Made available in DSpace on 2016-06-02T20:34:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Retido.pdf: 19733 bytes, checksum: 6aad255badc436a06364517de2344ab6 (MD5) Previous issue date: 2014-03-31 / Universidade Federal de Minas Gerais / The project "Metabolic, enzymatic and genetic studies of the endophytic fungus P. brasilianum" resulted in biosynthetic studies of bisphenylpropanoid amides, the brasilimides, confirming the origin of these substances via phenylpropanoid biosynthesis pathway, very unusual in fungi. PAL activity, the first enzyme involved in this biosynthetic route was successfully evaluated and the conditions of PAL production by P. brasilianum were optimized (culture medium and induction of PAL adding Phe to the culture), and the incubation conditions of the enzymatic reaction. The specificity of the PAL enzyme was studied, and the enzyme showed activity toward all substrates tested, including acting as TAL (tyrosine ammonia lyase). In vivo studies throught the addition of different substrates lead to N-acetylation confirmed by spectroscopy data. The genome of the fungus P. brasilianum was sequenced, and extensive studies through bioinformatics lead to the gene encoding PAL enzyme. From molecular biology studies, the enzyme was cloned and expressed as recombinant PAL fused to a SUMO protein and a his-tag at the N- terminus of the protein in pETSUMO vector expressed in E. coli BL21 (DE3) to obtain the best conditions for enzyme overexpression in its soluble form. The purification process of the recombinant enzyme was studied from a single purification step (affinity chromatography) by pH gradient elution, obtaining a high degree of purity confirmed by one-dimensional electrophoresis. The pure recombinant PAL enzyme obtained was characterized by MS and biochemically yielding Km values of 4,8 mM. Recent studies seem to point out that there is a relationship between the production of brasiliamides when the fungus is subjected to stress conditions. The PAL enzyme appears to be involved in defense mechanisms in this fungus, as has been described for plants. / O projeto "Estudos metabólicos, enzimáticos e genéticos do fungo endofítico P. brasilianum" tratou de investigações biossintéticas das amidas bisfenilpropanoídicas, as brasiliamidas, confirmando a origem fenilpropanoídica destas substâncias, muito incomum em fungos. A atividade da enzima Fenilalanina amônia-liase, primeira da rota biossintética, foi avaliada pela primeira vez no fungo em estudo, e as condições da produção de PAL por P. brasilianum foram otimizadas (meio de cultivo e indução ao adicionar fenilalanina ao cultivo), assim como as condições de incubação da reação enzimática. A especificidade da enzima foi determinada a qual se apresentou altamente promíscua em todos os substratos testados, inclusive atuando como TAL (tirosina amônia-liase). In vivo, a adição de diferentes precursores ao meio de cultivo levou a N-acetilação destes confirmado por dados espectroscópicos. O genoma do fungo P. brasilianum foi sequenciado, e através de extensos estudos de bioinformática pode-se determinar o gene que codifica a enzima PAL. A partir de estudos de biologia molecular foi possível clonar e expressar a enzima PAL recombinante fusionada a uma proteína SUMO e uma cauda polihis no N-terminal da proteína em vetor pETSUMO expresso em E. coli BL21(DE3) obtendo-se, dessa maneira, as melhores condições para superexpressão enzimática na forma solúvel. O processo de purificação da enzima recombinante foi estudado a partir de um único passo de purificação (coluna de afinidade) por gradiente de pH, obtendo alto grau de pureza comprovado através de eletroforese monodimensional. A enzima PAL recombinante pura obtida foi caracterizada por MS e bioquimicamente obtendose valores de Km de 4,8 mM. Estudos parecem deixar claro que exista uma relação entre a produção de brasiliamida A quando o fungo é submetido a situações de estresse, seguindo mesmo comportamento relatado em plantas e, portanto, a enzima PAL parece estar envolvida em mecanismos de defesa neste fungo.

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:36:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2236.pdf: 4508455 bytes, checksum: da224f07c31e180bc11a5171a3f168f6 (MD5) Previous issue date: 2009-02-12 / Universidade Federal de Minas Gerais / In the present work it was developed analytical methodologies for investigation of biosynthesis of bis-phenylpropanoyl amides, using labeled precursors in the culture medium. The effect of different nitrogen sources on the bis-phenylpropanoyl amides production was also evaluated. These amides are reported as antiparasitary compounds and they also showed activity against gram-positive Bacillus subtilis in bioassays conducted at LaBioMMi (DQ/UFSCar). The analytical methodologies developed were based on High Performance Liquid Chromatography (HPLC) and Mass Spectrometry techniques, mainly electrospray ionization (ESI) and MS/MS. Using the methodologies developed for preparative liquid chromatography it were isolated the bis-phenylpropanoyl amides, brasiliamide A and B and other secondary metabolites co-produced. Liquid chromatography coupled with mass spectrometry techniques allowed fragmentation studies which lead to selective detection experiments of brasiliamides in mediums enhanced with different nitrogen sources. The quantitative analysis (HPLC/UV-MS/MS) indicated great influence of the amino acid L-phenylalanine on the bis-phenylpropanoyl amides production. From these results, the biosynthesis of the phenylapropanoids was investigated using [2-13CPhe]. The RMN 13C and HPLC/UV-MS analysis showed the incorporation of two amino acid units on brasiliamides structure formed by the phenylpropanoids pathway, which is uncommon in fungi. The first phenylpropanoid pathway step was evaluated throw using enzymatic extract with Phenylalanine ammoniolyase (PAL). The HPLC/UV analysis indicates the formation of cinnamic acid from Lphenylalanine. / ESTUDOS BIOSSINTÉTICOS DE AMIDAS BIS-FENILPROPANOÍDICAS PRODUZIDAS PELO FUNGO Penicillium brasilianum, UM ENDOFÍTICO DE Melia azedarach. Foi o título do trabalho no qual foram desenvolvidas metodologias de análise para a investigação da biossíntese de amidas bisfenilpropanoídicas, pela adição de precursores isotopicamente marcados ao meio de cultura e otimização da produção destas amidas pelo micro-organismo quando submetido à variadas fontes nitrogenadas. As amidas, substâncias relatadas como bons antiparasitários, apresentaram também atividade contra a bactéria gram-positiva Bacillus subtilis. As metodologias de análise desenvolvidas foram baseadas em cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) e técnicas de espectrometria de massas com ionização por Electrospray (ESI). A utilização da técnica de cromatografia líquida em escala preparativa permitiu o isolamento das amidas bis-fenilpropanoidicas, brasiliamida A e B e ainda, metabólitos secundários co-produzidos com estes compostos. A utilização do acoplamento entre as metodologias de análise LC/MS permitiu, através de estudos de fragmentação MS/MS, determinar condições otimizadas para a detecção seletiva das amidas nos meios de cultura, enriquecidos com diferentes fontes nitrogenadas. As análises quantitativas por HPLC/UV-MS/MS indicaram que o aminoácido L-fenilalanina intensifica a produção das brasiliamidas no extrato fúngico, e, a partir destes resultados, a rota biossintética dos fenilpropanóides produzidos pelo fungo P. brasilianum foi avaliada com a adição de [2-13C-Phe]. As análises dos extratos enriquecidos com aminoácido isotopicamente marcado via RMN 13C e HPLC/UV-MS, indicaram a incorporação de duas unidades do aminoácido L-fenilalanina na estrutura das brasiliamidas e a rota biossintética foi estabelecida a partir do caminho geral dos fenilpropanóides, metabólitos pouco reportados em fungos. A primeira etapa da rota biossintética foi avaliada usando extratos de ensaios enzimáticos com a enzima Fenilalanina Amônioliase (PAL), onde se visualizou a formação do ácido cinâmico a partir do aminoácido Phe através de monitoramento por HPLC/UV.

O estudo fitoquímico das folhas de Ocotea catharinensis (Lauraceae) resultou no isolamento da neolignana tetraidrofurânica veraguensina (1) e do flavonóide glicosilado afzelina (10), ainda não descritas para a espécie, além de quatro neolignanas hexaidrobenzofurânicas (2-5) anteriormente descritas para mesma. Nos embriões somáticos in vitro constatou-se o acúmulo de duas neolignanas hexaidrobenzofurânicas (2, 3) e duas biciclo[3.2.1]octânicas (6, 7), dois sesquiterpenos (8, 9) e um fenilpropanóide (11). A neolignana biciclo[3.2.1]octânica (7S,8R,1\'R,2\'R,3\'R)-2\'-acetoxi-3,4-metilenodioxi-3\',5\'-dimetoxi-4\'-oxo-Δ1,3,5,5\',8\'-8.1\',7.3\'-neolignana (7), o sesquiterpeno (-)-eudesm-11-em-4α-ol (9) e o fenilpropanóide 6-metóxieugenol (11) não haviam sido isolados anteriormente desta espécie. O perfil dos metabólitos secundários incluiram análises do óleo essencial das folhas cuja análise indicou a predominância de mono- e sesquiterpenos e ausência de fenilpropanóides. Além disso, foram avaliadas atividades antifúngica e antioxidante nos extratos e substâncias isoladas. A fração de CHCl3 do extrato etanólico mostrou atividade antifúngica contra Cladosporium cladosporioide ou C. sphaerospermum. As frações de CHCl3 e de AcOEt do extrato etanólico, as neolignanas hexaidrobenzofurânica (5), biciclooctânica (6), o flavonóide glicosilado (10) e o fenilpropanóide (11) apresentaram atividade antioxidante através do método de DPPH (1,1-difenil-2-picril-hidrazila). A avaliação de hipóteses biossintéticas envolvidas na formação de neolignanas em O. catharinensis fizeram uso de culturas embriogênicas como modelo experimental. Foram realizados diversos estudos de bioconversões de precursores como o isoeugenol e 5-metoxieugenol utilizando-se suspensões celulares e frações enzimáticas porém as conversões in vivo utilizando-se precursores marcados e os embriões foram melhor sucedidas. Entre os precursores radioativos, a L-[U-14C]-fenilalanina foi incorporada às neolignanas hexaidrobenzofurânicas (2, 0,30% e 3, 0,19%) e biciclooctânica (6, 0,12%). No caso do ácido [8-14C]-ferúlico, esse foi incorporado à neolignana hexaidrobenzofurânica (2, 0,17%). Por outro lado, o uso de L-[1-13C]-fenilalanina e análise por espectrometria de massas-massas confirmou o enriquecimento de 13C nas neolignanas hexaidrobenzofurânicas (2 e 3). A análise por RMN de 13C indicou o enriquecimento de 4,3 e 5,0% nos carbonos C9 e C9\', respectivamente. Desta maneira, através dos dados de incorporação desses precursores, desvenda-se parte da via biossintética de neolignanas em O. catharinensis. / The phytochemical study of Ocotea catharinensis (Lauraceae) leaves resulted in the isolation of tetrahydrofuran neolignan veraguensin (1) and glycosylated flavonoid afzelin (10), not yet described for this species, besides four hexahydrobenzofuran neolignans (2-5), which had been previously described. The in vitro somatic embryos showed the accumulation of two hexahydrobenzofuran (2, 3) and two bicyclo[3,2,1]octane (6, 7) neolignans, two sesquiterpenes (8, 9) and one phenylpropanoid (11). Among these compounds (7S,8R,1\'R,2\'R,3\'R)-2\'-acetoxy-3,4-methylenedioxy-3\',5\'-dimethoxy-4\'-oxo-Δ1,3,5,5\',8\'-8.1\',7.3\'-neolignan (7), (-)-eudesm-11-en-4α-ol (9) and 6-methoxy-eugenol (11) have not been previously described for this species. The profile of secondary metabolite included the analysis of essential oil of leaves which indicated the predominance of mono- and sesquiterpene and no phenylpropanoids. In addition, antifungal and antioxidative activities were performed with extracts and isolated compounds. The CHCl3 fraction of ethanol extract exhibited antifungal activities against Cladosporium cladosporioide or C. sphaerospermum. The CHCl3 and EtOAc fractions of ethanol extract, the hexahydrobenzofuran (5) and a bicyclo[3.2.1]octane (6) neolignans, afzelin (10) and 6-methoxy-eugenol (11) displayed antioxidant activities using DPPH (1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl). The evaluations of biosynthetic hypothesis for neolignan formation in O. catharinensis were based on the use of embriogenic culture as an experimental model. Several assessment for conversion of putative precursors such as eugenol and 5-methoxyeugenol were evaluated using suspension cells and cell free preparations but none of them were as effective as in vivo conversion using labeled precursors directly in embryos. Among the radioactive precursors L-[U-14C]-phenylalanine was incorporated to hexahydrobenzofuran (2, 0.30%; 3, 0.19%) and bicyclo[3.2.1]octane (6, 0.17%) neolignans while [8-14C]-ferulic acid was incorporated only to the hexahydrobenzofuran neolignan (2, 0,17%). The tandem mass spectrometry analysis confirmed the incorporation of 13C atoms in the neolignans (2, 3) indicating the incorporation of one or two molecules of L-[1-13C]-phenylalanine. The analysis of 13C NMR data revealed the enrichment of 4.3 and 5.0% at the positions C9 and C9\', respectively. In summary, the labeling experiments have contributed to unravel the biosynthesis of neolignans in O. catharinensis.

O estudo fitoquímico de Peperomia oreophila revelou a presençca de duas lignanas furofurânicas (7R, 8R, 7R, 8R)-3,4,5-trimetóxi-3,4-metilenodioxi-5-metóxi- 8.8,7.O.9,7.O.9-lignana (1), (7R, 8R, 7R, 8R)-3,4,5-trimetóxi-3,4,5-trimetóxi- 8.8,7.O.9,7.O.9-lignana (2); as duas amidas (2E)-N-isobutil-3-(5-metóxi-7,8- benzodioxol-1-il)acrilamida (3), (2E)-N-isobutil-3-(3,4,5-trimetóxifenil)acrilamida (4), três derivados de acido cinâmico (2E)-3-(3,4,5-trimetóxifenil)acrilato de metila (5), (2Z)-3- (3,4,5-trimetóxifenil)acrilato de metila (6), (2E)-3-(5-metóxi-7,8-benzodioxol-1-il)acrilato de metila (7); os dois policetídeos fenólicos [(2E)-3,7-dimetilocta-2,6-dien-1-il]-5- metil-2-(3-metilbut-2-en-1-il)benzeno-1,3-diol (8) (inédita) e [(2E)-3,7-dimetilocta- 2,6-dien-1-il]-2,2,7-trimetil-2H-cromen-5-ol (9); de P. arifolia: o policetídeo fenólico [(2E)-3,7-dimetilocta-2,6-dien-1-il]-5-metil-2-(3-metilbut-2-en-1-il) benzeno-1,3-diol, isolada também de P. oreophila (10) (inédita); de P. urocarpa: o policetídeo fenólico 5- metil-2-[(2E,6E)-3,7,11-trimetildodeca-2,6,10-trien-1-il] benzeno-1,3-diol (11) e o ácido 2,4-dihidróxi-6-metil-3-[(2E,6E)-3,7,11-trimetildodeca-2,6,10-trien-1-il] benzóico, (12); de P. nitida: o fenilpropanoide apiol (1-alil-3,6-dimetóxi-10,11- benzodioxol) (13), os cromenos 7-hidróxi-2,2,5-trimetil-2H-cromeno-carboxilato de metila (14) e o 7-metóxi-2,2,5-dimetil-2H-cromeno-6-carboxilato de metila (15). O policetídeo 2-hidróxi-4,6-dimetóxiacetofenona, principal metabólito das folhas de P. glabella, teve sua biossíntese investigada utilizando-se como precursores o acetil-CoA e o malonil-CoA. Foram realizados estudos de otimização da atividade de policetídeo sintase (PKS) em função do pH, tempo de reação, temperatura e saturação de substratos, além de estudos da variação circadiana. Estudos de genes de PKS resultaram em amplificações cujo seqüenciamento poderá determinar a identidade dessas regiões e homologia entre as seqüências dessas Peperomias e a região KS do gene AviM de Streptomyces viridochromogenes que expressa o ácido orselínico / The phytochemical investigation carried out on Peperomia oreophila revealed the accumulation of two furofuran lignans (7R,8R,7R,8R)-3,4,5-trimethoxy-3,4- methylenedioxy-8.8, 7.O.9, 9.O.7-lignan (1), (7, 8R, 7R, 8)-3,4,5-trimethoxy-3,4,5- trimethoxy-8.8-7.O.9, 9.O.7-lignan (2); two amides (2´E)-N-isobutyl-3´-(5-methoxy-7,8- benzodioxol-1-yl) acrylamide (3), (2E)-N-isobutyl-3-(3,4,5-trimethoxyphenyl)acrylamide (4), three derivate cinâmic acid methyl (2E)-3-(3,4,5-trimethoxyphenyl)acrylate (5), methyl (2Z)-3-(3,4,5-trimethoxyphenyl)acrylate (6), methyl (2E)-3-(5-methoxy-7,8- benzodioxol-1-yl)acrylate (7); two phenolic polyketides [(2E)-3,7-dimethylocta-2,6- dien-1-yl]-5-methyl-2-(3-methylbut-2-en-1-yl)benzene-1,3-diol (8) (novel), [(2´E)-3´,7´- dimethylocta-2´,6´-dien-1-yl]-2,2,7-trimethyl-2H-chromen-5-ol (9); P. arifolia, two phenolic polyketide [(2E)-3,7-dimethylocta-2,6-dien-1-yl]-5-methyl-2-(3-methylbut-2- en-1-yl)benzene-1,3-diol, also isolated from P. oreophila (10) (novel); P. urocarpa, the two phenolic polyketides 5-methyl-2-[(2E,6E)-3,7,11-trimethyldodeca-2,6,10-trien-1- yl]benzene-1,3-diol (11) and 2,4-dihydroxy-6-methyl-3-[(2E,6E)-3,7,11-trimethyldodeca- 2,6,10-trien-1-yl]benzoic acid (12); P. nitida, the phenylpropanoid apiole 1-allyl-3,6- dimethoxy-10,11-benzodioxole (13); the chromenes methyl 7-hydroxy-2,2,5-trimethyl- 2H-chromene-6-carboxylate (14) and methyl 7-methoxy-2,2,5-trimethyl-2H-chromene-6- carboxylate (15). The polyketide 2-hydroxy-4,6-dimethoxyacetophenone, the major compound in P. glabella leaves, had its biosynthetic origin investigated using acetyl-CoA and malonyl-CoA as precursors. The enzymatic activity of polyketide synthase was optimized to pH, incubation time, temperatures and substrate saturation, in addition to the analysis of circadian variation activity. The amplifications of putative PKS genes was based on primers from AviM gene of Streptomyces viridochromogenes that express for orsellinic acid. The sequencing will enable the identification of such regions and also to study the homology to fungi PKS

As sementes do cacaueiro (Theobroma cacao L.) constituem a única fonte de manteiga de cacau, matéria prima fundamental para as indústrias de chocolates e confeitos, farmacêutica e cosmética. Cerca de 50 % do peso seco das sementes é composto por gordura, caracterizada pelo alto nível de estearato (30-37%), em combinação com palmitato (24-31%) e de oleato (33-39%), conferindo-lhe uma composição triglicerídica única, responsável pelas suas propriedades de fusão, com aplicações específicas e especiais. Apesar dos genes que codificam as enzimas da via metabólica de biossíntese de ácidos graxos e triglicerídeos em plantas serem conhecidos, os mecanismos moleculares pelos quais as plantas controlam a produção de estearato e que diferenciam as plantas acumuladoras de estearato de todas as demais não estão claramente definidos. O objetivo deste trabalho foi analisar a composição de ácidos graxos nos frutos de Theobroma cacao e a expressão temporal de genes relacionados à via metabólica de ácidos graxos e triglicerídeos durante o desenvolvimento de sementes de T. cacao, com ênfase na acumulação de estearato. Em paralelo, foram eleitos os genes referências mais estáveis para os estudos em embriões e diversos tecidos de Theobroma cacao. Empregando-se a técnica de reação quantitativa da amplificação em cadeia de transcritos reversos de RNA (RT-qPCR), foram analisadas a expressão dos genes codificadores da proteína carregadora de acil A, B e C, \'beta\'-cetoacil-ACP sintase II, \'delta\'9estearoil-ACP desaturase A e B, Acil-ACP tioesterase A, acil-ACP tioesterase B, acil-CoA sintetase A e B e da proteína oleosina. Quando se estudou de expressão gênica apenas nos embriões de T. cacao, os três genes mais estáveis foram proteína ribossomal L35, proteína carregadora de acil A e gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase. Quando se considerou diversos tecidos de plantas de Theobroma cacao, os melhores genes para a normalização dos valores de expressão foram os codificadores da proteína ribossomal L35, proteína carregadora de acil B e gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase. A acumulação de transcritos da \'delta\'9estearoil-ACP desaturase foi relacionada ao aumento do ácido oleico. O aumento na quantidade deste ácido acontece pela ação conjunta da \'delta\'9estearoil-ACP desaturase, e acil-ACP tioesterase A, a qual mostra maiores níveis de transcritos entre 90 e 140 DAP com pico aos 100 DAP. O aumento de ácidos esteárico estaria relacionado com a ação conjunta e com transcrição temporalmente coordenada dos genes das enzimas \'beta\' -cetoacil-ACP sintase II, Acil-ACP tioesterase A e Acil-ACP tioesterase B. Transcritos da enzima \'beta\' -cetoacil-ACP sintase II apresenta pico aos 100 DAP, possivelmente com acúmulo máximo de substratos 18:0-ACP, que poderiam ser hidrolizado preferencialmente pela enzima acil-ACP tioesterase A, ou acil-ACP tioesterase B, O intervalo entre o pico de acúmulo de trasncritos entre \'beta\'-cetoacil-ACP sintase II (100 DAP) e Acil-ACP tioesterase A e \'delta\'9estearoil-ACP desaturase (110 DAP) sugere que poderia ocorrer um acúmulo de estearato resultante da ação dessas enzimas. Esses resultados corroboram o modelo de acumulação de estearato proposto por Silva (2005) / Cacao seeds (Theobroma cacao L.) are unique sources of cocoa butter, fundamental raw material for the chocolate, confectionary, cosmetic and pharmaceutical industries. Around 50% of the seed dry weight represents fat, characterized by the high levels of stearate (30-37%), in combination of palmitate (24-31%) and oleate (33-39%), giving a unique triacylglycerol compostion, responsible for the melting profile for special and specific applications. Despite the fact that genes encoding enzymes of the fatty acid and triglyceride biosynthetic pathway of plants are known, the mechanisms to control the accumulation of high levels of stearate, that differ from other species, are not clearly defined. The objective of this work was to analyse the composition of fatty acids and the expression of genes associated with fatty acid and triglyceride biosynthetic pathway during the development of cacao pods, with emphasis with stearate accumulation. In parallel, the establishment of stable reference genes to investigate gene expression in developing embryos and other cacao tissues were investigated. Using the quantitative amplification of reversed transcripts (RT-qPCR), the expresion of genes coding for the acyl-carrier protein A, B and C; \'beta\'-ketoacyl-ACP sinthase II; \'delta\'9stearoyl-ACP desaturase A and B; Acyl-ACP thioesterase A; Acyl-ACP thioesterase B; Acyl-CoA sintethase A and B; and oleosin. When gene expression was conductd only in developing cacao embryos, the three most stable genes were the ribosomal protein L35, acyl-carrier protein A and glyceraldehide 3-phosphate dehydrogenase. When various tissues were considered, the best reference genes for gene expression normalization were those encoding for the ribosomal protein L35, acyl carrier protein B and glyceraldehide 3-phosphate dehydrogenase. The accumulation of \'delta\'9stearoyl-ACP desaturase transcripts could be associated with the accumulation of oleate, together with the increase of acyl-ACP thioesterase A, with increased relative levels of transcripts between 90 and 140 DAP, peaking at 100 DAP. The increase in stearate might result from the joint activity of the \'delta\'9stearoyl-ACP desaturase and acyl-ACP thioesterase A, which presented higher accumulation of transcripts between 90 and 140 DAP, with peak at 110 DAP. The increase in stearate would associated with the joint and temporal coordinated expression of genes encoding \'beta\'-ketoacyl-ACP synthase II, and Acyl-ACP thioesterase A and B. Transcripts of the enzyme \'beta\'-ketoacyl-ACP synthase II peaked at 100 DAP, possibly with the maximum accumulation of substrates 18:0-ACP, that would be preferentially hydrolzyed by the enzyme acyl-ACP thioesterase A, or acyl-ACP thioesterase B, The gap between the peak in transcript accumulation between \'beta\'-ketoacyl-ACP synthase II (100 DAP) and acyl-ACP thioesterase A and \'delta\'9stearoyl-ACP desaturase (110 DAP) could lead to the accumulation of stearate. These results corroborated the model proposed by Silva (2005)

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Alterations in these genes can change the final composition of starch and alter the quality of the rice grain after cooking. The quality of grain is influenced by the physico-chemical properties of starch. Through the associative mapping is possible to identify genes related to a quantitative trait and, therefore, using molecular markers of this gene as tools for assisted selection in breeding programs using access genebanks.This work had as objective identify and validate the association between amylose content (TA) and gelatinization temperature (TG) with molecular markers microsatellites and SNP of genes involved in starch metabolic route.Were used 242 accessions of rice core collection of Embrapa Arroz e Feijão, separated according to cropping system upland and lowland.The accessions were also classified for TA, based on the analysis conducted in 2004 and 2005, and TG analysis in 2007. The genetic analyzes were conducted using 36 molecular markers, 7 are those described in the literature, three microsatellite (SSR), 1 Sequence Tagged Sites (STS), 2 cleaved amplified polymorphic Sequence (CAPS) and the set of pairs of F7-F22-R1-R21 primers. The other markers were developed for this work in the Biotechnology laboratory of the Embrapa Arroz e Feijão, 6 markers are based on SSR and 26 SNP.For SSR markers were identified 70 alleles, with an average of 8.75 alleles per locus. The genetic diversity (He) was higher for access to lowland (0.72) compared to accesses with upland, that had a mean of 0.55. Found SNP/Indel 10 markers when the mini core collection was sequenced. The nucleotide diversity was low, with an average of 0.0054. CA-2 marker gene which expresses the enzyme glucose-6-phosphate isomerase, showed the greatest number of polymorphisms, with 9 SNP/Indel. Based on the genetic similarity dendrogram constructed with data from the SSR loci,was found genetic difference in the cropping system and the TA. Nine markers were significantly associated (p <0.05) with one of the characteristics. These six markers were associated with TA. The marker W2R, the waxy gene, was the one that best explained the variation of TA (82%). Eight markers were associated with TG. The F7-F22-R1-R21 together best explained the variation (66%).The factorial correspondence analysis has shown that the set of SSR loci literature together coms developed for this work are efficient in allocating access between TA classes. This work allowed the identification of not random associations between loci and starch characteristics of economic interest. Validating markers described in the literature and new markers, opening new prospects for the use of these markers in the early selection for TA and TG in rice. / A síntese do amido envolve vários genes que interagem em cascata. Mutações nestes genes interferem na composição final de amido e consequentemente na composição e qualidade do grão de arroz,pelo fato da composição físico-química do amido ter grande influência nas propriedades do grão. Por meio do mapeamento associativo é possível identificargenes relacionados às características quantitativas e, com isso,utilizar marcadores moleculares destes genes como ferramenta para seleção assistida em programas de melhoramento, que utilizam como base bancos de germoplasma. Este trabalho teve como principal objetivo identificar e validar a associaçăo entre o teor de amilose (TA) e temperatura de gelatinização (TG) com marcadores moleculares microssatélites e SNP de genes envolvidos na rota metabólica do amido. No desenvolvimento do trabalho foram utilizados 242 acessos da coleçăo nuclear de arroz da Embrapa Arroz e Feijão, que estão classificados de acordo com sistema de cultivo sequeiro e irrigado. Os acessos também foram classificados quanto ao TA, de acordo com análise realizada em 2004 e 2005, e à TG,avaliada neste trabalho. Foi construída uma mini coleção com 24 acessos contrastando quanto ao sistema de cultivo e ao TA. Como resultado, foi observado que a maior parte dos 242 acessos possuem TG intermediária, entre 69ºC e 73ºC. Para a análise genética foram utilizados36 marcadores moleculares, destes7estão descritos na literatura, sendo três microssatélite (SSR), 1Sequence Tagged Sites (STS),2Cleaved Amplified Polymorphic Sequence (CAPS) e o conjunto de pares de primers F7-F22-R1-R21.Os outros marcadores foram desenvolvidospara este trabalho no laboratório de biotecnologia da Embrapa Arroz e Feijão, sendoque 6 marcadores sãobaseados em SSR e 26 em SNP. Para o conjunto de marcadores SSR foram identificados 70 alelos, com média de 8,75 alelos por loco.A diversidade genética (He)foi maior para os acessos com sistema de cultivo irrigado (0,72) quando comparado aos acessos com sistema de cultivo sequeiro que tiveram média igual a 0,55. Foram encontrados SNP/Indel em 10 marcadores quando a minicoleção nuclear foi sequenciada.A diversidade nucleotídica foi baixa, com valor médio de 0,0054. O marcador CA-2, do gene que expressa a enzima Glucose-6-phosphate isomerase, apresentou o maior número de polimorfismos, com total de 9 SNP/Indel.Com base no dendrograma de similaridade genética, construído com os dados dos locos SSR, foi posssível diferenciar os acessos quanto ao sistema de cultivo e ao TA.Nove marcadores apresentaram associaçăo significativa (p <0,05) comuma das característicasavaliadas, sendo que seismarcadores foram associados com oTA. O marcador W2R, do gene waxy, foi o que mais explicou a variação de TA (82%). Para TG foiencontrada associação com 8 marcadores, sendo que o conjuntoF7-F22-R1-R21 explicou melhor a variação (66%). A análise fatorial de correspondęncia demostrou que o conjunto de locos SSRda literatura em conjunto coms desenvolvidos para este trabalho são eficientes em discriminar os acessos entre as classes deTA. Este trabalho possibilitou a identificaçãode associaçőes năo aleatórias entre locosecaracterísticas do amido de interesse econômico.Validando marcadores descritos na literatura e marcadores nunca testados,abrindo novas perspectivas quanto ao uso desses marcadores na seleçăo precoce para TA e TGem arroz.

Embriões somáticos de Ocotea catharinensis foram utilizados como modelo para a investigação da via biossintética para a formação de neolignanas com esqueleto benzofurânico, através do uso de precursores marcados com 13C e análise dos produtos por RMN de 13C. Isotopômeros de L-[13C]-fenilalanina administrados aos embriões, foram incorporados às neolignanas 5\'-metoxiporosina e armenina B . Entre os precursores intermediários, o acetato de [8-13C]-coniferila, preparado a partir da condensação de Knoevenagel seguido de várias etapas, foi incorporado na neolignana 5\'-metoxiporosina. No ensaio de bioconversão utilizando frações proteicas das culturas dos embriões de O. catharinensis, o acetato de coniferila foi convertido em isoeugenol que, junto com o eugenol, seriam os precursores hipotéticos para a formação dessas neolignanas. A análise filogenética de diversas espécies de Lauraceae indicou a proximidade entre espécies do gênero Ocotea, produzindo como principais metabólitos lignanas e neolignanas. Foi obtida a seqüência parcial do gene de proteína dirigente em O. catharinensis e O. macrophylla e a análise filogenética baseada na homologia das seqüências de proteína dirigente de Ocotea e de espécies de diferentes gêneros, indicaram um clado distinto formado para espécies de Ocotea. Estes dados dão suporte para a proposta de que neolignanas di-hidrobenzofurânicas seriam oriundas do acoplamento oxidativo entre unidades de E-isoeugenol e 5-metóxi-eugenol, com possível participação de proteína dirigente na regio- e estereoespecificidade das reações de dimerização . Baseando-se nestes resultados foi possível propor algumas etapas envolvidas na biossíntese de neolignanas. / Somatic embryos of Ocotea catharinensis were used as model to investigate the biosynthetic pathway of benzofuran neolignans formation by means of feeding precursors followed by analysis with 13C NMR. Isotopomers of L-[13C]-phenylalanine were administered to embryos and incorporated into di-hydrobenzofuran neolignans. Among the intermediate precursors, [8-13C]-coniferyl acetate, prepared by Knoevenagel and several steps, was incorporated in the neolignan 5\'-methoxyporosin. The studies of bioconversion using protein fraction obtained from the embryogenic cultures, the precursor coniferyl acetate was converted into isoeugenol, which together eugenol, is one of the putative precursors to the neolignans formation. Phylogenetic analysis of several species of Lauraceae indicated the proximity of Ocotea species producing lignans and neolignans as the main metabolites. A partial sequence of the dirigent protein gene from O. catharinensis and O. macrophylla were obtained and the phylogenetic analysis based on homology of dirigent protein sequences from Ocotea and from different plant genus indicated a distinct clade formed by Ocotea species. These findings support the hypothesis that the dihydrobenzofuran neolignans would be derived from the oxidative coupling between E- isoeugenol and 5- methoxy-eugenol and the dirigent protein would be involved in the regio- and stereospecificity of the dimerization reactions. Thus, it was possible to suggest some of the steps involved in the biosynthesis of neolignans.

A biodiversidade microbiana de diferentes ecossistemas tem incentivado estudos químicos e biológicos com micro-organismos dos mais variados habitats, os quais têm conduzido à obtenção de moléculas bioativas com aplicações na medicina, indústria química e agricultura, proporcionando melhorias na qualidade de vida ao homem. O presente trabalho teve como objetivos a bioprospecção por actinobactérias endofíticas e seus metabólitos, além do estudo da via biossintética dos sesquiterpenos aristoloquenos produzidos pelo fungo fitopatogênico Botrytis cinerea. No estudo de bioprospecção foram isoladas 41 linhagens de actinobactérias endofíticas de duas espécies de Asteraceae (Thitonia diversifolia e Lychnophora ericoides). A identificação através do sequenciamento de DNAr indicou predominância do gênero Streptomyces. As linhagens foram cultivadas em meio de arroz e os extratos etanólicos submetidos aos ensaios de citotoxicidade frente a células tumorais e antimicrobiano. Um total de 58,5% dos extratos apresentou atividade em pelo menos um dos ensaios realizados. Foram selecionadas as linhagens Streptomyces cattleya RLe 4 e Streptomyces sp. RLe 8 para cultivo em escala ampliada, isolamento e identificação de metabólitos bioativos. O isolamento dos compostos foi realizado através de diferentes técnicas cromatográficas e a identificação estrutural foi baseada em dados de ressonância magnética nuclear de 1H e 13C e espectrometria de massas. De S. cattleya RLe 4 foram isolados quatro compostos: 2-hidroxibenzamida, desferrioxamina E, 1-(3\',4\'-dimetoxifenil)-1-propanona e 1-(3\',4\'-dimetoxifenil)-1-etanona. Dos extratos de Streptomyces sp. RLe 8 foram isolados dez compostos: benzamida, 3- hidroxibenzamida, 3-hidróxi-4-metoxibenzamida, 4-hidróxi-3-metoxibenzamida, 3,4- dimetoxibenzamida, 2-fenilacetamida, dois isômeros de 3,4-diidro-3,4,6,8-tetraidróxi-1(2H)- naftalenona, 2,3-diidro-2,2-dimetil-4(1H)-quinazolinona e desferrioxamina B. O composto 2,3-diidro-2,2-dimetil-4(1H)-quinazolinona apresentou elevada atividade frente as células de câncer de cólon (HCT-8) e glioblastoma (SF295), com 93,9 % e 87.0 % de inibição, respectivamente. O outro enfoque da tese envolveu a otimização da produção de sesquiterpenos aristoloquenos por linhagens de B. cinerea, seguido de estudo biossintético destes produtos naturais através de experimentos de incorporação de precursores isotopicamente enriquecidos com 2H (deutério) e 13C (carbono treze). As análises dos dados obtidos de RMN de 2H e de 13C do sesquiterpeno majoritário indicaram que a biossíntese desta substância ocorre pela via do mevalonato (MVA). Os resultados também sugeriram o possível envolvimento da via do metil-eritritolfosfato ou 1-desoxi-D-xilulose-fosfato (MEP/DPX) na biossíntese deste sequiterpeno. Estes resultados podem contribuir para o planejamento racional de fungicidas seletivos com aplicação na agricultura. O trabalho desenvolvido mostrou o grande potencial de actinobactérias endofíticas para a obtenção de moléculas bioativas e que estudos usando precursores isotopicamente marcados fornecem informações precisas acerca da origem biossintética de produtos naturais. / The microbial biodiversity from different ecosystems has incited chemical and biological studies with microorganisms from several habitats, leading to the isolation of bioactive natural products with applications in medicine, chemical industry and agriculture, and thus contributing to a better quality of life. This thesis aimed the biopropecting on endophytic actinobacteria and their natural products, and also the biosynthetic study of aristolochene sesquiterpenes in the phytopathogenic fungus Botrytis cinerea. A total of 41 actinobacterial strains were isolated of two Asteraceae species (Thitonia diversifolia and Lychnophora ericoides) for the bioprospecting study. The rDNA sequencing showed predominancy of Streptomyces genus. All the strains were cultured on rice medium, and the ethanolic extracts were screened in cytotoxity and antimicrobial assays. As a result, 58.5% of the extracts showed activity in al least one bioassay. The strains Streptomyces cattleya RLe 4 and Streptomyces sp. RLe 8 were selected for scale up cultures, isolation and identification of bioactive compounds. Different chromatographic methods were applied for the isolation of compounds, and structural analysis were based on 1H and 13C nuclear magnetic resonance and mass spectrometry data. Four compounds were isolated from S. cattleya RLe 4: 2- hydroxybenzamide, desferrioxamine E, 1-(3\',4\'-dimethoxyphenyl)-1-propanone, and 1-(3\',4\'- dimethoxyphenyl)-1-etanone. Ten compounds were isolated from Streptomyces sp. Rle 8: benzamide, 3-hydroxybenzamide, 3-hydroxy-4-methoxybenzamide, 4-hydroxy-3- methoxybenzamide, 2-phenylacetamide, two isomers of 3,4-dihydro-3,4,6,8-tetrahydroxy- 1(2H)-naphthalenone, 2,3-dihydro-2,2-dimethyl-4(1H)-quinazolinone, and desferrioxamine B. Compound 2,3-dihydro-2,2-dimethyl-4(1H)-quinazolinone showed high antiproliferative activity against colon cancer cells (HCT-8) and glioblastoma cells (SF295), with 93.9 and 87.0% of inhibition, respectively. The second focus of the thesis involved the optimization of aristolochene sesquiterpenes production by two strains of B. cinerea, followed by the biosynthetic study through feeding experiments with 2H (deuterium) and 13C isotopically labeled precursors. The 2H and 13C NMR obtained data showed that the biosynthesis of the sesquiterpene proceeds by the mevalonate pathway (MVA). The results also suggested the possible participation of the non mevalonate pathway, methylerytritol phosphate ou 1-deoxy- D-xylulose phosphate (MEP/DXP), in the biosynthesis. These results might contribute to the rational design of selective fungides with application in agriculture. This thesis showed the endophytic actinobacteria as promising sources of bioactive natural products, and also showed that the isotopically labeled feeding experiments give reliable information about the natural products biosynthetic pathways.

A biomassa vegetal, seja como produto de interesse econômico ou do ponto de vista ecológico, é estritamente dependente do processo fotossintético. O advento das técnicas de biologia molecular e transformação genética de plantas trouxe boas perspectivas para a alteração do processo fotossintético, já que pouco foi conseguido com o melhoramento vegetal tradicional. Modificações genéticas nos LHCs (estruturas responsáveis pela captação e transferência da energia luminosa) mostram-se promissoras. Plantas transgênicas de tabaco (Nicotiana tabacum, L.) que expressam o gene quimérico Lhcb1*2 de ervilha têm sido estudadas por apresentarem uma série de alterações no metabolismo fotossintético, além de um ganho genético em relação à planta selvagem original. Vários autores observaram mudanças morfológicas, fisiológicas, bioquímicas e adaptativas que favorecem estas plantas em diversas condições de cultivo. Diversos experimentos foram realizados no intuito de melhor caracterizar as plantas transformadas com o gene Lhcb1*2 de ervilha. O potencial produtivo foi avaliado através da análise de crescimento e produção de massa seca. O metabolismo fotossintético foi analisado através de medidas de assimilação de CO2, fluorescência da clorofila a, metabólitos do ciclo de Calvin-Benson, glicólise e ciclo de Krebs, carboidratos (amido e sacarose) e aminoácidos. Os resultados obtidos mostram uma redução da taxa de fotorrespiração pelas plantas transgênicas. Esta redução promoveu o aumento do período de crescimento vegetativo e produção de biomassa, à semelhança do que ocorre em plantas cultivadas sob baixa pressão de oxigênio (5%) ou alto CO2. Entretanto, ao contrário do que ocorre nessas condições, a produção de sementes e o peso nas linhagens transgênicas não foram reduzidos. / Plant biomass, seen either from the economic or the ecological points of view, is highly dependent upon photosynthesys. The development of molecular biology and genetic engineering techniques brought great perspectives for the improvement of the photosynthetic process, since few progress had been achieved with traditional plant breeding. Genetic alteration of the LHCs (structures responsible for the capture and distribution of radiant energy) seems promising. Transgenic tobacco plants (Nicotiana tabacum, L.) over expressing the pea Lhcb1*2 gene have been studied. They present several alterations in the photosynthetic metabolism which lead to a genetic improvement of them in relation to the original plant. Many authors observed morphological, physiological, biochemical and adaptative changes which were benefical to these plants to diverse growing conditions. Several experiments were carried out in order to better characterize these transgenic tobacco lines. The potential for production was evaluated, via dry wight and growth rate. The photosynthetic metabolism was analyzed through CO2 assimilation, chlorophyll fluorescence, metabolites of the Calvin-Benson, glycolysis and Krebs cycles, carbohydrates (starch and sucrose) contents and amino acids. The results obtained show a reduction in photorespiration rate in the transgenic plants. Such reduction lead to on extension of the plant growing period and on enlargment of the biomass, similar to what occurs in plants growing under low O2 (5%) or high CO2 conditions. However, in contrast to what normally happens under these conditions, dry weight and seed production were not reduced in the transgenic lines.

Orientador: Nilson Ivo Tonin Zanchin / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-20T22:37:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Morello_LuisGustavo_D.pdf: 80024877 bytes, checksum: 1848ac9901b4322b786b1dcd7a521a69 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: Estudos prévios realizados em nosso laboratório demonstraram a interação entre as proteínas humanas SBDS e NIP7. SBDS participa da biogênese de ribossomos e sua deficiência está associada à síndrome de Shwachman- Bodian-Diamond. NIP7 é uma proteína conservada e já foi caracterizada em levedura, onde participa da formação da subunidade ribossomal 60S. Neste trabalho, nós investigamos o papel de NIP7 na síntese de ribossomos em células humanas. A depleção de NIP7 revelou defeitos no processamento do pré-rRNA associado à produção do rRNA 18S, causando déficit na formação da subunidade ribossomal 40S. Essa divergência de resultados entre a função de NIP7 em levedura e células humanas é consistente com o fato de que NIP7 humana não complementa levedura deficiente em Nip7p. Ainda, um rastreamento em sistema de duplo-híbrido tendo NIP7 humana como isca revelou parceiros de interação diferentes daqueles reportados para Nip7p em levedura. FTSJ3 foi a parceira isolada com maior frequência. FTSJ3 é a provável ortóloga de Spb1p em levedura, a qual está envolvida na formação da subunidade ribossomal 60S. A associação entre FTSJ3 e NIP7 foi demonstrada por ensaios de pull-down e imunoprecipitação, como sendo dependente de RNA. A co-localização nucleolar e co-sedimentação dessas proteínas em fracionamento em gradiente de sacarose corroboram a associação. Além disso, células humanas deficientes em FTSJ3 revelaram defeitos na via de maturação do rRNA 18S, mesma via afetada pela depleção de NIP7. Em adição, a caracterização proteômica de complexos contendo FTSJ3 e NIP7 revelaram que essas proteínas co-purificam complexos pré-ribossomais. Uma comparação entre o conjunto de proteínas que interagem com Spb1p e as proteínas identificadas nos ensaios de pull-down com FLAG-FTSJ3 revelou que elas apresentam apenas um ortólogo em comum, o qual, incrivelmente, é Nip7/NIP7. Essas observações revelaram diferenças significativas na função desses fatores durante a síntese de ribossomos em levedura e células humanas, adicionando NIP7 e FTSJ3 na lista crescente de fatores com funções divergentes nas vias de processamento do rRNA em levedura e humanos / Abstract: Previous studies from our laboratory have demonstrated the interaction between the SBDS and NIP7 human proteins. SBDS play a role in ribosome biogenesis and its deficiency is associated to the Shwachman-Bodian-Diamond syndrome. NIP7 is a conserved protein and has already been characterized in yeast, where it participates in the 60S ribosomal subunit formation. In this work, we investigated the role of NIP7 in ribosome biogenesis in human cells. NIP7 knockdown caused pre-rRNA processing defects associated to the 18S rRNA maturation, leading to deficiency in 40S ribosomal subunit synthesis. The divergence between NIP7 function in yeast and human cells is further supported by the fact that human NIP7 does not complement yeast deficient in Nip7p. In addition, a two-hybrid screen using human NIP7 as bait revealed interaction partners different from those reported for yeast Nip7p. FTSJ3 was isolated as one of the most frequent human NIP7-interacting candidates. FTSJ3 is a putative ortholog of yeast Spb1p, which has been implicated in 60S ribosomal subunit synthesis. The association between FTSJ3 and NIP7 was showed by pull-down and immunoprecipitation assays as an RNA-dependent interaction. Nucleolar colocalization and co-sedimentation on a sucrose gradiente fractionation corroborate this association. Furthermore, RNAi-mediated knockdown revealed that depletion of FTSJ3 causes pre-rRNA processing defects in the pathway leading to 18S rRNA maturation, the same pathway affected by NIP7 downregulation. In additon, proteomic characterization of FTSJ3- and NIP7- containing complexes showed that these proteins copurify pre-ribosomal complexes. A comparison of the set of Spb1p-interacting proteins with the proteins identified in the pulldown with FLAG-FTSJ3 showed that they share only one ortholog which, incredibly, is Nip7/NIP7. These observations revealed significant differences in the function of these factors during the synthesis of ribosomes in yeast and human cells, adding NIP7 and FTSJ3 to the growing list of factors with different functions in yeast and human rRNA processing pathways / Doutorado / Genetica Animal e Evolução / Doutor em Genetica e Biologia Molecular