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Estudo de ADME de compostos derivados do ácido pirazinóico com atividade antimicobacteriana /Franchin, Taísa Busaranho. January 2019 (has links)
Orientador: Rosangela Goncalves Peccinini / Resumo: A tuberculose é uma doença infectocontagiosa provocada pelo Mycobacterium tuberculosis que apesar de reconhecida a muitos anos, ainda tem ocorrência frequente na sociedade, assim como os casos de resistência aos medicamentos, que tem apresentado aumento significativo nos últimos anos. Na busca de novas estratégias para o tratamento, pesquisadores da Unifesp-Diadema desenvolveram novos compostos com potencial atividade antimicobacteriana, denominados pirazinoato de metila (I), pirazinoato de etila (II), pirazinoato de butila (III) e 2-(pirazina-2-carboniloxi)etill pirazina-2-carboxilato (IV), derivados do ácido pirazinóico, principal metabólito da pirazinamida. Ensaios in vitro como a avalição de propriedades físico-químicas e ensaios que avaliam a absorção, distribuição, metabolismo e excreção (ADME), auxiliam na predição das características farmacocinéticas em um estágio inicial do desenvolvimento, permitindo a seleção dos melhores candidatos a novos fármacos. O presente estudo teve como objetivo a realização de screening físico-químico (determinação do coeficiente de partição e da estabilidade química nos pHs de 1,2; 7,4 e 8,8) e ensaios de ADME (cálculo da permeabilidade aparente em monocamada de células Caco-2, a avaliação da estabilidade metabólica em microssoma de ratos e de humanos e avaliação da estabilidade em plasma de rato). Os compostos apresentaram logP de valor negativo, indicando hidrofilicidade e foi observada estabilidade frente os três pHs avaliados. A perme... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Tuberculosis is an infectious disease caused by Mycobacterium tuberculosis which, although recognized for many years, still occurs frequently in society, as well as cases of drug resistance, which has shown a significant increase in recent years. In the search for new treatment strategies, researchers at Unifesp-Diadema have developed new compounds with potential antimycobacterial activity called methyl pyrazinoate (I), ethyl pyrazinoate (II), butyl pyrazinoate (III) and 2- (pyrazine-2 -carbonyloxy) ethyl] pyrazine-2-carboxylate (IV), derivatives of pyrazinoic acid, pyrazinamide's main metabolite. In vitro assays such as the evaluation of physicochemical properties and assays that evaluate absorption, distribution, metabolism and excretion (ADME), aid in the prediction of pharmacokinetic characteristics at an early stage of development, allowing the selection of the best candidates for new drugs. The objective of the present study was the physical-chemical screening (determination of partition coefficient and chemical stability at pHs of 1.2, 7.4 and 8.8) and ADME tests (calculation of the apparent permeability in monolayer of Caco-2 cells, evaluation of metabolic stability in rat and human microsomes and evaluation of stability in rat plasma). The compounds presented logP negative value, indicating hydrophilicity and stability was observed the three pHs evaluated. The apparent permeability calculated for compounds I, II, III and IV resulted in values of 4.66 x10-6; 4.14 x10-... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre
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Biotransformações dos ácidos ent-poliáltico e ent-diidroagático por culturas microbianas e microssomas hepáticos / Biotransformations of ent-polyalthic acid and ent-dihydroagathic acid by microbial cultures and liver microsomes.Sousa, Ingrid Pontes de 21 September 2018 (has links)
Os diterpenos labdanos ácidos ent-poliáltico (AP) e ent-diidroagático (ADA) são metabólitos secundários amplamente distribuídos em diversas espécies vegetais, sendo particularmente comuns nos exsudatos extraídos dos troncos das árvores do gênero Copaifera (Leguminosae- Caesalpinioideae). Estas oleorresinas apresentam diversas atividades biológicas e são utilizadas na medicina popular desde a época dos índios pré-colombianos. Apesar de sua ampla utilização, não há estudos acerca de seu metabolismo. Estudos de biotransformação com constituintes bioativos como o AP e ADA podem contribuir para o entendimento de reações metabólicas in vivo das oleorresinas. Além de indispensáveis na fase pré-clinica de desenvolvimento e otimização de fármacos, os estudos de biotransformação in vitro também podem propiciar a obtenção de novas estruturas químicas farmacologicamente ativas. Assim, os diterpenos AP e ADA foram submetidos a estudos de biotransformação com diferentes tipos de biocatalisadores: fungos filamentosos, micro-organismos do trato gastrointestinal e microssomas hepáticos humanos. Foram obtidos quinze metabólitos de biotransformação com os fungos Cunninghamella elegans, Cunninghamella echinulata e Aspergillus brasiliensis, sendo treze estruturas ainda não descritas na literatura. A reação enzimática mais comum promovida pelos fungos sobre os diterpenoides foi a hidroxilação, porém isomerização da ligação dupla e acetilação também foram identificadas. Apesar de terem sido detectadas diminuições acentuadas nas concentrações dos diterpenos nas culturas com os microorganismos do trato gastrointestinal, os rendimentos dos processos de biotransformação na escala de produção desenvolvida não propiciaram metabólitos em concentrações satisfatórias para isolamento. Apesar dos baixos rendimentos, foi possível propor através de espectrometria de massas a estrutura de quatro derivados oxidados e/ou metilados do ADA após incubação com Saccharomyces boulardii, Lactobacillus fermentum, Escherichia coli, cultura mista com probióticos do gênero Lactobacillus e cultura mista com os probióticos do gênero Bifidobacterium. O ácido ent-agático foi identificado entre os metabólitos propostos, indicando a necessidade de mais estudos acerca do metabolismo dos constituintes das oleorresinas de Copaifera, uma vez que o ácido agático já foi reportado na literatura como abortivo em mamíferos. Para os metabólitos obtidos com microssomas hepáticos humanos foram propostas quatro estruturas oxidadas no metabolismo de fase I e quatro estruturas conjugadas com ácido glucurônico no metabolismo de fase II e fase I e II combinados. Os precursores e os derivados majoritários de biotransformação foram submetidos a ensaios de citotoxidade com células tumorais das linhagens Caco-2, HeLa e MCF-7, além da linhagem normal MCF-10A. As mudanças químicas promovidas pelos fungos na estrutura do ADA não acarretaram mudanças significativas em sua atividade biológica, enquanto a maioria dos derivados do AP apresentou menor efeito citotóxico. Apenas o metabólito P06(AP) apresentou atividade cerca de quatro vezes maior (IC50 = 62,6 ?M) que o precursor, sugerindo que a migração da dupla e a introdução de grupo acetato na estrutura do AP pode ser uma estratégia para obtenção de derivados mais ativos frente a linhagem HeLa. De modo geral, os resultados obtidos neste estudo reforçam a importância da biotransformação como estratégia para obtenção de novas estruturas químicas e contribuem para o entendimento do metabolismo de constituintes bioativos das oleorresinas medicinais de Copaifera / The labdane diterpenes ent-polyalthic (AP) and ent-dihydroagathic (ADA) acids are secondary metabolites widely spread in several plants. Both diterpenes are particularly common in the oleoresins extracted from the tree trunks of Copaifera sp. (Leguminosae- Caesalpinioideae). These oleoresins have several biological activities and have been used in folk medicine since the pre-Columbian Indians times. Despite their wide use, research on the metabolism of the oleoresins is lacking. Biotransformation studies with their bioactive constituents such as AP and ADA may contribute to the understanding of in vivo metabolic reactions. In vitro biotransformation studies are mandatory in the preclinical stage of drug development and optimization and can also provide new pharmacologically active derivatives. Given that, the diterpenes AP and ADA were submitted to biotransformation studies with different types of biocatalysts: filamentous fungi, microorganisms from the gastrointestinal tract and human liver microsomes. The biotransformation with the fungi Cunninghamella elegans, Cunninghamella echinulata and Aspergillus brasiliensis afforded two known structures and thirteen new metabolites. The most common enzymatic reaction by the fungi was hydroxylation, but isomerization of the double bond and acetylation were also detected. Although the microorganisms from the gut microbiota were able to reduce the concentration of the diterpenes in the cultures, the biotransformation yields of the processes were not enough for metabolite isolation. Despite the low yields, four oxygenated and/or methylated metabolites were proposed by mass spectrometry, after incubation of ADA with Saccharomyces boulardii, Lactobacillus fermentum, Escherichia coli, mixed culture with Lactobacillus sp. probiotics and mixed culture with Bifidobacterium sp. probiotics. The diterpene ent-agathic acid was identified among the metabolites, indicating the need for further studies on the metabolism of Copaifera oleoresin constituents, since agathic acid has already been reported as abortive in mammals. Four oxygenated structures and four metabolites conjugated with glucuronic acid were proposed for the phase I and phase II metabolism with human liver microsomes, respectively. The antiproliferative effects of the diterpenes and their major biotransformation derivatives were evaluated against the cancer cell lines Caco-2, HeLa and MCF-7 and the normal cell line MCF-10A. The chemical changes promoted by the fungi in the structure of ADA resulted in no significant changes in its biological activity. Most AP\'s derivatives displayed lower cytotoxic effects, except for the metabolite P06(AP), which showed to be four times more active (IC50 = 62.6 ?M) than its precursor. The migration of the double bond and the introduction of the acetate group in AP\'s skeleton were associated with the greater biological activity. The results obtained herein reinforce the use of biotransformation as a strategy to obtain new chemical structures and contribute to the understanding of the metabolic pathways of bioactive constituents of Copaifera medicinal oleoresins.
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Estudo de metabolismo in vitro e inibição enzimática do produto natural Licarina A empregando microssomas hepático de humanos / In vitro metabolism and enzymatic inhibition study of the natural product Licarin A employing human liver microsomes.Fortes, Simone Silveira 08 August 2017 (has links)
FORTES, S.S. Estudo de metabolismo in vitro e inibição enzimática do produto natural Licarina A empregando microssomas hepático de humanos. 2017. Tese (Doutorado) - Faculdade de Filosofia Ciências e Letras de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2017. Muitos fármacos comercializados tiveram sua origem em produtos naturais e seus derivados. Devido ao grande potencial farmacológico destas novas moléculas pesquisadas, uma etapa importante e inicial no desenvolvimento de um novo fármaco é a avaliação do seu comportamento frente as enzimas do citocromo P450 (CYP 450), incluindo os estudos de interações medicamentosas. Neste contexto, um substrato que merece destaque é a Licarina A (Lic A). Este composto é uma neolignana encontrada em algumas espécies de plantas e vêm demonstrando várias propriedades biológicas promissoras, dentre elas destaca-se a atividade anti-leishimania. No entanto, para que esta substância com comprovada atividade se torne um fármaco é necessário realizar, na fase pré-clínica, estudos sobre seu perfil metabólico frente às enzimas do CYP450 e estudos de interação medicamentosa. Portanto, esta Tese teve como objetivo determinar os parâmetros enzimáticos utilizando microssomas hepáticos de humanos através do estudo de metabolismo in vitro com esta molécula e realizar estudos de interação medicamentosa através dos estudos de inibição enzimática e pesquisar a isoforma do CYP450 que metaboliza predominantemente este produto natural através do emprego de enzimas recombinantes de humanos. Primeiramente, foi desenvolvido um método analítico para a determinação do produto natural Licarina A em meio microssomal. As análises foram realizadas por cromatografia liquida de alta eficiência empregando a coluna Ascentis C18 e fase móvel composta por metanol: solução aquosa de ácido fórmico 0,1% (75:25, v/v); a vazão empregada foi de 1,0 mL min-1. O método foi validado na faixa de concentração de 0,383 a 76,65 ?mol L-1, com coeficiente de correlação linear de 0,99 e limite de quantificação de 0,383 ?mol L-1. A precisão e exatidão apresentaram resultados dentro do recomendável pela ANVISA. Após validação do método, estabeleceram-se as condições lineares para a depleção da Lic A no meio microssomal e posteriormente, a cinética foi determinada em condições de velocidade inicial utilizando para tanto 0,20 mg mL-1 de concentração de proteínas microssomais e 20 minutos de tempo de incubação. O comportamento observado na cinética enzimática para a depleção da Lic A foi um comportamento atípico, caracterizada pelo modelo cinético de Hill. Os valores de Vmax, S50 e coeficiente de Hill foram, 1,651 ?mol mg-1 min-1, 3,87 ?mol L-1 e 2,0 respectivamente. A partir dos parâmetros cinéticos o valor de clearance intrínseco (CLint) para a Lic A foi de 0,22 mL min-1 mg-1. Posteriormente, a correlação in vitro in vivo foi realizada e foi observado um clareance hepático (CLhep) de 20 mL min-1 kg-1 e taxa de extração hepática (E) de 1. As isoformas do CYP450 envolvidas no metabolismo da Lic A foram CYP 1A2 e 2B6. Os estudos de inibição mostraram que a Lic A é um inibidor fraco frente as isoformas do CYP450 estudadas, com valores de IC50 maiores do que 80 ?mol L-1. Embora já tenha sido estudada diferentes vias metabólicas da licarina A com vários metabólitos identificados, esta foi a primeira vez que foi observado a formação de um metabólito in vitro com o uso de microssomas hepático humano. Com o auxílio da espectrometria de massa foi possível a identificação do metabólito de m/z 343 [M+H]+, possivelmente um composto epoxidado, da licarina A. / FORTES, S.S. In vitro metabolism and enzymatic inhibition study of the natural product Licarin A employing human liver microsomes. 2017. Thesis (Doctoral) - Faculdade de Filosofia Ciências e Letras de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2017. Many marketed drugs had their origin in natural products and their derivatives. Due to the biological potential of these new molecules, an important initial step in the development of a new drug is the evaluation of its behavior in front of cytochrome P450 enzymes (CYP 450), including studies of drug interactions. In this context, a substrate that deserves attention is Licarin A (Lic A). This compound is a neolignan found in some species of plants and several promising biological properties have been describing for this natural product, among them anti-leishimania activity. However, for this substance to become a drug, it is necessary to perform, in the preclinical phase, studies regarding its metabolic profile and drug interactions. Therefore, this thesis aimed to determine the enzymatic parameters by using human liver microsomes through in vitro metabolism study with this molecule and to conduct drug interaction studies through the enzyme inhibition studies and finally, to investigate the CYP450 isoforms that metabolize predominantly this natural product through the use of recombinant human enzymes. Firstly, an analytical method was developed for the quantification of the natural product Licarin A in microsomal medium. The analyzes were performed by high performance liquid chromatography employing an Ascentis C18 column and mobile phase composed of methanol: 0.1% formic acid aqueous solution (75:25, v / v); the flow rate used was 1.0 mL min-1. The method was validated in the concentration range of 0.333 to 76.65 ?mol L-1, with a linear correlation coefficient of 0.99 and a quantification limit of 0.333 ?mol L-1. Accuracy and precision showed results in agreement with ANVISA guidelines. After method validation, the linear conditions for depletion of Lic A in the microsomal medium were established. Subsequently, the kinetics were determined under initial velocity conditions using 0.20 mg mL-1 of microsomal protein concentration and 20 minutes of incubation time. The behavior observed in the enzymatic kinetics for the depletion of Lic A was an atypical behavior, characterized by the Hill kinetic model. The values of Vmax, S50 and Hill coefficient were 1.651 ?mol mg-1 min-1, 3.87 ?mol L-1 and 2.0, respectively. From the kinetic parameters, the intrinsic clearance (CLint) for Lic A was 0.22 mL min-1 mg-1. Subsequently, in vitro in vivo correlation was performed and a hepatic clareance (CLhep) of 20 mL min-1 kg-1 and a hepatic extraction rate (E) of 1 was observed. The CYP450 isoforms involved in the metabolism of Lic A were CYP 1A2 and 2B6. Inhibition studies have shown that Lic A is a weak CYP450 inhibitor, with IC50 values greater than 80 ?mol L-1. Although different metabolic pathways of licanin A have been studied and several metabolites were identified, this is the first report about the formation of an in vitro metabolite after metabolism by human liver microsomes. With the aid of mass spectrometry it was possible to identify the metabolite of m/z 343 [M+H]+, possibly an epoxidized compound, of licanin A.
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Caracterização in vitro do metabolismo e da absorção intestinal da casearina X / In vitro characterization of metabolism and intestinal absorption of casearin XSilva, Rodrigo Moreira da 14 March 2016 (has links)
As principais propriedades farmacológicas da Casearia sylvestris, uma espécie de árvore cujas folhas são utilizadas na medicina popular, já foram descritas na literatura. Recentemente foi demonstrada a potente atividade citotóxica in vitro da casearina X (CAS X), o diterpeno clerodânico majoritário isolado das folhas de C. sylvestris, contra linhagens de células tumorais humanas. Apesar dos resultados promissores, sua potente atividade citotóxica in vitro não pode ser extrapolada para uma potente atividade in vivo, a menos que possua boa biodisponibilidade e duração desejável do seu efeito. Tendo em vista que o avanço nas pesquisas de produtos naturais requer a avaliação pré-clínica de propriedades farmacocinéticas, no presente trabalho foi realizada a caracterização in vitro do metabolismo e da absorção intestinal da CAS X, com o objetivo de prever sua biodisponibilidade in vivo. Para os estudos de metabolismo in vitro, foi utilizado o modelo microssomal hepático de ratos e de humanos. Foi desenvolvido um método analítico para a quantificação da CAS X em microssomas, empregando a precipitação de proteínas com acetonitrila no preparo das amostras e a cromatografia líquida de alta eficiência para as análises. O método foi validado de acordo com os guias oficiais da Agência Nacional de Vigilância Sanitária e da European Medicine Agency (EMA). A CAS X demonstrou ser substrato para as reações de hidrólise mediada pelas carboxilesterases (CES) e apresentou um perfil cinético de Michaelis-Menten. Foram estimados os parâmetros de Vmax e KM, demonstrando que o clearance intrínseco em microssomas hepático de humanos foi 1,7 vezes maior que o de ratos. O clearance hepático foi estimado por extrapolação in vitro-in vivo, resultando em mais de 90% do fluxo sanguíneo hepático em ambas as espécies. Um estudo qualitativo para a pesquisa de metabólitos foi feito utilizando espectrometria de massas, pelo qual foi possível sugerir a formação da casearina X dialdeído como produto de metabolismo. Nos estudos de absorção intestinal in vitro foi utilizado o modelo de monocamadas de células Caco-2. Um método analítico por cromatografia líquida acoplada a espectrometria de massas foi desenvolvido e validado de acordo com o EMA, para as etapas de quantificação da CAS X no sistema de células. Os parâmetros cinéticos de permeabilidade aparente absortiva e secretória da CAS X foram estimados em um sistema celular, no qual a atividade hidrolítica da CES foi inibida. Assim, a CAS X foi capaz de permear a monocamada de células Caco-2, provavelmente por transporte ativo, sem a ocorrência de efluxo, mas com significativa retenção do composto dentro das células. Em conjunto, os ensaios in vitro realizados demonstraram a susceptibilidade da CAS X ao metabolismo de primeira passagem, como substrato para as CES específicas expressas no fígado e intestino. / Casearia sylvstris leaves are commonly used by folk medicine and its main pharmacological properties were already described in the literature. Casearin X (CAS X) is the major clerodane diterpene isolated from the leaves of C. sylvestris. Recently, the in vitro cytotoxic activity of the CAS X was demonstrated against human tumor cells lineages. Despite promising results, the CAS X in vitro cytotoxic activity cannot be extrapolated to an in vivo activity, unless the compound has good bioavailability and desirable duration of its effect. The advance in natural products research requires a pharmacokinetic preclinical assessment to justify a therapeutic indication. Thereby, this present work aims to predict the CAS X in vivo bioavailability, by the in vitro characterization of the metabolism and intestinal absorption. The rat and human hepatic microsomal model was used for in vitro metabolism studies. An analytical method for quantification of CAS X in microsomes was developed, employing protein precipitation with acetonitrile for sample preparation and High Performance Liquid Chromatography for analysis. This method was validated in according to Agência Nacional de Vigilância Sanitária and European Medicine Agency guidelines (EMA). CAS X demonstrated to be substrate for carboxylesterases (CES) by hydrolysis reaction, with a Michaelis-Menten kinetic profile. The parameters Vmax and KM was estimated and the intrinsic clearance was 1.7-fold higher in humans than rats. The hepatic clearance was estimated by in vitro-in vivo extrapolation, resulting in more than 90% of the hepatic blood flow for both species. A qualitative study was carried out for the metabolite identification, using Mass Spectrometry, suggesting the formation of casearin X dialdehyde as metabolism product. Monolayer of Caco-2 cells was used for the in vitro intestinal absorption studies. An analytical method by Liquid Chromatography coupled to Mass Spectrometry was developed and validated, according to EMA, for the quantification of CAS X in cells systems. The apparent permeability was estimated in both, absorptive and secretory directions, using cells monolayers with inhibited CES hydrolysis. CAS X was able to cross the Caco-2 cells monolayer, probably by active transport, with no significant efflux, but with a high retention of the compound inside the cells. These findings demonstrated that CAS X is susceptible to first-pass metabolism, as substrate for specific CES expressed in both, liver and intestine.
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Análise enantiosseletiva do praguicida miclobutanil após metabolismo in vitro por microssomas hepáticos de humanos / Enantioselective analysis of myclobutanil pesticide after in vitro metabolism by human liver microsomes.Fonseca, Franciele Saraiva 30 May 2018 (has links)
O miclobutanil é fungicida quiral da família dos triazóis, comercializado como mistura racêmica. Apesar dos enantiômeros apresentarem as mesmas propriedades físico-químicas, estes podem diferir em termos de atividade, metabolismo, excreção e toxicidade. No presente trabalho, foram realizados estudos in vitro enantiosseletivos de metabolismo empregando microssomas hepáticos de humanos cujos objetivos foram determinar os parâmetros cinéticos das enzimas do citocromo P450 (CYP450) após metabolismo do miclobutanil (na forma de racemato e enantiômeros isolados), determinar quais isoformas do CYP450 são responsáveis pelo metabolismo do praguicida e também a capacidade deste praguicida em inibir as principais enzimas do CYP450. Os estudos foram realizados empregando a mistura racêmica e também os enantiômeros isolados. Para tanto, foi desenvolvido e validado um método para análise enantiosseletiva do miclobutanil em meio microssomal empregando a cromatografia líquida de alta eficiência acoplada a espectrometria de massas. A separação dos enantiômeros foi realizada na coluna Chiralpak AD® empregando metanol (100%) como fase móvel. Após a validação do método, os parâmetros cinéticos foram determinados, com valores de Vmáx, Km e CLint de 66,06 + 4,59 nmol min-1 mg-1, 3,61 + 0,88 ?mol L-1 e 18,30 mL min-1 mg-1 respectivamente, quando o substrato foi o racemato e de 305,50 + 18,39 nmol min-1 mg-1, 6,85 + 1,29 ?mol L-1 e 44,60 mL min-1 mg-1 respectivamente, quando o (+)-miclobutanil foi empregado como substrato. O (?)-miclobutanil não foi metabolizado pelas enzimas presentes nos microssomas hepáticos de humanos. As isoformas responsáveis pelo metabolismo do miclobutanil foram a CYP2C19 e a CYP3A4. Os estudos in vitro de inibição mostraram que o miclobutanil é um inibidor moderado das enzimas CYP2D6 e CYP2C9 um inibidor forte das enzimas CYP3A4/5 e CYP2C19. / Myclobutanil is a chiral triazole fungicide, sold as a racemic mixture. Although the enantiomers have the same physico-chemical properties, they may exhibit different bioactivity, metabolism, excretion and toxicity. In the present work, in vitro enantioselective metabolism studies were carried out by using human liver microsomes, aiming to determine the kinetic parameters of cytochrome P450 (CYP450) enzymes after myclobutanil metabolism and the main CYP450 isoforms involved in the metabolism. In addition, the myclobutanil inhibition capacity over the main CYP450 enzymes was evaluated. The studies were carried out with rac-myclobutanil as well as with the isolated enantiomers. To accomplish that, an enantioselective method for myclobutanil analysis was developed and validated by using high performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry. The separation of enantiomers was realized on a Chiralpak AD® column and methanol (100%) was used as mobile phase. The enzymatic kinetics, Vmáx, Km and CLint, were: 66.06 + 4.59 nmol min-1 mg-1, 3.61 + 0.88 ?mol L-1 and 18.30 mL min-1 mg-1, respectively, for rac-myclobutanil and 305.50 + 18.39 nmol min-1 mg-1, 6.85 + 1.29 ?mol L-1 and 44.60 mL min-1 mg-1, respectively, for the (+)-myclobutanil. The (?)-myclobutanil was not metabolized by CYP450 enzymes. The isoforms involved in myclobutanil metabolism were CYP2C19 and CYP3A4. In vitro inhibition studies showed that myclobutanil is a medium inhibitor of CYP2D6 and CYP2C9 enzymes and a strong inhibitor of CYP3A4/A5 and CYP2C19 enzymes.
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Estudo do metabolismo in vitro da caramboxina / In vitro metabolism study of caramboxinPereira, Pâmela Rodrigues Rosa 23 April 2018 (has links)
A carambola (Avehrroa carambola L.) é uma rica fonte de vitaminas, sais minerais e antioxidantes. Seu formato de estrela, quando seccionada transversalmente, torna essa fruta muito valorizada na culinária. Contudo, nos últimos anos têm sido relatados alguns casos de intoxicação após ingestão desta fruta, relacionados, principalmente, a pacientes nefropatas. Sintomas como soluços intratáveis, agitação, confusão mental, vômito, convulsão e morte, decorrentes do status epilepticus (SE), foram descritos na maioria dos casos de intoxicação. Este quadro pode estar associado a presença de uma neurotoxina, caramboxina (CBX), que tem a capacidade de inibir o sistema de condução GABAérgico, além de atuar sobre os principais receptores glutamatérgicos, levando a ativação do mecanismo de excitotoxicidade neuronal. Há diversos modelos experimentais que buscam estudar os mecanismos ligados ao aparecimento do SE. Uma vez que a caramboxina pode estar relacionada com a indução do SE, estudos para melhor compreender seu metabolismo podem contribuir para sua possível aplicação em modelos experimentais de epilepsia. Portanto, este trabalho teve como objetivo estudar o metabolismo in vitro da caramboxina, utilizando microssomas hepáticos e modelo de oxidação biomimética. Um extrato metanólico foi preparado na proporção de 1:1 (m/v) e em seguida fracionado em coluna contendo sephadex LH-20. A fração contendo CBX foi submetida a cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) para seu isolamento. Essa metodologia permitiu um rendimento superior ao descrito na literatura, permitindo que esta neurotoxina possa ser futuramente avaliada em modelos experimentais in vivo de epilepsia. Parte da CBX isolada foi avaliada em ensaios de metabolismo in vitro com microssomas hepáticos de ratos, no entanto, não foi observado formação de produtos de oxidação nas condições empregadas, o que pode sugerir que não ocorra metabolismo de fase I da CBX, corroborando com a proposta de rápida eliminação pela urina por pessoas saudáveis que ingerem carambola. A avaliação da oxidação da CBX por modelo biomimético, utilizando catalizador de Jacobsen e oxidante e iodosilbenzeno (PhIO), apresentou a formação de um metabólito, o qual poderá ser posteriormente utilizado nos estudos de mecanismo de ação da CBX / The Star fruit (Averrhoa carambola L.) is a good source of vitamins, minerals and antioxidants. Its star shape, when cross-sectioned, makes this fruit highly prized in cooking. However, in the last years some cases of intoxication after ingestion of this fruit, mainly related to nephropathy patients, have been reported. Symptoms such as intractable hiccups, agitation, mental confusion, vomiting, convulsion, and death, due to status epilepticus (SE), have been described in most cases of intoxication. These clinical conditions may be associated with the presence of a neurotoxin, caramboxine (CBX), which has the capacity to inhibit the GABAergic conduction system, in addition to acting on the main glutamatergic receptors, leading to activation of the mechanism of neuronal excitotoxicity. Several experimental models aim to study the mechanisms related to the appearance of the SE. Since caramboxin may be related to the induction of ES, studies to better understand its metabolism may contribute to its possible application in experimental models of epilepsy. Therefore, this work aimed to study the in vitro metabolism of caramboxin, using hepatic microsomes and biomimetic oxidation model. A methanolic extract was prepared in the ratio of 1: 1 (m / v) and then fractionated on a column containing LH-20 sephadex. The fraction containing CBX was submitted to high performance liquid chromatography (HPLC) for its isolation. This methodology allowed a higher yield than described in the literature, allowing this neurotoxin to be evaluated in vivo in experimental models of epilepsy. Part of the isolated CBX was evaluated in in vitro metabolism assays with hepatic microsomes of rats, however, no oxidation product formation was observed under the conditions employed, which may suggest that CBX phase I metabolism does not occur, corroborating with a proposal for rapid urinary elimination by healthy people who eat carambola. The evaluation of CBX oxidation by biomimetic model, using Jacobsen\'s catalyst and oxidant and iodosilbenzene (PhIO), presented the formation of a metabolite, which could be used in future CBX action mechanism studies.
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Efeito de difenóis sobre alguns processos oxidativos / Effects of diphenols on oxidative processesAugusto, Ohara 27 November 1975 (has links)
Catecol e catecolaminas foram ensaiados sobre as atividades NADPH e NADH oxidásica dos microssomos. Quantidades catalíticas de adrenalina aumentam de duas a três vezes a velocidade de oxidação do NADPH, após um pequeno período de indução. O efeito da adrenalina é suprimido pela superóxido dismutase, se a enzima é adicionada antes de iniciada a reação. O efeito catalítico é atribuído a dois produtos de oxidação da adrenalina pelo íon superóxido; à quinona, produto de oxidação de dois elétrons e ao adrenocromo, produto de oxidação de quatro elétrons. Provavelmente, o adrenocromo reoxida a NADPH citocromo c redutase, e a quinona formada reage com oxigênio, regenerando adrenocromo. A adrenalina não mostrou qualquer efeito sobre a atividade NADH oxidásica, nem sobre a atividade NADPH oxidásica, estimulada por menadiona. Provavelmente, durante estes processos, dois elétrons são transferidos simultaneamente ao oxigênio. Catecol e catecolaminas duplicam a velocidade de oxidação do NADH em presença de quantidades catalíticas de NADH-citocromo b5 redutase e citocromo b5. Este resultado sugere a formação do íon superóxido, durante a autoxidação do citocromo b5. Catecol e p-hidroquinona promovem, cataliticamente, a oxidação da oxihemoglobina e oximioglobina à forma ferri. A velocidade de oxidação da oxihemoglobina mostra dependência de primeira ordem em relação à concentração de hemeproteína e de meia ordem em relação ao difenol ; contudo a altas concentrações dos catalisadores observa-se saturação, com valores de Vmáx similares para ambos os difenóis. É proposto que uma quinona , inicialmente formada, oxida a oxihemeproteína com liberação de oxigênio; por sua vez, a semiquinona oxida uma segunda molécula de oxihemeproteína, sendo que o oxigênio ligado recebe dois elétrons. Exceto para o caso da oximioglobina, que é mais reativa, a forma reduzida do catalisador deve estar presente para se opor ao desaparecimento da semiquinona por dismutação. Desde que se observa a liberação de oxigênio, esperada para a formação de água, o sistema pode ser considerado modelo de oxidase terminal. Infere-se tentativamente, que a oxihemoglobina tem estrutura HbFe2+ ...O2, e que a velocidade da oxidação catalisada é limitada pela velocidade de produção da verdadeira forma reativa, a estrutura ferri-superóxido, HbFe3+...O-2. / Catechol and catecholamines have been assayed upon the microsomal NADPH and NADH oxidase activities. Adrenaline shows a catalytic effect on the NADPH oxidation characterized by a small lag. The two-to three fold increase in rate can be supressed by dismutase if the enzyme is added before superoxide the reaction begins. The catalytic effect is ascribed to two products of adrenaline oxidation by the superoxide ion; to the quinone, the two electron oxidation product, and to the adrenochrome, the four electron oxidation product. Presumably, the adrenochrome reoxidizes the NADPH-cytochrome c reductase, and the formed quinone reacts with oxygen and regenerates the adrenochrome. Adrenaline neither changed, the NADH oxidase activity nor the menadione-stimulated NADPH oxidase activity. Presumably in these processes, two electrons are simultaneously transferred to the oxygen. Catechol and catecholamines doubled the rate of autoxidation of NADH in the presence of catalytic amounts of NADH-cytochrome b5 reductase and cytochrome b5 This result suggests superoxide ion formation in the autoxidation of the cytochrome. Catechol and p-hydroquinone catalytically promote the oxidation of oxyhemoglobin and oxymyoglobin to the ferri-form. Kinetic data for oxyhemoglobin oxidation indicates a first-order dependence upon the hemoprotein concentration and half-order dependence upon diphenol; however at high catalyst concentration, saturation is observed with similar Vmax values for both diphenols despite the difference in reactivity. It is proposed that initially formed quinone oxidizes the hemoprotein with oxygen release; in turn the semiquinone oxidizes a second molecule of hemoprotein and regenerates the quinone, with the bound oxygen acquiring two electrons. Except for the more reactive oxymyoglobin, the reduced form of the catalyst must be present to oppose semiquinone disappearance by dismutation, Since the expected release of 02 for water formation is observed, the system may be considered a model for terminal oxidase. It is tentatively inferred that oxyhemoglobin has the structure HbFe2+...02 and that the rate of the catalyzed oxidation is limited by the rate of generation of the true reacting form, the superoxide ferri structure, HbFe3+...0-2.
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Estudo in vitro do perfil metabólico do agente antitumoral piplartina frente às enzimas do citocromo P450 e predição de parâmetros farmacocinéticos / Metabolic profile of the antitumor agent piplartine by Cytochrome P450 enzymes, in vitro study and prediction of pharmacokinetic parametersMoreira, Fernanda de Lima 21 February 2017 (has links)
A piplartina (PPT) ou piperlongumine é um produto natural da classe dos alcaloides encontrada em espécies da família Pipereaceae. Devido a sua alta potência e seletividade na inibição de diversas linhagens de células tumorais, a PPT têm sido investigada como um potencial candidato à fármaco. Neste contexto, estudos relacionados à sua toxicidade e segurança devem ser realizados, incluindo a determinação do papel das enzimas do Citocromo P450 (CYP450) sobre o metabolismo da PPT. Esta família de enzimas é responsável pela biotransformação de cerca de 75% dos fármacos presentes no mercado. Os estudos pré-clínicos que visam avaliar o metabolismo podem ser realizados empregando modelos in vitro como uma ferramenta para predição de características farmacocinéticas in vivo. Assim, o presente estudo teve como objetivo a avaliação do perfil metabólico da PPT frente as enzimas do CYP450 empregando-se estudos in vitro com microssomas hepáticos humanos (HLM) e a posterior predição de parâmetros farmacocinéticos. Estes estudos incluíram a determinação de parâmetros enzimáticos, estudos de inibição da PPT sobre as principais isoformas do CYP450, elucidação estrutural de metabólitos gerados com a reação de metabolismo e, finalmente, estudos de fenotipagem enzimática. A metodologia geral de estudo de metabolismo in vitro envolveu o uso de técnicas cromatográficas acopladas a diversos detectores/analisadores, tais como arranjo de diodos, espectrometria de massa e ressonância magnética nuclear. O metabolismo foi avaliado pela medida da taxa de desaparecimento da PPT do meio microssomal. Após validação da metodologia para quantificação da PPT e determinação das condições de velocidade inicial de reação, um perfil sigmoidal foi obtido, indicando o metabolismo da PPT por enzimas contendo múltiplos sítios ativos e/ou catálise por diversas enzimas concomitantemente. Os parâmetros cinéticos calculados foram Vmax = 5,5 ± 0,5 nmol mg proteína-1 min-1, S50 = 127,70 ?mol L-1 e Coeficiente de Hill (h) = 3. O clearance intrínseco obtido foi de 22,68 ?L min -1 mg -1. A fração não ligada às proteínas plasmáticas e microssomais foi de 0,07 e 0,76, respectivamente. O clearance in vivo predito foi de 19,79 mL min -1 kg -1, o clearance hepático de 1,89 mL min -1 kg -1 e extração hepática de 0,09. Dentre quatro isoformas avaliadas, CYP3A, CYP2C9, CYP2D6 e CYP1A2, a PPT demonstrou um potencial em causar interação produto natural-medicamento apenas sobre a CYP1A2. A PPT é um inibidor competitivo dose-dependente da CYP1A2, apresentando um valor de Ki de 1,5 ?mol L-1. A razão [I]/Ki obtida de 9,1 prediz uma interação relevante in vivo. Além disso, a PPT apresentou uma inibição tempo-dependente sobre a CYP1A2 com valores de KI de 8 ?mol L-1 e kinact de 0,014 min-1. A inibição dose-, ii NADPH- e tempo-dependente confirmam uma inibição baseada no mecanismo em que o modo pelo qual a PPT liga-se à enzima é irreversível. Baseado nos dados obtidos pelas análises por espectrometria de massa e ressonância magnética nuclear, quatro metabólitos gerados após metabolismo da PPT com HLM tiveram suas estruturas propostas. Assim, foram caracterizados os metabólitos M1 (produto de uma desmetilação na posição meta do anel 3,4,5-trimetoxicinâmico), M2 (produzido por uma epoxidação entre o C3 e C4 do anel lactâmico), M3 (gerado através de uma oxidação no C5 do anel lactâmico) e, finalmente, M4 (produto de uma reação transdiidrodiol entre C3 e C4). O metabólito M4 é formado tardiamente (após 40 min de reação) e provavelmente é um metabólito secundário produzido a partir de M2 através de uma reação trans-diidrodiol. O estudo de fenotipagem demonstrou que as principais isoformas que contribuem para o metabolismo da PPT são a CYP1A2 (formação de M1) e a CYP3A4 (formação de M2 e M3). O emprego das isoformas recombinantes demonstrou a formação de M4 a partir da catálise por diversas isoformas, CYP2C19, CYP2C8, CYP2D6, CYP2B6 e CYP2E1. Portanto, o perfil metabólico do candidato a agente antitumoral PPT frente às enzimas do CYP450 foi demonstrado neste trabalho, proporcionando aspectos relacionados à segurança e eficácia desta substância. Os dados apresentados certamente servirão como guia em estudos clínicos futuros / Piplartine (PPT) or Piperlongumine is a naturally occurring alkaloid found in species of Pipereaceae family. Due its high potency and selectivity of inhibition of several cancer cell lines, PPT has been investigated as a potential drug candidate. In this context, studies related with toxicity and safety should be performed, including the role of the Cytochrome P450 (CYP450) enzymes in PPT metabolism. This family of enzymes is responsible for the biotransformation of 75% of the drugs in the market. The preclinical studies that aim to evaluate the drug metabolism can be performed by employing in vitro models as a tool for prediction of in vivo pharmacokinetic characteristics. Therefore, the aim of this work was to evaluate the metabolic profile of PPT after metabolism by CYP450 enzymes employing in vitro studies with human liver microsomes (HLM) and the ensuing prediction of pharmacokinetic parameters. These studies embraced the kinetic parameters determination, inhibition ability of PPT over the most important CYP450 isoforms, structural elucidation of the produced metabolites after metabolism reaction and, finally, the enzymatic phenotyping study. The general procedure for in vitro metabolism studies consisted of the use of chromatographic techniques coupled to different detectors/analyzers, such as diode array, mass spectrometry and nuclear magnetic resonance. The metabolism was evaluated measuring the rate of disappearance of the PPT from de microsomal medium. After method validation for PPT quantification and determination of initial velocity conditions, the enzymatic kinetics with a sigmoidal profile indicating a metabolism of PPT by enzymes with multiple active sites and/or metabolism by multiple CYP450 enzymes was observed. The following parameters were calculated: Vmax = 5.5 ± 0.5 nmol/mg protein/min, S50 = 127.7 ?mol/L, and Hill coefficient of 3.0. The intrinsic clearance was 22.68 ?L min -1 mg -1. The unbound fraction of PPT on plasmatic and microsomal proteins was 0.07 and 0.76, respectively. The predicted in vivo clearance was 19.79 mL min -1 kg -1, the hepatic clearance was 1.89 mL min -1 kg -1 and the hepatic extraction was 0.09. Among 4 isoforms evaluated, CYP3A, CYP2C9, CYP2D6 and CYP1A2, a potential natural product-drug interaction for only CYP1A2 isoenzyme by PPT was observed. PPT showed to be a competitive and dosedependent inhibitor of CYP1A2, showing a Ki value of 1.5 ?mol L-1. The ratio [I]/Ki of 9.1 predicts an important in vivo interaction. Furthermore, a time-dependent inhibition of CYP1A2 with a KI of 8 ?mol L-1 and a kinact of 0.014 min-1 by PPT was demonstrated. The dose-, time- and NADPH-dependent inhibition confirms an inhibition based on mechanism through an irreversible bond. Based on results obtained from the mass spectrometry analysis and from the nuclear magnetic resonance analysis, four metabolites were identified and characterized. The metabolites characterized were: M1 (product of a demethylation in the 3,4,5-trimethoxyphenyl portion, M2 (derived from an epoxidation between C3 and C4 on the lactone ring), M3 (product of a simple oxidation on C5 of lactone ring), and finally M4 (derived from a dihydrodiol reaction between C3 and C4). The metabolite M4 is produced later (after 40 min of reaction) and probably is a secondary metabolite produced from M2 through a dihydrodiol reaction. The phenotyping study demonstrated that the main isoforms involved in PPT metabolism are CYP1A2 (production of M1) and CYP3A4 (production of M2 and M3). The recombinant isoforms study demonstrated that several isoforms (CYP2C19, CYP2C8, CYP2D6, CYP2B6 and CYP2E1) catalyze the production of M4. In summary, a wide view about the metabolism of the promising drug candidate PPT by CYP450 enzymes was accomplished. These results, certainly, will be a useful guide for further clinical studies of PPT
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Estudos de inibição das enzimas do citocromo P450 pelo produto natural (-)-grandisina utilizando microssomas hepáticos de humanos / Inhibition studies of cytochrome P450 enzymes by the natural product (-)-grandisin using human liver microsomesHabenschus, Maísa Daniela 20 May 2016 (has links)
A (-)- grandisina (GRA) é um produto natural da classe das lignanas e é encontrada em muitas espécies de plantas das regiões Norte e Nordeste do Brasil. Por apresentar diversas propriedades biológicas, como atividade tripanocida, anti-inflamatória, antinociceptiva, e principalmente atividade antileucêmica e antitumoral contra tumores de Ehrlich, a GRA pode ser considerada um potencial candidato a fármaco. Porém, para que a GRA se torne um fármaco são necessárias diversas etapas de estudos, incluindo estudos pré-clínicos de interações medicamentosas (DDI). As DDI ocorrem principalmente devido a inibições diretas e tempo-dependentes das enzimas do citocromo P450 (CYP450), uma superfamília de enzimas responsável por metabolizar cerca de 75% dos fármacos em uso. Os estudos pré-clínicos de DDI envolvem o conhecimento do potencial inibitório do candidato a fármaco sobre essas enzimas e esses estudos podem ser realizados empregando diversos modelos in vitro, como, por exemplo, microssomas hepáticos de humanos (HLM). Assim, nesse estudo foi avaliado o efeito inibitório da GRA sobre a atividade das principais isoformas do CYP450 e também foram determinadas as isoformas que contribuem para a formação dos metabólitos da GRA. Os resultados demonstraram que múltiplas isoformas participam da formação dos metabólitos da GRA, com destaque para a CYP2C9, que participa da formação de todos os metabólitos. Em relação aos estudos de inibição, foi possível concluir que a GRA é um inibidor fraco da CYP1A2 e CYP2D6, com valores de IC50 maiores do que 200 µM e 100 µM, respectivamente, e um inibidor moderado e competitivo da CYP2C9, com IC50 igual a 40,85 µM e Ki igual a 50,60 µM. Para a CYP3A4 o potencial inibitório da GRA foi avaliado utilizando dois substratos distintos. A GRA demonstrou ser tanto um inibidor dose-dependente moderado e competitivo dessa isoforma, quanto um inibidor tempo-dependente baseado em mecanismo com potencial de inativação equiparável ao do irinotecano, inibidor baseado em mecanismo clinicamente significativo. Utilizando a nifedipina como substrato os valores de IC50 e Ki foram 78,09 µM e 48,71 µM, respectivamente. Já os valores dos parâmetros cinéticos de inativação foram KI= 6,40 µM, kinact= 0,037 min-1 e Clinact= 5,78 mL min-1 µmol-1. Para os ensaios empregando o midazolam os valores de IC50 e Ki foram 48,87 µM e 31,25 µM, respectivamente, e os valores dos parâmetros cinéticos de inativação foram KI= 31,53 µM, kinact= 0,049 min-1 e Clinact= 1,55 mL min-1 µmol-1. Com relação a CYP2E1, por sua vez, foi possível observar que a GRA tem capacidade de aumentar a atividade dessa isoforma significativamente a partir da concentração de 4 µM. Portanto, conclui-se que não há risco da GRA apresentar interações medicamentosas com fármacos metabolizados pela CYP1A2 e CYP2D6, enquanto que para a CYP2C9, apesar da GRA ser um inibidor moderado dessa isoforma, o risco é baixo. Já para medicamentos metabolizados pela CYP2E1 e CYP3A4 o risco de DDI existe e isso deve ser cuidadosamente monitorado in vivo, principalmente porque a CYP3A4 é a isoforma responsável por catalisar o metabolismo da maioria dos fármacos. / (-)-grandisin (GRA) is a lignanic natural product found in many species of plants from North and Northeast of Brazil. This compound has several biological properties, such as trypanocide, anti-inflammatory, antinociceptive, antileukemia activity and antitumor activity against Ehrlich tumor. Because of these biological properties, GRA is considered a potential drug candidate, however, before becoming a new drug, GRA has to undergo various tests, including preclinical drug-drug interactions (DDI) studies. Most of the times, DDI occur because of direct and time-dependent inhibitions of cytochrome P450 (CYP450) enzymes, an enzyme superfamily responsible for metabolizing the vast majority of drugs administered. Preclinical drug-drug interactions studies involve the evaluation of the potential of a drug candidate to inhibit this superfamily of enzymes and these studies can be conducted using in vitro models, such as human liver microsomes (HLM). Therefore, in this project, the inhibitory effect of GRA on the activity of some CYP450 isoforms was evaluated and the isoforms that catalyze the formation of GRA\'s metabolites were also determined. Results showed that multiple CYP450 isoforms participate in the GRA\'s metabolites formation, highlighting CYP2C9, which catalyzes the formation of all metabolites. The inhibition studies showed that GRA is a weak inhibitor of CYP1A2 and CYP2D6, with IC50 values greater than 200 µM and 100 µM, respectively, and a moderate and competitive inhibitor of CYP2C9, with IC50 value equal to 40.85 µM and Ki value equal to 50.60 µM. The capability of GRA to inhibit CYP3A4 was evaluated using two different substrates. GRA showed to be a moderate and competitive dose- dependent inhibitor of this isoform and also a mechanism-based time-dependent inhibitor with potential of inactivation comparable to irinotecan, a clinically significant mechanism-based inhibitor. IC50 and Ki values obtained using nifedipine as substrate were 78.09 µM and 48.71 µM, respectively, and inactivation kinetics parameters were KI= 6.40 µM, kinact= 0,037 min-1 e Clinact= 5.78 mL min-1 µmol-1. On the other hand, IC50 and Ki values using midazolam as substrate were 48.87 µM and 31.25 µM, respectively, and the values of inactivation kinetics parameters were KI= 31.53 µM, kinact= 0,049 min-1 and Clinact= 1.55 mL min-1 µmol-1. With respect to CYP2E1, it was observed that GRA increases its activity significantly from a concentration of 4 µM. Therefore, it is possible to conclude that there is no risk of DDI between GRA and drugs metabolized by CYP1A2 and CYP2D6, while for CYP2C9, although GRA is a moderate inhibitor of this isoform, the risk is low. Finally, for drugs metabolized by CYP3A4 and CYP2E1 there is risk of DDI and this should be carefully monitored in humans, mainly because CYP3A4 is an isoform responsible for catalyzing the metabolism of most drugs in use.
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Estudo de metabolismo in vitro do alcalóide Piplartina empregando microssomas hepático de ratos / In vitro metabolism study of the piplartine alkaloid using rats liver microsomesMarques, Lucas Maciel Mauriz 25 July 2013 (has links)
O gênero Piper pertencente à família Piperaceae, encontra-se distribuído nas regiões tropicais e subtropicais do globo. Estudos químicos têm demonstrado diversidade de metabólitos secundários com atividade biológica. Os alcalóides são metabólitos característicos. A piplartina, (E)-1-(3-(3,4,5-trimetoxifenil)acriloil)-5,6- diidropiridin-2(1H)-ona, é um alcalóide encontrado em muitas espécies. Tem atividade citotóxica contra células de linhagem tumoral, ansiolítica, antidepressiva, antifúngica e antiagregação plaquetária, sendo dessa forma, uma molécula candidata a um novo fármaco. O conhecimento do metabolismo de um candidato a fármaco é um fator importante na avaliação da sua segurança e eficácia. Ensaios in vitro estão crescentemente sendo utilizados como screening e os microssomas hepáticos representam o sistema in vitro mais utilizado. Dessa forma, o presente trabalho tem como objetivo determinar os parâmetros cinéticos enzimáticos in vitro da piplartina utilizando microssomas de fígado de ratos, bem como a determinação dos possíveis metabólitos formados. Para tanto, foi desenvolvido um método de quantificação da piplartina utilizando cromatografia líquida de alta eficiência. Como condição de análise, empregou-se uma coluna C18, fase móvel acetonitrila:água (40:60, v/v) e vazão de 1 mL min-1. Para extração da piplartina dos microssomas hepático de ratos foi empregado a extração líquido-líquido utilizando 4,0 mL de hexano como solvente extrator. Após otimização da extração, o método foi validado, mostrando-se linear na faixa de 2,4-157,7 ?M, obtendo-se uma equação da reta y= 0,0934x + 0,0027, (r= 0,99) e limite de quantificação de 2,4 ?M. A recuperação média foi de 85%. A precisão e exatidão apresentaram resultados dentro do recomendável pela ANVISA. A piplartina manteve-se estável até 50 minutos em condições de incubação, e até 6h sob a bancada. Após validação da metodologia, estabeleceram-se as condições lineares para a quantidade de proteínas microssomais: 0,28 mg mL-1 e para o tempo de incubação: 16 minutos no consumo da piplartina no meio microssomal, e então efetuou-se a determinação dos parâmetros cinéticos enzimáticos da piplartina empregando as condições de V0. Nesse estudo foi observado um Vmax= 4,74 ± 0,26 ?M/?g mL-1/min, h= 2,53 ± 0,37, S50= 44,69 ± 0,32 ?M e CLmax= 0,054 ?L/min/mg proteina, um perfil cinético indicativo de cooperatividade. Um estudo qualitativo para determinação dos possíveis metabólitos foi feito utilizando-se a espectrometria de massas, por meio da qual foi possível identificar a formação de dois produtos hidroxilados. Deste modo, os microssomas mostraram-se uma ferramenta útil, rápida e simples para determinação da cinética enzimática, e na condução dos estudos preliminares de metabolismo in vitro. / The genus Piper belongs to the Piperaceae family and includes species that are widely distributed throughout the tropical and subtropical regions of the world. Chemical studies have shown diversity of secondary metabolites with biological activity. The alkaloids are characteristic metabolites. The piplartine, (E)-1-(3-(3,4,5- trimethoxyphenyl)acryloyl)-5,6-diidropiridin-2(1H)-one is an alkaloid found in many species. It shows cytotoxic activity against tumor cell lines, anxiolytic, antidepressant, antifungal, and antiplatelet therapy, thus being a drug candidate. The knowledge regarding the oxidative metabolism is an important tool in assessing the safety and efficacy of a drug candidate. In vitro assays are increasingly being used as a screening tool and liver microsomes represent the most widely in vitro system used for that. This study aims to determine the in vitro enzymatic kinetic parameters for piplartine by cytochrome P450 enzymes (CYP) present in the rat liver microsomes, and the determination of possible metabolites. To accomplish, it was developed a method to quantify the piplartine using high performance liquid chromatography. The analysis was carried out employing a C18 column, mobile phase: acetonitrile: water (40:60, v/v) at a flow rate of 1 ml min-1. To extract piplartine from rat liver microsomes it was employed the liquid-liquid extraction (4.0 mL of hexane). The method was validated and proved to be linear in the range of 2.4 to 157.7 ?M, the equation for calibration curve was: y= 0.0934x + 0.0027 (r = 0.99), and a limit of quantification of 2.4 ?M. The mean recovery was 85%. The precision and accuracy were in agreement with ANVISA guidelines. The piplartine remained stable until 50 minutes of incubation conditions, and until 6 hours under the bench. Once validated, it was set the conditions for the linear amount of microsomal protein: 0.28 mg mL-1 and to the incubation time: 16 minutes, then it was performed the determination of enzymatic kinetic parameters, that revealed a sigmoidal profile with Vmax = 4.74 ± 0.26 ?M/mg mL-1/min, h = 2.53 ± 0.37, S50 = 44.69 ± 0.32 ?M, and CLmax = 0.054 ?L/min/mg protein, indicating a cooperativity behavior. A qualitative study to determine possible metabolites carried out using mass spectrometry, through which it was possible to identify the formation of two hydroxylated products. To conclude, the microsomes showed to be a useful, fast and simple tool to determination of enzymatic kinetics and in vitro metabolism studies.
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