Recent years have witnessed a growing concern for the ability of firms to effectively manage their new product innovation in the face of disruptive technological changes, increased global competition, and rising costs of research and development. These concerns notwithstanding, firms are additionally required to launch radical new products to the market, as incremental new products provide their developers with only short-term sales and profitability. In response to these challenges, firms have entered into collaborative alliances to share the risks and costs involved in the new product development (NPD) process and to enhance their product innovation performance. Turning research discoveries into marketable radical new products through collaborative alliances is even more important for relatively small firms operating in technologically intensive industries. Such firms are often underfunded and unable to undertake a full NPD cycle internally due to an inability of assembling the right mix of internal capabilities. The inevitable need to access capabilities from alliance partners may lead some small firms to form collaborative alliances under unfavourable situations, which make alliances prone to failure (70% by some estimates) to reach new product innovation goals. The substantial rate of alliance failure is embedded in a clash between the logic of radical new product innovation management (the need for flexibility between alliance partners), and recommendations for alliance management (the need to determine the responsibilities of each partner from the onset of the alliance). Despite the benefits of alliances in providing required resources, alliances can impose substantial transaction costs to focal small firms. Thus, it is crucial to investigate how firms, particularly small firms, can make a balance between the benefits and costs involved in alliances, to mitigate alliance risks and increase the probability of new product radicalness. In this thesis, I introduce a new typology and demonstrate its application to product performance. The typology categorizes alliance partnerships along two dimensions of partnership timing (the stage of the NPD process during which alliance is formed) and partnership type (the role of alliance partner during the NPD process). I use this this typology to determine the interaction effects of partnership timing and type on the probability of product innovativeness (radicalness). To this end, I rely on insights from Transaction Cost Economics (TCE) and Resource Based View of the firm (RBV) theories as well as the absorptive capacity concept to develop testable hypotheses. I use a sample of 230 drugs developed by 85 biotechnology firms in collaborative alliances with 384 alliances in 1982-2016 with universities and research institutes, other biotechnology firms, and pharmaceutical firms formed during discovery, development, and prelaunch stages of the new drug development process. I find that the probability of drug radicalness increases when alliances with universities and research institutes, as well as other biotech firms, are formed during the discovery or development stages of the new drug development. However, results indicate that partnership with pharma firms during the discovery or development stages reduces the likelihood of drug radicalness. During the prelaunch stage, except for negative relation between alliances with other biotech and drug radicalness, results failed to find a significant relationship between university as well as pharmaceutical partnership and drug radicalness. By disintegrating alliances along two dimensions of partnership type and timing, this thesis substantially increases the understanding of the benefits and costs of each partnership type and during each stage of the NPD process. This helps relatively small firms to better understand when and with whom during the process of NPD they need to initiate alliances to increase their likelihood of product radicalness. This thesis also contributes to the current theoretical insights of TCE and RBV theories by considering costs and benefits of each partnership type variant along different stages of the NPD process. Methodologically, instead of focusing on analysis using firm level outcome variables (count number of new products), this thesis turns the unit of analysis to product level (innovativeness of the product) and links each product to its designated alliance attributes (timing and type) to provide more subtle and fine-grained implications. / Thesis / Doctor of Philosophy (PhD)

A L- asparaginase é uma enzima aplicada no tratamento de Leucemia Linfoide Aguda, que atua na hidrólise da L- asparagina, privando a célula tumoral de um aminoácido essencial para o seu crescimento. A L- asparaginase, como outros biofármacos, deve ser estável, manter sua atividade específica e formar poucos agregados. A fim de manter a integridade do biofármaco, são utilizados adjuvantes nas formulações farmacêuticas, e dentre os mais importantes estão os osmólitos. Essas moléculas protegem a estrutura nativa da proteína, sendo capazes de interferir na formação de agregados e garantir a estabilidade proteica. O presente trabalho teve o objetivo de estudar o efeito dos osmólitos sacarose, sorbitol, arginina e glicina na atividade específica, estabilidade, cinética e caracterização de agregados na solução de L- asparaginase II de Erwinia chrysanthemi. Os resultados mostraram que a maioria dos osmólitos testados aumentou a atividade específica e a estabilidade da enzima, o que pode estar relacionado com o aumento da velocidade máxima e do kcat observados no ensaio cinético realizado com sacarose e sorbitol. Um perfil diferente de agregados foi encontrado para cada tipo de osmólito. A presença de sacarose ou sorbitol resultou na menor quantidade de agregados na faixa de, respectivamente, 100 a 200 e 200 a 300 nm em relação a enzima sem osmólito. Por outro lado, aumento no número total de agregados e presença de moléculas de alto peso molecular (300 a 500 nm) foram observados nas soluções enzimáticas contendo, respectivamente, glicina e arginina. Dessa forma, os resultados obtidos neste trabalho poderão auxiliar na produção e escolha da formulação de biofármacos, e, consequentemente, melhorar o tratamento medicamentoso de pacientes. / L L-Asparaginase is an enzyme applied in the treatment of Acute Lymphoblastic Leukemia, which acts on the hydrolysis of L- asparagine, depriving the tumor cell of an essential amino acid for its growth. L-asparaginase, as other biopharmaceuticals, must be stable, maintain its specific activity and form few aggregates. In order to maintain the integrity of the biopharmaceutical, adjuvants are used in the pharmaceutical formulations, and among the most importants adjuvants are the osmolytes. These molecules protect the native structure of the protein, being able of interfering in the formation of aggregates and guarantee protein stability. The present work had the objective of studying the effect of the osmolytes sucrose, sorbitol, arginine and glycine in the specific activity, stability, kinetic and aggregates characterization, in L- asparaginase II solution of Erwinia chrysanthemi. The results showed that the majority of the tested osmolytes increased the specific activity of the enzyme and its stability, which may be related to the augment of maximum velocity and kcat observed in the kinetic assay performed with sucrose and sorbitol. A different profile of aggregates was found for each type of osmolyte. The presence of sucrose or sorbitol resulted in the least amount of aggregates in the range of, respectively, 100-200 and 200-300nm in relation to the enzyme without osmolyte. On the other hand, increase in the total number of aggregates and the presence of high molecular weight molecules (300 to 500 nm) were observed in the enzymatic solutions containing, respectively, glycine and arginine. Thus, the results obtained in this work may help in the production and choice of the formulation of biopharmaceuticals and, consequently, improve the drug treatment of patients.

A avaliação da classe biofarmacêutica dos fármacos assume importância na política de medicamentos genéricos, já que as características de solubilidade e permeabilidade de um fármaco, conforme definidas pelo Sistema de Classificação Biofarmacêutica (SCB), constituem critério essencial para bioisenção na obtenção de registro de genéricos. O propósito do trabalho foi o de determinar a classe biofarmacêutica dos fármacos benzilato de anlodipino, fluconazol e cloridrato de fluoxetina, por meio da determinação de seus parâmetros de solubilidade e permeabilidade. Para o teste de solubilidade, foram desenvolvidos e validados métodos para a quantificação do benzilato de anlodipino, fluconazol e cloridrato de fluoxetina em água e nos tampões farmacopéicos pH 1,2; pH 4,5;pH 6,8 e 7,5. O estudo de solubilidade foi realizado pelo método shake flask num período de 72 horas de agitação a 37°C. A maior dose comercializada no mercado é de 10 mg, 200 mg e 20 mg respectivamente para o besilato de anlodipino, fluconazol e cloridrato de fluoxetina. Os valores de solubilidade para o besilato de anlodipino nos meios avaliados foram de 0,88 a 2,35 mg/mL enquanto intervalo da razão dose: solubilidade (D: S) foi de 4,24 mL a 11,36 mL. Para o fluconazol os valores de solubilidade foram: 8,22 a 14,4 mg/mL, e o intervalo da razão D: S foram de 13,38 mL a 24,33 mL. Já para o cloridrato de fluoxetina a solubilidade foi de 5,12 a 44,36 mg/mL, e o intervalo razão D: S foram de 0,45 a 3,91 mL. De acordo com o SCB, para classifacar um fármaco como de alta solubilidade a dose mais alta cormecializada do fármaco deve ser solúvel em 250 mL de meio aquoso na faixa de pH de 1 a 7,5 a 37º C e um fármaco é considerado como de alta permeabilidade quando a sua fração absorvida seja ≥ 90%. De acordo com esse critério, ambos os fármacos apresentam alta solubilidade. A avaliação da permeabilidade dos fármacos foi realizada por meio da determinação do fluxo de fármaco através de segmentos intestinais de ratos, isolados e contidos em câmaras de difusão vertical da plataforma manual para testes de permeabilidade. Os valores de permeabilidade aparente (Papp) obtidos nos experimentos indicam que o besilato de anlodipino e o fluconazol são fármacos de baixa permeabilidade, portanto, classe III e o cloridrato de fluoxetina alta permeabilidade, classe I. / The Biopharmaceutical Classification System (BCS) concept was established by Amidon and co-workers (1995) and BCS allows expectations regarding correlation between in vitro dissolution data and in vivo bioavailability data. According to the BCS, three major factors govern drug bioavailability: the drug aqueous solubility, the ability of the drug molecules to permeate biologic membranes and drug dissolution from the dosage form. Solubility criteria defined by the FDA to classify a drug as highly soluble requires the highest dose strength to be soluble in 250 mL of aqueous media over the pH range of 1-7.5 at 37°C and a drug is considered with high permeability when its fraction absorbed is ≥ 90%. The purpose of this study was to evaluate the solubility and permeability of amlodipine benzylate, fluconazole and fluoxetine hidrochoride in order to determine them BCS class. The solubility study was performed using the drug over a 72 hours period of agitation as the shake flask method at 37 °C. The results from solubility values are given in mg/mL and dose: solubility ratio is given in mL. The highest dose marketed is 10 mg, 200 mg and 20 mg, respectively for the amlodipine besylate, fluconazole and fluoxetine hydrochloride. The solubility values for the amlodipine besylate in the tested aqueous media range from 0.88 to 2.35 mg/mL, while dose solubility ratio (D: S) values range from 4.24 to 11.36 mL. The values for fluconazole solubility were 8.22 to 14.4 mg/mL, and the D: S was 13.38 to 24.33 mL. The fluoxetine hydrochloride solubility is range from 5.12 to 44.36 mg/mL, and the ratio D: S from 0.45 to 3.91 mL. According to BCS all the drugs have high solubility. The evaluation of the drugs permeability was performed by determining the drug flow through the rat intestinal segments, isolated and contained in vertical diffusion chambers platform for manual testing permeability. The apparent permeability values (Papp) obtained in the experiments indicate that the amlodipine besylate and fluconazole are low permeability drugs and fluoxetine hydrochloride high permeability. Considering Solubility and permeability assay, amlodipine besylate and fluconazole are Class III and fluoxetine hydrochloride is Class I.

A avaliação da classe biofarmacêutica dos fármacos assume importância na política de medicamentos genéricos, já que as características de solubilidade e permeabilidade de um fármaco, conforme definidas pelo Sistema de Classificação Biofarmacêutica (SCB), constituem critério essencial para bioisenção na obtenção de registro de genéricos. O propósito do trabalho foi o de determinar a classe biofarmacêutica dos fármacos benzilato de anlodipino, fluconazol e cloridrato de fluoxetina, por meio da determinação de seus parâmetros de solubilidade e permeabilidade. Para o teste de solubilidade, foram desenvolvidos e validados métodos para a quantificação do benzilato de anlodipino, fluconazol e cloridrato de fluoxetina em água e nos tampões farmacopéicos pH 1,2; pH 4,5;pH 6,8 e 7,5. O estudo de solubilidade foi realizado pelo método shake flask num período de 72 horas de agitação a 37°C. A maior dose comercializada no mercado é de 10 mg, 200 mg e 20 mg respectivamente para o besilato de anlodipino, fluconazol e cloridrato de fluoxetina. Os valores de solubilidade para o besilato de anlodipino nos meios avaliados foram de 0,88 a 2,35 mg/mL enquanto intervalo da razão dose: solubilidade (D: S) foi de 4,24 mL a 11,36 mL. Para o fluconazol os valores de solubilidade foram: 8,22 a 14,4 mg/mL, e o intervalo da razão D: S foram de 13,38 mL a 24,33 mL. Já para o cloridrato de fluoxetina a solubilidade foi de 5,12 a 44,36 mg/mL, e o intervalo razão D: S foram de 0,45 a 3,91 mL. De acordo com o SCB, para classifacar um fármaco como de alta solubilidade a dose mais alta cormecializada do fármaco deve ser solúvel em 250 mL de meio aquoso na faixa de pH de 1 a 7,5 a 37º C e um fármaco é considerado como de alta permeabilidade quando a sua fração absorvida seja ≥ 90%. De acordo com esse critério, ambos os fármacos apresentam alta solubilidade. A avaliação da permeabilidade dos fármacos foi realizada por meio da determinação do fluxo de fármaco através de segmentos intestinais de ratos, isolados e contidos em câmaras de difusão vertical da plataforma manual para testes de permeabilidade. Os valores de permeabilidade aparente (Papp) obtidos nos experimentos indicam que o besilato de anlodipino e o fluconazol são fármacos de baixa permeabilidade, portanto, classe III e o cloridrato de fluoxetina alta permeabilidade, classe I. / The Biopharmaceutical Classification System (BCS) concept was established by Amidon and co-workers (1995) and BCS allows expectations regarding correlation between in vitro dissolution data and in vivo bioavailability data. According to the BCS, three major factors govern drug bioavailability: the drug aqueous solubility, the ability of the drug molecules to permeate biologic membranes and drug dissolution from the dosage form. Solubility criteria defined by the FDA to classify a drug as highly soluble requires the highest dose strength to be soluble in 250 mL of aqueous media over the pH range of 1-7.5 at 37°C and a drug is considered with high permeability when its fraction absorbed is ≥ 90%. The purpose of this study was to evaluate the solubility and permeability of amlodipine benzylate, fluconazole and fluoxetine hidrochoride in order to determine them BCS class. The solubility study was performed using the drug over a 72 hours period of agitation as the shake flask method at 37 °C. The results from solubility values are given in mg/mL and dose: solubility ratio is given in mL. The highest dose marketed is 10 mg, 200 mg and 20 mg, respectively for the amlodipine besylate, fluconazole and fluoxetine hydrochloride. The solubility values for the amlodipine besylate in the tested aqueous media range from 0.88 to 2.35 mg/mL, while dose solubility ratio (D: S) values range from 4.24 to 11.36 mL. The values for fluconazole solubility were 8.22 to 14.4 mg/mL, and the D: S was 13.38 to 24.33 mL. The fluoxetine hydrochloride solubility is range from 5.12 to 44.36 mg/mL, and the ratio D: S from 0.45 to 3.91 mL. According to BCS all the drugs have high solubility. The evaluation of the drugs permeability was performed by determining the drug flow through the rat intestinal segments, isolated and contained in vertical diffusion chambers platform for manual testing permeability. The apparent permeability values (Papp) obtained in the experiments indicate that the amlodipine besylate and fluconazole are low permeability drugs and fluoxetine hydrochloride high permeability. Considering Solubility and permeability assay, amlodipine besylate and fluconazole are Class III and fluoxetine hydrochloride is Class I.

A L- asparaginase é uma enzima aplicada no tratamento de Leucemia Linfoide Aguda, que atua na hidrólise da L- asparagina, privando a célula tumoral de um aminoácido essencial para o seu crescimento. A L- asparaginase, como outros biofármacos, deve ser estável, manter sua atividade específica e formar poucos agregados. A fim de manter a integridade do biofármaco, são utilizados adjuvantes nas formulações farmacêuticas, e dentre os mais importantes estão os osmólitos. Essas moléculas protegem a estrutura nativa da proteína, sendo capazes de interferir na formação de agregados e garantir a estabilidade proteica. O presente trabalho teve o objetivo de estudar o efeito dos osmólitos sacarose, sorbitol, arginina e glicina na atividade específica, estabilidade, cinética e caracterização de agregados na solução de L- asparaginase II de Erwinia chrysanthemi. Os resultados mostraram que a maioria dos osmólitos testados aumentou a atividade específica e a estabilidade da enzima, o que pode estar relacionado com o aumento da velocidade máxima e do kcat observados no ensaio cinético realizado com sacarose e sorbitol. Um perfil diferente de agregados foi encontrado para cada tipo de osmólito. A presença de sacarose ou sorbitol resultou na menor quantidade de agregados na faixa de, respectivamente, 100 a 200 e 200 a 300 nm em relação a enzima sem osmólito. Por outro lado, aumento no número total de agregados e presença de moléculas de alto peso molecular (300 a 500 nm) foram observados nas soluções enzimáticas contendo, respectivamente, glicina e arginina. Dessa forma, os resultados obtidos neste trabalho poderão auxiliar na produção e escolha da formulação de biofármacos, e, consequentemente, melhorar o tratamento medicamentoso de pacientes. / L L-Asparaginase is an enzyme applied in the treatment of Acute Lymphoblastic Leukemia, which acts on the hydrolysis of L- asparagine, depriving the tumor cell of an essential amino acid for its growth. L-asparaginase, as other biopharmaceuticals, must be stable, maintain its specific activity and form few aggregates. In order to maintain the integrity of the biopharmaceutical, adjuvants are used in the pharmaceutical formulations, and among the most importants adjuvants are the osmolytes. These molecules protect the native structure of the protein, being able of interfering in the formation of aggregates and guarantee protein stability. The present work had the objective of studying the effect of the osmolytes sucrose, sorbitol, arginine and glycine in the specific activity, stability, kinetic and aggregates characterization, in L- asparaginase II solution of Erwinia chrysanthemi. The results showed that the majority of the tested osmolytes increased the specific activity of the enzyme and its stability, which may be related to the augment of maximum velocity and kcat observed in the kinetic assay performed with sucrose and sorbitol. A different profile of aggregates was found for each type of osmolyte. The presence of sucrose or sorbitol resulted in the least amount of aggregates in the range of, respectively, 100-200 and 200-300nm in relation to the enzyme without osmolyte. On the other hand, increase in the total number of aggregates and the presence of high molecular weight molecules (300 to 500 nm) were observed in the enzymatic solutions containing, respectively, glycine and arginine. Thus, the results obtained in this work may help in the production and choice of the formulation of biopharmaceuticals and, consequently, improve the drug treatment of patients.

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The present study has evaluated the chemical composition of the essential oils of 13 species of Myrtaceae (Myrcia spp., Marlierea sp. and Calyptranthes sp.) from the Terra Firme ecosystem (Amazon). In addition, the cytotoxic, antibacterial, bacteriostatic, antifungal and larvicidal potentials of these oils have been described. Twenty-seven samples belonging to these thirteen species (18 individuals of 11 species of Myrcia, one of Marlierea caudata and one of Calyptranthes spruceana) were collected from the Adolpho Ducke Forest Reserve, EMBRAPA (Manaus) and the PANC site (Manaus). Its essential oils were obtained by hydrodistillation, dried and stored under refrigeration. The chemical characterization was carried out by means of CG-DIC and CG-EM analysis. The Arithmetic Indexes and the Spectral Similarity Indexes were obtained, whose results were compared with those described in the main databases. The mean chemical characterization of these oils was 95%, totaling 336 compounds identified, of which 34 have been abundant (50.7 to 96.17%). The most frequent and, in some cases, the most frequent components are: (E)-caryophyllene, δ-cadinene, Espatulenol, α-Copaene, β-elemene, α-humulene, Caryophyllene oxide, β-selinene, α-muurolene and α–cadinol (42.73% of nonoxygenated sesquiterpenes and 36.98% of oxygenated sesquiterpenes). This chemical variability is common to Myrcia species of other Brazilian ecosystems/biomes. Of the seven pairs of Myrcia individuals collected in distinct periods (dry and rainy), 242 compounds were identified, of which 125 were common, 41 and 76 of which were unique to the rainy and dry periods, respectively. Essential oils of the dry period have exhibit greater chemical variability. In addition, the chemical variability of the essential oils of Myrcia spp. of this ecosystem has been described by 51 cyclization pathways. Of these routes, thirteen have a high frequency (above 50%), four of which are the most prominent ones (Cariofilan, Cadinano, Aromadendrano and Eudesmano). The chemical results of this study have revealed a clear agreement of the chemical composition of Marlierea caudata with the chemistry composition of Myrcia spp.. On the other hand, this observation is not clearly evident for C. spruceana. Moreover, It should be noted that the chemical composition of the essential oils of M. magnoliifolia, M. minutiflora, M. fenestrata, M. amapensis and Marlierea caudata have been described for the first time. As for toxicity to cancer cells (Skmel 3 and ACPO2) and normal cells (MRC5), M. minutiflora presents moderate activity for human melanoma (Skmel 3) and gastric adenocarcinoma (ACPO2) as well as cytotoxic to non-neoplastic fibroblasts (MRC5). M. citrifolia, M. minutiflora, M. paivae and M. magnoliifolia present moderate to high activity against Staphylococcus aureus. M. fallax, M. sylvatica, M. paivae and C. spruceana present moderate activity against Staphylococcus aureus. As for the bacteriostatic action, all species tested have shown moderate to high activity against Pseudomonas aeroginosas. In relation to the insecticidal activity, M. citrifolia, M. bracteata, M. fenestrata, M. amazonica, M. paivae and C. spruceana are active, since after 24 h the mortality percentage of Aedes aegypti larvae was 100% in 25 mg.L- 1 of essential oil. Furthermore, the use of chemometric tools in this study has shown it possible to observe the segregation of samples by major terpene groups and their most influential cyclic pathways, whose substances of major relevance in this model have been (E)-Caryophyllene, δ-Cadinene, and Espatulenol. Its pharmacological activities described in the literature should suggest that they are responsible for the biological results observed in this work. However, novel biological assays with such isolated constituents must be necessary. Therefore, with respect to the chemistry of Myrcia volatile constituents occurring in Terra Firme (Amazonia), the present study has been evidenced very characteristic Amazonian chemotypes and without similarity with other species collected outside the region, which leads us to conclude how much to must be studied from the precious Amazonian biodiversity. / A família Myrtaceae apresenta 132 gêneros distribuídas em 5.760 espécies presentes na Austrália, sudeste da Ásia, América tropical e temperada. No Brasil, apresenta-se com 1018 espécies em 23 gêneros. Myrcia D.C é um dos maiores gêneros com 282 espécies presentes em quase todo território, sendo 220 endêmicas. Suas espécies são empregada na medicina popular brasileira, com destaque para Myrcia spp., as quais são usadas pela população tradicional da Amazônia como adstringentes, diuréticos, hipoglicemicas, anti-hemorrágicas, antioxidantes e no tratamento de hipertensão e úlceras. O presente estudo avalia a composição química dos óleos essenciais de 13 espécies de Myrtaceae (Myrcia spp., Marlierea sp. e Myrciaria sp.) de ecossistema de Terra Firme (Amazônia). Além disso são descritos os potenciais citotóxico, antibacteriano, bacteriostático, antifúngico e larvicida desses óleos. Vinte sete amostras pertencentes a essas treze espécies (18 indivíduos de 11 espécies de Mycia, um indivíduo de Marlierea caudata e outro de Calyptranthes spruceana) foram coletados na Reserva Florestal Adolpho Ducke, na EMBRAPA (Manaus) e no sítio PANC (Manaus). Seus óleos essências foram obtidos por hidrodestilação, secos e armazenado sob refrigeração. A caracterização química ocorreu por meio de análises por CG-DIC e CG-EM, cujos Índices Aritiméticos calculados e de Similaridade Espectral foram comparados com os descritos nas principais bases de dados. A média de caracterização química desses óleos foi de 95%, totalizando 336 substâncias identificadas, das quais 34 são abundantes (50,7 a 96,17%). Os componentes mais frequentes, e em alguns casos majoritários, são: (E)–cariofileno, δ–cadineno, Espatulenol, α–copaeno, β–elemeno, α–humuleno, Óxido de cariofileno, β–selineno, α–muuroleno e α–cadinol, prevalecendo estruturas sesquiterpênicas (42,73% de sesquiterpenos não-oxigenados e 36,98% de sesquiterpenos oxigenados). Essa variabilidade química é comum a espécies de Myrcia de outros ecossistemas/biomas brasileiros. Dos sete pares de indivíduos de Myrcia coletados em períodos distintos (seco e chuvoso), identificou-se 242 substâncias, sendo 125 comuns, com 41 exclusivas do período chuvoso e 76 são exclusivos do períoso seco. Os óleos essenciais do período seco apresentaram uma maior variabilidade química. Além disso, a variabilidade química dos óleos essenciais de Myrcia spp. desse ecossistema pôde ser descrita por 51 vias de ciclização. Dessas vias, treze apresentam elevada frequência (superior a 50%), sendo quatro vias de destaque pela maior ocorrência (Cariofilano, Cadinano, Aromadendrano e Eudesmano). Os resultados químicos desse estudo revelam uma clara concordância de Marlierea caudata com a química de Myrcia spp., porém o mesmo não se evidencia claramente para C. spruceana. Ressalta-se que a composição química dos óleos essenias de M. magnoliifolia, M. minutiflora, M. fenestrata, M. amapensis e Marlierea caudata são descritos pela primeira vez. Quanto à toxicidade frente a células cancerígenas (Skmel 3 e ACPO2) e normais (MRC5), M. minutiflora apresenta atividade moderada para melanoma humano (Skmel 3) e adenocarcinoma gástrico (ACPO2), bem como citotóxica para fibroblastos nãoneoplásicos (MRC5). M. amazonica e M. fenestrata também apresentam atividade moderada para Skmel 3. Quanto ao potencial antimicrobiano e bacteriostático, M. citrifolia, M. minutiflora, M. paivae e M. magnoliifolia apresentam atividade moderada a elevada frente a Staphylococcus aureus. M. fallax, M. sylvatica, M. paivae e C. spruceana apresentam atividade moderada frente a Staphylococcus aureus. Quanto a ação bacteriostática, todas as espécies ensaiadas apresentam atividade moderada a elevada frente a Pseudomonas aeroginosas. Em relação a atividade inseticida, M. citrifolia, M. bracteata, M. fenestrata, M. amazonica, M. paivae e C. spruceana são ativas, pois após 24 h o percentual de mortalidade das larvas de Aedes aegypti é de 100% em 25 mg.L-1 de óleo essencial. A aplicação de ferramentas quimiométricas nesse estudo possibilitou observar a segregação das amostras por grupos terpênicos majoritários e suas vias de ciclização mais influentes, cujas substâncias de maior relevância nesse modelo são: (E)-cariofileno, δ–cadineno e Espatulenol. Suas atividades farmacológicas descritas na literatura sugerem serem os responsáveis pelos resultados biológicos observados nesse trabalho. Contudo, novos ensaios biológicos com tais constituintes isolados talvez sejam necessários. Portanto, a respeito da química dos constituintes voláteis de Myrcia ocorrentes em Terra Firme (Amazônia), o presente estudo evidência quimiotipos amazônicos bem característicos e sem similaridade com outras espécies coletadas fora da região, o que nos leva a concluir o quanto ainda há a ser estudado a partir da preciosa biodiversidade amazônica.

A permeabilidade através do epitélio intestinal tem se tornado um importante aspecto a ser determinado nas avaliações biofarmacotécnicas envolvendo fármacos e medicamentos. A técnica mais empregada para essa determinação in vitro é aquela que utiliza a cultura de células Caco-2. Entretanto, ainda são discutíveis as condições para a realização desses experimentos, uma vez que a padronização das mesmas é fator fundamental para a confiabilidade dos resultados. Nesta tese, foram avaliadas as condições para realização dos estudos de permeabilidade através de membranas de células Caco-2 para a rifampicina, principal fármaco utilizado no tratamento da tuberculose. Para tanto, foram investigados fatores tais como a citotoxicidade da rifampicina em diferentes concentrações, a influência da concentração do fármaco sobre a permeabilidade, do pH de realização dos experimentos e da presença de proteínas do muco intestinal, além da influência de proteínas plasmáticas. Foi também investigado o potencial indutor da rifampicina sobre a expressão da glicoproteína-P (Pgp) e seu impacto na permeabilidade da própria rifampicina. Os estudos foram desenvolvidos utilizando membranas de células Caco-2 provenientes da American Type Culture Collection (ATCC) cultivadas em placas Transwel®, a quantificação da fração permeada foi por cromatografia líquida de alta eficiência com métodos validados. A análise da indução da expressão da Pgp foi realizada por PCR-RT. Demonstrou-se que as concentrações da rifampicina (10,0; 25,0 e 50,0 µg/mL) não ocasionaram danos às células Caco-2 no estudo de citotoxicidade pela técnica que emprega o sal do brometo de 3-(4,5-dimetil-2-tiazoli)-2,5-difenil-2H-tetrazólio (MTT). As concentrações de rifampicina (5,0; 10,0 e 25,0 µg/mL) não resultaram em valores estatisticamente diferentes de permeabilidade aparente (Papp) em células Caco-2 nas condições do estudo. A rifampicina apresentou valor de Papp significativamente maior em pH 6,8 dentre os valores de pH avaliados (5,8 ; 6,8; 7,4). A presença de muco simulado e de soro fetal bovino não resultou em valores de permeabilidade significativamente distintos do resultado obtido sem a sua adição ao experimento. A expressão da Pgp em células Caco-2 é induzida pela adição da rifampicina (10µg/mL), ocasionando diminuição da sua permeabilidade por mecanismo de efluxo. Pelos resultados de permeabilidade obtidos em todas as condições avaliadas, a rifampicina pode ser considerada um fármaco de alta permeabilidade de acordo com o Sistema de Classificação Biofarmacêutica. / The permeability through the intestinal epithelium has become an important aspect to be determined in evaluations involving drugs and pharmaceutical products. The most common technique for this determination in vitro is one that uses the culture of Caco-2 cells. Nevertheless, the conditions for carrying out such experiments are still questionable, since the standardization of them is essential to the reliability of the results. In this thesis, we evaluate the conditions for the studies of permeability of rifampicin through membranes of Caco-2 cells, the main drug used in the treatment of tuberculosis. To this end, we examined factors such as cytotoxicity of rifampicin at different concentrations, the influence of drug concentration on the permeability, as well as the pH of the experiments, the presence of proteins of intestinal mucus, and the influence of plasma proteins. It was also investigated the potential of rifampicin on the expression of P-glycoprotein (Pgp) and its impact on the permeability of rifampicin itself. The studies were developed using membranes of Caco-2 cells from American Type Culture Collection (ATCC) grown on plates Transwel®, and the quantification of the fraction of drug permeated was obtained by high performance liquid chromatography with validated methods. The analysis of induction of expression of Pgp was performed by RT-PCR. It was demonstrated that the concentrations of rifampicin (10,0; 25,0 and 50,0 µg/mL) did not cause damage to Caco-2 cells in the study of the cytotoxicity technique that uses a bromide salt of 3 - (4,5-dimethyl-2 - thiazol) -2,5-diphenyl-2H-tetrazolium (MTT). The concentrations of rifampicin (5,0; 10,0 and 25,0 &#181g/mL) did not result in statistically different values of apparent permeability (Papp) in Caco-2 cells under the conditions of the study. Rifampicin showed a value of Papp significantly higher at pH 6.8 in comparison with other measured pH values (5,8 and 7,4). The presence of mucus simulated and fetal calf serum did not result in permeability values significantly different from the result obtained without its addition to the experiment. The expression of P-gp in Caco-2 cells is induced by the addition of rifampicin (10 µg/ml), decreasing its permeability by efflux mechanism. Taking into account the results of permeability obtained in all conditions, the rifampicin can be considered a high permeability drug according to the biopharmaceutical classification system.

O tratamento para a Leucemia Linfoblástica Aguda LLA utiliza, entre outros fármacos, a enzima L-asparaginase (ASNase) proveniente da bactéria Escherichia coli. Reações imunológicas estão entre os problemas do tratamento com ASNase, e a formação de anticorpos contra essa proteína pode impedir o sucesso no tratamento. Duas cisteíno proteases lisossomais estão relacionadas com a degradação de ASNase nos seres humanos, a Catepsina B (CTSB) e Asparagina Endopeptidase (AEP). Em estudos prévios do nosso grupo obteve-se mutantes de ASNase resistentes a degradação por CTSB e/ou AEP in vitro. Nesse trabalho avaliamos essas mutantes quanto a sua citotoxicidade em linhagens celulares de leucemia e conduzimos estudos in vivo, aplicando as proteoformas de ASNases em camundongos Balb C para avaliar a atividade asparaginase sérica das enzimas ao longo do tempo, bem como obter informações sobre a formação de anticorpos contra essas proteoformas. Nos ensaios de citotoxicidade, duas das proteoformas testadas tiveram efeito citotóxico semelhante a forma selvagem, enquanto uma outra proteoforma tem a citotoxicidade sensivelmente reduzida. Já nos ensaios in vivo, uma proteoforma demonstrou meia vida sérica maior da atividade asparaginásica, e duas proteoformas causaram reduzida formação de anticorpos. Juntos, esses resultados colaboram para a obtenção de uma nova geração de ASNases com melhor biodisponibilidade, e efeitos adversos reduzidos, gerando a possibilidade de menores doses e frequência de aplicações. / The Treatment for Acute Lymphoblastic Leukemia (ALL) includes the biopharmaceutical L-asparaginase (ASNase) from Escherichia coli. Immunological reactions are among the problems of treatment using ASNase, and the antibodies formation protein may prevent success in treatment. Lysosomal cysteine proteases are related to ASNase degradation, Cathepsin B (CTSB) and Asparagine Endopeptidase (AEP). In previous studies, ASNase mutants resistant to CTSB and / or AEP degradation in vitro were obtained. In this work, mutants were evaluated in cytotoxicity in ALL cell lines and, in vivo studies, applying doses of the wild and mutant ASNases in Balb C mice to evaluate serum asparaginase activity of the enzymes over time, as well as to obtain information on the formation of antibodies against these proteoforms. Regarding to the cytotoxicity, two proteoforms among the tested had similar cytotoxicity than the wild-type. While another proteoform had the cytotoxicity severely reduced. One proteoform have demonstrated greater serum half-life of asparaginase activity, while two other mutants caused reduced antibody formation. Together, these results collaborate to obtain a new generation of ASNases with increased bioavailability and reduced side effects, generating the possibility of lower doses and frequency of applications.

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O tratamento para a Leucemia Linfoblástica Aguda LLA utiliza, entre outros fármacos, a enzima L-asparaginase (ASNase) proveniente da bactéria Escherichia coli. Reações imunológicas estão entre os problemas do tratamento com ASNase, e a formação de anticorpos contra essa proteína pode impedir o sucesso no tratamento. Duas cisteíno proteases lisossomais estão relacionadas com a degradação de ASNase nos seres humanos, a Catepsina B (CTSB) e Asparagina Endopeptidase (AEP). Em estudos prévios do nosso grupo obteve-se mutantes de ASNase resistentes a degradação por CTSB e/ou AEP in vitro. Nesse trabalho avaliamos essas mutantes quanto a sua citotoxicidade em linhagens celulares de leucemia e conduzimos estudos in vivo, aplicando as proteoformas de ASNases em camundongos Balb C para avaliar a atividade asparaginase sérica das enzimas ao longo do tempo, bem como obter informações sobre a formação de anticorpos contra essas proteoformas. Nos ensaios de citotoxicidade, duas das proteoformas testadas tiveram efeito citotóxico semelhante a forma selvagem, enquanto uma outra proteoforma tem a citotoxicidade sensivelmente reduzida. Já nos ensaios in vivo, uma proteoforma demonstrou meia vida sérica maior da atividade asparaginásica, e duas proteoformas causaram reduzida formação de anticorpos. Juntos, esses resultados colaboram para a obtenção de uma nova geração de ASNases com melhor biodisponibilidade, e efeitos adversos reduzidos, gerando a possibilidade de menores doses e frequência de aplicações. / The Treatment for Acute Lymphoblastic Leukemia (ALL) includes the biopharmaceutical L-asparaginase (ASNase) from Escherichia coli. Immunological reactions are among the problems of treatment using ASNase, and the antibodies formation protein may prevent success in treatment. Lysosomal cysteine proteases are related to ASNase degradation, Cathepsin B (CTSB) and Asparagine Endopeptidase (AEP). In previous studies, ASNase mutants resistant to CTSB and / or AEP degradation in vitro were obtained. In this work, mutants were evaluated in cytotoxicity in ALL cell lines and, in vivo studies, applying doses of the wild and mutant ASNases in Balb C mice to evaluate serum asparaginase activity of the enzymes over time, as well as to obtain information on the formation of antibodies against these proteoforms. Regarding to the cytotoxicity, two proteoforms among the tested had similar cytotoxicity than the wild-type. While another proteoform had the cytotoxicity severely reduced. One proteoform have demonstrated greater serum half-life of asparaginase activity, while two other mutants caused reduced antibody formation. Together, these results collaborate to obtain a new generation of ASNases with increased bioavailability and reduced side effects, generating the possibility of lower doses and frequency of applications.