O óxido nítrico (NO) é um mensageiro químico gerado pela atividade da enzima óxido nítrico sintase (NOS) a qual foi detectada em vários órgãos incluídos os do sistema reprodutor e parece estar envolvido na maturação oocitária. No entanto, há poucos estudos sobre o papel desse sistema em oócitos da espécie bovina. Sabe-se que o NO atua pela via da guanilato ciclase (GC) estimulando a produção do nucleotídeo GMPc, que por sua vez é capaz de influenciar nos níveis de outro nucleotídeo (AMPc) via fosfodiesterases (PDE). O AMPc é um importante elemento da via de sinalização do FSH nos complexos cumulus-oócitos e no controle da maturação oocitária. O objetivo do presente projeto foi investigar a influência do FSH na via do NOS/NO e seus componentes em oócitos bovinos maturados in vitro e o envolvimento das células do cumulus (CC) na via de sinalização. Para tanto, complexos cumulus-oócito (CCO) e oócitos desnudos (OD - maturados sem células do cumulus) foram maturados in vitro por 24h na presença ou ausência de FSH. As amostras foram avaliadas quanto a: 1) taxa da maturação nuclear; 2) níveis de produção de NO; 3) níveis de AMPc e GMPc; 4) abundância relativa de RNAm de NOS2, PDE5A, PDE6C, PKG1, PKG2, ADCY6, ADCY9, PDE3A e PKA1. O FSH, na concentração de 0,05UI/mL, estimulou positivamente a maturação nuclear em CCO e OD, com 80,6 e 89% de oócitos maturados, respectivamente. Quando comparados diretamente os grupos CCO e OD, o FSH não influenciou as taxas de maturação (71 e 71,3%, p>0,05), nem os níveis de produção de NO (12,8 e 7,4 µM/mL, p>0,05). Os níveis de GMPc em CCO aumentaram após 1 e 3 h de MIV na presença de FSH (266,3 e 187,2 pmol/pool com FSH e 240,5 e 168,5 pmol/pool sem FSH, respectivamente, p<0,05). Após 6 h os níveis de GMPc declinaram de forma mais acentuada no grupo sem FSH (46,3 e 106,9 pmol/pool, com e sem FSH, respectivamente, p<0,05). Os níveis de AMPc em CCO também foram mais elevados na presença de FSH à 1 e 3 h de MIV (7,60 e 7,81 pmol/pool, respectivamente) em comparação com CCO maturados sem FSH (0.30 e 0,76 pmol/pool, respectivamente, p<0,05). Após 6h, os níveis declinaram e foram similares para ambos os grupos (0,43 pmol/pool, p>0,05). Em relação à expressão dos genes selecionados, todos foram detectados nos oócitos (CCO e OD), porém, em células do cumulus, foram detectados apenas PDE5A, ADCY6, ADCY9 e PKA1. Quando observados os resultados do grupo CCO, apenas os genes PKG1, ADCY6 e PDE3A sofreram influência do FSH (p<0,05), apresentando um aumento destes transcritos. No grupo OD, apenas o gene PKG1 sofreu influência do FSH, também apresentando um aumento destes transcritos (p<0,05). Em células do cumulus, os genes ADCY6 e ADCY9 sofreram influência do FSH, sendo que para a ADCY6 provocou um aumentos destes transcritos, e para a ADCY9 provocou uma queda dos mesmos (p<0,05). Em conclusão, o FSH pode exercer influência positiva na maturação nuclear de oócitos bovinos, agindo sobre os níveis de GMPc e AMPc, mas não sobre o NO. O FSH pode influenciar a expressão gênica em oócitos e em células do cumulus de bovinos. / Nitric oxide (NO) is a chemical messenger generated by the nitric oxide synthase (NOS) enzyme, which was detected in several organs including the reproductive system and appears too involved in oocyte maturation. However, there are few studies on the role of this system in bovine oocytes. NO is known to act via guanylate cyclase (GC) stimulating the production of the nucleotide cGMP, which in turn is capable of influencing the levels of another nucleotide, cAMP via phosphodiesterases (PDE). cAMP is an important factor in FSH signaling in cumulus-oocyte complexes (COC) for the control of maturation. The aim of the present work was to investigate the influence of FSH on the NOS/NO pathway and its components in bovine oocytes matured in vitro and the involvement of cumulus cells (CC) in the signaling pathway. COC and denuded oocytes (DO - matured without cumulus cells) were matured in vitro for 24 h with or without FSH. Samples were assessed for: 1) maturation rate; 2) levels of NO production; 3) levels of cGMP and cAMP; 4) relative abundance for mRNA of NOS2, PDE5A, PDE6C, PKG1, PKG2, ADCY6, ADCY9, PDE3A and PKA1. FSH positively stimulated oocyte maturation at 0.05UI/mL concentration for both COC and OD (80.6 and 89% maturation rates, respectively). When COC and OD were compared directly, FSH did not affect maturation rates (71 and 71.3%, p>0.05) nor NO production levels (12,8 and 7,4 µM/mL), p>0.05). cGMP levels increased after 1 and 3 h in vitro maturation (IVM) with FSH (266.3 and 187.2 pmol/pool with FSH and 240.5 and 168.5 pmol/pool without FSH, respectively, p<0.05). After 6 h IVM, cGMP levels in COC declined more in the group cultured with FSH (46.3 and 106.9 pmol/pool, with and without FSH, respectively, p<0.05). cAMP levels in COC were also increased in the presence of FSH at 1 and 3 h IVM (7.60 and 7.81 pmol/pool, respectively) in comparison to COC cultured without the hormone (0.30 and 0.76 pmol/pool, respectively, p<0.05). After 6 h, the levels declined and were similar for both groups (0.43 and 0.02 pmol/pool, p>0.05). Regarding mRNA expression for the selected genes, all of them were detected in oocytes, but only four of them were detected in cumulus cells: PDE5A, ADCY6, ADCY9 and PKA1. For COC only PKG1, ADCY6 and PDE3A were influenced by FSH (p<0.05), with an increase in transcript relative abundance, For DO, only PKG1 was influenced by FSH and also showed an increase in these transcripts (p<0.05). In cumulus cells, ADCY6 and ADCY9 were affected by FSH, with an increase for ADCY6 and a decrease in ADCY9 transcripts (p<0.05). In conclusion, FSH may positively influence nuclear maturation, acting on cGMP and cAMP levels, but not on NO. FSH may also influence gene expression in bovine oocytes and cumulus cells.

Orientador: Elenice Aparecida de Moraes Ferrari / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-18T00:49:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Machado_AlineVilardaSilva_M.pdf: 2487506 bytes, checksum: ec15fc1b78bef814d6d459499276cdf5 (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: A ritmicidade circadiana, expressa na alteração do comportamento e em aspectos morfofisiológicos e moleculares ao longo das 24 horas do dia, é uma das funções básicas dos organismos vivos. Os processos comportamentais e os mecanismos moleculares no hipocampo, que estão envolvidos na aprendizagem e memória, demonstram oscilação circadiana. Vários estudos sugeriram que o condicionamento clássico aversivo é afetado pelo sistema de temporização circadiana e que a oscilação circadiana de vias moleculares específicas é requerida para a consolidação da memória aversiva. O presente trabalho investigou a oscilação circadiana da expressão da nNOS e da atividade da proteína NOS no hipocampo de pombos e as suas relações com a modulação temporal do condicionamento contextual aversivo. Na Parte I, caracterizou-se o padrão temporal da expressão da nNOS, que foi detectada por Western Blotting e o padrão temporal da atividade enzimática da NOS, determinada pela quantidade de L-citrulina produzida por minuto e por micrograma de proteína na reação. Na Parte II, nos horários de mínima e máxima atividade enzimática da proteína, pombos foram treinados e testados em condicionamento aversivo ao contexto. As sessões foram gravadas para posterior análise comportamental. Após o teste foi realizada a imunoistoquímica para marcação da nNOS em neurônios do hipocampo. Foi evidenciada ritmicidade circadiana significativa (p < 0,05) na expressão protéica da nNOS e na atividade enzimática da NOS, segundo os valores fornecidos pelo método Cosinor para caracterização do padrão temporal. As médias da densitometria óptica dos grupos com horários mais próximos da acrofase - ZT04 (10hs; 0,944 ± 0,12) e a batifase - ZT16-(22hs; 0,572 ± 0,16) foram significativamente diferentes (F5,18 p < 0,0001). Os grupos condicionados, em ambos os horários, mostraram maior duração e maior ocorrência do comportamento de congelamento do que os controles (p < 0,05). Houve uma variação dia-noite para o comportamento de congelamento nos grupos controles (p < 0,05). A marcação de células nNOS-positivas foi maior no hipocampo dos grupos condicionados sendo que o total de células nNOS-positivas na área dorsal do grupo experimental testado à noite foi maior do que aquele observado nos grupos controles e no experimental da manhã (p < 0,05). Os dados mostraram que a expressão protéica da nNOS e da atividade enzimática da NOS no hipocampo de pombos mostram uma oscilação que caracteriza um padrão temporal circadiano. Tanto no horário de máxima como no de mínima atividade da nNOS, o condicionamento contextual aversivo resultou em medo condicionado ao contexto e em expressão de células nNOS-positivas no hipocampo que foi maior nos pombos condicionados do que nos controles. Contudo, no hipocampo do grupo testado à noite houve um maior número de células nNOS-positivas. Esse dado estimula questionamento sobre se ocorreria a ativação de mecanismos compensatórios para o aumento da expressão da proteína nNOS, quanto essa é requisitada em situações de baixa disponibilidade / Abstract: The circadian rhythm, expressed in changing behavior and the morphophysiologic and molecular aspects over 24 hours of the day is one of the basic functions of living organisms. The behavioral processes and molecular mechanisms in the hippocampus, which are involved in learning and memory, show circadian oscillation. Several studies have suggested that classical fear conditioning is affected by the circadian timing system and the circadian oscillation of specific molecular pathways is required for the consolidation of aversive memory. This study investigated the circadian oscillation of nNOS expression and activity of NOS protein in the hippocampus of pigeons and their relationship with the temporal modulation of aversive contextual conditioning. In Part I, we have characterized the temporal pattern of nNOS expression, which was detected by Western blotting and temporal pattern of NOS enzyme activity, determined by the amount of L-citrulline produced per minute and per microgram of protein in the reaction. In Part II, at the times of minimum and maximum activity of the protein, pigeons were trained and tested in aversive conditioning to context. The sessions were taped for later behavioral analysis. After the test was performed immunohistochemical for labeling of nNOS in neurons in the hippocampus. Circadian rhythm was evident (p <0.05) in nNOS protein expression and enzyme activity of NOS, according to figures provided by Cosinor method to characterize the temporal pattern. The mean optical density of groups with times closer to the acrophase - ZT04 (10hrs; 0.944 ± 0.12) and nadir - ZT16-(22hs; 0.572 ± 0.16) were significantly different (F5, 18 p <0.0001 ). The groups conditioned in both schedules, showed more frequent and longer duration of freezing behavior than controls (p <0.05). There was a day-night variation for freezing behavior in control groups (p <0.05). Labeling of nNOS-positive cells was higher in the hippocampus of the groups conditioned with total nNOS-positive cells in the dorsal area of the experimental group tested at night was higher than that observed in control groups and experimental group in the morning (p <0.05). The data showed that nNOS protein expression and enzymatic activity of NOS in the hippocampus of pigeons show an oscillation that characterizes a circadian temporal pattern. Both at the time of maximum as the low activity of nNOS, the aversive contextual conditioning resulted in fear conditioning to context and expression of nNOS-positive cells in the hippocampus was higher in pigeons conditioned than in controls. However, in the hippocampus of the group tested in the evening there was a greater number of nNOS-positive cells. This fact encourages questioning of whether there would be activation of compensatory mechanisms for the increased expression of nNOS protein, as this is required in situations of low availability / Mestrado / Fisiologia / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Aureo Tatsumi Yamada / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-08T07:35:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Lippe_ElianaMaraOliveira_M.pdf: 15998840 bytes, checksum: c90882b20fd79172ca6324e555698016 (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: o sucesso da implantação e do desenvolvimento embrionário no útero de humanos e roedores decorre de interações íntimas entre as células de origem materna e fetal, com a intermediação de citocinas e mediadores químicos em fino balanço estabelecendo um diálogo entre as diferentes populações celulares da interface materno-fetal. Este diálogo envolve do lado fetal as células trofoblásticas e do lado materno o estroma decidualizado, vasos sanguíneos e células leucocitárias do endométrio, numa complexa rede de sinalizações cujos mecanismos são apenas parcialmente conhecidos. Desequilíbrios neste balanço de sinalizações podem resultar na interrupção da gravidez sendo particularmente intrigante a participação das células natural killer uterinas (uNK) que constituem uma população linfocitária que estão presentes em grande quantidade no ambiente uterino exclusivamente durante a gestação. O presente trabalho teve como objetivo avaliar a expressão e participação das isoformas das enzimas óxido nítrico sintases (NOS) como potencial indutor do desequilíbrio da homeostasia do microambiente uterino na interface materno-fetal envolvendo a produção do óxido nítrico (NO). Foram utilizados camundongos no 8° e 10° dia de gestação (dg) normal e grupos de animais cujos embriões foram lesionados mecanicamente por intervenção cirúrgica ou inoculados com lipopolissacarídios (LPS). Amostras uterinas de sítios embrionários foram coletadas nos períodos de 1, 2 e 6 horas pós-lesão mecânica, ou, 6 horas após inoculação com LPS e processados de acordo com as técnicas rotineiras para embebição em parafina, assim como, processados para obtenção de homogeneizados teciduais da região mesometrial destes sítios embrionários. Cortes de parafina foram submetidos à reação citoquímica com a lectina Dolichos biflorus (DBA) e às reações imunocitoquímicas para as isoformas iNOS, eNOS e nNOS e, para IFNa. Foram realizadas SDS-PAGE dos homogeneizados teciduais e Western-blot com os anticorpos anti-iNOS, anti-eNOS e anti-nNOS. A região mesometrial dos sítios embrionários lesionados mecanicamente apresentou hiperemia após 1 hora de lesão que evoluiu para um quadro de hemorragia nos períodos posteriores. No grupo submetido ao tratamento com LPS foi observado um quadro de hiperemia no período de 6 horas. Pela citoquímica com a lectina DBA constataram-se alterações na morfologia das células uNK destes sítios, sendo notória a perda de reatividade no conteúdo dos grânulos lisosomo-secretores. As avaliações imunocitoquímica para iNOS indicaram que as células uNK, as células deciduais e as células trofoblásticas gigantes expressam iNOS constitutivamente na gestação normal, o mesmo ocorrendo com as isoformas eNOS e nNOS. Nos sítios de lesão embrionária, as células uNK apresentam acentuada redução na marcação pela imunocitoquímica para a iNOS e nNOS nos períodos de 1 e 2 horas, com recuperação parcial após 6 horas. Estas variações não foram constatadas em outras células da interface materno-fetal. A eNOS apresentou marcações constantes nas células uNK e nas células musculares lisas, sem variações nos grupos experimentais de lesão embrionária. Pelo Western-blot foi constatada uma redução signficativa para a iNOS e nNOS nos períodos de 1 e 2 horas pós-lesão mecânica. Estes resultados demonstraram que as células uNK respondem às alterações do ambiente uterino induzido pela lesão embrionária ou pelo LPS, com rápida mobilização das isoformas iNOS e nNOS possivelmente na produção do NO. O NO liberado por estas células pode ser a causa da alteração da permeabilidade ou lesão vascular da região mesometrial provocando a hiperemia e hemorragia. A mobilização da atividade da iNOS nas células uNK não parece ser dependente do IFN-a. e portanto não ocorre o envolvimento das células dendríticas nesta via de sinalização / Abstract: The successful embryo implantation and development in human and rodents uteri is dependent of intimate interaction between maternal and fetal cells, with intervening of fine balance of cytokines and chemical mediators on cross-talks between cells in the maternal-fetal interface. This dialogue involves the cells of decidualized stroma, blood vessels and leukocytes from endometrium of maternal side and the trophoblast cells from embryo in a complex signaling network which mechanism is only partially understood. Unbalance of these signals could outcome in miscarriage being intriguing the participation of uterine natural killer cells (uNK) that com pose lymphocyte population accumulate in the uterine environment specifically during pregnancy. The aim of this work was to evaluated the participation of nitric oxide synthase (NOS) enzymes isoforms which arise in nitric oxide (NO) production, as potential inducer of unbalance of homeostasis in the uterine environment. It was used normal pregnant mice on 8° and 10° gestational days and groups of animais which embryos were surgically lesioned or inoculated with lipopolyssacharide (LPS). Uterine samples were colleted after 1, 2 and 6 hs of embryo lesion or 6hs after LPS inoculation and processed for conventional paraffin embedding, as so as, for tissue homogenates of mesometrial region from this uterine sites. Paraffin sections were processed for Dolichos biflorus (DBA) lectin cytochemistry and immunocytochemistry for iNOS, eNOS, nNOS and IFN-a. SDS-PAGE and Western blot were performed with tissue homogenates using anti-iNOS, anti-eNOS and antinNOS. The mesometrial region of embryo lesioned uterine sites showed hyperemia after 1 hr lesion and increased to hemorrhage after that. In the LPS treated animais was seen hyperemia after 6hr. The DBA cytochemistry showed morphological changes in the uNK cells found in this embryo lesioned sites being noticeable the lost of reactivity in the secretory-Iysosome granules contents. The immunocytochemical for iNOS pointed out the uNK, decidual and trophoblast cells expressing iNOS constitutively in the normal pregnancy, as did the eNOS and nNOS. In the embryo damaged sites the uNK cells showed remarkable reduction in the iNOS and nNOS labeling after 1 and 2 hr with partial recuperation after 6 hr. These variations were not seen in other cells. The eNOS showed constant labelling on uNK cells and smooth muscle cells without changes in the experimental groups of embryo lesion or treated with LPS. By Western blot, it was noted significant lowering for iNOS and nNOS in the periods of 1and 2 hr after lesion. These results showed acute response of uNK cells against the changes of uterine environment induced by embryo lesion and LPS treatment, with fast mobilization of iNOS and nNOS isoforms possibly in the production of NO. The NO released from these cells could be the cause of changes on vascular permeability or even lesion of blood vessels localized in the mesometrial region wich results in hyperemia and hemorrhage. The iNOS activation of uNK cells does not seem dependent of IFN-a and therefore without commitmentof dendritic cells in this signaling pathway / Mestrado / Histologia / Mestre em Biologia Celular e Estrutural

Orientador: Mario Jose Abdalla Saad / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-14T18:10:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Silva_AleksandraAlves_M.pdf: 835795 bytes, checksum: 33a3294673868ddb2965c3532c08b534 (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: As óxido nítrico sintases (NOS) são divididas em dois grandes grupos de enzimas, NOS induzível (iNOS) e NOS constitutivas (cNOS). Embora o óxido nítrico (NO) seja um importante mediador de defesa do organismo, a produção excessiva de NO está envolvida na patogênese de muitas doenças inflamatórias e metabólicas. Alguns estudos demonstram que o óxido nítrico exógeno e o NO produzido pela iNOS pode induzir resistência à insulina em músculo e desempenha um papel importante na hiperglicemia de jejum. Este estudo teve como objetivo sintetizar e investigar o efeito de um potente e seletivo inibidor de atividade da iNOS, o Iodato de S-Metilisotiouréia (I-SMT) 5 mg/kg por dia, na hiperglicemia de jejum e na resistência à insulina em um modelo de obesidade induzida por dieta hiperlipídica. Foram observados os parâmetros metabólicos e de sinalização celular da Proteína quinase B/Akt (Akt) e os resultados fornecem evidências de que o grupo tratado com I-SMT foi protegido contra o desenvolvimento de resistência à insulina, e intolerância à glicose induzida por dieta hiperlipídica. Portanto, propomos que potentes inibidores farmacológicos, com seletividade significativa pela iNOS podem representar uma nova abordagem terapêutica para o tratamento da resistência à insulina e suas complicações como o diabetes tipo 2. / Abstract: Nitric oxide synthase (NOS) has been divided into two major sub-enzymes, inducible NOS (iNOS) and constitutive NOS (cNOS). Although nitric oxide (NO) is an important defense mediator, the excessive production of NO has been involved in the pathology of many inflammatory and metabolic diseases. Some studies demonstrate that exogenous nitric oxide (NO) and the NO produced by iNOS can induce insulin resistance in muscle and plays an important role in fasting hyperglycemia. This study investigates the effect of a potent and selective iNOS activity inhibitor, the S-Methylisothiourea Iodide (SMT-I) 5 mg/kg per day, in fasting hyperglycemia and insulin resistance in diet-induced obesity model. We observed the metabolic parameters and Akt signalization and these findings provide evidence that the SMT-I treated group are protected against the development of insulin resistance, glucose intolerance and diet-induced obesity. Therefore, we propose that highly selective inhibitors of iNOS activity may represent a novel therapeutic approach for the therapy of insulin resistance and its complications as type 2 diabetes. / Mestrado / Biologia Estrutural, Celular, Molecular e do Desenvolvimento / Mestre em Fisiopatologia Médica

Orientador: Elenice Aparecida de Moraes Ferrari / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-11T20:16:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Denadai_MagdaAline_M.pdf: 823511 bytes, checksum: 1887972f9e5047fecbd7195247b586a8 (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: O óxido nítrico (NO), um neurotransmissor não convencional, tem papel importante em processos neurobiológicos de comportamento e de memória. Sua síntese é mediada por três isoformas de sintase do óxido nítrico (NOS): a neuronal (nNOS), a endotelial (eNOS) e induzível (iNOS). Este trabalho analisou o efeito do 7-nitroindazole (7-NI), um inibidor seletivo da nNOS, no condicionamento clássico aversivo em pombos. Foram usados 4 grupos: tratados com 7-NI (grupo 7-nitroindazole; G7-NI, n=5), tratados com óleo de amendoim (grupo veículo; GV, n=5), controle/sem tratamento (grupo controle; GC, n=5) e grupo não tratado/não condicionado (grupo manipulação; GM, n=5). A administração i.p. de 7-NI (25 mg/kg), ou do óleo de amendoim foi feita imediatamente após o treinamento. O G7-NI, o GV e o GC receberam três associações som-choque (5°, 10° e 15º minutos) numa sessão de 20 min. O teste a o contexto foi realizado 24 horas depois. As sessões foram gravadas para posterior transcrição e análise comportamental. A ocorrência da resposta de congelamento durante o treino não diferiu entre os grupos (p>0,05), mas durante o teste foi menor para o G7-NI em comparação ao treino (p<0.01) e aos demais grupos no teste (p<0.001). A atividade da NOS dependente de Ca++ no hipocampo foi menor no G7-NI do que nos outros grupos (p<0,01). Análise por Western blot indicou aumento na expressão de nNOS no G7-NI (p<0,05). A administração sistêmica de 7-NI teve um efeito amnésico sobre a memória contextual aversiva, indicando que a atividade da NOS dependente de Ca++ é importante para os processos de condicionamento clássico aversivo em pombos. / Abstract: Nitric oxide (NO) is an unsual neurotransmitter that plays an important role in neurobiological functions underlying behavior and memory. NO synthesis and release can be mediated by three isoforms of NO synthases (NOS): neuronal (nNOS), endothelial (eNOS) and inducible (iNOS). This study examined the effect of 7-nitroindazole (7-NI), a selective nNOS inhibitor, on contextual fear conditioning in pigeons. Four groups of pigeons were used: treated with 7-NI (7-NI; n=5), treated with peanut oil (Vehicle; n=5), non treated controls (Control; n=5) and non treated and no-trained controls (Non-trained; n=5). Treatment consisted in 7-NI (25 mg/kg; i.p.) or vehicle (peanut oil) administration, immediately after training. All the animals were trained in one 20 min session during which three tone-shock pairings (5th, 10th and 15th minutes) were presented. The test to the context was conducted 24h later. Behavioral categories were analyzed through the transcription of video-tapes of the sessions. The groups 7-NI, Vehicle and Control showed no significant differences in freezing during the conditioning session (p>0.05). During the test to the context the group 7-NI expressed significantly lower freezing as compared to Vehicle and Control (p<0.05). The 7-NI pigeons showed lower hippocampal activity of Ca++ dependent-NOS than Vehicle and Control groups (p<0.01). Western blot analysis indicated significant increase in nNOS expression (p<0.05). The systemic administration of 7-NI induced amnestic effects on contextual fear memory that evidence that Ca++-dependent NOS activity is required for fear conditioning in pigeons. / Mestrado / Fisiologia / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

O óxido nítrico (NO) é um mensageiro químico gerado pela atividade da enzima óxido nítrico sintase (NOS) a qual foi detectada em vários órgãos incluídos os do sistema reprodutor e parece estar envolvido na maturação oocitária. No entanto, há poucos estudos sobre o papel desse sistema em oócitos da espécie bovina. Sabe-se que o NO atua pela via da guanilato ciclase (GC) estimulando a produção do nucleotídeo GMPc, que por sua vez é capaz de influenciar nos níveis de outro nucleotídeo (AMPc) via fosfodiesterases (PDE). O AMPc é um importante elemento da via de sinalização do FSH nos complexos cumulus-oócitos e no controle da maturação oocitária. O objetivo do presente projeto foi investigar a influência do FSH na via do NOS/NO e seus componentes em oócitos bovinos maturados in vitro e o envolvimento das células do cumulus (CC) na via de sinalização. Para tanto, complexos cumulus-oócito (CCO) e oócitos desnudos (OD - maturados sem células do cumulus) foram maturados in vitro por 24h na presença ou ausência de FSH. As amostras foram avaliadas quanto a: 1) taxa da maturação nuclear; 2) níveis de produção de NO; 3) níveis de AMPc e GMPc; 4) abundância relativa de RNAm de NOS2, PDE5A, PDE6C, PKG1, PKG2, ADCY6, ADCY9, PDE3A e PKA1. O FSH, na concentração de 0,05UI/mL, estimulou positivamente a maturação nuclear em CCO e OD, com 80,6 e 89% de oócitos maturados, respectivamente. Quando comparados diretamente os grupos CCO e OD, o FSH não influenciou as taxas de maturação (71 e 71,3%, p>0,05), nem os níveis de produção de NO (12,8 e 7,4 µM/mL, p>0,05). Os níveis de GMPc em CCO aumentaram após 1 e 3 h de MIV na presença de FSH (266,3 e 187,2 pmol/pool com FSH e 240,5 e 168,5 pmol/pool sem FSH, respectivamente, p<0,05). Após 6 h os níveis de GMPc declinaram de forma mais acentuada no grupo sem FSH (46,3 e 106,9 pmol/pool, com e sem FSH, respectivamente, p<0,05). Os níveis de AMPc em CCO também foram mais elevados na presença de FSH à 1 e 3 h de MIV (7,60 e 7,81 pmol/pool, respectivamente) em comparação com CCO maturados sem FSH (0.30 e 0,76 pmol/pool, respectivamente, p<0,05). Após 6h, os níveis declinaram e foram similares para ambos os grupos (0,43 pmol/pool, p>0,05). Em relação à expressão dos genes selecionados, todos foram detectados nos oócitos (CCO e OD), porém, em células do cumulus, foram detectados apenas PDE5A, ADCY6, ADCY9 e PKA1. Quando observados os resultados do grupo CCO, apenas os genes PKG1, ADCY6 e PDE3A sofreram influência do FSH (p<0,05), apresentando um aumento destes transcritos. No grupo OD, apenas o gene PKG1 sofreu influência do FSH, também apresentando um aumento destes transcritos (p<0,05). Em células do cumulus, os genes ADCY6 e ADCY9 sofreram influência do FSH, sendo que para a ADCY6 provocou um aumentos destes transcritos, e para a ADCY9 provocou uma queda dos mesmos (p<0,05). Em conclusão, o FSH pode exercer influência positiva na maturação nuclear de oócitos bovinos, agindo sobre os níveis de GMPc e AMPc, mas não sobre o NO. O FSH pode influenciar a expressão gênica em oócitos e em células do cumulus de bovinos. / Nitric oxide (NO) is a chemical messenger generated by the nitric oxide synthase (NOS) enzyme, which was detected in several organs including the reproductive system and appears too involved in oocyte maturation. However, there are few studies on the role of this system in bovine oocytes. NO is known to act via guanylate cyclase (GC) stimulating the production of the nucleotide cGMP, which in turn is capable of influencing the levels of another nucleotide, cAMP via phosphodiesterases (PDE). cAMP is an important factor in FSH signaling in cumulus-oocyte complexes (COC) for the control of maturation. The aim of the present work was to investigate the influence of FSH on the NOS/NO pathway and its components in bovine oocytes matured in vitro and the involvement of cumulus cells (CC) in the signaling pathway. COC and denuded oocytes (DO - matured without cumulus cells) were matured in vitro for 24 h with or without FSH. Samples were assessed for: 1) maturation rate; 2) levels of NO production; 3) levels of cGMP and cAMP; 4) relative abundance for mRNA of NOS2, PDE5A, PDE6C, PKG1, PKG2, ADCY6, ADCY9, PDE3A and PKA1. FSH positively stimulated oocyte maturation at 0.05UI/mL concentration for both COC and OD (80.6 and 89% maturation rates, respectively). When COC and OD were compared directly, FSH did not affect maturation rates (71 and 71.3%, p>0.05) nor NO production levels (12,8 and 7,4 µM/mL), p>0.05). cGMP levels increased after 1 and 3 h in vitro maturation (IVM) with FSH (266.3 and 187.2 pmol/pool with FSH and 240.5 and 168.5 pmol/pool without FSH, respectively, p<0.05). After 6 h IVM, cGMP levels in COC declined more in the group cultured with FSH (46.3 and 106.9 pmol/pool, with and without FSH, respectively, p<0.05). cAMP levels in COC were also increased in the presence of FSH at 1 and 3 h IVM (7.60 and 7.81 pmol/pool, respectively) in comparison to COC cultured without the hormone (0.30 and 0.76 pmol/pool, respectively, p<0.05). After 6 h, the levels declined and were similar for both groups (0.43 and 0.02 pmol/pool, p>0.05). Regarding mRNA expression for the selected genes, all of them were detected in oocytes, but only four of them were detected in cumulus cells: PDE5A, ADCY6, ADCY9 and PKA1. For COC only PKG1, ADCY6 and PDE3A were influenced by FSH (p<0.05), with an increase in transcript relative abundance, For DO, only PKG1 was influenced by FSH and also showed an increase in these transcripts (p<0.05). In cumulus cells, ADCY6 and ADCY9 were affected by FSH, with an increase for ADCY6 and a decrease in ADCY9 transcripts (p<0.05). In conclusion, FSH may positively influence nuclear maturation, acting on cGMP and cAMP levels, but not on NO. FSH may also influence gene expression in bovine oocytes and cumulus cells.

Submitted by Renata Lopes (renatasil82@gmail.com) on 2018-11-21T14:52:02Z No. of bitstreams: 1 josianeaparecidademiranda.pdf: 875991 bytes, checksum: 560d8fad3e6561f7771f93eff40c6a89 (MD5) / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2018-11-23T12:59:37Z (GMT) No. of bitstreams: 1 josianeaparecidademiranda.pdf: 875991 bytes, checksum: 560d8fad3e6561f7771f93eff40c6a89 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-11-23T12:59:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 josianeaparecidademiranda.pdf: 875991 bytes, checksum: 560d8fad3e6561f7771f93eff40c6a89 (MD5) Previous issue date: 2011-03-29 / - / -

INTRODUÇÃO: A importância do parênquima pulmonar na piora funcional da asma tem sido recentemente investigada. Embora a ativação da enzima óxido nítrico sintase induzida (iNOS) amplifique a responsividade e o remodelamento das vias aéreas induzidos pela inflamação crônica, seu efeito no parênquima pulmonar não foi previamente estudado. OBJETIVO: Avaliar a influência do óxido nítrico derivado da iNOS na mecânica pulmonar, na inflamação e no processo de remodelamento no tecido pulmonar periférico de cobaias com inflamação pulmonar alérgica. MÉTODOS: Os animais foram submetidos a sete inalações com doses crescentes de ovalbumina (1~5 mg/mL) ou soro fisiológico por 4 semanas. As cobaias receberam 1400-W (inibidor específico de iNOS, intraperitoneal) ou veículo por 4 dias, iniciando 30 minutos antes da sétima inalação. Após 72h da sétima inalação, os animais foram anestesiados, exsanguinados e fatias de tecido pulmonar periférico foram retiradas e suspensas em banho orgânico de Krebs, e a resistência e elastância tecidual foram avaliadas em condição basal e após desafio com ovalbumina. Após, as fatias de tecido pulmonar periférico foram submetidas à avaliação histopatológica. RESULTADOS: Os animais expostos às inalações com ovalbumina apresentaram valores maiores de porcentagem de aumento da resistência e da elastância tecidual em relação ao basal após desafio com ovoalbumina no banho (p<0.05). Houve aumento no número de eosinófilos (p<0.001), nas células iNOS positivas (p<0.001), na deposição de fibras elásticas e colágenas (p<0.05), na densidade de actina (p<0.05) e na expressão de 8-epi-PGF2a (p<0.001) no septo alveolar. A administração de 1400-W reduziu todos estes parâmetros funcionais e morfológicos (p<0.05). CONCLUSÕES: Neste modelo experimental, o bloqueio específico da iNOS atenuou a constrição, a inflamação e o remodelamento no parênquima pulmonar. Estas alterações podem estar relacionadas aos efeitos do óxido nítrico na modulação da via do estresse oxidativo. O presente estudo sugere que a inibição específica da iNOS pode amplificar as estratégias terapêuticas utilizadas na abordagem de doenças inflamatórias crônicas pulmonares. / INTRODUCTION: The importance of lung parenchyma in functional asthma impairment has been recently addressed. Although the inducible nitric oxide synthase (iNOS) activation amplifies chronic inflammation-induced airway responsiveness and remodeling, its effect on lung parenchyma has not been previously investigated. OBJECTIVE: To evaluate the influence of iNOSderived NO in the pulmonary mechanics, inflammation, and remodeling processes in peripheral lung tissue of guinea pigs with pulmonary allergic inflammation. METHODS: Animals were submitted to seven ovalbumin exposures with increasing doses (1~5 mg/mL) or saline for 4 weeks. The guinea pigs received 1400-W (iNOS-specific inhibitor, intraperitoneal) or vehicle for 4 days, beginning 30 minutes before the 7th inhalation. At 72h after the 7th inhalation, animals were anesthetized, exsanguinated and peripheral lung tissue strips were retreat and suspended in a Krebs organ bath, and the tissue resistance and elastance were evaluated at baseline condition and after ovalbumin challenge. After that, strips were submitted to histopathological evaluation. RESULTS: The ovalbumin-exposed animals presented greater values of percentage of increase of tissue resistance and elastance related to baseline after ovalbumin challenge in the bath (p<0.05). There were increase in the number of eosinophils (p<0.001) and iNOSpositive cells (p<0.001), in collagen and elastic fiber deposition (p<0.05), in actin density (p<0.05) and in 8-epi-PGF2a expression (p<0.001) in the alveolar septa. The 1400-W administration reduced all these functional and morphological parameters (p<0.05). CONCLUSIONS: In this experimental model, the iNOS-specific blockage attenuated constriction, inflammation, and remodeling in the lung parenchyma. These alterations may be related to NO effects in the modulation of the oxidative stress pathway. The present study suggests that specific iNOS inhibition can amplify the therapeutics strategies used in the management in chronic inflammatory lung diseases.

INTRODUÇÃO: A pneumonectomia está associada à alta mortalidade e alto índice de complicações. Entre estas, o edema pulmonar pós-pneumonectomia é uma das mais graves, podendo chegar a 100% de mortalidade. Pouco se sabe acerca dos fatores etiológicos desta doença, bem como sua associação a um processo inflamatório ou estresse oxidativo. O objetivo deste estudo foi analisar os efeitos agudos da pneumonectomia esquerda sobre o pulmão remanescente de ratos quanto à avaliação funcional por gasometria e avaliação histológica por formação de edema, infiltrado inflamatório, estresse oxidativo e reatividade vascular. MÉTODOS: Trinta e um ratos Wistar foram submetidos ao estudo. Vinte e um foram submetidos à pneumonectomia esquerda, sendo sacrificados em 48 horas (11 animais) e 72 horas (10 animais). Como controle do tratamento, 10 ratos foram submetidos à operação sham, sendo 5 sacrificados em 48 horas e 5 em 72 horas. A avaliação funcional foi realizada por meio de coleta de sangue arterial, gasometria e análise da relação pO2/FiO2. A análise histológica consistiu da avaliação dos seguintes parâmetros: (1) grau de edema perivascular; (2) presença de infiltrado inflamatório obtido por meio da densidade de neutrófilos; (3) expressão tecidual imunoistoquímica da Óxido Nítrico Sintase (NOS) para a avaliação do estresse oxidativo e (4) do grau de reatividade vascular, medido por meio da relação luz parede (lumen/wall ratio). Na avaliação do estresse oxidativo, foram analisadas a isoformas induzida e endotelial da NOS (iNOS e eNOS). Além destes parâmetros, o edema pulmonar foi avaliado por meio do ganho de massa pulmonar proporcional, denominado de Índice Pulmonar (IP) e da relação do peso úmido e do peso seco (Razão U/S). A análise estatística foi realizada por meio do teste ANOVA. RESULTADOS: Não houve diferença entre os grupos quanto à relação pO2/FiO2. Quanto à análise histológica, houve diferença quanto ao edema perivascular, infiltrado inflamatório, imunoexpressão de iNOS e eNOS e reatividade vascular. Houve interação entre a pneumonectomia e o sacrifício mais tardio, com maior índice de edema perivascular neste grupo (p=0,0274). Houve menor densidade de neutrófilos nos animais submetidos à pneumonectomia tanto em 48 como 72 horas (p=0,0168). Não houve diferença na imunoexpressão tecidual de iNOS entre os animais submetidos à pneumonectomia e seus respectivos grupos controle, mas houve diminuição no grupos de 72 horas (p=0,0212). A análise imunoistoquímica da eNOS evidenciou maior expressão nos animais submetidos à pneumonectomia (p=0,0208). Quanto ao grau de reatividade vascular, houve menor razão L/P nos grupos sacrificados após 72 horas (p=0,0107), sugerindo maior vasoconstrição nestes grupos. Embora tenha havido maior ganho de massa pulmonar nos dois grupos de animais submetidos à pneumonectomia (p=0,0033), a Razão U/S não mostrou diferença entre os grupos. CONCLUSÕES: A pneumonectomia esquerda em ratos não causou alterações funcionais, mas causou alterações histológicas. Quanto a estas alterações, não foram de natureza inflamatória e nem relacionadas ao estresse oxidativo. Foram caracterizadas por edema perivascular e vasoconstrição, observados após 72 horas da operação. / INTRODUCTION: Pneumonectomy is associated with high mortality and complication rates. Of these complications, post-pneumonectomy pulmonary edema is one of the most severe with a mortality rate that can reach 100%. Little is known about the etiological factors involved in this process and its association with inflammatory process or oxidative stress. The objective of this study was to analyze the acute effects of left pneumonectomy on the remaining lung of rats based on functional assessment by blood gas analysis and on histological assessment by edema formation, inflammatory infiltrate, oxidative stress and vascular reactivity. METHODS: Thirty one Wistar rats were included in the study. Twenty one underwent left pneumonectomy and were sacrificed in 48 hours (11 animals) and 72 hours (10 animals). Ten rats underwent sham procedure for control and five were sacrificed in 48 hours and five in 72 hours. Functional assessment was conducted by arterial blood gas and pO2/FiO2 ratio analyses. Histological analysis consisted of the assessment of the following parameters: (1) degree of perivascular edema; (2) presence of inflammatory infiltrate suggested by neutrophil density; (3) immunohistochemical expression of Nitric Oxide Synthase (NOS) in tissues to assess oxidative stress and (4) the degree of vascular reactivity measured by lumen/wall ratio (L/W ratio). For the assessment of oxidative stress, induced and endothelial isoforms of NOS (iNOS and eNOS) were analyzed. In addition to these parameters, pulmonary edema was assessed by means of proportional pulmonary mass gain, called Pulmonary Ratio (PR) and of the wet/dry weight ratio (W/D Ratio). The statistical analysis was conducted using the ANOVA test. RESULTS: The histological analysis showed difference regarding perivascular edema, inflammatory infiltrate, immunoexpression of iNOS and eNOS and vascular reactivity. The rate of perivascular edema was higher in animals submitted to pneumonectomy and sacrificed after 72 hours (p=0.0274). Neutrophil density was lower in animals submitted to pneumonectomy for those sacrificed after 48 and 72 hours alike (p=0.0168). There was no difference in the immunoexpression of iNOS in tissues between animals submitted to pneumonectomy and control groups, but such immunoexpression was reduced in both 72-hour groups (p=0.0212). The immunohistochemical analysis of eNOS evidenced a higher expression in animals submitted to pneumonectomy (p=0.0208). As concerns the degree of vascular reactivity, there was a lower W/D ratio in the groups sacrificed after 72 hours (p=0.0107), suggesting greater vasoconstriction in these groups. There was no difference between the groups as to the pO2/FiO2 ratio. Although the two groups submitted to pneumonectomy had greater gain of mass (p=0.0033), there was no difference in the W/D ratio between the groups. CONCLUSIONS: Left pneumonectomy in rats did not cause functional alterations but caused histological alterations that were neither of inflammatory nature nor related to oxidative stress. The alterations included perivascular edema and vasoconstriction observed after 72 hours of the procedure.

Há décadas a exposição ao mercúrio é alvo de estudos toxicológicos devido ao alto potencial de danos a saúde humana. Na região amazônica os primeiros estudos reportavam a exposição ocupacional pelo uso nos garimpos de ouro, entretanto recentemente destacam-se os estudos relacionados a exposição ambiental que ocorre na região decorrente do consumo de peixes contaminados com mercúrio. Muitos estudos se concentram em populações ribeirinhas residentes na região do rio Tapajós, onde o consumo de peixes é frequente e o metil-mercúrio (MeHg) contido nos peixes é o responsável pela exposição dessas pessoas ao metal. O MeHg apresenta efeitos tóxicos relevantes sobre o sistema cardiovascular, e muitos grupos de pesquisa buscam elucidar os mecanismos que expliquem tais efeitos. Alguns estudos apontam uma diminuição significativa na disponibilidade do óxido nítrico (NO) após exposição ao organometal, o que poderia contribuir para uma alteração da fisiologia cardiovascular uma vez que o NO é um modulados desse sistema. O NO é sintetizado pela óxido nítrico sintase endotelial (eNOS) e sua atividade pode ser alterada por vários fatores, dentre eles, os polimorfismos nos genes que codificam essa proteína, são eles: T-786C na região promotora, 27-pb VNTR no intron 4 e Glu298Asp no exon 7. Neste sentido, o presente estudo teve por objetivo avaliar os efeitos dos polimorfismos da eNOS sobre a síntese de NO entre os indivíduos expostos a metilmercúrio. Foram analisadas amostras de sangue de 214 voluntários com idade entre 15 e 84 anos, dos quais 103 homens e 111 mulheres. A concentração de mercúrio no sangue (Hg sangue) total variou de 1,7 a 179,3 µg/L e a concentração plasmática de nitrito variou entre 85,7 e 695,8 M. Foram determinados os valores de pressão arterial sistólica (PAS), pressão arterial diastólica (PAD), índice de massa corporal (IMC) e freqüência cardíaca (FC) de todos os voluntários. A PAS média foi de 119,8 mmHg e a média da PAD foi 71,8 mmHg. O IMC médio foi de 24,5 Kg/m2 e a FC média foi 70,4 batimentos por minuto (bpm). Não foram observadas diferenças entre os grupos, segundo genótipos dos três polimorfismos, quanto às características dos voluntários: idade, PAS, PAD, IMC, FC, Hg sangue e as concentrações plasmáticas de nitrito. Quando os polimorfismos foram estudados isoladamente foi observado que o alelo C na região promotora, o alelo 4b no intron 4 e o alelo Glu no exon 7 apresentaram-se associados a concentrações reduzidas e nitrito plasmático. Quando a população foi estratificada com base na concentração de Hg essa associação desapareceu, provavelmente mascarada pelas altas concentrações do metal. Entretanto quando foram estudados os haplótipos pode ser observada novamente a associação desses mesmos alelos com a diminuição da concentração do nitrito, confirmando os achados iniciais. O haplótipo mais frequente na população combina os alelos selvagens para todos os polimorfismos (T, 4b e G) e o haplótipo menos freqüente combina os alelos variantes. O haplótipo associado à menor concentração plasmática de nitrito combina os alelos selvagens (C, 4b e G), confirmando os primeiros resultados. Essa abordagem haplotípica é muito útil na observação de efeitos mais discretos uma vez que é possível observar os efeitos dos três polimorfismos agindo simultaneamente sobre uma variável, nesse caso o óxido nítrico. O presente estudo sugere que os fatores genéticos exercem grande influência sobre a produção e biodisponibilidade de NO e que esses fatores combinados com a exposição ambiental ao Hg podem agir de maneira sinérgica, aumentando a suscetibilidade aos efeitos cardiotóxicos do metal através da modulação da atividade da eNOS. / The mercury (Hg) exposure has been target of toxicological studies due the high potential of damage to human health. In the Amazon region the first studies reported the occupational exposure due the use in gold mining, however, recently become relevant the studies about the environment exposure due the fish intake in the riparian population. Several studies have been concentrated in the riparian community in the Tapajós river region, where the fish consumption is frequent and the methylmercury content in fish is responsible to exposure of this people. The MeHg presents toxic effects in the cardiovascular system and many researches groups try to elucidate the mechanisms that explain this effects. Some studies report a significant reducing in nitric oxide (NO) production after the Hg exposure, which could contribute to an altered physiology of the cardiovascular system, once the NO is a modulating factor of this system. The NO is produced by the endothelial nitric oxide synthase (eNOS) and its activity can be altered by many factors like polymorphisms in gene that codify this protein, among this: : T-786C in the promoter region, 27-pb VNTR in intron 4 and Glu298Asp in exon 7. In this regard, the present study mean to evaluate the effects of the eNOS polymorphisms over the NO synthesis among the Hg exposed subjects. In this work, the whole blood samples of 214 volunteers were analyzed for determination of Hg concentration, nitrite plasma concentration and genotyping. The age of the volunteers varied between 15 and 84 years old, including 103 men and 111 women. The blood mercury concentration varied between 1.7 and 179.3 µg/L and the nitrite plasma concentration varied between 85.7 and 695.8 M. Was determinate the systolic arterial pressure (SAP), diastolic arterial pressure (DAP), body mass index (BMI) and heart rate (HR). The SAP mean was 119.8 mmHg and the DAP mean was 71.8 mmHg. The BMI mean was 24.5 Kg/m2 and the HR mean was 70.4 beats per minute. There was no difference among the groups of the three polymorphisms according the volunteers characteristics: age, DAP, SAP, BMI, HR, blood Hg concentration and nitrite plasma concentration. When the polymorphisms were observed separately the reduced nitrite plasma concentration was associated with the presence of the alleles: C in promoter region, 4b in intron 4 and G in exon 7, however there is lack of association when the volunteers were grouped according the blood Hg concentration, probably due a mask effect of the high Hg concentration. When these three polymorphisms were observed simultaneously, in analysis of the haplotypes, the association between the same alleles and the nitrite plasma concentration was observed again, confirming the initial findings. The commonest haplotype in the volunteers combine the alleles of the three polymorphisms (T, 4b and G) and the less frequent haplotype combine the three variants alleles. There was an association between the haplotype C, 4b and G and reduced nitrite plasma concentration, according the result of the polymorphisms separately. The haplotype analysis is too interesting to observe discrete effects, once is possible to analyze the effects of the three polymorphisms acting simultaneously above one variable, in this case, nitric oxide production. The present study suggest that genetic factors could exert a relevant influence above the NO production and bioavailability and that this factors combined with environmental Hg exposure can acting synergic, increasing the susceptibility to Hg cardiovascular effects, through the modulation of the eNOS activity.