modèles de culture cellulaires in vitro : les hiPSCs et la culture de cellules épithéliales primaires bronchiques humaines (HBECs) cultivées en ALI (interface air liquide).Dans un premier temps, nous avons généré des lignées hiPSCs par reprogrammation cellulaire à partir du sang périphérique d’un sujet sain (contrôle), et de trois patients BPCO sévères hautement caractérisés. Dans un second temps, la différenciation dirigée des hiPSCs a permis de récapituler le développement pulmonaire précoce (génération de progéniteurs bronchiques NKX2.1) par la mise au point d’un protocole de différenciation dirigée robuste et reproductible sur plusieurs lignées hiPSCs. La maturation de ces progéniteurs bronchiques en culture 2D ou 3D a permis d’obtenir des structures épithéliales exprimant les marqueurs de cellules basales (KRT5), de cellules Club (CCSP), et ciliées (FOXJ1). Dans un second temps, ces épithélia seront exposés au tabac (CSE- cigarette smoke extract) afin d’induire un phénotype « BPCO-like ». Enfin, la culture des HBECs cultivées en ALI des patients BPCO sévères a été réalisée en condition exposée (CSE) et non exposée. La résistance transépithéliale, la motilité ciliaire, le profil sécrétoire et la diversité ARN ont été collecté.Ce travail a permis de mettre en place les outils nécessaires pour reproduire les trajectoires in vitro de la BPCO et élucider les origines de la pathologie. Les outils de séquençage à haut débit (transcriptomique dans notre étude), permettront de découvrir de nouveaux candidats, représentants de potentielles cibles en vue d’un criblage pharmacologique. / COPD (Chronic Obstructive Pulmonary Disease) is a major public health problem and will be the 3rd leading cause of death in the world in 2030. Age, smoking, and air pollution through the exposure to particulate matter but also domestic pollution - mostly represented by domestic biomass combustion - are well-identified risk factors for the development of COPD. To date, there is no cure that can interfere with the natural history of the disease.Pluripotent stem cells, including induced pluripotent human stem cells (hiPSCs), are defined by two fundamental properties: self-renewal and the ability to differentiate into all cell types in our body. They offer an unprecedented opportunity to model the normal and pathological human development of the respiratory system.This research project aimed to model in vitro the trajectories of COPD, related to a developmental origin (pediatric roots) and / or susceptibility to tobacco. In order to elucidate the underlying mechanisms of COPD and tobacco susceptibility, we established two extreme groups: i) 4 patients with a severe form of COPD, the "highly susceptible" group, ii) 4 patients who are free of COPD or other tobacco-related comorbidity despite heavy smoking, called as "highly resistant" to tobacco.We have used two different but complementary in vitro cell culture models: hiPSCs and human bronchial primary epithelial cell cultures (HBECs) grown in ALI condition (Air Liquid Interface).First of all, we generate hiPSCs cell lines by reprogramming cells from peripheral blood of a healthy subject (control), and three highly characterized severe COPD patients. In a second step, the directed differentiation of hiPSCs allowed to recapitulate the early pulmonary development (NKX2.1 generation of bronchial progenitors) by the development of a robust and reproducible directed differentiation protocol of several hiPSCs lines. The maturation of these bronchial progenitors in 2D or 3D culture allows the generation of epithelial structures expressing markers of KRT5 + basal cells , CSSP + Club cells and FOXJ1 + ciliated cells. In a second step, these epithelia will be exposed to tobacco (CSE-cigarette smoke extract) in order to induce a "COPD-like" phenotype. Finally, ALI culture of HBECs of severe COPD patients was performed in unexposed and exposed condition (CSE). Transepithelial resistance, ciliary motility, secretory profile, and RNA diversity were collected.This work allowed to put in place the necessary tools to reproduce the in vitro trajectories of COPD and to clarify the origins of this pathology. The high throughput sequencing tools (transcriptomic in our study), will allow the discovery of new candidates, that represent potential targets for future pharmacological screening.

Le développement de traitements thérapeutiques du cancer du sein reste limité par le niveau de connaissance des mécanismes moléculaires et cellulaires impliqués lors du développement normal et tumoral de la glande mammaire. L’épithélium mammaire est entouré d’une matrice extracellulaire (MEC) organisée, la membrane basale, dont le constituant principal est la laminine. Des études ont montré que les interactions entre les cellules mammaires et la MEC, dépendantes des intégrines, jouent un rôle majeur dans le développement et la tumorigenèse mammaires. Ces études n’ont cependant pas permis de déterminer les hétérodimères d’intégrine spécifiquement impliqués. Dans ce contexte, mon projet de thèse a visé à définir le rôle joué par les intégrines liant la laminine (dimères contenant les sous-unités 3 et/ou 6) dans le développement mammaire, dans le maintien de cellules souches mammaires fonctionnelles dans la glande adulte et dans le développement tumoral. Les résultats de mon travail suggèrent que :(i) l’intégrine 31 présente une fonction unique au cours de la lactation. Les mécanismes moléculaires impliqués en aval de 31 font intervenir la voie FAK/Rac1/PAK1 menant à l’inhibition de la MLCK, nécessaire à la relaxation des cellules myoépithéliales mammaires et permettant de nouveaux cycles de contraction. (ii) les interactions régulées par les intégrines entre les cellules basales mammaires et la laminine sont essentielles pour régénérer l’épithélium mammaire. Cependant, les intégrines 3 et 6 présentent des fonctions redondantes dans les cellules souches mammaires. (iii) l’intégrine 31 joue un rôle clef dans le développement tumoral mammaire. L’intégrine 31 active des voies de signalisation intracellulaires FAK/Rac1/PAK1, MAPK et JNK qui favorisent la survie et la prolifération des cellules tumorales. Ensembles, ces données permettent une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires impliqués dans le développement mammaire, la fonction de la glande adulte et la tumorigenèse. / The improvement of breast cancer therapy requires thorough analysis of the pathways leading to tumorigenesis and clear understanding of the molecular and cellular mechanisms involved in normal mammary gland development. Mammary epithelium is surrounded by a specifically organized extracellular matrix (ECM), basement membrane, and secreted glycoproteins, laminins, are among its major constituents. Integrin-mediated interactions between mammary epithelial cells and ECM have been shown to play an essential role in the control of mammary development and tumorigenesis. However, specific roles played by distinct integrin heterodimers are yet poorly understood. My thesis project aimed to define the functions of laminin-binding integrins, i.e., heterodimers, containing 3 or 6 subunits, in normal mammary gland development, in control of mammary stem and progenitor cell functions in adult gland, and in mammary tumorigenesis. The results of my work suggest that: (i31 integrin has a unique function in the control of the myoepithelial cell contractile activity during lactation; it contributes to the activation of the FAK/Rac1/PAK1 pathway leading to MLCK inhibition required for myoepithelial cell relaxation, thereby, permitting further contractile cycles. (ii) integrin-mediated interactions of mammary basal cells with laminins are essential for the regeneration of the mammary epithelium. However, 31 and 6-contaning integrins have redundant functions in mammary stem cells.(iii) 31 integrin plays a major role in mammary tumorigenesis, it promotes survival and proliferation of tumor cells activating intracellular signaling pathways involving FAK/Rac1/PAK1, MAPK and JNK pathways. Altogether, these data provide new insights into the molecular mechanisms of mammary development, adult gland function and tumorigenesis.

Les épithéliums jouent le rôle de barrière physique et chimique chez les Métazoires. Les épithéliums subissent des remodelages pendant l’embryogénèse. La morphogénèse des tissus est dirigée par des déformations cellulaires coordonnées fonctionnant grâce à des réseaux contractiles intracellulaires constitués d’actine et de myosine. Ce réseau d’actomyosine peut être soit pulsatile, soit stable. Un exemple est l’élongation de l’ectoderme ventro-latéral par intercalation cellulaire, le long de l’axe antéro-postérieur (AP) de l’embryon de la Drosophile. Les jonctions parallèles à l’axe dorso-ventral (DV) rétrécissent et forment de manière irréversible de nouvelles jonctions parallèles à l’axe AP. Des pulsations de myosine-II (Myo-II) médio-apicale se déplacent de manière anisotrope vers les jonctions parallèles à l’axe DV. Ceci provoque le rétrécissement graduel des jonctions, rétrécissement stabilisé par une population de Myo-II polarisée dans le plan du tissu et enrichie au niveau de ces jonctions. Les mécanismes cellulaires qui régulent la pulsatilité, la stabilité et la polarité de la Myo-II restent à élucider. Lors de ma thèse, j’ai identifié de nouveaux effecteurs régulant l’activation et la polarité planaire de la voie Rho1-Rok-Myo-II aux niveaux des jonctions. J'ai d'abord caractérisé le rôle de la kinase Misshapen dans l’activation polarisée de la voie Rho1 au niveau des jonctions. Misshapen agit en aval de la signalisation GPCR afin de favoriser l’activation de Rho1 et contrôle la polarisation de cette activation en transmettant l’information des récepteurs Toll. Puis j'ai identifié Pebble comme la RhoGEF régulant Rho1 et l'accumulation de Myo-II aux jonctions. / Epithelial build up strong mechanical and chemical barriers in Metazoans. Epithelia can be dramatically remodeled during embryogenesis. Tissue morphogenesis is driven by coordinated cellular deformations which are powered by intracellular contractile networks constituting actin and Myosin. Actomyosin networks can either be pulsatile or stable. One example is the elongation of the ventral-lateral ectoderm by cell intercalation, along antero-posterior (AP) axis of Drosophila embryo. Junctions parallel to the dorso-ventral (DV) axis shrink and form new junctions along AP axis. Medial apical Myosin-II (Myo-II) pulses flow anisotropically towards junctions aligned in DV axis, resulting in steps of junction shrinkage which are stabilized by a planar-polarized pool of Myo-II enriched at these junctions. Sequential deformation and stabilization drive irreversible tissue deformations akin to a ratchet. The cellular mechanisms that regulate Myo-II pulsatility, stability and polarity remained to be unfurled. During my PhD, I identified new regulators for Rho1-Rok-Myo-II pathway at junctions, and Myo-II planar polarity. On the one hand, I characterized the function of Misshapen kinase in polarized activation of Rho1 pathway at junctions. Misshapen acts downstream GPCR signaling to enhance Rho1 activation, and controls the polarization of this activation by transducing information from Toll receptors. Also, I identified Pebble as RhoGEF regulating Rho1 at junctions and Myo-II accumulation.

La fasciculation des axones joue un rôle essentiel dans le développement des réseaux neuronaux. Cependant, la dynamique de la fasciculation axonale, ainsi que les mécanismes biophysiques à l’œuvre dans ce processus, demeurent encore très mal compris. En vue d'étudier les mécanismes de fasciculation d'axones ex vivo, nous avons développé un système modèle simple, constitué par des explants d'épithélium olfactif de souris embryonnaires en culture, à partir desquels poussent les axones des neurones sensoriels olfactifs. Grâce à une étude en vidéomicroscopie, nous avons observé que ces axones interagissent de façon dynamique par leur fibre, à la manière de fermetures éclair pouvant se fermer ("zippering") ou s'ouvrir ("unzippering"), ce qui conduit respectivement à la fasciculation ou à la défasciculation des axones. Mettant à profit cette nouvelle préparation expérimentale pour l'étude des interactions dynamiques entre axones, nous avons développé une analyse biophysique détaillée des processus de zippering/unzippering.Nous mettons en évidence dans notre travail l'existence d'un mécanisme biophysique cohérent de contrôle des interactions locales entre fibres axonales. Ce mécanisme local est à mettre en relation avec les changements de la structure globale du réseau axonal (degré de fasciculation) qui s'opèrent sur une échelle temporelle plus longue. Enfin, nous discutons la signification fonctionnelle de nos observations et analyses, et proposons un nouveau rôles de la tension mécanique dans le développement du système nerveux : la régulation de la fasciculation des axones et, en conséquence, de la formation des cartes topologiques au sein des réseaux neuronaux. / While axon fasciculation plays a key role in the development of neural networks, very little is known about its dynamics and the underlying biophysical mechanisms. In a model system composed of neurons grown ex vivo from explants of embryonic mouse olfactory epithelia, we observed that axons dynamically interact with each other through their shafts, leading to zippering and unzippering behaviour that regulates their fasciculation. Taking advantage of this new preparation suitable for studying such interactions, we carried out a detailed biophysical analysis of zippering, occurring either spontaneously or induced by micromanipulations and pharmacological treatments.We show that there is a consistent mechanism which governs local interactions between axon shafts, supported by broad experimental evidence. This mechanism can be reconciled with changes in global structure of axonal network developing on slower time scale, analogically to well-studied relation between local relaxations, and topological changes and coarsening in two-dimensional liquid foams. We assess our observations and analysis in light of possible in vivo functional significance and propose a new role of mechanical tension in neural development: the regulation of axon fasciculation and consequently formation of neuronal topographic maps.

L’asthme sévère de l’enfant est une pathologie respiratoire chronique dont le traitement est difficile. L’épithélium bronchique à l’interface de l’organisme et de l’environnement, est un pivot central dans la maladie asthmatique. Le but de ce travail a donc été d’étudier l’épithélium bronchique de l’enfant asthmatique sévère.Dans un premier temps, j’ai développé un modèle de reproduction d’épithélium bronchique in vitro obtenu à partir de cellules épithéliales bronchiques issues de biopsies bronchiques d’enfants asthmatiques sévères. J’ai comparé ces épithélia obtenus chez l’enfant à ceux obtenus chez l’adulte. Nous avons spécifiquement étudié un marqueur inflammatoire important dans l’asthme sévère, le TSLP. J'ai montré 2 isoformes de TSLP ayant un rôle contraire, anti inflammatoire et proinflammatoire. Dans un deuxième temps, j’ai mis au point un modèle d’exacerbation d’asthme viro-induite. J’ai utilisé le modèle de culture et soumis les cellules à une stimulation Poly I:C. Les différentes cytokines sécrétées lors d’une exacerbation asthmatique virale ont été retrouvées augmentées dans notre modèle : CXCL8, CXCL10, CCL2, CXCL9 et RANTES. Enfin, j’ai étudié le propionate de fluticasone dans le modèle d’exacerbation asthmatique. Nous avons montré que l’effet de la fluticasone est différent entre les cellules épithéliales bronchiques issues de témoins et celles issues d’asthme sévère. Le modèle de stimulation viro-induite a permis d’étudier l’effet des corticoïdes inhalés sur l’épithélium bronchique et va permettre d’étudier les voies mécanistiques en jeu dans les exacerbations viro-induites, de tester d’autres molécules et proposer d’autres pistes thérapeutiques. / Severe childhood asthma is a chronic respiratory disease difficult to control despite treatment. Bronchial epithelium, at the interface between the body and the environment, is a central pivot in the asthmatic disease. The aim of this study was to examine the bronchial epithelium of severe asthmatic children. Initially, I developed a bronchial epithelium in vitro reproduction model obtained from bronchial epithelial cells from bronchial biopsies of severe asthmatic children. I compared these epithelia obtained in children with those obtained in adults. We specifically studied an important inflammatory marker in severe asthma,TSLP. I have highlighted the presence of two isoforms of TSLP which have an opposite role, anti-inflammatory for the short form and the long form for proinflammatory.Secondly, I developed an asthma exacerbation model of virus-induced. I used the culture model and challenged bronchial cells with poly I:C to. Different cytokines secreted upon viral asthma exacerbation were found increased in our model: CXCL8, CXCL 10, CCL2, RANTES and CXCL9.Finally, I have studied fluticasone propionate in the exacerbation asthmatic model. I studied cells from asthmatic and from non asthmatic children. Interestingly, we have shown that the effect of fluticasone is different between bronchial epithelial cells from non asthmatic children and those from severe asthma.The model of virus-induced stimulation was used to study the effect of inhaled corticosteroids on bronchial epithelium and will allow studying the mechanistic pathways involved in virus-induced exacerbations, testing other molecules and propose other therapeutic approaches.

Les maladies inflammatoires de l’intestin (MIIs, [MIM 266600]) sont caractérisées par une inflammation chronique au niveau du tube gastro-intestinal. Les deux principales formes sont la maladie de Crohn (MC) et la colite ulcéreuse (CU). Les MIIs résulteraient d’un défaut du système immunitaire et de l’épithélium intestinal. Ce dernier forme une barrière physique et biochimique qui sépare notre système immunitaire des microorganismes commensaux et pathogènes de la microflore intestinale. Un défaut dans la barrière épithéliale intestinale pourrait donc mener à une réponse immunitaire soutenue contre notre microflore intestinale. Les études d’association pangénomiques (GWAS) ont permis d’identifier 201 régions de susceptibilité aux MIIs. Parmi celles-ci, la région 1q32 associée à la MC (p<2x10-11) et à la CU (p<6x10-7) contient 4 gènes, dont C1orf106, un gène codant pour une protéine de fonction inconnue. Le re-séquençage de la région 1q32 a permis d’identifier une variante génétique rare de C1orf106 (MAF˂1%) associée aux MIIs (p=0,009), Y333F. Nous avons démontré que la substitution de la tyr333 par une phénylalanine semble avoir un effet sur la stabilité protéique de C1orf106 tel que démontré lors de l’inhibition de la synthèse protéique induite par le cycloheximide. Nous avons déterminé que C1orf106 est exprimé dans le côlon et l’intestin grêle. De plus, son expression est augmentée lors de la différenciation des cellules épithéliales Caco-2 en épithélium intestinal polarisé. Son profil d’expression correspond aux types cellulaires et tissulaires affectés dans les MIIs. De plus, C1orf106 est partiellement co-localisée avec le marqueur des jonctions serrées, ZO-1. Toutefois, son marquage reproduit parfaitement celui du marqueur des jonctions adhérentes, E-cadhérine. Les jonctions serrées et adhérentes sont localisées du côté apical de la jonction intercellulaire et sont toutes deux impliquées dans l’établissement de la barrière épithéliale. Nous avons donc testé l’impact de C1orf106 sur la perméabilité de l’épithélium intestinal. Nous avons observé une augmentation de la perméabilité épithéliale chez un épithélium intestinal formé par des cellules Caco-2 sous-exprimant C1orf106. Nos résultats suggèrent que C1orf106 pourrait être le gène causal de la région 1q32. / The Inflammatory bowel diseases (IBD, [MIM 266600]) involve chronic inflammation of the digestive tract and include ulcerative colitis (UC) and Crohn’s disease (CD). IBD may result from defects in the homeostasis of immune system and intestinal epithelium. The latter forms a physical and biochemical barrier to commensal and pathogenic microorganisms. A dysfunction in the epithelial barrier may lead to a sustained immune response against the gut flora. Genome wide association studies (GWAS) have identified 200 susceptibility regions in IBD. Among these, the 1q32 region associated with risk of both CD (p<2x10-11) and UC (p<6x10-7), contains the gene C1orf106. Our targeted re-sequencing study has identified a low-frequency variant, Y333F (p=0.009) in C1orf106, a protein of unknown function and in which tyrosine333 is predicted to be phosphorylated. We demonstrated that its substitution by a phenylalanine may have an effect on C1orf106 protein stability as shown by cycloheximide treatment experiments. Our RNA expression analyses of human tissues and cell lines demonstrated that C1orf106 is mostly expressed in the small intestine and colon. It is also detectable in monocytic cell lines but more highly expressed in colonic epithelial cell lines. Furthermore, its expression is increased by 40% during differentiation of colonic epithelial Caco-2 cells into polarized epithelium. To provide further biological context, we generated colorectal LS174T cells that stably overexpress the Y333F alleles and demonstrated that it is partially localized with ZO-1, used as a tight junction (TJ) marker. We did observe tighter colocalization with E-cadherin, a canonical marker for adherens junctions (AJ), typically located below the TJ complex. AJ and TJ play an essential role in the establishment of epithelial barrier. The localization of C1orf106 at these regions suggests its possible implication in epithelial barrier homeostasis. Using trans-epithelial measurement of ions movement across epithelium, we demonstrated an increased in permeability of an epithelium formed by C1orf106 knock-down Caco-2 cells. Our results suggest that C1orf106 could be the causal gene of the 1q32 susceptibility region.

Le transport de Na+ par ENaC et de Cl- par CFTR, dans l’épithélium des voies aériennes (VA), contrôle la clairance mucociliaire en modulant le volume du liquide de surface (ASL). L’expression et la fonction de ces canaux peuvent être modifiées au cours des maladies inflammatoires chroniques des VA. Dans un modèle de culture primaire de cellules épithéliales nasales humaines (CENH), nous avons démontré l’existence, au cours de la polypose nasosinusienne, d’une chute de la sécrétion de Cl- par CFTR dont l’expression est diminuée par le TGFß1, cytokine de l’inflammation. Nous avons ensuite étudié l’effet de l’élastase, et de son inhibiteur l’EPIhNE4 sur la fonction d’ENaC dans des CENH de patients atteints ou non de mucoviscidose (CF) où l’hyperactivité d’ENaC provoque une déshydratation de l’ASL. Nous avons démontré l’existence d’une activité sérine protéase endogène dans les CENH (patients CF ou non CF) qui, après inhibition, permet de révéler une augmentation de la fonction d’ENaC induite par l’élastase alors inhibable par l’EPI-hNE4. Enfin, nous avons analysé l’effet du 4 phenylbutyrate (4PBA), traitement proposé chez les patients CF, sur le canal ENaC. Le 4- PBA entraîne une augmentation de la fonction d’ENaC dans les CENH de patients CF ou non en adressant des sous-unités du canal à la membrane apicale via la régulation d’une molécule chaperone Hsc70. Le 4-PBA pourrait donc être utilisé dans des pathologies respiratoires avec défaut d’expression d’ENaC mais son usage pourrait être délétère chez les patients CF. La régulation des transports ioniques au cours des maladies inflammatoires chroniques des VA représente donc une cible thérapeutique intéressante / Na+ and Cl- transport by ENaC and CFTR respectively in airway epithelium (AE) control mucociliary clearance by regulating the airway surface liquid (ASL). Ion channel expression and function could be altered by chronic inflammation in AE. In primary cultures from human nasal epithelial cells (HNEC) we demonstrated, in nasal polyposis, a decrease of CFTR expression and Cl- secretion induced by TGFß1, an inflammatory cytokine. We also evaluated the effects of elastase, and its inhibitor EPI-hNE4, on ENaC function in HNEC from cystic fibrosis (CF where ENaC hyperactivity contributes to ASL dehydration) and non CF patients. We detected an endogenous serine protease activity in HNEC (CF or non CF) which, after inhibition, unmask an increase in ENaC function induced by elastase, this increase being then inhibited by EPI-hNE4. Finally, we investigated the effects of a drug now tested in CF patients treatment, the 4-phenylbutyrate (4PBA). 4-PBA promoted ENaC cell surface expression and activity in CF or non CF HNEC by increasing ENaC subunits translocation to plasma membrane via the regulation of Heat Shock Protein 70. 4-PBA treatment could therefore be of interest in the treatment of airway diseases when ENaC trafficking is disrupted but should be used with caution when treating CF patients where ENaC function is already upregulated. All together these results highlight the role of ion transport regulation during chronic inflammatory airway diseases and could lead to new therapeutic strategies

La voie pulmonaire suscite un intérêt grandissant pour l’administration systémique des peptides et protéines thérapeutiques, aujourd’hui encore administrés essentiellement par voie parentérale. Un microsystème a été conçu pour permettre de faciliter et accélérer les études in vitro de criblage de différentes biomolécules actives et de sélectionner les formulations les plus adaptées à leur pénétration à travers l’épithélium pulmonaire, en vue de sélectionner les meilleurs candidats à une administration par voie pulmonaire. Organisé en deux configurations distinctes, ce microsystème permet dans un premier temps d’obtenir des barrières épithéliales pulmonaires polarisées et jointives (cellules Calu-3) en seulement 7 jours dans des micropuits de 1mm², sans avoir à renouveler le milieu nutritif ni avoir recours à un appareillage externe associé au microsystème. Grâce à la mise au point d’une technique simple de fabrication, des plateformes de culture contenant jusqu’à 12 micropuits en parallèle sont aujourd’hui fabriquées de manière standardisée. L’évaluation du passage de molécules est ensuite réalisée sous une deuxième configuration dédiée à la mesure de la perméabilité des barrières épithéliales cultivées en micropuits. La capacité de différents candidats (nanoparticules et biomolécules) à traverser l’épithélium pulmonaire a été étudiée. Le passage de nanoparticules de PLGA revêtues de chitosane ainsi que le passage de l’insuline ont été démontrés avec succès. Enfin, l’électrophorèse capillaire couplée à une détection par fluorescence induite par laser (EC-LIF), compatible avec les faibles volumes manipulés dans ce microsystème, a été exploitée pour la détection et la quantification de l’insuline après passage des barrières pulmonaires miniaturisées. A cette fin, l’insuline a soit été marquée par le FITC, soit complexée à un anticorps ou a un aptamère fluorescents. A l’heure actuelle, seule la méthode développée pour le marquage de l’insuline par le FITC est utilisable à des fins de quantification, mais le recours à un aptamère a montré des premiers résultats encourageants. / The pulmonary route is of increasing interest for the systemic administration of therapeutic proteins and peptides, still largely administered parenterally. A microdevice was designed to facilitate and accelerate the in vitro screening studies of various active biomolecules and to select the most suitable formulations for penetration through the lung epithelium, in order to select the best candidates for an administration via the lungs. Organized in two distinct configurations, this microdevice allows as a first step the culture of tight polarized bronchial epithelial barriers (Calu-3 cells) in 7 days in 1 mm² microwells, without the need for medium renewal or the use of an external apparatus. A simple manufacturing technique was developed and glass culture platforms containing 12 parallel microwells can be obtained in a standardized manner. The ability of molecules to cross the pulmonary barrier is then performed in the second configuration of the microdevice, which is dedicated to the permeability measurement of the tight epithelial Calu-3 barriers cultured in microwells. Among the different candidates studied (nanoparticules and biomolecules), the pulmonary barrier permeability regarding PLGA nanoparticules coated with chitosan and regarding insulin has been successfully demonstrated. Finally, capillary electrophoresis with laser induced-fluorescence (CE-LIF), a technique compatible with the low volumes handled in this microdevice, has been exploited for insulin detection and quantification after its transport across the miniaturized pulmonary barriers. To this end, insulin was either FITC-labeled or complexed with a fluorescent antibody or aptamer. Currently, only the derivatization method can be used for a quantification purpose, but the use of an aptamer to indirectly quantitate insulin has shown encouraging results.

Chez les patients mucoviscidosiques (CF), l'épithélium des voies aériennes est souvent lésé et remodelé. Que le remodelage soit lié à l'infection et/ou l'inflammation inhérentes à la pathologie ou à un processus de régénération dérégulée reste à déterminer. Le premier objectif de cette thèse a été de déterminer le rôle de l'inflammation dans le remodelage et la régénération de l'épithélium bronchique CF. Grâce à un modèle in vitro de culture en interface air-liquide, nous avons montré qu'en absence d'infection et d'inflammation exogènes, la régénération épithéliale CF est anormale et retardée, et que l'épithélium régénéré est remodelé, en comparaison d'un épithélium régénéré non-CF. En outre, en générant une inflammation chronique dans les cultures CF et non-CF, nous avons pu attribuer un rôle pour l'inflammation endogène (mémoire inflammatoire) des cellules CF dans l'augmentation de la hauteur épithéliale et dans le développement de l'hyperplasie des cellules basales, un rôle essentiel de l'inflammation exogène dans le développement de l'hyperplasie des cellules mucipares, et l'absence d'influence de l'inflammation dans le retard de différenciation des cellules ciliées épithéliales CF. Le second objectif de cette thèse a été d’identifier une molécule susceptible d’être anti-remodelage et/ou pro-régénératrice. Les résultats obtenus montrent qu’une molécule issue des agro-ressources régionales régule l'augmentation de la hauteur épithéliale et l'hyperplasie des cellules basales et sécrétoires, favorise la différenciation des cellules ciliées, et réduit l'inflammation et de synthèse de la mucine MUC-5AC, tant dans les cultures CF quand dans les cultures non-CF soumises à une inflammation chronique. Enfin, la molécule restaure la sécrétion des ions chlorure CFTR-dépendante dans les cultures CF. Cette molécule semble donc être un candidat médicament prometteur pour le traitement de la CF. / The airway epithelium of cystic fibrosis (CF) patients is frequently injured and remodeled. Whether these alterations are related to infection and/or inflammation or to a dysregulated regeneration process remains to be elucidated. The first objective of this study was to determine the involvement of inflammation in remodeling and regeneration of the CF airway epithelium. Using an in vitro model of airway epithelial cell culture at the air-liquid interface, we demonstrated that, in absence of exogenous infection and inflammation, the CF airway epithelium regeneration was abnormal, delayed, and led to the reconstitution of a remodeled epithelium, in comparison to a non-CF regenerated airway epithelium. Moreover, by inducing a chronic inflammation in non-CF and CF cultures, we were able to attribute a role of the endogenous inflammation of CF cells (inflammatory memory) in the airway epithelium height increase as well as in the basal cell hyperplasia development, an essential involvement of exogenous inflammation in the development of goblet cell hyperplasia, and the absence of implication of inflammation in the ciliated cell differentiation delay. The second objective of this study was to identify an anti-remodeling and/or pro-regenerative molecule. The results we obtained showed that a molecule derived agro-resources regulated the increase in the airway epithelium height as well as the basal and goblet cell hyperplasia development, favored the ciliated cell differentiation, decreased the inflammation and the production of the MUC5-AC mucin, in the CF cultures an in the chronically inflamed non-CF cultures. Finally, this molecule restored chloride secretion through CFTR in CF cultures. In conclusion, the chosen molecule seems to be a promising therapeutics for cystic fibrosis.

But de l’étudeL’atrésie intestinale est une anomalie congénitale définie par une perte de la continuité digestive. Malgré une restauration chirurgicale précoce de cette continuité, surviennent durant les premiers mois de vie des troubles de la motilité digestive et des surinfections bactériennes chez un tiers des patients. Ces troubles fonctionnels étaient attribués jusque là principalement à des altérations du système nerveux entérique. Le but de cette étude était de confirmer cette hypothèse mais également d’élargir le champ des explorations aux autres composants du tube digestif.Matériel et méthodesLe modèle animal de l’atrésie chez le rat initialement décrit dans notre équipe a été utilisé pour caractériser les anomalies d’expression génique par transcriptomique. L’étude portait également sur la maturation digestive chez des fœtus de rat contrôle entre un stade de développement embryonnaire E15 et E21. Des modifications en amont et en aval de l’obstruction ont été étudiées en prélevant deux segments successifs de 1 cm par cette approche globale transcriptomique puis précisées par RT-PCRq et confirmées par des techniques immunohistochimiques et de microscopie électronique. RésultatsChez les fœtus témoins, l’expression génique montre une décroissance physiologique pour le SNE et une augmentation pour les systèmes neuroendocrine et épithélial de E15 à E21. Concernant les fœtus avec atrésie, les modifications concernent quasi exclusivement le segment d’amont avec une augmentation du calibre intestinal, de l’épaisseur musculaire et une accélération globale de la maturation. Une redistribution des sous types neuronaux est constatée dans le segment d’amont ainsi qu’une augmentation de l’expression du système neuro endocrine. Pour ces deux systèmes, le segment d’aval est peu modifié. Des modifications importantes du système épithélial sont observées en amont comme en aval avec pour conséquence probable une altération de la barrière intestinale et du système anti infectieux.ConclusionCes résultats montrent que les changements prédominent dans le segment en amont de l’atrésie alors que le segment d’aval était parfois considéré comme le plus pathologique. De plus, il a été retrouvé des changements inattendus du système neuroendocrine et épithélial qui sous tendent une implication non exclusive du SNE. D’autres recherches sont nécessaires pour confirmer ces données et les exploiter dans une démarche thérapeutique. / Aim of the studyIntestinal atresia is a rare congenital affection with postoperative motility disorders, leading sometimes to death. Previous related studies mainly focused on enteric nervous system (ENS) alterations as it was identified to cause abnormal peristalsis. The aim of the study was to expertise the underlying pathological conditions of intestinal atresia using a global approach, before focusing on ENS and neuroendocrine cells in order to precise the presumptive involvement of the different layers of the intestinal wall.MethodsPreliminary transcriptomic approach was elected to screen global gene expression involved in intestinal development and atresia-linked disorders in the rat model previously described by our team. Rat embryos were assigned to atretic group and controls embryos at different stages of development ED15, ED17, ED19 and ED21. Two successive intestine samples of 1 cm were harvested in the proximal segment and in the distal one. The pattern of gene expression was further assessed by immunohistochemistry, electron microscopy and RT-qPCR. Main resultsA physiological decrease in gene expression for enteric nervous system markers and an increase for neuroendocrine and epithelial system was observed on controls from stages ED15 to ED21. Regarding affected embryos, structural modifications concerned the proximal segment with increased muscular layer and a significant disruption including global accelerated maturation was observed in the proximal segment with increased gene expression of neuroendocrine system. Distal segment was comparable to controls for the two systems. Important modifications were noted concerning the epithelial system with consequent abnormalities of the gut barrier and anti infectious functions.ConclusionsFetal intestinal obstruction results in a disrupted gut development predominant in the proximal segment. The distal segment and the ENS were poorly concerned by theses changes. Neuroendocrine and epithelial cells underwent significant unexpected changes, supporting the evidence that ENS do not play an exclusive role in the pathways of intestinal motility disorders.