O καρκίνος του μαστού αποτελεί την δεύτερη πιο συχνή μορφή καρκίνου που απαντάται και στα δύο φύλα ενώ είναι συνιστά την πιο συχνά εμφανιζόμενη μορφή καρκίνου στις γυναίκες καθώς και την πρώτη αιτία θανάτου στο γυναικείο φύλο. Η γενετική ανάλυση του κληρονομικού καρκίνου έχει ενταχθεί τα τελευταία χρόνια και αποτελεί σημαντικό μέρος της κλινικής πράξης, καθώς όλο και περισσότεροι ασθενείς ελέγχονται για την ύπαρξη γαμετικών μεταλλάξεων στα υψηλής διεισδυτικότητας γονίδια BRCA1 και BRCA2. Προκειμένου να μελετήσουμε την συνεισφορά των γονιδίων BRCA1 και BRCA2 στην εμφάνιση καρκίνου μαστού στον ελληνικό πληθυσμό εξετάστηκαν 200 άτομα που παρουσίαζαν σημαντικό ατομικό ή/και οικογενειακό ιστορικό καρκίνου του μαστού ή/και των ωοθηκών. Έτσι, στην περίπτωση του γονίδιου BRCA1 βρέθηκαν 13 διαφορετικές παθογόνοι μεταλλάξεις σε 29 από τις ασθενείς (14.5%) ενώ για το γονίδιο BRCA2 αναλύθηκαν συνολικά 156 ασθενείς (155 γυναίκες και 1 άνδρας) και μεταλλάξεις ανιχνεύθηκαν σε 8 γυναίκες (5.2%) και 1 άνδρα (100%). Παράλληλα έγινε προσπάθεια χαρακτηρισμού του φάσματος μεταλλάξεων του μετρίου διεισδυτικότητας γονιδίου RAD51C σε ελληνικές οικογένειες. Η ανάλυση αυτή πραγματοποιήθηκε σε 87 ασθενείς όμως δεν ανιχνεύθηκε κάποια παθογόνος μετάλλαξη σε κάποιον ασθενή. Επιπρόσθετα, πραγματοποιήθηκε η ανίχνευση μεγάλων γονιδιακών αναδιατάξεων στα γονίδια BRCA1 και BRCA2 με την βοήθεια τριών τεχνικών ανίχνευσης: την τεχνική της ανίχνευσης γονιδιακών αναδιατάξεων με χρήση διαγνωστικών εκκινητών για τις πιο συχνές γονιδιακές αναδιατάξεις του γονιδίου BRCA1 στον ελληνικό πληθυσμό (δύο απαλειφές του εξωνίου 20, μία απαλειφή των εξονίων 23 και 24 και τέλος μια απαλειφή του εξονίου 24), την τεχνική της πολλαπλής και ποσοτικής αλυσιδωτής αντίδρασης της πολυμεράσης μικρών φθοριζόντων τμημάτων (QMPSF) για το γονίδιο BRCA1 και την τεχνική της πολλαπλής ενίσχυσης τμημάτων DNA μέσω ιχνηθετών (MLPA®) τόσο για το γονίδιο BRCA1 όσο και για το γονίδιο BRCA2. Η τεχνική της ανίχνευσης με την χρήση διαγνωστικών εκκινητών εφαρμόστηκε σε 200 ασθενείς με καρκίνο μαστού ή/και ωοθηκών και ανιχνεύθηκαν 15 ασθενείς που έφεραν κάποια από τις συχνότερες γονιδιακές αναδιατάξεις του γονιδίου BRCA1 (7.5%). Αντίθετα, με την τεχνική του QMPSF και του MLPA δεν ανιχνεύθηκε κάποια γονιδιακή αναδιάταξη στα BRCA1/2 στους συνολικά 24 ασθενείς που εξετάστηκαν. Επιπλέον, στα πλαίσια της παρούσας διατριβής πραγματοποιήθηκε η ανάλυση 403 γυναικών με τριπλά αρνητικό καρκίνο του μαστού ανεξαρτήτως οικογενειακού ιστορικού και ηλικίας εμφάνισης της νόσου. Κατά την ανάλυση αυτή ελέγχθηκαν συγκεκριμένα εξόνια καθώς και γονιδιακές αναδιατάξεις του BRCA1. Μεταλλάξεις ανιχνεύθηκαν σε 65 από τις ασθενείς αυτές (16%). Στα πλαίσια της παρούσας διατριβής πραγματοποιήθηκε ανάλυση απλοτύπου προκειμένου να αποδειχθεί ότι η απαλειφή των εξονίων 23 και 24 αποτελεί ελληνική ιδρυτική μετάλλαξη. Για το σκοπό αυτό αναλύθηκε ο απλότυπος σε 21 οικογένειες που έφεραν την συγκεκριμένη γονιδιακή αναδιάταξη με την βοήθεια της τεχνικής των πολυμορφικών δεικτών επαναλήψεων μικροδορυφορικού DNA. Η ανάλυση απλοτύπου κατέδειξε ότι 8 από 10 γενετικούς τόπους είναι κοινοί μεταξύ των ατόμων που φέρουν την απαλοιφή επιβεβαιώνοντας έτσι την υπόθεση ότι η απαλειφή αυτή αποτελεί ιδρυτική μετάλλαξη του ελληνικού πληθυσμού. Ακολούθως, μελετήθηκε η συνεισφορά και άλλων γονιδίων στην προδιάθεση για καρκίνο μαστού και ωοθηκών και πραγματοποιήθηκε ανάλυση 21 γονιδίων (BRCA1, BRCA2, CHEK2, PALB2, BRIP1, TP53, PTEN, STK11, CDH1, ATM, BARD1, MLH1, MRE11, MSH2, MSH6, MUTYH, NBN, PMS1, PMS2, RAD50, RAD51C) με την χρήση τεχνολογίας αλληλούχισης επόμενης γενεάς. Για το σκοπό αυτό αναλύθηκαν 42 ασθενείς με σοβαρό ιστορικό καρκίνο μαστού ή/και ωοθηκών, οι οποίες είχαν βρεθεί αρνητικές για μεταλλάξεις στα γονίδια BRCA1 & 2. Κατά την ανάλυση αυτή βρέθηκαν μεταλλάξεις σε 11 ασθενείς (26.2%). Ακόμα, πραγματοποιήθηκε εξομική αλληλούχιση σε μια ασθενή, η οποία παρουσίαζε βαρύτατο ατομικό και οικογενειακό ιστορικό και είχε βρεθεί αρνητική για μεταλλάξεις σε 21 γονίδια (BRCA1, BRCA2, CHEK2, PALB2, BRIP1, TP53, PTEN, STK11, CDH1, ATM, BARD1, MLH1, MRE11, MSH2, MSH6, MUTYH, NBN, PMS1, PMS2, RAD50, RAD51C). Η αλληλούχιση αυτή πραγματοποιήθηκε από την εταιρεία BGI. Συνολικά ανιχνεύθηκαν 39.762 πολυμορφισμοί ενός νουκλεοτιδίου (SNPs) και 1,646 μικρές ενθέσεις/απαλειφές (InDels) σε ολόκληρο το γονιδίωμα της ασθενούς. Μετά από ανάλυση των αποτελεσμάτων αυτών καταλήξαμε σε 12 παραλλαγές που αποτελούν ενδεχομένως πιθανά παθογόνα αλληλόμορφα. / Breast cancer is the second most common cancer in both sexes while it is the most frequent cancer as well as the first cause of death in women. The genetic testing of hereditary cancer is part of the everyday clinic as the number of patients that is checked for germline mutation in BRCA1 and BRCA2 is continuously increasing. In order to study the contribution of the high penetrance genes BRCA1 and BRCA2 in breast cancer in Greece 200 patients with severe history of breast and/or ovarian cancer were screened. In BRCA1 13 different pathogenic mutations were found in 29 patients (14.5%) while in BRCA2 156 patients were screened (155 female and 1 male) and pathogenic mutations were identified in 8 female (5.2%) and 1 male patients (100%). At the same time, we tried to characterize the mutation spectrum of the medium penetrance gene RAD51C in Greek families. For this purpose, we screened 87 patients but no mutations was found. In addition, the identification of large genomic rearrangements in both genes took place, using three methods: diagnostic primers were used in order to identify the 4 most common BRCA1 genomic rearrangements in Greece (two deletions in exon 20, one deletion of exons 23 and 24 and one in exon 24), the QMPSF method for the BRCA1 genomic rearrangements (Quantitative Multiplex PCR of Short Fluorescent fragments) and the MLPA method for both BRCA1 and BRCA2 genomic rearrangements (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification). With the first technique 200 patients with breast and/or ovarian cancer were analyzed and 15 of them were found to carry one of the most frequent BRCA1 genomic rearrangements. In the contrary, no large genomic rearrangements in neither gene was identified among the 24 patients who were screened using the two latter methods (QMPSF and MLPA). Also, we have screened 403 triple negative female patients who were diagnosed with triple-negative invasive breast cancer, independently of their age or family history, for germline BRCA1 mutations in exons where a mutation have previously been found in Greek population including the genomic rearrangements. Mutation were identified in 65 patients (16%). In this study we used haplotype analysis in order to demonstrate that the BRCA1 deletion of exons 23 and 24 constitutes a Greek founder mutation. For this purpose, we performed haplotype analysis in 21 Greek families who carry this specific genomic rearrangement using the DNA Microsatellite Repeats analysis. The haplotype analysis showed that 8 out of 10 genetic regions are common among people that carry this deletion confirming that the deletion is a Greek founder mutation. We also studied the contribution of other genes in breast/ovarian cancer predisposition by studying 21 genes (BRCA1, BRCA2, CHEK2, PALB2, BRIP1, TP53, PTEN, STK11, CDH1, ATM, BARD1, MLH1, MRE11, MSH2, MSH6, MUTYH, NBN, PMS1, PMS2, RAD50, RAD51C) using next generation sequencing techniques. We examined 42 patients with severe breast and/or ovarian cancer history that were found negative for BRCA1/2 mutations. In this analysis pathogenic mutation were found in 11 patients (26.2%). At last, exome sequencing was performed in a female patient who had severe family history and was found negative for germline mutations in 21 genes (BRCA1, BRCA2, CHEK2, PALB2, BRIP1, TP53, PTEN, STK11, CDH1, ATM, BARD1, MLH1, MRE11, MSH2, MSH6, MUTYH, NBN, PMS1, PMS2, RAD50, RAD51C). The sequencing was carried out by Beijing Genomics Institute (BGI). In total, were identified 39.762 singe nucleotide polymorphisms (SNPs) and 1.646 insertions - deletions (InDels) in the patient's exome. After the result analysis we concluded in 12 variants that could constitute possible pathogenic alleles.

Ο καρκίνος του μαστού αποτελεί μία από τις συχνότερα εμφανιζόμενες μορφές καρκίνου παγκοσμίως και είναι η πρώτη σε αριθμό κρουσμάτων στο γυναικείο πληθυσμό. Υπολογίζεται ότι στην Ελλάδα κάθε χρόνο προσβάλλονται από καρκίνο του μαστού 4500 γυναίκες και χάνουν τη ζωή τους 1500, ενώ υπολογίζεται ότι 1 στις 8 γυναίκες παγκοσμίως θα παρουσιάσει καρκίνο μαστού σε κάποια φάση της ζωής της. Είναι ενδιαφέρον ότι, στην Ευρώπη, το 60% των κρουσμάτων καρκίνου του μαστού διαγιγνώσκεται σε πρώιμο στάδιο – ποσοστό που στην Ελλάδα μόλις και μετά βίας εγγίζει το 5%. Τα στοιχεία αυτά καταδεικνύουν πόσο ελλιπής είναι η σχετική ενημέρωση μεταξύ των Ελληνίδων, γεγονός εξαιρετικά λυπηρό, αν λάβουμε υπόψη τις δυνατότητες πλήρους ίασης που παρέχει μία έγκαιρη διάγνωση. Τα ποσοστά θανάτου από καρκίνο του μαστού χαρακτηρίζονται από πτωτική τάση από τις αρχές του 1990, με τις μεγαλύτερες μειώσεις να εντοπίζονται στις γυναίκες κάτω των 50. Οι ερευνητές αποδίδουν την πτώση αυτή στην έγκαιρη διάγνωση μέσω μαστογραφιών καθώς και στις βελτιώσεις που έχουν επέλθει στις σχετικές θεραπευτικές αγωγές. Ο αριθμός των ατόμων που έχουν αντιμετωπίσει με επιτυχία τον καρκίνο του μαστού αυξάνεται συνεχώς - από τον Ιανουάριο του 2006, υπήρξαν περίπου 2,5 εκατομμύρια γυναίκες στις ΗΠΑ που, βάσει της έκθεσης, έχουν ξεπεράσει με επιτυχία την περιπέτεια του καρκίνου του μαστού. Το κλειδί για την επιτυχή καταπολέμηση του καρκίνου του μαστού είναι η πρώιμη ανίχνευση. Ο έγκαιρος εντοπισμός επιτυγχάνεται με διάφορες διαγνωστικές τεχνικές όπως η μαστογραφία, το σπινθηρογράφημα, το υπερηχογράφημα κ.α. Στη διπλωματική αυτή εργασία γίνεται προσπάθεια περιγραφής μια πειραματικής τεχνικής που βασίζεται στη θερμοκρασία της επιφάνειας του μαστού και που έχει ως σκοπό να λειτουργήσει συμπληρωματικά στις υπόλοιπες διαγνωστικές μεθόδους. / The breast cancer is one of the most common kinds of cancer worldwide and the first in incidence counts among women. It is estimated that 4500 women in Greece are diagnosed with breast cancer every year and 1500 die from breast cancer, while about 1 in 8 women worldwide will develop invasive breast cancer over the course of her lifetime. It is interesting that in Europe the 60% of the breast cancer incidence counts is diagnosed in an early stage, while in Greece this percentage barely reaches the 5%. These data reveal how deficient the decreased awareness among Greek women, which is really sad considering the chances for a full recovery in case of early detection. Breast cancer death rates began decreasing since 1990, with larger decreases in women under 50. These decreases are thought to be the result of treatment advances, earlier detection through screening, and increased awareness. The amount of people that have survived breast cancer is constantly increasing. Since January of 2006, more than 2,5 million women in the United States have been treated for breast cancer. The key for the successful prevention and treatment of breast cancer is the early detection. The early detection is achieved with various diagnostic screening techniques such as mammography, scintigraph, ultrasound etc. In this diploma thesis an experimental method which is based on breast surface temperature is being described and its purpose is to work supplementary with the rest of methods.

Να διερευνηθεί η επίδρασης μίας τροποποιημένης τεχνικής ριζικής προστατεκτομής, με διατήρηση της ουρήθρας μέχρι το επίπεδο του σπερματικού λοφιδίου, στα μετεγχειρητικά ογκολογικά και λειτουργικά αποτελέσματα. Ασθενείς και μέθοδοι: Στην προοπτική αυτή μελέτη, 360 ασθενείς που υποβλήθηκαν σε ανοικτή οπισθοηβική ριζική προστατεκτομή από τον Ιανουάριο του 2008 μέχρι τον Απρίλιο του 2012 χωρίστηκαν σε δύο ομάδες. Στους ασθενείς της ομάδας Α πραγματοποιήθηκε η κλασσική ριζική προστατεκτομή ενώ οι ασθενείς της ομάδας Β υποβλήθηκαν στην τροποποιημένη χειρουργική επέμβαση. Τα ογκολογικά αποτελέσματα αξιολογήθηκαν με την παρακολούθηση του PSA και τον έλεγχο βιοχημικής υποτροπής καθώς και με την ύπαρξη θετικών χειρουργικών ορίων. Η μετεγχειρητική ακράτεια εκτιμήθηκε με τον αριθμό πανών/ημέρα καθώς και με τη συμπλήρωση των ερωτηματολογίων ICIQ-SF και IIQ-SF. Η μετεγχειρητική στυτική δυσλειτουργία εκτιμήθηκε με τη συμπλήρωση των ερωτηματολογίων IIEF και SEAR. Επίσης καταγράφηκε και αναλύθηκε η επίδραση της χειρουργικής τροποποίησης στην εμφάνιση μετεγχειρητικών συμπτωμάτων αποθήκευσης των ούρων. Αποτελέσματα: Ογδόντα πέντε ασθενείς εξαιρέθηκαν από τη μελέτη. Από τους 244 ασθενείς που πληρώσουν τα κριτήρια εισόδου, στην ομάδα Α και Β συμπεριλήφθηκαν 115 (47,1%) και 129 (52,9%) ασθενείς, αντίστοιχα. Δεν παρατηρήθηκαν στατιστικά σημαντικές διαφορές στα ποσοστά εμφάνισης θετικών χειρουργικών ορίων (p=0,562) και βιοχημικής υποτροπής (p=0,321). Παρατηρήθηκαν σημαντικά υψηλότερα ποσοστά ακράτειας (p=0,026), επιτακτικότητας (p<0,001) και νυκτουρίας (p<0,001) στους ασθενείς της ομάδας Α στον 1ο μήνα μετεγχειρητικά. Επίσης, υπήρξε στατιστικά σημαντική διαφορά στον αριθμό πανών/ημέρα υπέρ της ομάδας Β στον 1ο (p=0,037), 3ο (p=0,003) και 6ο (p=0,032) μήνα μετά το χειρουργείο. Η διαφορά αυτή, ωστόσο, εξαλείφθηκε στους 12 μήνες μετεγχειρητικά. Παρόμοια αποτελέσματα παρατηρήθηκαν με τις βαθμολογίες των ερωτηματολογίων ICIQ-SF και IIQ-SF, αναδεικνύοντας βελτιωμένα αποτελέσματα στους ασθενείς της ομάδας Β για τους πρώτους 6 μήνες. Δεν παρατηρήθηκαν διαφορές στα ποσοστά εμφάνισης μετεγχειρητικής στυτικής δυσλειτουργίας καθώς και στις βαθμολογίες των ερωτηματολογίων IIEF και SEAR. Συμπεράσματα: Η τροποποιημένη χειρουργική τεχνική με διατήρηση της ουρήθρας μέχρι το επίπεδο του σπερματικού λοφιδίου αποτελεί μία νέα τροποποίηση της κλασσικής τεχνικής, η οποία μπορεί να μειώσει το χρόνο ανάκτησης της εγκράτειας των ούρων σε ασθενείς που υποβάλλονται σε ριζική προστατεκτομή, χωρίς να μειώνει το ογκολογικό αποτέλεσμα και την πρόγνωση της νόσου. / To investigate the effect of a modified surgical technique of open retropubic radical prostatectomy, with preservation of maximal urethral length to the level of verumontanum, in postoperative oncological and functional outcomes. Patients and methods: In this study, 360 patients who underwent open retropubic radical prostatectomy from January 2008 until April 2012 were divided into two groups. Patients of group A underwent the classical procedure of radical prostatectomy as it has been described by Walsh and Donker, while patients of group B underwent the modified technique. The oncological outcomes were evaluated by monitoring PSA value for biochemical failure and by recording the incidence of positive surgical margins. Postoperative incontinence was evaluated by the number of pads/day and through ICIQ-SF and IIQ-SF questionnaires. Postoperative erectile dysfunction was assessed by completing IIEF and SEAR questionnaires. We also recorded and analyzed the effect of the surgical modification in postoperative irritative urinary symptoms. Results: Eighty five patients were excluded from the study. Of the 244 patients who fulfill the inclusion criteria, 115 (47.1%) and 129 (52.9%) patients were included in group A and B, respectively. There was no statistically significant difference in the incidence rates of positive surgical margins (p=0.562) and biochemical recurrence (p=0.321) between the groups. There were significantly higher rates of incontinence (p=0.026), urgency (p<0.001) and nocturia (p<0.001) in patients of group A within the first postoperative month. There was also statistically significant difference in the number of pads/day in favor of group B in 1st (p=0.037), 3rd (p=0.003) and 6th (p=0.032) month after the operation. However, this difference disappeared at 12 months postoperatively. Similar results were observed in the scores of ICIQ-SF and IIQ-SF questionnaires, demonstrating improved outcomes in patients of group B within the first 6 months. There were no differences in the incidence rates of postoperative erectile dysfunction and in the scores of IIEF and SEAR questionnaires, as well. Conclusions: We proposed a modified surgical technique with preservation of maximal urethral length until the anatomical landmark of verumontanum. This technique may reduce the time continence recovery in patients undergoing radical prostatectomy, without compromising the oncological outcome and disease prognosis.

Η ανάγκη εξατομίκευσης της θεραπείας ασθενών που πάσχουν από καρκίνο κρίνεται επιτακτική, λόγω του στενού θεραπευτικού εύρους των αντινεοπλασματικών φαρμάκων και των παρατηρούμενων δια-ατομικών διαφορών στη φαρμακοκινητική και στην κλινική ανταπόκριση. Ένα πολύ χρήσιμο εργαλείο στην εξατομίκευση της θεραπείας θεωρείται ότι είναι η πληθυσμιακή φαρμακοκινητική-φαρμακοδυναμική μοντελοποίηση, καθώς μπορεί να περιγράψει τις σχέσεις δόσης-ανταπόκρισης, να εξηγήσει την παρατηρούμενη μεταβλητότητα στην έκθεση στο φάρμακο ή στην κλινική ανταπόκριση και να καθοδηγήσει την επιλογή της δόσης βάσει της βέλτιστης αναλογίας οφέλους-κινδύνου για τη δεδομένη θεραπεία. Η παρούσα διδακτορική διατριβή επικεντρώθηκε στην μπεβασιζουμάμπη, ένα σχετικά καινούριο φάρμακο στοχευμένης θεραπείας για το οποίο δεν υπάρχουν αρκετά διαθέσιμα στοιχεία που αφορούν στη φαρμακοκινητική και φαρμακοδυναμική συμπεριφορά του. Σκοπός της συγκεκριμένης μελέτης ήταν ο χαρακτηρισμός της αλληλεπίδρασης της μπεβασιζουμάμπης με τον μοριακό της στόχο, VEGF165, σε ενήλικες ασθενείς με μεταστατικό ορθοκολικό καρκίνο που λαμβάνουν το φάρμακο σε συνδυασμό με χημειοθεραπεία (FOLFIRI, FOLFOX ή CAPIRI). Για αυτόν τον λόγο, προσδιορίστηκαν αρχικά οι συγκεντρώσεις της ολικής μπεβασιζουμάμπης και του ελεύθερου VEGF165 σε διάφορους κύκλους θεραπείας και στη συνέχεια, εφαρμόζοντας τη μη γραμμική μικτών επιδράσεων μοντελοποίηση με το υπολογιστικό πρόγραμμα NONMEM 7.3, αναπτύχθηκε ένα φαρμακοκινητικό μοντέλο σύνδεσης της μπεβασιζουμάμπης με τον VEGF165. Επιπλέον, διερευνήθηκε η επίδραση των δημογραφικών δεδομένων και των VEGF μονονουκλεοτιδικών πολυμορφισμών στην αλληλεπίδραση μεταξύ της φαρμακοκινητικής της μπεβασιζουμάμπης και των συγκεντρώσεων του VEGF165. Είναι η πρώτη φορά που χρησιμοποιήθηκε η TMDD προσέγγιση για τον χαρακτηρισμό της in vivo αλληλεπίδρασης μπεβασιζουμάμπης-VEGF165. Σύμφωνα με αυτή την προσέγγιση, η φαρμακοκινητική ενός φαρμάκου επηρεάζεται από την υψηλής συγγένειας δέσμευση με τον μοριακό του στόχο και την επακόλουθη αποικοδόμηση του σχηματιζόμενου συμπλόκου μέσω ενδοκυττάρωσης. Το αναπτυχθέν μοντέλο επέτρεψε την ικανοποιητική περιγραφή της φαρμακοκινητικής της μπεβασιζουμάμπης και των ιδιοτήτων σύνδεσής της με τον VEGF165. Η κάθαρση της μπεβασιζουμάμπης βρέθηκε να είναι 0.18 L/day, η τιμή αναφοράς της συγκέντρωσης του ελεύθερου VEGF165 ήταν 212 ng/L, η σταθερά του ρυθμού απομάκρυνσης του ελεύθερου VEGF165 ήταν 0.401 day-1 και η Kss ήταν 267 nM. Η επίδραση του πραγματικού σωματικού βάρους συνυπολογίστηκε στην εκτίμηση όλων των φαρμακοκινητικών παραμέτρων του μοντέλου. Κάποιες στατιστικά μη σημαντικές συσχετίσεις παρατηρήθηκαν μεταξύ της συγγένειας δέσμευσης του φαρμάκου και των VEGF-2578C/A και VEGF-634G/C πολυμορφισμών. Το αναπτυχθέν μοντέλο θα μπορούσε να αποτελέσει ένα χρήσιμο εργαλείο στην εξατομίκευση της θεραπείας και στην αξιολόγηση της κλινικής ανταπόκρισης ασθενών που λαμβάνουν μπεβασιζουμάμπη σε συνδυασμό με χημειοθεραπεία. / The need for individualized treatment in cancer patients is considered crucial due to the narrow therapeutic range of antineoplastic drugs and the observed inter-individual differences in pharmacokinetics and clinical response. Population pharmacokinetic-pharmacodynamic modeling has been recognized as a beneficial tool for personalizing treatment, as it can describe the dose-response relationships, explain the observed variability in drug exposure or response and guide dose selection based on the optimal benefit-risk ratio for a given treatment. The current doctoral thesis was focused on bevacizumab, a relatively new targeted therapy drug for which no sufficient data are available regarding its pharmacokinetic and pharmacodynamic behavior. The aim of the present study was to characterize the interaction of bevacizumab with its molecular target, VEGF165, in adult patients with metastatic colorectal cancer who receive the drug in combination with chemotherapy (FOLFIRI, FOLFOX or CAPIRI). For this reason, the concentrations of total bevacizumab and free VEGF165 were first determined in different cycles of treatment and then, a pharmacokinetic model for bevacizumab binding to VEGF165 was developed by using nonlinear mixed-effects modeling implemented in NONMEM 7.3 software. Moreover, the effect of demographic data and VEGF single nucleotide polymorphisms on the interplay between bevacizumab pharmacokinetics and VEGF165 concen-trations was investigated. This is the first time the TMDD approach was applied to characterize the in vivo bevacizumab-VEGF165 interaction. According to this approach, the pharmacokinetics of a drug is affected by its high affinity binding to its molecular target and subsequent degradation of the formed complex via endocytosis. The developed model allowed an adequate description of bevacizumab pharmacokinetics and its binding properties to VEGF165. Bevacizumab clearance was found to be 0.18 L/day, the free VEGF165 concentration at baseline was 212 ng/L, the elimination rate constant of free VEGF165 was 0.401 day-1, and Kss was 267 nM. The effect of actual body weight was taken into account in the estimation of all pharmacokinetic model parameters. Correlations, which were not statistically significant, were noticed between the binding affinity of the drug and the VEGF-2578C/A and VEGF-634G/C polymorphisms. The developed model could become a useful tool for individualizing treatment and evaluating clinical response of patients receiving bevacizumab in combination with chemotherapy.

Με σκοπό να διερευνήσουμε τους μηχανισμούς επαγωγής απόπτωσης από την TRAIL και την επιλεκτικότητα την οποία δείχνει απέναντι στα καρκινικά κύτταρα, χρησιμοποιήσαμε κυτταρικές σειρές, προερχόμενες από το παχύ έντερο ανθρώπου, οι οποίες αντιπροσωπεύουν τα διάφορα στάδια της καρκινογένεσης, από το πρώιμο αδένωμα στο καρκίνωμα. Παρατηρήθηκε μια ανθεκτικότητα των πρώιμων αδενωμάτων απέναντι στην TRAIL σε αντίθεση με τα κύτταρα που προέρχονται από καρκίνους προχωρημένου σταδίου, ενώ σημαντικό ρόλο φαίνεται να παίζει, εκτός από το στάδιο καρκινογένεσης και η ύπαρξη ορισμένων ογκογονιδίων στον καθορισμό της ευαισθησίας των κυττάρων απέναντι στην TRAIL. Συγκεκριμένα, οι διάφορες ισομορφές του ογκογονιδίου RAS παίζουν ιδιαίτερο ρόλο τόσο όσο αφορά την ανταπόκριση του κύτταρου στην επαγωγή με TRAIL, όσο και στη ρύθμιση των μορίων που εμπλέκονται άμεσα στο μονοπάτι σηματοδότησης του TRAIL. Τα ογκογονίδια RAS παίζουν σημαντικό ρόλο στην καρκινική εξαλλαγή ενεργοποιώντας μια σειρά από μονοπάτια σηματοδότησης που οδηγούν στην ανεξέλεγκτη κυτταρική διαίρεση και στην προστασία από τα αποπτωτικά σήματα. Εντούτοις, η TRAIL (Tumor Necrosis Factor Related Apoptosis Inducing Ligand) έχει τη δυνατότητα να προκαλεί απόπτωση κυρίως στα καρκινικά κύτταρα, ενεργοποιώντας τους υποδοχείς DR4 και DR5 (Death Receptors). Σε αυτή τη μελέτη δείξαμε ότι σε αδενοκαρκινώματα του παχέος εντέρου ανθρώπου η έκφραση των υποδοχέων της TRAIL ρυθμίζεται από την ενεργότητα της κινάσης MEK (MAPK/ERK Kinase). Η ευαισθησία στην TRAIL των κυτταρικών σειρών που χρησιμοποιήσαμε φάνηκε να συσχετίζεται με το βαθμό κακοήθους εξαλλαγής. Συγκεκριμένα, οι κυτταρικές σειρές AAC1 και RGC2, που προέρχονται απο πρώιμα αδενώματα και η κυτταρική σειρά Caco2, που προέρχεται απο μέσο αδένωμα παρουσίασαν μεγάλη ανθεκτικότητα στην TRAIL. Αντίθετα, οι κυτταρικές σειρές DLD-1 και HT-29, που προέρχονται απο αδενοκαρκινώματα προχωρημένου στάδιου ήταν ευαίσθητες στην TRAIL. Επιλέχθηκε η κυτταρική σειρά Caco2 η οποία είναι ανθεκτική στην TRAIL και οι δύο κυτταρικές σειρές που προέρχονται από προχωρημένα αδενοκαρκινώματα για να εξεταστεί η έκφραση σημαντικών μορίων για την αποπτωτική σηματοδότηση από την TRAIL. Φάνηκε μια αντιστοιχία της έκφρασης των υποδοχέων DR4 και DR5 με την ευαισθησία των κυττάρων στην TRAIL, ενώ τα επίπεδα έκφρασης των FADD, κασπάση 8, κασπάση 3 και FLIP δεν παρουσίασαν παρόμοια αντιστοιχία. Επιπλέον, παρατηρήθηκε παρατεταμένη ενεργοποίηση των κινασών MEK, ERK, JNK1/2 και p38 μετά από επαγωγή με TRAIL, σε αντίθεση με την αντίστοιχη κινητική ενεργοποίησης των ίδιων κινασών μετά από επαγωγή με ορό. Αντίστοιχη κινητική με αυτή των ΜΕΚ και ERK παρουσίασε η έκφραση του γονιδίου c- FOS μετά από επαγωγή με TRAIL ή ορό. Τα κύτταρα Caco2, DLD-1 και HT- 29 επωάστηκαν με χημικούς αναστολείς των κινασών ΜΕΚ για 16 h και ελέγχθηκε η έκφραση των DR4 και DR5. Τα επίπεδα των DR4 και DR5 μειώθηκαν και στις τρεις κυτταρικές σειρές ως συνέπεια της αναστολής της ΜΕΚ, ενώ η αναστολή των ΜΕΚ δεν επιρρέασε τα επίπεδα των FADD, FLIP, κασπάση 8, κασπάση 3 και τον υποδοχέα FAS που ανήκει στην ίδια οικογένεια με τους DR4 και DR5. Επιπλέον, ελέγχθηκε με ανάλυση FACS η έκφραση των υποδοχέων DR4, DR5 και FAS in vivo σε ζωντανά κύτταρα που προεπωάστηκαν με τον αναστολέα της ΜΕΚ και στους αντίστοιχους μάρτυρες και τα αποτελέσματα ήταν αντίστοιχα με αυτά των in vitro πειραμάτων. Οι παραπάνω παρατηρήσεις αποτελούν ισχυρές ενδείξεις για το συσχετισμό της ενεργοποίησης της οδού MEK/ERK/FOS με με την έκφραση των υποδοχέων DR4 και DR5 και με την ευαισθησία των κυττάρων στην TRAIL, καθώς κύτταρα HT-29 που προεπωάστηκαν με τον αναστολέα των ΜΕΚ παρουσίσαν μειωμένη ευαισθησία στην TRAIL. Για τον προσδιορισμό των διακριτών επιδράσεων των ογκογονιδίων RAS στον καρκίνο του παχέος εντέρου, διαμολύνθηκαν κύτταρα που προέρχονται από μέσο αδένωμα του παχέος εντέρου (Caco2) με τα ογκογονίδια Ki- και Ha-RAS. Μετά από εξέταση πολλών διαφορετικών κλώνων επιλέχθηκαν για λεπτομερέστερη ανάλυση κλώνοι οι οποίοι δεν υπερεκφράζουν την RAS σε πρωτεϊνικό επίπεδο πάνω από 3 φορές σε σχέση με την ενδογενή RAS των μητρικών κυττάρων. Επιπλέον, ελέγχθηκε αν οι κλώνοι που υπερεκφράζουν τις ογκογόνες RAS παρουσιάζουν αυξημένη σηματοδότηση προς μονοπάτια κυτταρικής σηματοδότησης που είναι γνωστό οτι ενεργοποιούνται από τις RAS. Τόσο οι κλώνοι Ki-RAS, όσο και οι Ha-RAS, έδειξαν να ενεργοποιούν τα μονοπάτια σηματοδότησης RAF/MEK/ERK και PI3K/AKT με τους Ha-RAS να προκαλούν ισχυρότερη ενεργοποίηση. Σχεδιάστηκαν πειράματα για τον καθορισμό του βαθμού της in vitro και in vivo κακοήθους εξαλλαγής. Τα πειράματα σε μαλακό άγαρ δείχνουν την αποτελεσματικότητα των καρκινικών κυττάρων να αναπτύσσονται δημιουργώντας αποικίες χωρίς να προσκολλώνται σε επιφάνεια. Οι δυο ισομορφές της RAS αύξησαν σημαντικά την ιδιότητα των Caco2 να σχηματίζουν αποικίες σε μαλακό άγαρ, ενώ η Ha-RAS παρουσίασε τη μεγαλύτερη ικανότητα. Για τον προσδιορισμό του βαθμού κακοήθους εξαλλαγής των κλώνων in vivo έγινε υποδόριος εμβολιασμός με περίπου 106 κύτταρα από τον κάθε κλώνο σε ποντίκια SCID. Τόσο η Κi-RASV12 όσο και η Ha-RASV12 αύξησαν την ικανότητα των Caco2 να σχηματίζουν όγκους σε ποντίκια SCID με την Ha-RAS να προκαλεί τον σχηματισμό περισσότερων και μεγαλύτερων όγκων. Για την περαιτέρω κατανόηση των μηχανισμών εξαλλαγής των κυττάρων από τα ογκογονίδια RAS αξιολογήθηκαν αποτελέσματα από ανάλυση γονιδιακών μικροσυστοιχιών. Μετά από ανάλυση του γονιδιακού προφίλ των CACO-RAS κλώνων και τα δυο ογκογονίδια βρέθηκαν να επάγουν την έκφραση γονιδίων που εμπλέκονται στην αγγειογένεση και στην προώθηση του καρκίνου, όπως τα γονίδια που κωδικοποιούν τους υποδοχείς VEGF και TGFβ. Σημειώνεται ότι μεταστατικοί δείκτες, όπως η Vimentin, που είναι και δείκτης της μετάβασης από επιθηλιακό σε μεσεγχυματικό φαινότυπο, βρέθηκαν να υπερεκφράζονται μόνο στους κλώνους Ha-RASV12. Ο in vitro και in vivo χαρακτηρισμός εξαλλαγμένων κυττάρων από τα ογκογονίδια RAS, καθώς και η ανάλυση μικροσυστοιχειών γονιδίων έδειξε ότι στο κυτταρικό μοντέλο που χρησιμοποιήθηκε το ογκογονίδιο Ha-RAS έχει αυξημένες εξαλλακτικές ιδιότητες. Τα ογκογονίδια RAS αύξησαν το βαθμό κακοήθους εξαλλαγής των κυττάρων Caco2 και ελέγχθηκε αν αυτό συνοδεύεται από αυξημένη ευαισθησία των κλώνων CACO2-RAS στην TRAIL. Μετρήθηκε η βιωσημότητα των κλώνων CACO2-RAS μετά από επαγώγη με TRAIL και φάνηκε ότι και τα δύο ογκογονίδια αύξησαν την ανταποκρισιμότητα των κυττάρων Caco2 στην TRAIL. Τα Caco2 που εξαλλάχθηκαν με την Ki- RASV12 ήταν λιγότερο ευαίσθητα στην TRAIL από ότι αυτά με τη Ha- RASV12 σε όλους τους κλώνους που ελέγχθηκαν. Ο έλεγχος της έκφρασης σημαντικών παραγόντων για την απόπτωση από την TRAIL έδειξε ότι οι πρωτεΐνες που παρουσίασαν τις μεγαλύτερες διαφοροποιήσεις στους κλώνους που υπερεκφράζουν τις RAS, σε σχέση με τα κύτταρα μάρτυρα, ήταν οι υποδοχείς DR4 και DR5. Παρόλο που οι κλώνοι Ha-RAS παρουσίασαν μεγαλύτερη ευαισθησία στην TRAIL, τα επίπεδα έκφρασης των DR4 και DR5 ήταν παρόμοια μεταξύ των κλώνων Ki-RAS και Ha-RAS. Για να ελεγχθεί κατά πόσο το μονοπάτι σηματοδότησης MEK/ERK παίζει ρόλο στην υπερέκφραση των υποδοχέων από τα ογκογονίδια RAS χρησιμοποιήθηκαν χημικοί αναστολείς της ΜΕΚ και ελέγθηκε η επίδρασή τους στα επίπεδα των DR4 και DR5. H χημική αναστολή της ΜΕΚ προκάλεσε μείωση των επιπέδων των φωσφορυλιωμένων ERK1/2 και των επιπέδων έκφρασης των DR4 και DR5 τόσο στους CACO-Κ15, όσο και στους CACO-Η2. Τέλος, ελέγχθηκε κατά πόσο η μείωση των DR4 και DR5 από την χημική αναστολή των ΜΕΚ μπορέι να έχει επίδραση στη δράση της TRAIL απέναντι στους κλώνους CACO2-RAS και βρέθηκε ότι προεπώση των Ha-RASV12 κλώνων για 16 h με χημικό αναστολέα των ΜΕΚ μέιωσε σημαντικά την ευαισθησία τους στην TRAIL. / In order to study the mechanism by which TRAIL (Tumor Necrosis Factor Related Apoptosis Inducing Ligand) induces apoptosis almost exclusively to cancer cells we used human colon cancer cell lines that represent different stages of carcinogenesis, from early adenoma to carcinoma. It was observed that early adenoma cells were resistant to TRAIL-induced apoptosis. On the contrary, cells that were derived from carcinomas were sensitive; while a correlation of the sensitivity of the cells to TRAIL-induced apoptosis to the presence of certain activated oncogenes was observed. In particular, the various isoforms of RAS oncogenes appear to play an important role in the responsiveness of the cancer cells to TRAIL as well as in regulating specific components which are essential for TRAIL signaling. RAS oncogenes play an important role in oncogenic transformation by activating various signaling pathways that favor tumor growth also by controlling cell division and resistance to apoptotic stimuli. TRAIL, however, has the unique ability to cause apoptosis preferentially to cancer cells by activating DR4 and DR5 receptors. In this study we show that in human colorectal adenocarcinomas cells the expression of DR4 and DR5 is partially regulated by the activity of MEK (MAPK/ERK Kinase). The sensitivity of the cell lines to TRAIL seemed to be correlated with the level of oncogenic transformation of the cells. In particular, the AAC1 and RGC2 cell lines that were derived from early adenomas and the Caco2 cell line that was derived from an intermediate adenoma were very resistant to TRAIL induced apoptosis. On the contrtary, the DLD-1 and HT-29 cell lines, which came from advanced stage carcinomas were sensitive to TRAIL. The Caco2 cell line, which is resistant to TRAIL and the cell lines that derived from advanced stage adenocarcinomas were chosen for expression analysis of important molecules in TRAIL-induced apoptosis. There was a correlation of DR4 and DR5 expression with the sensitivity of the cell lines to TRAIL, while the expression levels of FADD, Caspase 3, Caspase 8 and FLIP did not seem to correlate with TRAIL sensitivity in these cell lines. In addition, it was observed a prolonged activation of MEK, ERK1/2, JNK1/2 and p38 after induction with TRAIL, which did not follow the kinetics of serum-induced activation of ERK1/2. The activation of MEK and ERK1/2 was correlated to the kinetics of c-FOS proto-oncogene expression induced by TRAIL or serum. The expression levels of DR4 and DR5 were analysed after incubation for 16 h of the Caco2, DLD-1 and HT-29 cell lines with MEK inhibitors. There was a decrease of DR4 and DR5 expression levels in response to MEK inhibition, while the expression levels of FADD, Caspase 3, Caspase 8, FLIP and FAS receptor were not affected. Moreover, FACS analysis of living cells showed that MEK inhibition reduces the levels of DR4 and DR5 but not of other receptors of the same family, in vivo. It appears that the activation of the MEK/ERK/FOS axis plays a role in the positive feedback loop of TRAIL its receptors DR4 and DR5. To determine the distinct effects of different RAS oncogenes in cancer cells colon intermediate adenoma cells (Caco2) were chosen for transfection with the Ki- and Ha-RAS oncogenes. Clones that did not express more than 3 times the endogenous levels of RAS proteins were selected for further analysis. In addition it was examined whether the CACO2-RAS clones are able to activate the RAF/MEK/ERK and PI3K/AKT pathways, which are known effectors of RAS proteins. Both RAS isoforms activated these two pathways with the Ha-RASV12 clones presenting better potential in activating both RAF/MEK/ERK and PI3K/AKT pathways. In order to characterize the in vitro and in vivo oncogenic potential the ability of the CACO2-RAS clones to grow in soft agar and to grow tumors in nude mice was examined. The in vitro and in vivo characterization of the Caco2 RASV12-transformed cells showed that the Ha-RAS oncogene has a higher in vitro and in vivo transforming ability relative to the Ki-RAS oncogene in these cells. Results from cDNA microarray analysis were evaluated in order to further understand the mechanisms by which the RAS oncogenes cause oncogenic transformation. Gene expression profile analysis of the CACO2-RAS clones showed that both oncogenes induced expression of genes involved in angiogenesis and tumor promotion such as VEGF and TGFβ. Notably, metastatic markers, such as Vimentin, which is also an epithelial to mesenchymal transition marker, were overexpressed only in the Caco2 cells transformed with the Ha-RAS oncogene. The RAS oncogenes increased the oncogenic potential of the Caco2 cells and it was examined if the increased oncogenic potential correlated with increased sensitivity to TRAIL. Moreover, the examination of the expression levels of molecules important for TRAIL singnaling showed that Ki-RAS as well as Ha-RAS oncogenes can induce DR4 and DR5 expression with similar efficiency. However, in spite of similar induction of DR4 and DR5 by the two RAS oncogenes, the Ki-RAS-transformed cells were less susceptible to TRAIL induced apoptosis. Finally, in order to see whether the increased MEK/ERK activation observed in the CACO-RAS clones played a role in increasing DR4 and DR5 levels the CACO-RAS clones were incubated for 16h in the presence of MEK inhibitors. MEK inhibition resulted in decreased DR4 and DR5 expression levels, as well as decreased sensitivity of the clones to TRAIL induced apoptosis.

- / -

Η παρούσα μελέτη οδηγεί στην εξαγωγή συμπερασμάτων σχετικά με τη δραστικότητα στεροειδών εστέρων της Ν-ακετυλο-μελφαλάνης. Τα στοιχεία που προκύπτουν από την παραπάνω μελέτη δύνανται να συμπληρώσουν και να ενισχύσουν τα ήδη υπάρχοντα δεδομένα για τη συγκεκριμένη κατηγορία ενώσεων αφενός και, αφετέρου, να παρέχουν νέα δεδομένα για την αξιολόγηση και το μελλοντικό σχεδιασμό βελτιωμένων πιθανών στεροειδικών προφαρμάκων του συγκεκριμένου αλκυλιωτικού παραγοντα. Η βιολογική αξιολόγηση των νεοσύστατων ενώσεων περιλαμβάνει, στα πλαίσια της παρούσας εργασίας, την in vitro μελέτη τους όσον αφορά στην ικανότητα επαγωγής της Ανταλλαγής των Αδελφών Χρωματίδων (SCE) και αναστολής του Δείκτη Πολλαπλασιασμού (PRI), ως δείκτες της ενδεχόμενης in vivo αντιλευχαιμικής τους δράσης. Η μέτρηση της Ανταλλαγής των Αδελφών Χρωματίδων αποτελεί μία γρήγορη κι ευαίσθητη μέθοδο για την ανίχνευση παραγόντων που προκαλούν βλάβες στο γενετικό υλικό [210]. Η ικανότητα αποκοπής και επιδιόρθωσης διαφόρων τύπων αλλοιώσεων του DNA είναι μία γενικότερη ιδιότητα των ζωντανών κυττάρων, συμπεριλαμβανομένων και των καρκινικών. Η μη επιδιορθωμένη βλάβη, λοιπόν, εκφρασμένη σαν Ανταλλαγή των Αδελφών Χρωματίδων (SCE) σε φυσιολογικά κύτταρα, που έχει προκληθεί από συγκεκριμένες ενώσεις, υποδεικνύει ανάλογα την αδυναμία καρκινικών κυττάρων ζώντων οργανισμών να επιδιορθώσουν βλάβες που προκαλούνται από τους ίδιους παράγοντες. Η παραπάνω διατύπωση επαληθεύεται από πλήθος μελετών όπου η in vitro επαγωγή των SCEs συσχετίζεται άμεσα και σε περιπτώσεις, ανάλογα με την in vivo αντινεοπλασματική δραστικότητα ενώσεων της κατηγορίας των αλκυλιωτικών παραγόντων και των στεροειδικών εστέρων τους [165,173,174,197]. Αξιολογώντας τα αποτελέσματα της in vitro μελέτης, λοιπόν, διαπιστώνεται καταρχήν η περιορισμένη κυτταροτοξική ικανότητα της Ν-ακετυλο-μελφαλάνης έναντι του μη τροποποιημένου φαρμάκου, που εμφανίζεται περίπου 5 φορές περισσότερο δραστικό όσον αφορά την επαγωγή της SCE. Μελέτες, που αναφέρουν ότι η εισαγωγή της συγκεκριμένης τροποποίησης στο μόριο του φαρμάκου καθιστά τον αλκυλιωτικό παράγοντα πολύ λιγότερο τοξικό έναντι φυσιολογικών κυττάρων, καθιστούν την παραπάνω διαπίστωση αναμενόμενη. Σχολιάζοντας, περαιτέρω, τα αποτελέσματα που έδωσαν οι στεροειδείς εστέρες, είναι δυνατό να διατυπωθεί γενικότερα ότι η σύζευξη με τους στεροειδικούς σκελετούς αυξάνει σε όλες τις περιπτώσεις την ικανότητα πρόκλησης αλλοιώσεων στο γενετικό υλικό συγκριτικά με τον αλκυλιωτικό παράγοντα και, μάλιστα, σε ορισμένες από αυτές την καθιστά εφάμιλλη ή/και υπέρτερη σε σχέση με τη μη τροποποιημένη μελφαλάνη. Το γεγονός αυτό συνηγορεί με τα ως τώρα στοιχεία για τη θετική επίδραση του στεροειδικού φορέα. Εστιάζοντας, πιο συγκεκριμένα, στις διαφοροποιήσεις των στεροειδικών σκελετών, διαπιστώνεται καταρχήν ότι η εισαγωγή διπλού δεσμού μεταξύ 5 και 6 θέσης οδηγεί σε εμφανή ενίσχυση της δράσης των τελικών μορίων τόσο στην περίπτωση του σκελετού του ανδροστανίου όσο και στην περίπτωση του χολεστανίου. Περισσότερο αξιοσημείωτη διαφοροποίηση στη δράση, ωστόσο, εντοπίζεται στην περίπτωση του ανδροστανίου στη συγκέντρωση 0,4μΜ. Όσον αφορά στην εισαγωγή της NHCO ομάδας στο Δ δακτύλιο του απλού ανδροστανίου παρατηρείται αξιόλογη ενίσχυση της δράσης καταλήγοντας σε διπλασιασμό σχεδόν της γενοτοξικής δράσης του αρχικού εστέρα και παρέχοντας το δραστικότερο προϊόν. Αξιοσημείωτο παρουσιάζεται το γεγονός ότι σε σχέση με τον αλκυλιωτικό παράγοντα η επαγωγή των SCEs που προκλήθηκε από τον εστέρα με τον τροποιημένο στεροειδικό σκελετό είναι 6 φορές ισχυρότερη, ενώ ισχυρότερη εμφανίζεται και συγκριτικά με τη μελφαλάνη. Όλα τα παραπάνω στοιχεία ήταν αναμενόμενα στον αρχικό σχεδιασμό και επιβεβαιώνουν τα δεδομένα της βιβλιογραφίας. Όλες οι ενώσεις στην in vitro μελέτη χρησιμοποιήθηκαν σε δύο διαφορετικές συγκεντρώσεις. Με την αύξηση της δόσης παρατηρείται και ενίσχυση της δράσης των εστέρων με εξαίρεση το λακταμικό παράγωγο που η δράση του διατηρείται σχεδόν σταθερή. Κατά συνέπεια δύναται να επάγει τη δράση του σε μικρότερες δόσεις γεγονός που μπορεί να αποδειχτεί πλεονεκτικό σε in vivo χορήγηση. Όσον αφορά στην επίδραση των υπό μελέτη ενώσεων στο ρυθμό πολλαπλασιασμού των κυττάρων (PRI), διαπιστώνεται ότι ο PRI παραμένει στα ίδια περίπου επίπεδα με την ομάδα ελέγχου, κατά συνέπεια δεν παρατηρείται κυτταροστατική δράση. Τα παραπάνω συμπεράσματα έρχονται, σε γενικές γραμμές, σε συμφωνία με τα δεδομένα που έχουν παρουσιαστεί στο κεφάλαιο 4. Η σύζευξη του αλκυλιωτικού παράγοντα σε στεροειδικούς σκελετούς φαίνεται ότι εξυπηρετεί, πέρα από τη βελτίωση της μεταφοράς του κυτταροτοξικού παράγοντα, και την ενίσχυση της τελικής του δράσης, όπως διαπιστώνεται κυρίως με τον τροποποιημένο σκελετό. Πράγματι, η εισαγωγή της NHCO ομάδας ως ενδοκυκλικής λακτάμης οδήγησε σε παράγωγο με εμφανώς ενισχυμένη γενοτοξική ικανότητα. Η παραπάνω τροποίηση συνεισφέρει, αφενός, στην αύξηση της διαλυτότητας του τελικού μορίου στο ενδοκυτταρικό περιβάλλον, γεγονός που διευκολύνει την προσέγγιση του φαρμάκου στο θεραπευτικό στόχο, και, αφετέρου, αλληλεπιδρά ενδεχομένως με ανάλογες ομάδες που απαντώνται σε πρωτεΐνες και νουκλεϊκά οξέα. Επιπλέον, δεν παραλείπεται και η πιθανότητα ενζυμικές διεργασίες να μετατρέπουν τη συγκεκριμένη ομάδα του στεροειδικού σκελετού σε κυτταροτοξικά ενεργά ενδιάμεσα με συνέπεια τη συνεργική δράση στεροειδούς και αλκυλιωτικού παράγοντα. Η παραπάνω in vitro μελέτη σε φυσιολογικά λεμφοκύτταρα, βέβαια, παρέχει την ένδειξη για την ενδεχόμενη αντιλευχαιμική δράση. Μεγάλο ενδιαφέρον θα παρουσίαζε μία in vivo μελέτη σε καρκινικά μοντέλα. Είναι κατανοητό ότι εντός του οργανισμού το φάρμακο υπόκειται σε διάφορες μεταβολικές διεργασίες που απουσιάζουν από την in vitro μελέτη και, ταυτόχρονα, στο διαφοροποιημένο ενζυμικό προφίλ της νεοπλασίας, στοιχεία που πιθανά επηρεάζουν την τελική αντικαρκινική δράση. Συνυπολογίζοντας, λοιπόν, και τα αποτελέσματα μίας in vivo μελέτης μπορούμε να εξάγουμε πιο ασφαλή συμπεράσματα για τη σχέση χημικής δομής-βιολογικής δράσης και το μελλοντικό σχεδιασμό ανάλογων ενώσεων με βελτιωμένες ιδιότητες. / -

Η παρούσα εργασία αποτελείται από έξι κεφάλαια, τα οποία έχουν την εξής δομή: Στο κεφάλαιο 1 γίνεται μια εισαγωγή στο πρόβλημα του καρκίνου του μαστού, κάνοντας αρχικά μία παρουσίαση της ανατομίας και της φυσιολογίας του μαστού. Στη συνέχεια γίνεται μια αναφορά στο πως αναπτύσσεται ο καρκίνος του μαστού, ποιοι προδιαθεσιακοί παράγοντες υπάρχουν και πως αντιμετωπίζεται. Επίσης περιγράφονται και τα διάφορα είδη καρκινικών ευρημάτων. Αναλύονται τα διάφορα διαγνωστικά μέσα δίνοντας έμφαση στη μαστογραφία ως μέσο απεικόνισης του καρκίνου, στον τρόπο που παράγεται, ψηφιοποιείται και ερμηνεύεται. Τέλος γίνεται αναφορά στα πλεονεκτήματα που προκύπτουν από τη χρήση του υπολογιστή στη μαστογραφική μελέτη. Στο κεφάλαιο 2 γίνεται αναφορά στις μεθόδους ψηφιακής επεξεργασίας και ανάλυσης εικόνας που εφαρμόζονται στη μαστογραφία. Αναλύονται μια σειρά από τεχνικές βελτίωσης της ποιότητας των ψηφιακών μαστογραφιών, δίνοντας έμφαση στην έννοια του ιστογράμματος εικόνας και στις διάφορες τεχνικές τροποποίησης του. Τέλος γίνεται αναφορά στην υφή της εικόνας και στις διάφορες παραμέτρους που χρησιμοποιούνται στην ψηφιακή ανάλυση ενός μαστογραφήματος όπως επίσης και στην διαδικασία κατάταξης των διαφόρων περιοχών του σε υγιή και μη φυσιολογικά. Στο κεφάλαιο 3 αναλύεται μια άλλη ομάδα μεθόδων ανάλυσης εικόνας μαστογραφιών η οποία μπορεί να περιγραφεί ως τεχνικές ανίχνευσης ανωμαλιών. Αυτές οι μέθοδοι προσπαθούν να εντοπίσουν συγκεκριμένες ανωμαλίες, όπως οι μικροαποτιτανώσεις, οι οζώδεις σκιάσεις, ή οι αλλοιώσεις της δομής των γειτονικών ιστών μέσα στις εικόνες μαστογραφιών. Αυτές οι μέθοδοι ταξινομούνται στην ερευνητική περιοχή της επεξεργασίας εικόνας για τον εντοπισμό των ανωμαλιών στις μαστογραφίες. Στο κεφάλαιο 4 της διπλωματικής εργασίας γίνεται παρουσίαση της συγκριτικής ανάλυσης που χρησιμοποιείται για την ερμηνεία των ψηφιακών μαστογραφημάτων. Γίνεται αναφορά στα είδη της, στα στάδια από τα οποία αποτελείται καθώς και στις δυσκολίες που παρουσιάζονται κατά την εφαρμογή της. Αναλύεται η διαδικασία της συστοίχισης μαστογραφημάτων, που είναι ένα από τα πιο βασικά αλλά και συνάμα από τα πιο πολύπλοκα στάδια της συγκριτικής ανάλυσης και τέλος γίνεται εκτενής αναφορά στο συντελεστή ετεροσυσχέτισης ως μέσο για την αναγνώριση και τη συστοίχιση δισδιάστατων προτύπων. Στο κεφάλαιο 5 αναλύονται τα συστήματα ταξινόμησης προτύπων που χρησιμοποιούνται για την αναγνώριση των υπόπτων περιοχών στα ψηφιακά μαστογραφήματα. Δίνεται έμφαση στα τεχνητά νευρωνικά δίκτυα, που αποτελούν τα πιο ευρέως χρησιμοποιούμενα συστήματα απόφασης στο χώρο αυτό, και ιδιαίτερα στα δίκτυα ακτινικών συναρτήσεων που χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα διπλωματική εργασία. Στο κεφάλαιο 6 περιγράφονται τρεις ξεχωριστές μελέτες. Αρχικά μελετήθηκε το πρόβλημα της συστοίχισης ψηφιακών μαστογραφιών. Το πρώτο στάδιο της συγκριτικής ανάλυσης μαστογραφημάτων, είτε αυτή είναι δίπλευρη είτε πρόσκαιρη, είναι η συστοίχιση των αντίστοιχων μαστογραφημάτων. Στο σύστημα που υλοποιήθηκε, επιδιώκουμε τη συστοίχιση μαστογραφημάτων μέσω της εξαγωγής του περιγράμματος κάθε μαστού και της ελαχιστοποίησης της διαφοράς των εμβαδών τους. Βρίσκοντας την ελάχιστη τιμή του εμβαδού μετατοπίζοντας στο χώρο την μια μαστογραφία υπολογίζουμε ταυτόχρονα και τη θέση του καλύτερου ταιριάσματος των δύο μαστογραφημάτων. Έπειτα μελετήθηκαν διάφορες τοπολογίες νευρωνικών δικτύων ακτινικών συναρτήσεων. Ως παραμέτρους –εισόδους στο νευρωνικό δίκτυο- χρησιμοποιήσαμε στατιστικούς περιγραφείς της υφής. Οι πιο απλές τεχνικές περιγραφής της υφής, με πολύ καλή απόδοση, είναι οι στατιστικές τεχνικές που βασίζονται στα ιστογράμματα των περιοχών, τις επεκτάσεις τους και τις ροπές τους. Πραγματοποιήθηκαν αξιολογήσεις του συστήματος αναγνώρισης για ροπές από 1ης έως και 15ης τάξης ώστε να βρεθεί ο αριθμός που μας εξασφαλίζει την καλύτερη απόδοση. Η καλύτερη τοπολογία του δικτύου χρησιμοποιήθηκε για την ανάπτυξη ενός συστήματος ανίχνευσης υπόπτων περιοχών σε ψηφιακές μαστογραφίες. Τέλος αναπτύσσεται διεξοδικά σύστημα ανίχνευσης υπόπτων περιοχών σε ψηφιακά μαστογραφήματα Η ταξινόμηση πραγματοποιείται με στατιστικούς περιγραφείς της υφής ενώ ο έλεγχος γίνεται μέσω χρήσης νευρωνικού δικτύου ακτινικών συναρτήσεων. Το σύστημα ανίχνευσης δίνει ως αποτέλεσμα τα αρχικά μαστογραφήματα σηματοδοτημένα με τις πλέον ύποπτες περιοχές για την ύπαρξη νεοπλασίας. Παρουσιάζονται αναλυτικά τα στάδια που ακολουθήθηκαν για τη υλοποίηση του συστήματος, τα πειραματικά αποτελέσματα, τα προβλήματα που αντιμετωπίστηκαν και τα συμπεράσματα που εξήχθησαν. / -

Το θέμα της παρούσας διπλωματικής εργασίας είναι η ανάκτηση πληροφορίας από δενδρικές δομές που εμφανίζονται σε ιατρικές εικόνες. Η διάγνωση με την βοήθεια ηλεκτρονικών υπολογιστών είναι ένας ευρέως αναπτυσσόμενος κλάδος της πληροφορικής καθώς υποβοηθά το ιατρικό έργο. Συχνά στην ιατρική απαιτείται αξιολόγηση δεδομένων που προκύπτουν από εικόνες (π.χ. απλή ακτινογραφία, αξονική τομογραφία). Οι ιατρικές αυτές εικόνες παρουσιάζουν τη μορφολογία διαφόρων οργάνων του ανθρώπινου σώματος. Ο σκοπός της παρούσας διπλωματικής εργασίας είναι η ανάλυση ιατρικών εικόνων με τη βοήθεια προγραμμάτων που κατασκευάζουμε προκειμένου να αυτοματοποιηθεί η διαδικασία της διάγνωσης. Οι ιατρικές εικόνες τις οποίες μελετάμε απεικονίζουν δενδρικές δομές από ιστούς του ανθρώπινου σώματος. Πιο συγκεκριμένα, γίνεται προσπάθεια να εντοπιστούν εκείνα τα χαρακτηριστικά των δενδρικών δομών που συμβάλλουν με ακρίβεια στη διάγνωση του ασθενούς. Παλιότερες εργασίες έχουν αποδείξει ότι η ανάλυση της μορφολογίας αυτών των δενδρικών δομών μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την εξόρυξη περιγραφικών χαρακτηριστικών που διακρίνουν τους ασθενείς από τους μη ασθενείς. Αυτοματοποιημένες τεχνικές ανάλυσης των εικόνων αυτών έχουν ήδη χρησιμοποιηθεί για την ανίχνευση πρώιμων σταδίων όγκων του εγκεφάλου, καρκίνου του μαστού και τρισδιάστατη ανάλυση της μορφολογίας των αεραγωγών στον πνεύμονα. Η μέθοδός μας προσπαθεί να βελτιώσει τα αποτελέσματα από προηγούμενες μεθόδους αναλύοντας την εικόνα, ώστε να μοντελοποιηθεί η δενδρική δομή που υπάρχει. Με βάση τη δενδρική δομή λαμβάνονται μετρήσεις αρκετών παραμέτρων, όπως το πλήθος των διακλαδώσεων, η χωρική πυκνότητα των διακλαδώσεων (ανάλυση Sholl) και ο δείκτης ασυμμετρίας. Βάσει των παραπάνω μετρήσεων, γίνεται κατηγοριοποίηση των εξεταζόμενων ασθενών σε δύο κλάσεις (ασθενείς με ευρήματα και ασθενείς χωρίς ευρήματα). Τέλος, γίνεται αξιολόγηση της προτεινόμενης μεθόδου με κριτήρια την ευαισθησία και ειδικότητά της σχετικά με τον εντοπισμό ευρημάτων. Η έρευνά μας μπορεί να βρει εφαρμογές στην ανίχνευση ευρημάτων που οδηγούν σε καρκίνο του στήθους. Στην περίπτωση αυτή οι ιατρικές εικόνες που εξετάζονται είναι γαλακτογραφίες (είδος ακτινογραφίας που χρησιμοποιείται κατά την εξέταση του στήθους). Επίσης, μπορεί να εφαρμοστεί στις δενδρικές δομές που υπάρχουν στο πυελοκαλυκικό σύστημα των νεφρών. Καταλήγοντας, η μέθοδος αυτή μπορεί να χρησιμοποιηθεί στη σύγκριση και την κατηγοριοποίηση ιστών ή τμημάτων του ανθρωπίνου σώματος που αποτελούνται από δενδρικές δομές. / -

Ο μαζικός αδένας σχηματίζεται την 6η εμβρυϊκή εβδομάδα ως πάχυνση του εξωδέρματος (μαζική ακρολοφία), ενώ κατά τον 5ο εμβρυϊκό μήνα αναπτύσσονται από τις αρχικές επιθηλιακές καταβολές, συμπαγείς χορδές κυττάρων στο υποκείμενο χόριο. Ο μαστός ως εξωκρινής αδένας φέρει υποδοχείς, μέσω των οποίων υπόκειται σε ορμονικό έλεγχο τόσο κατά τη διάρκεια του έμμηνου κύκλου, όσο και κατά τη διάρκεια της κύησης και της γαλακτοφορίας, η οποία αποτελεί και το σκοπό ύπαρξης του μαστού. Όμως ο μαστός αποτελεί ένα από τα όργανα του ανθρώπινου σώματος το οποίο υφίσταται καρκινική εξαλλαγή, αφού αποτελεί την 1η αιτία θανάτου από καρκίνο μεταξύ των γυναικών. Υπολογίζεται πως ο ετήσιος κίνδυνος για να προσβληθεί μία γυναίκα από καρκίνο του μαστού είναι 1: 37.000 μεταξύ των ηλικιών 30-40, ενώ ο αριθμός αυτός αυξάνει σε 1: 200-235 σε ηλικίες άνω των 70 ετών. Σημαντικοί τρόποι προληπτικού ελέγχου, και αυτοί οι οποίοι θα μελετηθούν, προκειμένου να διαγιγνώσκεται έγκαιρα μια κακοήθης αλλοίωση του μαστού είναι η μαστογραφία, που με τη βοήθεια πάντα του υπερηχογραφήματος και του έγχρωμου Doppler είναι σε θέση να εντοπίζει αλλοιώσεις μεγέθους ακόμα και 2 mm, οι οποίες δεν έχουν δώσει ακόμα κλινική σημειολογία. Όταν η μάζα γίνει ψηλαφητή αυτό σημαίνει ότι θα είναι ήδη μεγέθους 2 cm και θα έχει διηθήσει τους γύρω ιστούς. Το υπερηχογράφημα θα μειώσει τον αριθμό των γυναικών οι οποίες θα χρειαστεί να υποβληθούν σε βιοψία, καθώς δίνει τη δυνατότητα καθορισμού της κυστικής ή συμπαγούς σύστασης της απεικονιζόμενης στη μαστογραφία αλλοίωσης. Σκοπός του screening με τις απεικονιστικές αυτές μεθόδους είναι να μειωθεί ακόμα περισσότερο η θνητότητα και η θνησιμότητα από καρκίνο του μαστού καθώς ιάσιμη νόσος είναι αυτή η οποία δεν έχει δώσει ακόμα κλινική σημειολογία. / The mammary gland is formed during the 6th week of fetal life, as an exoderma thickening, while during the 5th month compact cords are being developed subcutaneously. The mammary gland as an exocrine gland, carries receptors through which is subject to hormonal control. Not only does this occur during menstrual circle, but also during gestation and lactation, which is the purpose of its existence. Statistics show that the mammary gland is among the human organs, which are most susceptible to cancerous transmutation, since breast cancer is the first cause of death from cancer among women. It is estimated that the annual risk a woman runs to be affected by breast cancer is 1: 37.000 between the ages 30-40, while this risk increases to 1: 200-235 to women above 70 years of age. Mammography along with ultrasonography and color Doppler are significant preventive measures, in order to obtain a prompt diagnosis of a malignant breast lesion. They are capable of pinpointing a lesion as small as 2mm, before this can be clinically detected. When it reaches the point of being palpable, it measures more than 2cm and will have already infiltrated the surrounding tissue. Ultrasonography will reduce the number of women who will need to undergo biopsy in order to distinguish the cystic or solid nature of a suspicious lesion detected in a mammogram. The aim of screening mammography along with ultrasonography is to decrease the morbidity of breast cancer, since breast cancer is curable only at the stage when clinical examination cannot detect it.