- / -

Ανάμεσα στα διάφορα είδη του γένους Crocus, ο C. sativus έχει μελετηθεί εκτενώς ως προς τη σύσταση και τις βιολογικές ιδιότητες των στύλων του, οι οποίοι αποτελούν το γνωστό άρτυμα (κρόκος ή ζαφορά) το οποίο χρησιμοποιείται ευρέως στη Μεσογειακή, την Ινδική και την Κινέζικη μαγειρική. Ανά τους αιώνες, στον κρόκο έχουν αποδοθεί πολλές θεραπευτικές ιδιότητες. Παρά την ύπαρξη πολλών μελετών, οι οποίες αναφέρουν ότι η κροκετίνη και οι κροκίνες από τον κρόκο έχουν ποικίλες βιολογικές δράσεις, θέματα που αφορούν στον τρόπο χορήγησης του κρόκου καθώς και στην απορρόφηση και στο μεταβολισμό των καροτενοειδών του σε ανθρώπους δεν έχουν ακόμα απαντηθεί. Στην παρούσα μελέτη, ισοκρατική μέθοδος υγρής χρωματογραφίας ανάστροφης φάσης αναπτύχθηκε και επικυρώθηκε για την ανίχνευση κροκετίνης σε πλάσμα. Τα αποτελέσματα έδειξαν υψηλή συγκέντρωση της κροκετίνης μετά από 2 ώρες (1.24 -3.67 μΜ) και παρουσία της ακόμα και στις 24 ώρες (0.10-0.24). Ενδιαφέρον προκαλεί η παρουσία του cis-ισομερούς σε ποσοστά 25 με 50%, προτείνοντας in vivo ισομερείωση. Με χρήση υγρής χρωματογραφίας (HPLC) και UV/vis φασματοσκοπίας δείχνουμε για πρώτη φορά την παρουσία υδρόφιλων καροτενοειδών στους στύλους τριών ενδημικών ειδών Crocus: C. boryi ssp. tournefortii, C. boryi ssp. boryi και C. niveus και ότι στα ενδημικά είδη η αλκαλική υδρόλυση οδηγεί σε ένα άγλυκο trans-καροτενοειδές. Με σκοπό την περαιτέρω έρευνα ως προς την επίδραση των μεθανολικών εκχυλισμάτων αλλά και συστατικών του saffron στον πολλαπλασιασμό καρκινικών κυττάρων του μαστού, εφόσον ο καρκίνος του μαστού αποτελεί κύρια αιτία θανάτου σε γυναίκες, χρησιμοποιήσαμε τις κυτταρικές σειρές MCF-7 και MDA-MB-231 ενώ μετρήθηκε και η επίδραση στην διηθητικότητα της κυτταρικής σειράς MDA-MB-231. Μετά από επώαση 24 ωρών, η κροκετίνη ανέστειλε σημαντικά όχι μόνο τον πολλαπλασιασμό αλλά επίσης την διήθηση, στις συγκεντρώσεις 1 και 10 μM. Μελέτες όσον αφορά στις μοριακές αλλαγές στην έκφραση των MMPs και των TIMPs, έδειξαν σημαντική μείωση στη γονιδιακή και πρωτεϊνική έκφραση των MT1-MMP και MT2-MMP και των ζελατινασών. / Among the different species of Crocus, only C. sativus has been extensively studied for the composition and the biological properties of its styles, since these constitute the well-known spice saffron, which is widely used in the Mediterranean, Indian and Chinese diet. Throughout centuries, saffron is attributed with many therapeutic uses. Crocetin is a carotenoid dicarboxylic acid, which in nature is esterified with glucose or gentiobiose units forming the crocins, abundant components of saffron (a spice with many reputed medicinal uses). Although studies have demonstrated that crocetin and crocins from saffron have various biological functions, issues concerning the route and way of saffron administration, the absorption and metabolism of saffron carotenoids in humans have not been answered yet. In the present study, an isocratic reversed-phase liquid chromatographic method was developed and validated for the determination of crocetin in plasma. Samples were pre-treated by solid phase extraction (recoveries >72%) and were chromatographed on a Luna C-18 column (4.6 mm x 250 mm, 5 μm) with a mobile phase consisting of methanol/water/trifluoroacetic acid (75.0/24.5/0.5, % v/v/v) at a flow rate of 1.0 mL min-1. The HPLC method developed resulted in sharp peaks at 10.7 (trans-crocetin) and 18.6 min (cis-crocetin), whereas the calibration curve of total crocetin in plasma displayed a good linearity for concentrations of 0.020 to 20 μΜ (R2=0.999). Specificity, precision, accuracy and stability were also studied with spiked plasma samples and were acceptable. The developed method was applied to the determination of crocetin levels in plasma of four healthy human volunteers before and after consumption of one cup of saffron infusion (200 mg of saffron in water 80°C for 5 min). Results showed that the concentration of crocetin was high after 2h (1.24 -3.67 μΜ) and still determined after 24 h (0.10-0.24). Interestingly, the percentage of the cis-isomer ranges from 25 to 50%, suggesting in vivo isomerization. With high performance liquid chromatography (HPLC) and UV/vis spectroscopy we show for the first time, the presence of hydrophilic carotenoids in the styles of three other Crocus taxa, endemic in Greece: C. boryi ssp. tournefortii, C. boryi ssp. boryi and C. niveus. In order to investigate the effect of the methanolic extracts and the constituents of saffron on breast cancer cell proliferation, since breast cancer is a major cause of death among women, we used the cell lines MCF-7 and MDA-MB-231 cells. Incubation for 24 and 48 h showed an inhibitory effect on cell proliferation. Studies on the effect of constituents of C. sativus styles showed that the antiproliferative effect is mainly attributed to crocetin. In order to further study the effect of crocetin, the active metabolite of crocins, on breast cancer cells, we used the highly invasive MDA-MB-231 cells and measured the viability with the WST-1 assay and the invasiveness through a reconstituted basement membrane. After 24 h incubation, crocetin inhibited not only proliferation but also invasion significantly at the physiological relevant concentrations of 1 and 10 μM. Studies in the molecular changes of expression of MMPs and their endogenous inhibitors (TIMPs), were performed following reversed transcription and polymerase chain reaction, whereas protein expression and gelatinolytic activity were determined with Western blotting and zymography. The gene and protein expression of MT1-MMP and MT2-MMP were greatly attenuated by both crocetin and all-trans-retinoic acid (ATRA, used as control). Incubation with 10 μM crocetin for 24 h in serum free conditions reduced pro-MMP-9 levels, whereas when cultured in media with sera 2 and 5%, it also reduced gelatinase protein expression. Crocetin and ATRA also upregulate TIMP-1 and TIMP-3 mRNA expression and downregulate TIMP-2 expression.

- / -

-- / --

Η αδειοδότηση της αντιγραφής διασφαλίζει την ακεραιότητα της γενετικής πληροφορίας κατά τη μεταβίβασή της στα θυγατρικά κύτταρα και εξασφαλίζει ότι το DNA αντιγράφεται μία μόνο φορά κατά τη διάρκεια του ίδιου κυτταρικού κύκλου. Η πρωτεΐνη Cdt1 αποτελεί σημαντικό παράγοντα αδειοδότησης και συσσωρεύεται κατά τη G1 φάση του κυτταρικού κύκλου. Φυσικός αναστολέας της Cdt1 είναι η Geminin, που εκφράζεται καθ’όλες τις φάσεις του κυτταρικού κύκλου, εκτός από τη G1. Η διατήρηση της ισορροπίας της έκφρασης των πρωτεϊνών Cdt1 και Geminin είναι σημαντική για τη διασφάλιση της γενετικής ακεραιότητας. Αποσιώπηση της Geminin ή υπερέκφραση της Cdt1 μπορεί να οδηγήσει σε εκτοπική επανέναρξη της αντιγραφής. Σε ποντίκια, η υπερέκφραση της Cdt1 συμβάλλει στην εμφάνιση κακοήθειας, γεγονός που αποδεικνύει το ρόλο της πρωτεΐνης ως ογκογονίδιο. Πρόσφατες μελέτες υποδεικνύουν ότι μόρια που συμμετέχουν στο μηχανισμό αδειοδότησης της αντιγραφής μπορούν να χρησιμεύσουν ως προγνωστικοί-διαγνωστικοί δείκτες. Υψηλά επίπεδα έκφρασης των MCMs και της Geminin έχουν παρατηρηθεί σε διάφορες κακοήθειες και έχουν συσχετιστεί με κλινικοπαθολογικές παραμέτρους της ασθένειας. Αν και έχει δειχθεί ότι η Cdt1 διαθέτει ογκογόνο δράση, ελάχιστα δεδομένα είναι διαθέσιμα, μέχρι στιγμής, αναφορικά με τα επίπεδα έκφρασής της σε κακοήθεις καταστάσεις και με την πιθανή χρήση της ως βιολογικού δείκτη. Αρχικός στόχος αυτής της εργασίας ήταν η έκφραση ενός τμήματος της Cdt1 πρωτεΐνης για την ανοσοποίηση κουνελιών και την παραγωγή αντισώματος. Συγκεκριμένα πραγματοποιήθηκε έκφραση της υβριδικής GST-C391 hCdt1 πρωτεΐνης σε ετερόλογο βακτηριακό σύστημα έκφρασης. Παράλληλα πραγματοποιήθκε έκφραση ενός ακόμη τμήματος της hCdt1 που έφερε τον επίτοπο His. Η δεύτερη υβριδική πρωτεΐνη (His-ΔΝ Cdt1) χρησιμοποιήθηκε για τον καθαρισμό των αντιορρών των ανοσοποιημένων ζώων και την απομόνωση του αντισώματος. Η ειδικότητα του καθαρισμένου αντισώματος πιστοποιήθηκε με ανοσοφθορισμό και ανοσοαποτύπωση western σε δύο καρκινικές κυτταρικές σειρές, στα HeLa και στα MCF7. Επιπλέον, πειράματα ανοσοϊστοχημειας σε τομές από περιστατικά καρκίνου μαστού επιβεβαίωσαν τη δυνατότητα χρήσης του αντισώματος σε ιστικές τομές παραφίνης. Η εξέταση των πρωτεϊνικών επιπέδων έκφρασης της Cdt1 έδειξε σημαντική υπερέκφραση της πρωτεΐνης στον όγκο σε σχέση με τον παρακείμενο φυσιολογικο ιστό. Επιπλέον, στην παρούσα εργασία προσδιορίστηκαν τα επίπεδα έκφρασης του mRNA των Cdt1 και Geminin, με τη μέθοδο της Real-Time PCR, σε δύο καρκινικές κυτταρικές σειρές (HeLa και MCF7) και σε πρωτογενείς ανθρώπινους ινοβλάστες. Διαπιστώθηκε αύξηση των επιπέδων έκφρασης του mRNA του Cdt1 κατά δύο φορές στις δύο καρκινικές κυτταρικές σειρές, σε σχέση με τους ινοβλάστες. Αντίθετα, η Geminin, εκφράζεται περισσότερο κατά δύο φορές στα HeLa σε σχέση με τα φυσιολογικά κύτταρα, ενώ στα MCF7 τα επίπεδά της είναι υποδιπλάσια σε σχέση με τους ινοβλάστες. Επομένως, ο λόγος των Cdt1/Geminin επηρεάζεται με διαφορετικό τρόπο στις δύο καρκινικές σειρες: στα HeLa φαίνεται ότι διατηρείται σταθερός, σε σχέση με τους ινοβλάστες, ενώ στα MCF7 παρουσιάζεται τετραπλάσιος. / -

Στην παρούσα μελέτη εξετάζεται η έκφραση των ρυθμιστικών πρωτεϊνών του κυτταρικού κύκλου p27kip1, p34cdc2 και p53 σε πορογενές διηθητικό καρκίνωμα του μαστού και αρνητικούς λεμφαδένες, διερευνάται πιθανή συσχέτιση μεταξύ τους ή μεταξύ των πρωτεϊνών αυτών και των κλασσικών κλινικοπαθολογικών παραμέτρων και εκτιμάται η προγνωστική τους αξία στο νεόπλασμα αυτό. Ανοσοϊστοχημική ανάλυση εφαρμόσθηκε σε 94 παρασκευάσματα καρκίνου του μαστού μονιμοποιημένα σε διάλυμα φορμόλης 10% και εγκλεισμένα σε παραφίνη με τη χρήση μονοκλωνικών αντισωμάτων για τις πρωτεΐνες p27kip1, p34cdc2 και p53. Παρακείμενος καλοήθης επιθηλιακός μαζικός ιστός ήταν διαθέσιμος για εξέταση σε 82 περιπτώσεις για την p27kip1 και την p53 και σε 74 για την p34cdc2. Το διάμεσο διάστημα παρακολούθησης των ασθενών ήταν 72 μήνες. Θετικότητα για την p27kip1 στο νεοπλασματικό και στον καλοήθη ιστό διαπιστώθηκε σε 61 (65%) και 75 (91%) περιπτώσεις αντίστοιχα. Τα καρκινικά κύτταρα ήταν θετικά για την p34cdc2 σε 80 (85%) περιπτώσεις ενώ το παρακείμενο καλόηθες επιθήλιο σε 12 (16%). Θετικότητα για την p53 στον όγκο παρατηρήθηκε σε 21 (23%) περιπτώσεις. Θετική συσχέτιση διαπιστώθηκε μεταξύ της έκφρασης της p27kip1 στον όγκο και της κατάστασης των οιστρογονικών και προγεστερονικών υποδοχέων. Θετική συσχέτιση παρατηρήθηκε επίσης μεταξύ της p27kip1 και ηλικίας των ασθενών μεγαλύτερης των 50 ετών ενώ η απώλεια της έκφρασης της p27kip1 συνδυάσθηκε με χαμηλό βαθμό διαφοροποίησης και μεγαλύτερο μέγεθος όγκου. Τέλος, δεν παρατηρήθηκε συσχέτιση της ανοσοδραστικότητας της p27kip1 με το ελεύθερο από υποτροπή της νόσου διάστημα ή τη συνολική επιβίωση. Υψηλά επίπεδα της p34cdc2 στους πυρήνες των νεοπλασματικών κυττάρων συσχετίσθηκαν με χαμηλότερο βαθμό διαφοροποίησης και με την έκφραση της p53 αλλά όχι με το ελεύθερο από υποτροπή της νόσου διάστημα ή τη συνολική επιβίωση. Η κυτταροπλασματική έκφραση της p34cdc2 στον όγκο συσχετίσθηκε με χαμηλό βαθμό διαφοροποίησης και με το ελεύθερο από υποτροπή της νόσου διάστημα. Η έκφραση της p34cdc2 στο φυσιολογικό μαζικό αδένα αποτελούσε ανεξάρτητο προγνωστικό παράγοντα για την έκβαση των ασθενών. Η έκφραση της p53 συνδυάσθηκε με χαμηλό βαθμό διαφοροποίησης και αρνητικούς ορμονικούς υποδοχείς, αλλά δεν συσχετίσθηκε με το ελεύθερο από υποτροπή της νόσου διάστημα ή τη συνολική επιβίωση. Με βάση τα ευρήματα αυτά, διαταραχές στην έκφραση των πρωτεϊνών p27kip1, p34cdc2 και p53 οδηγούν σε απορρύθμιση του κυτταρικού κύκλου και πιθανά συμβάλλουν με τον τρόπο αυτό στην καρκινογένεση στο μαστό. Η έκφραση της p27kip1, της p34cdc2 και της p53 στον καρκίνο του μαστού με αρνητικούς λεμφαδένες δεν αποτελεί προγνωστικό παράγοντα της έκβασης της νόσου, ενώ υπάρχει μία συσχέτιση μεταξύ της παρουσίας της p34cdc2 στον καλοήθη ιστό και της πρόγνωσης. Η συσχέτιση της p34cdc2 με την p53 εισηγείται τη συμμετοχή της p53 στον έλεγχο της μετάβασης από τη φάση G2 στη φάση Μ του κυτταρικού κύκλου. / This study investigates the expression of the cell cycle regulatory proteins p27kip1, p34cdc2 and p53 in node-negative invasive ductal breast carcinoma, investigates for potential correlation between them, or between these proteins and the classical clinicopathological parameters, and assesses their prognostic value in this neoplasm. Immunohistochemistry was applied on formalin-fixed (10%), paraffinembedded tissue sections from 94 breast carcinoma specimens using monoclonal antibodies for the p27kip1, p34cdc2 and p53 proteins. Adjacent benign epithelial breast tissue was available for examination in 82 cases for p27kip1 and p53 and 74 cases for p34cdc2. The median follow-up period was 72 months. p27kip1 positivity in the neoplastic and benign tissue was found in 61 (65%) and 75 (91%) cases respectively. Tumor cells were positive for p34cdc2 in 80 (85%) cases while the adjacent benign epithelium in 12 (15%) cases. Tumor p53 positivity was observed in 21 (23%) cases. A positive correlation was found between p27kip1 expression in tumor and estrogen and progesterone receptor status. There was also a significant positive association between p27kip1 and patients age 50 years or higher while low expression of p27kip1 was correlated with high tumor grade and greater tumor size. There was no correlation between p27kip1 immunoreactivity and disease free survival (DFS) or overall survival (OS). High levels of nuclear p34cdc2 in the neoplastic tissue were associated with higher histological grade and p53 expression but were not correlated with DFS or OS. Cytoplasmic p34cdc2 expression in tumor was associated with high tumor grade and DFS. p34cdc2 expression by the normal breast tissue independently predicted patient outcome. Expression of p53 was associated with high tumor grade and negative steroid receptors, but was not correlated with DFS or OS. Based on these findings, alterations of the proteins p27kip1, p34cdc2 and p53 are involved in cell cycle deregulation and probably contribute in breast tumorigenesis. Expression of p27kip1, p34cdc2 and p53 in nodenegative breast carcinoma does not predict disease outcome, while there is an association between the presence of p34cdc2 in normal breast tissue and prognosis. The relationship of p34cdc2 and p53 indicates an implication of p53 in the G2-M cell cycle checkpoint control.

Η λεμφαγγειογένεση η σχετιζόμενη με όγκους πρόσφατα έχει θεωρηθεί σαν ένας νέος μηχανισμός εξάπλωσης του καρκίνου. Όμως υπάρχει μεγάλη ετερογένεια στα αποτελέσματα των μελετών που συσχετίζουν την έκφραση λεμφαγγειακών δεικτών στο ενδοθήλιο των λεμφαγγείων με κλινικοπαθολογοανατομικές παραμέτρους των όγκων και με την πρόγνωση των ασθενών. Επίσης ένα μεγάλο θέμα διαφωνίας είναι το ποια είναι η σημασία των περιογκικών σε σχέση με τα ενδοογκικά λεμφαγγεία για την μετάσταση των όγκων. Στην παρούσα μελέτη διερευνήσαμε την έκφραση και την πιθανή προγνωστική σημασία των δεικτών του λεμφαγγειακού ενδοθηλίου, VEGFR-3, Ρodoplanin και LYVE-1 σε διηθητικά καρκινώματα εκ πλακώδους επιθηλίου του τραχήλου της μήτρας . Υλικά και Μέθοδοι: Το υλικό της μελέτης αποτέλεσαν 51 παρασκευάσματα υστερεκτομών με διηθητικό καρκίνωμα εκ πλακώδους επιθηλίου τραχήλου. Με την μέδοδο της Ανοσοϊστοχημείας εξετάσθηκε η πρωτεϊνική έκφραση των δεικτών CD31, VEGFR-3, Ρodoplanin και LYVE-1.Ο έλεγχος της παρουσίας ανοσοθετικών αγγείων για όλα τα ανωτέρω μόρια έγινε σε όλη την έκταση της ιστολογικής τομής, μέσα στο παρέγχυμα και σε όλη την περιφέρεια του όγκου με μικρή μεγέθυνση φωτονικού μικροσκοπίου( x 4 ).Η αγγειακή πυκνότης εκτιμήθηκε στις περιοχές με την μεγαλύτερη αγγειοβρίθεια (hot spots) σε πέντε συνεχόμενα μεγάλα οπτικά πεδία (HPF=. x 400) και ορίσθηκε ως ο μέσος όρος του αριθμού των αγγείων στα πεδία αυτά. Χρησιμοποιήθηκε στατιστικό πρόγραμμα ανάλυσης SPSS for windows με σκοπό την εκτίμηση της πιθανής συσχέτισης μεταξύ του βαθμού της αγγειακής πυκνότητας και κλινικοπαθολογοανατομικών παραμέτρων όπως είναι ο βαθμός κακοηθείας ,το στάδιο του όγκου και η παρουσία λεμφαδενικών μεταστάσεων.. Αποτελέσματα: Η Ρodoplanin και LYVE-1 εκφράσθηκαν στο ενδοθήλιο των λεμφαγγείων ενώ έκφραση του VEGFR-3 παρατηρήθηκε στα λεμφαγγεία αλλά και στα αιμοφόρα αγγεία.. Η αγγειακή πυκνότης με βάση την έκφραση του VEGFR3 συσχετίσθηκε στατιστικά σημαντικά με την αγγειακή πυκνότητα με βάση την έκφραση του CD31 .Η αγγειακή πυκνότης όπως αναδείχθηκε με την έκφραση του VEGFR3 σχετίσθηκε σημαντικά με όγκους αυξημένου βαθμού κακοηθείας .Αυξημένη ενδοογκική λεμφαγγειακή πυκνότης όπως αναδείχθηκε με την έκφραση LYVE-1 σχετίσθηκε επίσης στατιστικά σημαντικά με όγκους προχωρημένου σταδίου. Όμως δεν παρατηρήθηκε συσχέτιση της έκφρασης των λεμφαγγειακών δεικτών με την παρουσία λεμφαδενικών μεταστάσεων. Συμπέρασμα: Τα αποτελέσματα αυτής της μελέτης δηλώνουν ότι ο VEGFR-3 δεν αποτελεί πιθανόν ένα ειδικό δείκτη λεμφαγγείων αλλά φαίνεται να εμπλέκεται και στην αγγειογένεση των όγκων .Ο VEGFR3 και LYVE-1 αλλά όχι η Ρodoplanin συσχετίσθηκαν με προγνωστικές παραμέτρους του καρκινώματος του τραχήλου όπως είναι ο βαθμός κακοηθείας και το στάδιο της νόσου. Αυτό το γεγονός υποδηλώνει ότι η χρήση πολλαπλών λεμφαγγειακών δεικτών είναι απαραίτητη για την εκτίμηση της προγνωστικής σημασίας της λεμφαγγειογένεσης που σχετίζεται με όγκους .Λόγω του ότι δεν βρέθηκε συσχέτιση μεταξύ της λεμφαγγειακής πυκνότητος και της μετάστασης σε λεμφαδένες , η σχετιζόμενη με όγκους λεμφαγγειογένεση πιθανόν να αποτελεί μία επιπλέον οδό καρκινικής διασποράς αλλά όχι απαραίτητη προϋπόθεση για την μετάσταση του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας. / Tumor-associated lymphangiogenesis has now been firmly established as a novel mechanism of cancer progression. However, results regarding correlation of lymphatic markers expression to clinicopathological tumor parameters and prognosis of cancer patients are heterogenous. In the present study we assessed the expression and prognostic significance of the lymphatic endothelial markers VEGFR-3, podoplanin and LYVE-1 and the panendothelial marker CD31 in invasive squamous cell carcinoma (SCC) of the uterine cervix. Design. The study comprised of 51 hysterectomy specimens with invasive SCC of the uterine cervix. Protein expression of CD31, VEGFR-3, podoplanin and LYVE-1 was examined by means of immunohistochemistry.Vessel counting was performed in whole tumor histologic section as well as in inner tumor areas and invasive tumor fronts separately. Vessel density scores were evaluated in areas of higher vascularization (hot spots). Statistical analysis was performed using SPSS v.12 to evaluate potential correlation between vessel density scores and clinicopathological parameters such as tumor grade, presence of lymph node metastases and disease stage. Results. While podoplanin and LYVE-1 was mainly expressed in lymphatic endothelium VEGFR-3 expression was observed in both lymphatic and blood vessels. Intratumoral vessel density for all markers used was significantly higher in intratumoral compared with peritumoral areas. There was a significant correlation between vessel density scores as assessed by VEGFR3 and CD31 (p<0.001, r=0.5). Intratumoral and peritumoral VEGFR3 vessel density significantly correlated with advancing tumor grade (p=0.001 and p=0.035 respectively). Intratumoral LVD (lymph vessel density) as assessed by LYVE-1 immunostaining was also significantly higher in high stage tumors (p=0.008). However there was no correlation of lymphatic markers expression with nodal metastases. Conclusions. Our results suggest that VEGFR-3 does not probably represent a specific lymphatic marker but it is also implicated in tumor angiogenesis. VEGFR3 and LYVE-1 but not podoplanin correlated with prognostic parameters of cervical carcinomas such as grade and stage, suggesting that the use of multiple lymphatic markers is required for the evaluation of the prognostic significance of tumor associated lymphangiogenesis. While both intratumoral and peritumoral VEGFR3 correlated with grade only intratumoral LVD for LYVE-1 correlated with stage suggesting that the relative significance of intartumoral versus peritumoral lymphatics remains a matter of debate. Finally, since there was no correlation between LVD scores and nodal status, tumor associated lymphatics should be regarded as an additional pathway rather than a necessity for lymph node metastasis in cervical cancer.

Οι οστικές μεταστάσεις εμφανίζονται συχνά κατά την εξέλιξη του καρκίνου, συχνότερα σε συγκεκριμένου τύπου καρκίνους όπως ο καρκίνος του μαστού και του προστάτη και λιγότερο συχνά σε άλλους κακοήθεις όγκους όπως του πνεύμονα και του νεφρού. Περισσότερο από 50% των ασθενών με προχωρημένο καρκίνο του μαστού και του προστάτη εμφανίζουν οστικές μεταστάσεις, ενώ άπαξ και ο όγκος προσβάλλει τα οστά η νόσος καθίσταται στην πλειονότητα των περιπτώσεων μη ιάσιμη. Τα συμπτώματα από την προσβολή του σκελετού περιλαμβάνουν μεταξύ άλλων πόνο, παθολογικά κατάγματα, υπερασβεστιαιμία, και εκδηλώσεις από τα νεύρα Οι υπάρχουσες θεραπευτικές παρεμβάσεις είναι παρηγορητικές καθιστώντας επιτακτική την καλύτερη κατανόηση των υποκείμενων μηχανισμών, η οποία θα επιτρέψει την ανακάλυψη νέων θεραπειών. Ο οστεοτροπισμός συγκεκριμένων νεοπλασιών είχε απασχολήσει από πολύ νωρίς τους επιστήμονες δίνοντας τις βάσεις για τις πιο σύγχρονες προσεγγίσεις. Τα όλο αυξανόμενα δεδομένα υπογραμμίζουν ότι ο σχηματισμός των οστικών μεταστάσεων δεν αποτελεί μια απλή διαδικασία μετανάστευσης των καρκινικών κυττάρων στην μεταστατική εστία. Αντίθετα συνίσταται από ένα σύνολο πολύπλοκων διεργασιών στο οποίο συμμετέχουν τα καρκινικά κύτταρα και τα κύτταρα του ξενιστή. Αρχικά εμφανίζεται επέκταση της πρωτοπαθούς εστίας εις βάρος των παρακείμενων κυττάρων και του στρώματος του ιστού. Στη συνέχεια η μείωση της έκφρασης μορίων προσκόλλησης στην επιφάνεια των καρκινικών κυττάρων οδηγεί σε αποκοπή τους από την πρωτοπαθή εστία και σε διήθηση του ιστού και των αγγειακών τοιχωμάτων. Ακολουθεί η μετανάστευσή τους μέσω της αιματικής ροής ενώ με την βοήθεια κατάλληλων μορίων διαφεύγουν της εποπτείας του ανοσοποιητικού συστήματος και καταλήγουν στα κολποειδικά τριχοειδή του μυελού όπου αγκυροβολούν και αναπτύσσονται. Στη συνέχεια διηθούν και πάλι τα αγγειακά τοιχώματα για να εγκατασταθούν πλέον στον μυελό των οστών όπου και θα αναπτυχθεί η δευτεροπαθής εστία με μηχανισμούς που θα αναλυθούν. / -

Η εγκαθίδρυση και ανάπτυξη καρκίνου του προστάτη διαμεσολαβείται από τη δράση μιας πλειάδας ογκογενετικών αυξητικών παραγόντων. Μέχρι σήμερα έχει αναδειχθεί η εμπλοκή του αυξητικού παράγοντα HARP στην ανάπτυξη καρκινικών όγκων διαφορετικής προελεύσεως. Στην παρούσα εργασία, διερευνήθηκε η πιθανή συμμετοχή της HARP στην ανάπτυξη καρκίνου του προστάτη. Με εφαρμογή μιας αντινοηματικής στρατηγικής πραγματοποιήθηκε καταστολή έκφρασης της HARP στην καρκινική κυτταρική σειρά προστάτη LNCaP και μελετήθηκε τόσο ο ρόλος της HARP στην αύξηση και μεταναστευτική ικανότητα των καρκινικών κυττάρων, όσο και η ενδεχόμενη αγγειογενετική δράση της in vitro και in vivo. Η εξωγενώς χορηγούμενη ανασυνδυασμένη HARP ανθρώπου, ήταν μιτογόνος για τα κύτταρα LNCaP. Επιπρόσθετα η καταστολή έκφρασης της ενδογενούς HARP, ανέδειξε την αναγκαιότητα του συγκεκριμένου αυξητικού παράγοντα για τη μετανάστευση των κυττάρων LNCaP καθώς και για την κυτταρική αύξηση τόσο σε συνθήκες εξαρτώμενες όσο και ανεξάρτητες από την προσκόλληση σε υπόστρωμα. Οι επαγόμενες, από τα κύτταρα LNCaP, λειτουργίες των ενδοθηλιακών κυττάρων in vitro και ο σχηματισμός νέων αγγείων in vivo, αναχαιτίστηκαν όταν ανεστάλη η έκφραση της HARP. Ο αυξητικός παράγοντας ινοβλαστών FGF-2 είναι ένας πλειοτροπικός αυξητικός παράγοντας, ο οποίος διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην εγκαθίδρυση και ανάπτυξη καρκίνου του προστάτη. Τα αποτελέσματα της παρούσας διατριβής, κατέδειξαν ότι ο FGF-2 δύναται να επάγει σε σημαντικό ποσοστό τον πολλαπλασιασμό και τη μετανάστευση των κυττάρων LNCaP. Το μόριο της HARP φαίνεται να μεσολαβεί προκειμένου να εκδηλωθούν οι διεγερτικές δράσεις του FGF-2, δεδομένου ότι τελευταίος δεν επηρέασε αντίστοιχες λειτουργίες των κυττάρων LNCaP στα οποία είχε κατασταλεί η έκφραση της HARP. Επιπλέον, ο FGF-2 διέγειρε την έκφραση και έκκριση της HARP από τα κύτταρα LNCaP και αύξησε τη δραστηριότητα λουσιφεράσης πλασμιδιακού οχήματος αναφοράς, στο οποίο είχε κλωνοποιηθεί η ρυθμιστική περιοχή του γονιδίου της HARP. Ο ειδικός αναστολέας του υποδοχέα FGFR-1, SU-5402, αναχαίτισε την επαγόμενη από τον FGF-2 ενεργοποίηση του γονιδίου της HARP και την επακόλουθη έκκριση της πρωτεΐνης, οδηγώντας με τον τρόπο αυτό σε εξασθένιση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού. Επώαση των κυττάρων LNCaP με πυροσταφυλικό νάτριο, το οποίο απομακρύνει με έμμεσο τρόπο το υπεροξείδιο του υδρογόνου, ανέδειξε την εξάρτηση των διεγερτικών δράσεων του FGF-2 από την ενδοκυτταρική παραγωγή υπεροξειδίου του υδρογόνου, ενώ ανάσχεση της δραστικότητας του FGFR-1 ανέστειλε τον επαγόμενο από τον FGF-2 σχηματισμό δραστικών μορφών οξυγόνου. Με χρησιμοποίηση ολιγονουκλεοτιδικών δολωμάτων έναντι του ΑΡ-1 και εφαρμογή κατευθυνόμενης μεταλλαξιγένεσης στη ρυθμιστική περιοχή του γονιδίου της HARP, διαπιστώθηκε η εμπλοκή του ΑΡ-1 στην επαγόμενη από τον FGF-2 έκφραση και έκκριση της HARP. Η επίδραση του FGF-2 στα κύτταρα LNCaP, φαίνεται να οφείλεται στη δέσμευση των Fra-1, JunD και της ενεργού μορφής της c-Jun στη ρυθμιστική περιοχή του γονιδίου της HARP. Συμπερασματικά, καταδεικνύεται ο σημαντικός ρυθμιστικός ρόλος του αυξητικού παράγοντα HARP σε ποικίλες βιολογικές διεργασίες των καρκινικών κυττάρων ανθρώπινου προστάτη. Επιπλέον, στην παρούσα εργασία προτείνεται ο ρόλος και ο μηχανισμός δράσης του αυξητικού παράγοντα FGF-2 στα κύτταρα LNCaP, ενώ ταυτόχρονα αντικατοπτρίζεται η πολυπλοκότητα των μονοπατιών αυξητικών παραγόντων που εμπλέκονται στον καρκίνο του προστάτη. / The development and growth of human prostate cancer is mediated by many tumor cell-derived growth factors. Heparin affin regulatory peptide (HARP) seems to be involved in the progression of several tumors of diverse origin. In the present work, we sought to determine if HARP is implicated in human prostate cancer. An antisense strategy for inhibition of HARP expression in the human prostate cancer cell line LNCaP was used to study the role of HARP on cancer cell growth, migration and angiogenic potential in vitro and in vivo. Exogenous human recombinant HARP was mitogenic for LNCaP cells. By decreasing the expression of endogenous HARP, we found that HARP was essential for LNCaP cell migration, as well as anchorage-dependent and independent growth. Endothelial cell functions in vitro and blood vessel formation in vivo induced by LNCaP cells were also inhibited when HARP expression was diminished. Fibroblast growth factor 2 (FGF-2) is a pleiotropic growth factor that has been implicated in prostate carcinoma formation and progression. In the present study we found that exogenous FGF-2 significantly increased human prostate cancer LNCaP cell proliferation and migration. HARP seems to be an important mediator of FGF-2 stimulatory effects, since the latter had no effect on stably transfected LNCaP cells that did not express HARP. Moreover, FGF-2 significantly induced HARP expression and secretion by LNCaP cells and increased luciferase activity of a reporter gene vector carrying the full length promoter of HARP gene. The FGFR1-specific inhibitor SU-5402 blocked the FGF-2-increased HARP gene activation and the consequent protein release, leading to impairment of LNCaP cell proliferation. Treatment of LNCaP cells with the hydrogen peroxide scavenger pyruvate, pointed to the dependence of FGF-2-induced HARP expression and LNCaP cell proliferation on hydrogen peroxide generation, and blockade of FGFR1 activity abrogated the FGF-2-induced production of reactive oxygen species. Activator protein-1 (AP-1) seems to be involved in FGF-2-stimulated HARP expression and secretion by LNCaP cells, as revealed using AP-1 decoy oligonucleotides and point mutation analyses in the HARP gene promoter. Binding of AP-1 complexes consisting of Fra-1, JunD and phospho-c-Jun, to the HARP promoter seems to be amenable for FGF-2 effect. These results point to an important regulator role of HARP in diverse biological activities in human prostate cancer cells. Furthermore, the present work establishes the role and the mode of activity of FGF-2 in LNCaP cells and reflects the many-sidedness of growth factor pathways within prostate cancer.

Aντικείµενο της παρούσας διατριβής είναι η ανάπτυξη και ο έλεγχος τετραδιάστατων υπολογιστικών µοντέλων της απόκρισης καρκινικών όγκων και φυσιολογικών ιστών in vivo σε ακτινοθεραπευτικά σχήµατα καθώς και της απόκρισης καρκινικών όγκων in vivo σε χηµειοθεραπευτικά σχήµατα. Στόχος είναι η χρήση των µοντέλων για τη βαθύτερη κατανόηση και ανάλυση της βιολογίας του καρκίνου και κυρίως για την εξατοµικευµένη βελτιστοποίηση της θεραπευτικής στρατηγικής µε τη διεξαγωγή πειραµάτων in silico (=στον υπολογιστή). Τα εν λόγω πειράµατα βασίζονται στα ατοµικά απεικονιστικά, ιστοπαθολογικά, γενετικά και ιστορικά δεδοµένα του ασθενούς. Τα µοντέλα δοµούνται µε τη χρήση κατάλληλου κυβικού πλέγµατος το οποίο διακριτοποιεί την ανατοµική περιοχή ενδιαφέροντος καθώς και µε ένα πλήθος καινοτόµων αλγορίθµων που αποδίδουν υπολογιστικά τα επί µερους βιολογικά φαινόµενα. Σε κάθε κυψελίδα του πλέγµατος προσοµοιώνονται οι βασικοί βιολογικοί «νόµοι» των κυττάρων όπως ο εξαρτώµενος από την τοπική παροχή οξυγόνου και θρεπτικών ουσιών µεταβολισµός, η υπό συνθήκες διέλευση του κυτταρικού κύκλου, ο υπό συνθήκες κυτταρικός θάνατος (δια της νέκρωσης ή της απόπτωσης), η επιβίωση των κυττάρων µετά από την ακτινοβόληση ή την επίδραση χηµειοθεραπευτικού φαρµάκου, οι µηχανισµοί γεωµετρικής διόγκωσης και συρρίκνωσης του όγκου, η ενεργοποίηση των βλαστικών κυττάρων σε περίπτωση νέκρωσης φυσιολογικού ιστού κτλ. Το πλέγµα σαρώνεται χωροχρονικά και προσοµοιώνονται οι αλλαγές καταστάσεων των υποοµάδων κυττάρων πουβρίσκονται σε κάθε κυψελίδα. Επίσης προσοµοιώνεται η διαφορική συρρίκνωση ή η αύξηση του καρκινικού όγκου η οποία οδηγεί στη µακροσκοπική και απεικονιστικά ορατή αυξοµείωση του µεγέθους του. Από πλευράς µαθηµατικών «εργαλείων» χρησιµοποιούνται η έννοια των κυτταρικών αυτοµάτων, η γενική τεχνική Monte Carlo για την προσοµοίωση στοχαστικών φαινοµένων καθώς και ένα πλήθος νέων προτεινόµενων αλγορίθµων για τη διακριτή περιγραφή επί µέρους φαινοµένων / µηχανισµών. Για λόγους µείωσης του υπολογιστικού κόστους έτσι ώστε αυτό να είναι συµβατό µε την κλινική πράξη, προτείνεται και εφαρµόζεται µια σειρά από προσεκτικές κβαντοποιήσεις σε διάφορες παραµέτρους. Τα µοντέλα που αναπτύχθηκαν προσαρµόστηκαν στην περίπτωση του εγκεφαλικού όγκου πολυµόρφου γλοιοβλαστώµατος και της γύρω από αυτό φυσιολογικής λευκής και φαιάς ουσίας. Ως χηµειοθεραπευτικό φάρµακο θεωρήθηκε η τεµοζολοµίδη (temodal © ή temodar © ). Καταρχή τα µοντέλα ελέχθηκαν σχολαστικά τόσο από πλευράς αριθµητικής ευστάθειας (π.χ. διαφορετικές σειρές σάρωσης του πλέγµατος, χρήση διαφορετικών «σπόρων» στις γεννήτριες τυχαίων αριθµών κτλ.) όσο και από πλευράς ποιοτικής βιολογίας. Ακολούθησε η διεξαγωγή παραµετρικών µελετών η οποία επιβεβαίωσε ηµιποσοτικά τη συµφωνία τους µε την πειραµατική και κλινική συσσωρευµένη γνώση. Η διαδικασία ελέγχου συνεχίστηκε µε την προσοµοίωση πραγµατικών κλινικών µελετών (clinical studies) για συγκεκριµένες περιπτώσεις και µε τη συνακόλουθη διαπίστωση συµφωνίας µεταξύ αυτών και των αποτελεσµάτων των προσοµοιώσεων. Αν και οι κλινικοί έλεγχοι συνεχίζονται, τα µέχρι τώρα αποτελέσµατα συγκροτούν µια σηµαντική βάση αξιοπιστίας των µοντέλων. Τονίζεται πάντως ότι λόγω του ηµιστοχαστικού χαρακτήρα αλλά και της εξαιρετικής πολυπλοκότητας του καρκίνου είναι πρακτικάαπίθανο το αποτέλεσµα µιας προσµοίωσης να συµπίπτει απόλυτα µε τα πραγµατικά κλινικά δεδοµένα. Το κεντρικό συµπέρασµα της διατριβής είναι ότι τα αναπτυχθέντα προσοµοιωτικά µοντέλα είναι ικανά να αποτελέσουν τον πυρήνα ενός αξιόπιστου εικονικού συστήµατος διεξαγωγής ογκολογικών πειραµάτων και εξατοµικευµένης βελτιστοποίησης της ακτινοθεραπευτικής και χηµειοθεραπευτικής στρατηγικής. / Considerable research efforts have focused on the mathematical / computer modeling of the response of tumors and normal tissues to various therapeutic modalities but, unfortunately, current models of such dynamic processes need substantial improvement due to the complexity of the problems addressed and the paucity of large series of clinical data. This thesis presents an effort to overcome a number of current modeling shortcomings by addressing the actual clinical tumor and the surrounding normal tissue in vivo. Therefore, the proposed model simulates the spatiotemporal response of a tumor under different radiotherapeutic and chemotherapeutic fractionation schemes. Modeling of the in vivo response of slowly responding normal tissues to radiotherapy is also addressed. The special case of glioblastoma multiforme (GBM) has been considered as an application paradigm. Concerning chemotherapy, the effect of the temozolomide agent has been computer modeled. The salient points of the model are the following. The imaging data of the patient (e.g. MRI T1 slices), the exact histopathologic type of the malignancy as well as pertinent genetic (e.g. p53 gene status) data are appropriately collected and introduced into the simulation software. The proposed 4-D simulation model which refers predominantly to the cell – tissue level is based on the cell cycle, the oxygen and nutrient supply (as estimated form the imaging data), the cell loss factor, the alpha and beta radiobiological parameters of the linear quadratic (LQ) model and the pharmacokinetic and pharmacodynamic parameters of the drug. Especially for the normal tissues, the tissue homeostatic tendency has been primarily taken into account.All parameters used in the model have already been defined and can in principle be determined either experimentally or clinically. Therefore new mathematics dictated parameters of ambiguous physical meaning are avoided. The chiefly discrete mathematics employed include the generic stochastic Monte Carlo technique, cellular automata constructs, Euclidean geometry metrics etc. Visualization of the simulation predictions has been achieved using virtual reality techniques. The model predictions have shown good agreement with both reason and clinical experience. An at least semi-quantitative agreement of the simulation predictions with the outcome of the RTOG Study 83-02 has strengthened the potential of the model. Long term quantitative testing and adaptation are ongoing. Therefore, after completion of the necessary long term tests and eventual improvements the proposed modeling platform could serve as a patient individualized decision-support system. In this way the medical doctor could make his or her final decision on the selection of the most promising therapeutic scheme by taking into account both, the predicted outcomes of all simulated regimens as well as his or her own medical knowledge and expertise. It is noted, however, that such a computational platform does not intend to replace the medical doctor’s input but to add the possibility to investigate the impact of specific treatment-induced perturbations. Such a system could also serve as an educational platform for professionals and patients by means of virtual reality demonstrations of the likely natural development and treatment responsiveness of specific cancers so that all groups might positively contribute to the discussion about treatment procedure.