Abstract : 5-Methylcytosine is an epigenetic mark, which can be oxidized to 5-hydroxymethylcytosine (5hmC) in DNA by ten-eleven translocation (TET) oxygenases. It is an initial step in the demethylation of 5mC. Levels of 5hmC is relatively high in the brain compared to other organs, but these levels are known to be significantly reduced during the development of a brain tumor, especially in glioblastoma multiforme (GBM). However, no known mechanisms may fully explain this abnormality. The objectives of my project were to (1) understand the implications of the demethylation pathway mediated by TET, and (2) gain a deeper insight in the epigenetic make-up of brain tumors. (1) U87 cells were incubated with 5mC, 5hmC, 5-formylcytosine (5fC) or co-incubated of 5hmC with 3,4,5,6-tetrahydro-2’-deoxyuridine (dTHU) over a timeline of 0, 24, 48 and 96 hours. (2) 130 brain tumors (GBM= 79; grade II/III= 51) were obtained directly from surgery and immediately suspended in DNA extraction buffer. Both cell samples and tumor tissues underwent DNA extraction and DNA digestion protocols. The percent per cytosine (%/C) was obtained by quantification of 5mC, 5hmC, 5fC, 5-hydroxymethyluracil (5hmU) and 5formyluracil (5fU) using LC-MS/MS. (1) Cellular incubations showed that it is possible to increase levels of 5hmC in DNA, but also a slight increase in 5mC levels throughout the experiment. 5HmC levels dramatically increased by 1.9-fold after 96h. On the other hand, no increase was observed in 5fC levels. Both 5hmC and 5fC incubations were accompanied by high increases in 5hmU and 5fU levels respectively. The addition of dTHU to the 5hmC incubation decreased 5hmU incorporation by 65%. (2) The average levels of 5mC, 5hmC and 5fC, in brain tumors, were 4.0, 0.15 and 0.021 %/C respectively. 5HmU and 5fU levels were present at comparable levels of 5hmC and 5fC. Levels of 5hmC, 5hmU and 5fU were significantly lower in the DNA of GBM specimens. There was a strong correlation between 5mC with 5hmC and 5fC in GBM, but this was absent in low grade tumors. The presence of 5hmU and 5fU in brain tumor and the increase in their levels during cell incubations indicate a deamination activity in these cancerous cells, which may impinge on the cellular levels of 5hmC, in particular. Furthermore, upon the incubations with 5hmC, downstream levels of 5fC did not increase suggesting a TET malfunction. TET activity is maintained in GBMs, but impaired in low grade tumors due to isocitrate dehydrogenase-1 (IDH1) mutations. Therefore, in brain tumors, a strong deamination activity and TET impairment may lead to epigenetic reduction of 5hmC. / Résumé : 5Mtéthylcytosine (5mC) est une marque épigénétique qui peut être oxydée en 5-hydroxyméthylcytosine (5hmC) par ten-eleven translocation (TET) oxygénases. Ceci amène à l’étape initiale de la déméthylation de 5mC. Le niveau de 5hmC est plus élevé dans le cerveau par rapport aux autres organes. Par contre, ce niveau a une réduction marquante au cours du développement d’une tumeur cérébrale, notamment le glioblastome multiforme (GBM). Toutefois, il n’y a aucun mécanisme connu pour expliquer cette anomalie. Les objectifs de ce projet étaient de (1) discerner l’implication de la voie de déméthylation obtenu par médiation de TET et (2) d’avoir une compréhension plus profonde de la constitution épigénétique des tumeurs cérébraux. (1) Des cellules U87 ont été incubées avec 5mC, 5hmC, 5-fomylcytosine (5fC) et une co-incubation de 5hmC avec 3,4,5,6-tétrahydro-2’-déoxyuridine (dTHU). Les échantillons ont été récoltés à 0, 24, 48, 96 heures. (2) 130 tumeurs cérébraux (GBM = 79; grade II/III = 51) étaient obtenus directement de chirurgie et mise en suspension dans un tampon d’extraction d’ADN le jour même. Les échantillons d’U87 et de tissu tumoral ont subi les protocoles d’extraction et de digestion d’ADN. Le pourcentage par cytosine (%/C) était calculé par la quantification de 5mC, 5hmC, 5fC, 5-hydroxyméthyluracile (5hmU) et 5-formyluracile (5fU) en utilisant LC-MS/MS. (1) Les incubations d’U87 ont démontrées la possibilité augmenter les niveaux génomique de 5hmC, mais aussi une légère augmentation des niveaux de 5mC. Les niveaux de 5hmC ont accru de 1.9 fois après 96hrs. Par contre, aucune variation n’a été observée dans les niveaux de 5fC. Les incubations de 5hmC et 5fC ont été accompagnées par une élévation des niveaux de 5hmU et 5fU respectivement. L’addition de dTHU avec 5hmC avait diminué l’incorporation de 5hmU par 65%. (2) Dans les tumeurs cérébraux, les niveaux moyens de 5mC, 5hmC et 5fC étaient de 4.0, 0.15 et 0.021%/C respectivement. Les quantités de 5hmU et 5fU étaient grandement plus faible dans le GBMs que dans les tumeurs de bas grades. La présence de 5hmU et 5fU dans les tumeurs et leur augmentation durant l’incubation des U87 indiquent une activité de désamination, qui peut, en particulier, entraver les niveaux de 5hmC. En outre, malgré l’incubation avec 5mC, les niveaux de 5hmC et 5fC n’ont pas augmentés suggérant un dysfonctionnement de TET. L’activité de TET est maintenue dans GBM, mais altérée dans les tumeurs de bas grades à cause de mutation isocitrate dehydrogenase-1 (IDH1). Par conséquent, la forte activité de désamination et la déficience en TET peuvent conduire à une réduction épigénétique.

Em mamíferos a inativação do cromossomo X (ICX) consiste no silenciamento gênico de um dos dois X presentes nas células somáticas normais das fêmeas, garantindo a compensação de dose transcricional em relação aos machos. Existem duas formas de ICX: aleatória, na qual a escolha do cromossomo X inativado se dá ao acaso (X paterno ou materno); e de maneira completamente desviada, na qual a atividade do cromossomo X dependerá de sua origem parental. Nas fêmeas marsupiais a inativação ocorre de forma completamente desviada, sendo o X paterno preferencialmente inativado em todas as células, já nas células embrionárias de eutérios, o que se observa é a ICX aleatória. Entretanto, naquelas células que darão origem aos tecidos extra-embrionários, de camundongos e bovinos, a ICX se dá de forma equivalente à dos marsupiais, ou seja, o X paterno é preferencialmente inativado. Há mais de 30 anos o padrão de ICX em tecidos extra-embrionários humanos tem sido alvo de intenso debate. A crítica que se faz aqui é que tais estudos foram realizados com base na expressão de apenas um ou dois genes ligados ao X com amostras de tecidos extra-embrionários em diferentes idades gestacionais e, por vezes, em poucas amostras, o que deve ter levado às contradições entre as conclusões. O diferencial deste trabalho foi a utilização de técnicas de genotipagem de SNPs presentes em regiões codificadoras, para analisar o padrão de atividade alelo-específica de um grande número de genes presentes ao longo de todo o cromossomo X, gerando um panorama mais representativo da ICX em placenta humana. Neste estudo é comprovado o padrão aleatório de ICX em placenta humana a termo e demonstrado que este órgão se apresenta como um 65 mosaico em relação à escolha do X inativo. A análise global da atividade gênica no cromossomo X indicou ainda que a manutenção do estado epigenético do X inativo parece ser heterogêneo. Em conjunto, os dados gerados são capazes de explicar as incongruências entre as conclusões previamente publicadas. Este trabalho também ilustra as diferenças nos mecanismos de ICX entre humanos e camundongos e reforça a importância de se avaliar esse tema em outras espécies de mamíferos eutérios na tentativa de se elucidar os processos evolutivos envolvidos na compensação de dose em mamíferos / Imprinted inactivation of the paternal X chromosome in marsupials is the primordial mechanism of dosage compensation for X-linked genes between females and males in Therians. In Eutherian mammals, X chromosome inactivation (XCI) evolved into a random process in cells from the embryo proper, where either the maternal or paternal X can be inactivated. However, species like mouse and bovine maintained imprinted XCI exclusively in extraembryonic tissues. The existence of imprinted XCI in humans remains controversial, with studies based on the analyses of only one or two X-linked genes in different extraembryonic tissues. Here we readdress this issue in human term placenta by performing a robust analysis of allele-specific expression of 23 X-linked genes, including XIST, using 28 SNPs in transcribed regions. We show that XCI is random in human placenta, and that this organ is arranged in relatively large patches of cells with either maternal or paternal inactive X. In addition, this chromosome-wide analysis indicated heterogeneous maintenance of the epigenetic state along the inactive X, which combined with the extensive mosaicism found in placenta, can explain the lack of agreement among previous studies. Our results illustrate the differences of XCI mechanism between humans and mice, and highlight the importance of addressing the issue of imprinted XCI in other species in order to understand the evolution of dosage compensation in placental mammals

O principal objetivo deste trabalho é o de estabelecer uma estratégia confiável relacionada a genotoxicidade, proteção genômica e recombinação mitótica em Aspergillus nidulans. A genotoxicidade foi induzida por vapor de benzeno e, para testar a proteção genômica, a soja foi usada devido às suas propriedades anticarcinogênicas muito conhecidas. O principal resultado obtido foi que a soja transgênica mostrou maiores propriedades antigenotóxicas do que a soja tradicional. Isto foi duplamente confirmado, tanto através de estratégias de genética clássica, como molecular. Além disso, cada experimento foi repetido três vezes. Principais conclusões foram as seguintes: a) estabelecimento de um protocolo adequado para atender às complexidades dos eventos epigenéticos e, b) a aplicação desse tal protocolo e experimentos afins para testar outros agentes ambientais suspeitos de apresentarem propriedades antigenotóxicas, ou que precisem de sua identificação como tal. Evidentemente, levando-se em conta a grande preocupação relacionada aos alimentos transgênicos e aos muitos produtos de biotecnologia, que entram no mercado, o elenco de prováveis candidatos aos tipos de testes apresentados, será muito grande. Como os resultados obtidos sugerem íntima relação entre metilação de DNA eucariótico, a recombinação mitótica e outros eventos danosos às células, os eventos envolvidos serão epigeneticamente discutidos. / Main aim is to provide a reliable approach to deal with the aspects related to induced genotoxicity, genomic protection and eukaryotic mitotic recombination in Aspergillus nidulans. Genotoxicity was benzene fumes induced, and to test genomic protection soybean has been used on account of its putative anticarcinogenic properties. Main outcome is that transgenic soybean bears higher antigenotoxic properties than traditional soybean. This has been twofold confirmed through basic genetic approaches and molecular approaches, as well. In addition, each experimental approach has been three times repeated. Additional important outcomes are: a- establishment of a reliable protocol to deal with the complexities of the epigenetic events, and b- likely use of present protocol and experimental set-up to test other environmental agents of which antigenotoxic properties are either suspected, or need precise identification. Evidently, on account of present wide concern the transgenic foodstuffs, and many other biotechnological products, as well, are obvious candidates for similar approaches. Obtained results suggest close relationships among eukaryotic DNA methylation, mitotic recombination, and other cells damaging events reputedly leading to carcinogenesis.

Le lymphome est un cancer des ganglions lymphatiques, lieu de prolifération et différenciation des cellules immunitaires en particulier des lymphocytes B qui sont des cellules productrices d'anticorps. Les lymphomes résultent de l’accumulation de mutations génétiques dans le génome d’une cellule B normale contribuant à la transformation en cellule B maligne. Cette cellule B dite transformée prolifère alors pour engendrer un clone de cellules B malignes qui s’accumulent au niveau des ganglions lymphatiques, formant alors une tumeur appelée ‘lymphome B’ (pour cancer lymphoïde issu de la transformation maligne des lymphocytes B). Le ganglion lymphatique normal a une structure histologique qui se décompose ainsi, du centre à la périphérie : le centre germinatif, la zone du manteau et la zone marginale. Les lymphomes B sont classés en différents sous-types histologiques en fonction de leur origine topographique au niveau du ganglion lymphatique et de leurs caractéristiques bio cliniques spécifiques. Parmi ces sous-types, une forme particulièrement agressive peut être distinguée : le lymphome à cellules du manteau. Ce sous-type de lymphome est caractérisé par des rechutes successives et une survie qui est généralement courte (médiane de survie de 4 à 5 ans) même si certains patients, avec des formes plus indolentes de lymphomes à cellules du manteau, présentent des survies prolongées (médiane de survie de 7 à 10 ans). Des biomarqueurs prédictifs de la courte survie manquent aujourd’hui, ce qui rend difficile la prise en charge optimisée des patients. Ce projet s’intéresse à cette question. Plus précisément, nous nous proposons de rechercher des mutations génétiques associées à la résistance thérapeutique. Notre approche sera basée sur le séquençage ciblé à haut débit du génome de cellules B tumorales issus de patients présentant des cas classiques du lymphomes à cellules du manteau mais aussi des cas plus particuliers comme ceux présentant des résistances thérapeutiques précoces, par exemple. Par cette approche dite de ‘cartographie’ à l’échelle du génome, nous espérons identifier des nouveaux prédicteurs moléculaires de la survie chez ces patients atteints de lymphome à cellules du manteau et également apporter de nouvelles connaissances dans l’interconnexion entre la génétique et l’épigénétique dans cette maladie. / Lymphoma is a cancer of the lymph nodes which are organs in which immune cells, particularly the antibody producing B cells, proliferate and differentiate before circulating in the blood and tissues to fight infection. B cell lymphoid cancers – ‘B cell lymphoma’ arise as a consequence of the occurrence of gene mutations in B cells. By affecting the functions of key B cell genes, these mutations drive the malignant transformation of the affected B cells which then begin to divide abnormally eventually destroying normal lymph node organization and function. The lymph node is divided into distinct micro-anatomical compartments or zones which are called (from the inner to outer most compartment – germinal centre, mantle zone, and marginal zone). B cell lymphoma classification follows this general organization and classifies tumours depending on the compartment of origin of the particular tumour B cell population. This classification thus defines lymphoma according to a ‘histological subtype’ with defined clinic-biological features. Among these subtypes, mantle cell lymphoma (MCL) is a particularly aggressive form of B lymphoid cancer. This type of lymphoma is characterised by successive relapses and short survival (median is 4 to 5 years), although some patients can show long survival. Predictive biomarkers of this clinical behavior are lacking. This project aims to address this question. More specifically we propose to perform whole ‘exome’ sequencing – i.e. sequencing of all protein coding sections of all known protein coding genes in the genome – of the tumour B cell DNA from patients who show refractory or early relapsing disease compared to patients who show relatively long survival. By doing this genome scale study we hope to identify new gene mutations that can serve as molecular predictors of survival and bring new knowledges in the understanding between genetics and epigenetics in MCL.

Epigenetic changes (specifically DNA methylation) have been associated with adverse health outcomes; however, unlike genetic markers that are fixed over the lifetime of an individual, methylation can change. Given that there are a large number of methylation sites, measuring them repeatedly introduces multiple testing problems beyond those that exist in a static genetic context. Using simulations of epigenetic data, we considered different methods of controlling the false discovery rate. We considered several underlying associations between an exposure and methylation over time. We found that testing each site with a linear mixed effects model and then controlling the false discovery rate (FDR) had the highest positive predictive value (PPV), a low number of false positives, and was able to differentiate between differential methylation that was present at only one time point vs. a persistent relationship. In contrast, methods that controlled FDR at a single time point and ad hoc methods tended to have lower PPV, more false positives, and/or were unable to differentiate these conditions. Validation in data obtained from Project Viva found a difference between fitting longitudinal models only to sites significant at one time point and fitting all sites longitudinally.

RNAs associate with chromatin through various ways and carry out diverse functions. One mechanism by which RNAs interact with chromatin is by the complementarity of RNA with DNA, forming a three-stranded nucleic acid structure named R-loop. R-loops have been shown to regulate transcription initiation, RNA modification, and immunoglobulin class switching. However, R-loops accumulated in the genome can be a major source of genome instability, meaning that they must be tightly regulated. This thesis aims to identify R-loop-binding proteins systemically and study their regulation of R-loops. Using immunoprecipitation of R-loops followed by mass spectrometry, with or without crosslinking, a total of 364 proteins were identified. Among them RNA-interacting proteins were prevalent, including some already known R-loop regulators. I found that a large fraction of the R-loop interactome consists of proteins localized to the nucleolus. By examining several DEAD-box helicases, I showed that they regulate rRNA processing and a shared set of mRNAs. Investigation of an R-loop-interacting protein named CEBPZ revealed its nucleolar localization, its depletion caused down-regulation of R-loops associated with rRNA and mRNA. Characterization of the genomic distribution of CEBPZ revealed its colocalization with insulator-regulator CTCF. When studying if CEBPZ recruits CTCF, I found that instead of regulating CTCF binding, CEBPZ depletion has a major effect on the performance of CUT&RUN, a technique for identifying DNA binding sites of proteins. How CEBPZ affects CUT&RUN is still under investigation, the study of which may help us understand the roles of CEBPZ in regulation of global chromatin structure and genome integrity.

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La lutte contre les maladies chroniques nécessite la mise en œuvre de nouvelles stratégies de prédiction du risque et de prévention. La médecine personnalisée représente une approche sophistiquée pour réussir la prise en charge des morbidités de populations vieillissantes. Dans le cadre de ces travaux de thèse inspirés par les principes de la médecine personnalisée, nous décrivons une approche qui associe plusieurs méthodologies «-omiques». Nous avons utilisé un modèle de «dénominateur commun» pour les maladies chroniques afin d'identifier des biomarqueurs associés aux facteurs de risque et aux voies biologiques de maladies courantes. Par l’étude de variants génétiques localisés dans la région comportant le gène TREM2, nous avons identifié une association entre le rs6918289 et à la fois de taux élevés de TNF-α et une augmentation de l’épaisseur intima-média de l’artère fémorale. Grâce à des études d’association panépigénomique (EWAS), nous avons identifié de nouveaux marqueurs épigénétiques liés à des facteurs de risque de maladies courantes. Un site CpG de méthylation était associé à une augmentation du tour de taille, contribuant à expliquer la régulation épigénétique de l’obésité abdominale. De plus, une étude EWAS des taux de triglycérides a permis d’identifier deux sites CpG significatifs. L’un de ces deux sites a pu être confirmé dans le tissu adipeux. Une étude EWAS a également été réalisée pour décrire la régulation épigénétique des concentrations de VEGF-A. 20 sites CpG ont pu être identifiés ainsi et leurs relations avec la régulation du VEGF-A ont été examinées par analyse bioinformatique poussée. Les liens entre le VEGF-A et 11 cytokines ont également été étudiés. Le taux de protéine VEGF-A était associé à IL-4, MCP1 et EGF. Les associations entre les cytokines et des isoformes spécifiques de l’ARNm du VEGF-A ont également été évaluées : le VEGF165 était associé à MCP1 et IL-1α, et le VEGF189 à IL-4 et IL-6. Nous avons étudié le rôle du VEGF-A et LT dans l’athérosclérose. Cela a permis d’identifier un variant génétique lié au VEGF-A associé à l’attrition des télomères qui pourrait constituer un dénominateur commun pour les maladies chroniques. L’utilisation de diverses méthodologies pour étudier les facteurs de risque et les voies impliquées dans des maladies chroniques courantes a permis d’identifier de nouveaux marqueurs diagnostiques qui pourraient améliorer la prédiction du risque de maladie basée sur le profil génétique de chaque individu. / The fight against common chronic diseases requires the implementation of new risk prediction and prevention strategies. Personalised medicine offers sophisticated approaches for management of the morbidities of the ageing population. In this thesis, inspired by the principles of personalised medicine, we describe an integrative approach combining “-omics” methodologies. We use a model of a “common denominator” for cardiovascular disease (CVD) and other chronic diseases to identify biomarkers linked with common diseases risk factors and molecular pathways. With the investigation of genetic variants, located in the region of the TREM2 gene, we identified the association of SNP rs6918289 with increased levels of TNF-α and intima-media thickness of the femoral artery. With the use of epigenome-wide association studies (EWAS), we identified novel epigenetic biomarkers related to common diseases risk factors: central obesity and lipid levels. One methylation site (CpG) was associated with increased waist circumference (cg16170243), which could explain the epigenetic regulation of central obesity. Moreover, an EWAS of the triglyceride levels identified two significant CpG sites, one of which was replicated in the adipose tissue (cg04580029), giving insights into epigenetic regulation of lipid levels. An EWAS was also used to study the epigenetics of VEGF-A levels; 20 CpG sites were identified and their relations with VEGF-A regulation were analysed through detailed bioinformatics analysis. VEGF-A was further investigated for its relation with 11 cytokines. VEGF-A protein levels were associated with IL-4, MCP1 and EGF. Specific VEGF-A mRNA isoforms were also investigated for their association with cytokines; VEGF165 showed associations with MCP1 and IL-1α and VEGF189 with IL-4 and IL-6. Together with another important biomarker, TL, we studied the role of VEGF-A in atherosclerosis and identified one VEGF-A related genetic variant associated with telomere attrition, which could present a common denominator of chronic diseases. The employment of diverse methodologies for the investigation of common chronic diseases risk factors and pathways provided new diagnostic markers and generated results, which could help to improve the diseases risk prediction based on the individual genetic “make-up”. New insights into associations between different biomarkers might help in understanding the pathophysiological pathways common between CVDs and other chronic diseases.

L'expression des gènes est étroitement régulée par différentes régions régulatrices afin d'assurer une grande variété de types cellulaires et de fonctions. Identifier ces régions régulatrices actives, leurs caractéristiques et comprendre comment elles interagissent entre elles dans chaque type cellulaire est un enjeu majeur. Cette connaissance permettrait notamment de mieux comprendre l'impact des variants génomiques très souvent localisés dans les régions non-codantes. Par ailleurs, le développement de cancers et autres maladies est lié à des dérégulations des contrôles de l'expression des gènes. Pour pouvoir envisager des traitements ciblés et tendre vers une médecine de précision, il est important de comprendre comment toute cette machinerie est orchestrée.Plusieurs approches ont été développées pour répondre à cette question, la plupart basées sur des données expérimentales de modification d'histones, méthylation et facteurs de transcription (TFs). Cependant, ces données sont limitées à des échantillons spécifiques et ne peuvent pas être générées pour tous les régulateurs et tous les patients. Mes travaux de thèse ont porté, dans une première partie, sur la modélisation de l'expression des gènes uniquement à partir de l'information contenue dans la séquence ADN. Nous avons utilisé un modèle linéaire avec sélection de variables, équivalent en terme de performances à des méthodes non paramétriques et simple à interpréter. Ce modèle m'a permis de comparer plusieurs types de variables basées sur la séquence ADN, comme les motifs de fixation des TFs et la composition nucléotidique. Ces variables sont déterminées pour différentes régions du gène afin d'évaluer leur pouvoir régulateur et leur contribution. Les introns seuls, dont la composition nucléotidique reflète celle de l'environnement du gène, expliquent une part importante de la variation de l'expression des gènes. De plus, nous avons démontré que les domaines topologiques (TADs), dans lesquels les interactions sont favorisées, partagent une composition génomique similaire. Notre modèle de prédiction nous permet vraisemblablement de capturer, pour chaque individu, la composition des TADs actifs.Dans un second temps de mon travail, je me suis intéressée aux régulations pouvant survenir dans les introns. Le consortium international FANTOM a fourni un des atlas de sites de départ de la transcription (TSSs) les plus importants à ce jour et nous avons noté que la majorité d'entre eux sont détectés dans les régions non-codantes, notamment les introns. Nous avons donc entrepris un travail visant à explorer ces TSS introniques. Pour déterminer si ces TSSs sont fonctionnels, je me suis intéressée à la recherche de potentiels motifs régulateurs autour de ces signaux de transcription. Une fraction de ces signaux sont localisés 2 bases en aval d'une répétition de Thymidines (T). Des évidences biochimiques et génétiques suggèrent qu'au moins une partie de ces signaux correspondent à de longs ARNs non-codants sens-introniques exprimés de manière tissu-spécifique. Il semblerait également que la longueur des répétitions de Ts ait une influence sur la présence d'un signal de transcription au niveau de ces loci et, indirectement, sur l'expression du gène hôte. Ces observations offrent une possible base moléculaire à l'effet de ces courtes répétitions en tandem de T. / Genome expression is tightly controlled by different regulatory regions to provide a wide variety of cell types and functions. Identifying these regulatory regions, their characteristics and understand how they interact with each other in a tissue-specific manner is prime importance. This knowledge should help better understand the impact of genomic variants often located in non-coding regions. Besides, cancer development is invariably linked to deregulation of gene expression controls. To pave the way for targeted treatments and precision medicine, it is important to understand how all this machinery is orchestrated.To answer this question, several approaches were developed, most of them based on experimental data of histone modification, methylation and transcription factors (TFs). However, these data are limited to specific samples and cannot be generated for all the regulators and all the patients. First, my thesis research aimed at modeling gene expression based on DNA sequence only. We used a linear model with variable selection, equivalent in term of performances with non-parametric methods and easy to interpret. This model allowed me to compare several types of variables based on the DNA sequence, as TFs binding motifs and nucleotide composition. These variables are computed for various gene regions to estimate their regulatory power and contribution. Strikingly, introns, for which nucleotide composition reflects gene environment, appear to explain an important part of gene expression variation. Furthermore, we demonstrated that the topological domains (TADs), in which interactions are favored, share similar genomic compositions. Our prediction model presumably captures, for every individual, the composition of active TADs.A second aspect of my work studied the regulations occurring in introns. The international FANTOM consortium provided one of the most important transcription start sites (TSSs) atlas and we noticed that the majority of these TSSs are detected into non-coding regions, in particular introns. We thus investigated these intronic TSSs. To determine if these TSSs are functional, we searched for new potential regulatory motifs at the vicinity of these transcription signals. We found that a fraction of them is located 2 bases downstream of a repetition of Ts. Biochemical and genetic evidences suggest that at least part of these signals correspond to sense-intronic long non-coding RNAs, which are expressed in a tissue specific manner. The length of the T repetition also appears to govern the presence of a transcription signal at these loci and indirectly impact on host gene expression. These findings provide one possible molecular explanation for the effect of these short tandem repeats of Ts.

Depuis quelques années, une biopsie testiculaire suivie d’une congélation du tissu testiculaire est proposée aux enfants atteints de cancer avant introduction d’un traitement gonadotoxique. Cette procédure de préservation de la fertilité est proposée avec l’espoir qu’une méthode de restauration de la fertilité soit développée. Le tissu testiculaire décongelé pourrait ainsi être utilisé afin d’effectuer une maturation in vitro, évitant la réintroduction de cellules tumorales, pour produire des spermatozoïdes. Ce travail de thèse a consisté, dans un premier temps, à évaluer la mise en place de la méthylation de l’ADN au sein du tissu testiculaire prépubère de souris au cours de la spermatogenèse in vitro. La culture de tissu testiculaire frais ou décongelé de souris prépubère permet le maintien des niveaux d’expression des ADN méthyltransférases 1 et 3a dans les spermatogonies et les spermatocytes. De plus, la méthylation de l’ADN est retrouvée jusque dans les spermatozoïdes produits in vitro. Par la suite, la qualité nucléaire des spermatozoïdes ainsi obtenus a été analysée. La culture de tissu testiculaire n’a pas d’impact sur le taux d’aneuploïdie, la condensation de la chromatine et la fragmentation de l’ADN spermatique. Cependant, la congélation suivie par la culture organotypique augmente la proportion de spermatozoïdes avec un ADN oxydé. Enfin, la fonctionnalité des spermatozoïdes produits in vitro a été analysée par micro-injection ovocytaire et la dynamique de différentes marques épigénétiques a été étudiée au cours du développement préimplantatoire. Les taux de développement embryonnaire sont diminués par l’utilisation de spermatozoïdes produits in vitro. Les niveaux des histones H3K4me3, H3K27me3 et H3K9ac sont peu modifiés dans les embryons issus de spermatozoïdes générés in vitro alors que la méthylation et déméthylation de l’ADN sont plus impactées. La production de spermatozoïdes après culture de tissu prépubère frais ou décongelé dans le modèle murin a permis de mettre en évidence que cette procédure n’est pas sans impact sur l’embryon précoce bien que la qualité des spermatozoïdes produits soit peu altérée. / In recent years, testicular biopsy followed by the freezing of testicular tissue has been proposed to children with cancer before the introduction of a gonadotoxic treatment. This fertility preservation procedure is offered with the hope that a fertility restoration method will be developed. The thawed testicular tissue could thus be used to perform in vitro maturation, avoiding the reintroduction of tumor cells, to produce spermatozoa. This thesis work first consisted in assessing the establishment of DNA methylation in mouse prepubertal testicular tissue during in vitro spermatogenesis. The culture of fresh or thawed mouse testicular testicular tissue allows the expression levels of DNA methyltransferases 1 and 3a to be maintained in spermatogonia and spermatocytes. In addition, DNA methylation is found even in in vitro produced spermatozoa. The nuclear quality of these spermatozoa was then analyzed. The culture of testicular tissue has no impact on sperm aneuploidy rate, chromatin condensation and DNA fragmentation. However, freezing followed by organotypic culture increases the proportion of spermatozoa with oxidized DNA. Finally, the functionality of in vitro produced spermatozoa was analyzed by oocyte microinjection and the dynamics of different epigenetic marks was studied during preimplantation development. Embryo developmental rates are decreased when using in vitro produced spermatozoa. The levels of H3K4me3, H3K27me3 and H3K9ac are slightly modified in embryos derived from spermatozoa generated in vitro whereas DNA methylation and demethylation are more affected. The production of spermatozoa after culture of fresh or thawed prepubertal tissue in the mouse model has shown that this procedure is not without impact on the early embryo, although the quality of the spermatozoa produced is relatively unaltered.