L'arthrose est la maladie musculo-squelettique la plus commune dans le monde. Elle est l'une des principales causes de douleur et d’incapacité chez les adultes, et elle représente un fardeau considérable sur le système de soins de santé. L'arthrose est une maladie de l’articulation entière, impliquant non seulement le cartilage articulaire, mais aussi la synoviale, les ligaments et l’os sous-chondral. L’arthrose est caractérisée par la dégénérescence progressive du cartilage articulaire, la formation d’ostéophytes, le remodelage de l'os sous-chondral, la détérioration des tendons et des ligaments et l'inflammation de la membrane synoviale. Les traitements actuels aident seulement à soulager les symptômes précoces de la maladie, c’est pour cette raison que l'arthrose est caractérisée par une progression presque inévitable vers la phase terminale de la maladie. La pathogénie exacte de l'arthrose est encore inconnue, mais on sait que l'événement clé est la dégradation du cartilage articulaire. Le cartilage articulaire est composé uniquement des chondrocytes; les cellules responsables de la synthèse de la matrice extracellulaire et du maintien de l'homéostasie du cartilage articulaire. Les chondrocytes maintiennent la matrice du cartilage en remplaçant les macromolécules dégradées et en répondant aux lésions du cartilage et aux dégénérescences focales en augmentant l'activité de synthèse locale. Les chondrocytes ont un taux faible de renouvellement, c’est pour cette raison qu’ils utilisent des mécanismes endogènes tels que l'autophagie (un processus de survie cellulaire et d’adaptation) pour enlever les organelles et les macromolécules endommagés et pour maintenir l'homéostasie du cartilage articulaire. i L'autophagie est une voie de dégradation lysosomale qui est essentielle pour la survie, la différenciation, le développement et l’homéostasie. Elle régule la maturation et favorise la survie des chondrocytes matures sous le stress et des conditions hypoxiques. Des études effectuées par nous et d'autres ont montré qu’un dérèglement de l’autophagie est associé à une diminution de la chondroprotection, à l'augmentation de la mort cellulaire et à la dégénérescence du cartilage articulaire. Carames et al ont montré que l'autophagie est constitutivement exprimée dans le cartilage articulaire humain normal. Toutefois, l'expression des inducteurs principaux de l'autophagie est réduite dans le vieux cartilage. Nos études précédentes ont également identifié des principaux gènes de l’autophagie qui sont exprimés à des niveaux plus faibles dans le cartilage humain atteint de l'arthrose. Les mêmes résultats ont été montrés dans le cartilage articulaire provenant des modèles de l’arthrose expérimentaux chez la souris et le chien. Plus précisément, nous avons remarqué que l'expression d’Unc-51 like kinase-1 (ULK1) est faible dans cartilage humain atteint de l'arthrose et des modèles expérimentaux de l’arthrose. ULK1 est la sérine / thréonine protéine kinase et elle est l’inducteur principal de l’autophagie. La perte de l’expression de ULK1 se traduit par un niveau d’autophagie faible. Etant donné qu’une signalisation adéquate de l'autophagie est nécessaire pour maintenir la chondroprotection ainsi que l'homéostasie du cartilage articulaire, nous avons proposé l’hypothèse suivante : une expression adéquate de ULK1 est requise pour l’induction de l’autophagie dans le cartilage articulaire et une perte de cette expression se traduira par une diminution de la chondroprotection, et une augmentation de la mort des chondrocytes ce qui conduit à la dégénérescence du cartilage articulaire. Le rôle exact de ULK1 dans la pathogénie de l'arthrose est inconnue, j’ai alors créé pour la première fois, des souris KO ULK1spécifiquement dans le cartilage en utilisant la technologie Cre-Lox et j’ai ensuite soumis ces souris à la déstabilisation du ménisque médial (DMM), un modèle de l'arthrose de la souris pour élucider le rôle spécifique in vivo de ULK1 dans pathogenèse de l'arthrose. Mes résultats montrent que ULK1 est essentielle pour le maintien de l'homéostasie du cartilage articulaire. Plus précisément, je montre que la perte de ULK1 dans le cartilage articulaire a causé un phénotype de l’arthrose accéléré, associé à la dégénérescence accélérée du cartilage, l’augmentation de la mort cellulaire des chondrocytes, et l’augmentation de l'expression des facteurs cataboliques. En utilisant des chondrocytes provenant des patients atteints de l’arthrose et qui ont été transfectées avec le plasmide d'expression ULK1, je montre qu’ULK1 est capable de réduire l’expression de la protéine mTOR (principal régulateur négatif de l’autophagie) et de diminuer l’expression des facteurs cataboliques comme MMP-13 et ADAMTS-5 et COX-2. Mes résultats jusqu'à présent indiquent que ULK1 est une cible thérapeutique potentielle pour maintenir l'homéostasie du cartilage articulaire. / Osteoarthritis (OA) is the most common musculoskeletal disease worldwide. It is one of the leading causes of pain and disability among adults, and represents a considerable burden on the healthcare system. OA is a disease of the entire joint, involving not only the articular cartilage but also the synovium, ligaments and subchondral bone. It is characterized by the progressive degeneration of the articular cartilage, osteophyte formation, remodelling of the subchondral bone, deterioration of tendons and ligaments and various degrees of inflammation of the synovium. While current therapies and management strategies can help alleviate symptoms early in the disease process, OA is characterized by almost inevitable progression towards end-stage disease. The exact pathogenesis of OA is largely unknown but the key event in OA is the degradation of the articular cartilage. The articular cartilage is only composed of chondrocytes; cells responsible for the synthesis of the extracellular matrix (ECM) and maintenance of articular cartilage homeostasis. Chondrocytes maintain the articular cartilage matrix by replacing degraded macromolecules and respond to focal cartilage injury or degeneration by increasing local synthesis activity. Since chondrocytes exhibit low levels of turnover, they rely on endogenous mechanisms such as autophagy (a cell survival and adaptation process) to remove damaged organelles and macromolecules in order to maintain articular cartilage homeostasis. Autophagy is a lysosomal degradation pathway that is essential for survival, differentiation, development and homeostasis. It regulates maturation and promotes survival of terminally differentiated chondrocytes under stress and hypoxic conditions. Studies by us and others have shown that compromised autophagy is associated with decreased chondroprotection, increased cell death and articular cartilage degeneration. Carames et al showed that autophagy is constitutively expressed in normal human articular cartilage. However, expression of key autophagy inducers is reduced in ageing cartilage. Our previous studies have also identified a panel of key autophagy genes that are expressed in low levels in human OA cartilage as well as in the articular cartilage from mouse and dog models of experimental OA. Specifically, we identified that expression of unc-51 like kinase-1 (ULK1) is suppressed in human OA cartilage and experimental OA models. ULK1 is a serine/threonine protein kinase and is the most upstream autophagy inducer. Loss of ULK1 results in disruption of autophagy induction. Since adequate autophagy signaling is required for maintaining chondroprotection as well as articular cartilage homeostasis, we hypothesized that ULK1 is required for autophagy induction in the articular cartilage and loss of it will result in decreased chondroprotection and enhanced chondrocyte death leading to the degeneration of articular cartilage. Since the exact role of ULK1 in pathogenesis of OA is unknown, I created for the first time, an inducible cartilage- specific ULK1 knockout (KO) mice using Cre-Lox technology and subjected these mice to the destabilization of the medial meniscus (DMM) mouse OA model to specifically elucidate the specific in vivo role of ULK1 in OA pathogenesis. My results show that ULK1 is essential for maintaining articular cartilage homeostasis. Specifically I show that loss of ULK1 in the articular cartilage results in an accelerated OA phenotype; which is associated with accelerated cartilage degeneration, enhanced chondrocyte cell death, increased expression of catabolic MMP-13. Using human OA chondrocytes transfected with ULK1 expression plasmid I show that ULK1 is able to reduce the expression of mTOR (major negative regulator of autophagy) and decrease the expression of OA catabolic factors including MMP-13, ADAMTS-5 and COX-2. My results so far suggest that ULK-1 is a potential therapeutic target to maintain articular cartilage homeostasis.

Tout médicament administré par la voie orale doit être absorbé sans être métabolisé par l’intestin et le foie pour atteindre la circulation systémique. Malgré son impact majeur sur l’effet de premier passage de plusieurs médicaments, le métabolisme intestinal est souvent négligé comparativement au métabolisme hépatique. L’objectif de ces travaux de maîtrise est donc d’utiliser, caractériser et développer différents outils in vitro et in vivo pour mieux comprendre et prédire l’impact du métabolisme intestinal sur l’effet de premier passage des médicaments comparé au métabolisme hépatique. Pour se faire, différents substrats d’enzymes du métabolisme ont été incubés dans des microsomes intestinaux et hépatiques et des différences entre la vitesse de métabolisme et les métabolites produits ont été démontrés. Afin de mieux comprendre l’impact de ces différences in vivo, des études mécanistiques chez des animaux canulés et traités avec des inhibiteurs enzymatiques ont été conduites avec le substrat métoprolol. Ces études ont démontré l’impact du métabolisme intestinal sur le premier passage du métoprolol. De plus, elles ont révélé l’effet sur la vidange gastrique du 1-aminobenzotriazole, un inhibiteur des cytochromes p450, évitant ainsi une mauvaise utilisation de cet outil dans le futur. Ces travaux de maîtrise ont permis d’améliorer les connaissances des différents outils in vitro et in vivo pour étudier le métabolisme intestinal tout en permettant de mieux comprendre les différences entre le rôle de l’intestin et du foie sur l’effet de premier passage. / To reach the systemic circulation, orally administered drugs have to be absorbed and not metabolized by the intestine and the liver. Even though it has a major impact on the first pass effect of many xenobiotics, the intestinal metabolism is often neglect compare to the hepatic metabolism. The objective of this work is to use, characterize and develop multiple in vitro and in vivo tools to better understand and predict the impact of intestinal metabolism on the first pass effect of xenobiotics compared to the liver. To do so, multiple substrates of metabolic enzymes were incubated in intestinal and hepatic microsomes and differences between the rate of metabolism and the production of metabolites were demonstrated. To better understand the impact of these differences in vivo, mechanistic studies were undergone in rats cannulated or treated with enzymatic inhibitors with the substrate metoprolol. These studies demonstrated the impact of intestinal metabolism on the first pass of metoprolol. Moreover, they exposed the effect on gastric emptying of 1-aminobenzotriazole, a cytochrome p450 inhibitor, avoiding its wrong utilisation in future studies. This work helped increase the knowledge about the different in vitro and in vivo tools to study intestinal metabolism and to better understand the differences between the role of the intestine and the liver on the first pass effect.

L’arthrose (OA) est une maladie dégénérative très répondue touchant les articulations. Elle est caractérisée par la destruction progressive du cartilage articulaire, l’inflammation de la membrane synoviale et le remodelage de l’os sous chondral. L’étiologie de cette maladie n’est pas encore bien définie. Plusieurs études ont été menées pour élucider les mécanismes moléculaires et cellulaires impliqués dans le développement de l’OA. Les effets protecteurs du récepteur activé par les proliférateurs de peroxysomes gamma (PPARγ) dans l'OA sont bien documentés. Il a été démontré que PPARγ possède des propriétés anti-inflammatoires et anti-cataboliques. Aussi, plusieurs stimuli ont été impliqués dans la régulation de l’expression de PPARγ dans différents types cellulaires. Cependant, les mécanismes exacts responsables de cette régulation ainsi que le profil de l’expression de ce récepteur au cours de la progression de l’OA ne sont pas bien connus. Dans la première partie de nos travaux, nous avons essayé d’élucider les mécanismes impliqués dans l’altération de l’expression de PPARγ dans cette maladie. Nos résultats ont confirmé l’implication de l’interleukine-1β (IL-1β), une cytokine pro-inflammatoire, dans la réduction de l’expression de PPARγ au niveau des chondrocytes du cartilage articulaire. Cet effet coïncide avec l'induction de l’expression du facteur de transcription à réponse précoce de type 1 (Egr-1). En plus, la diminution de l'expression de PPARγ a été associée au recrutement d'Egr-1 et la réduction concomitante de la liaison de Sp1 au niveau du promoteur de PPARγ. Dans la deuxième partie de nos travaux, nous avons évalué le profil d’expression de ce récepteur dans le cartilage au cours de la progression de cette maladie. Le cochon d’inde avec OA spontanée et le chien avec OA induite par rupture du ligament croisé antérieur (ACLT) deux modèles animaux d’OA ont été utilisés pour suivre l’expression des trois isoformes de PPARs : PPAR alpha (α), PPAR béta (β) et PPAR gamma (γ) ainsi que la prostaglandine D synthase hématopoïétique (H-PGDS) et la prostaglandine D synthase de type lipocaline (L-PGDS) deux enzymes impliquées dans la production de l’agoniste naturel de PPARγ, la 15-Deoxy-delta(12,14)-prostaglandine J(2) (15d-PGJ2). Nos résultats ont démontré des changements dans l’expression de PPARγ et la L-PGDS. En revanche, l’expression de PPARα, PPARβ et H-PGDS est restée stable au fil du temps. La diminution de l’expression de PPARγ dans le cartilage articulaire semble contribuer au développement de l’OA dans les deux modèles animaux. En effet, le traitement des chondrocytes par de siRNA dirigé contre PPARγ a favorisé la production des médiateurs arthrosiques tels que l'oxyde nitrique (NO) et la métalloprotéase matricielle de type 13 (MMP-13), confirmant ainsi le rôle anti-arthrosique de ce récepteur. Contrairement à ce dernier, le niveau d'expression de la L-PGDS a augmenté au cours de la progression de cette maladie. La surexpression de la L-PGDS au niveau des chondrocytes humains a été associée à la diminution de la production de ces médiateurs arthrosiques, suggérant son implication dans un processus de tentative de réparation. En conclusion, l’ensemble de nos résultats suggèrent que la modulation du niveau d’expression de PPARγ, de la L-PGDS et d’Egr-1 au niveau du cartilage articulaire pourrait constituer une voie thérapeutique potentielle dans le traitement de l’OA et probablement d’autres formes d'arthrite. / Osteoarthritis (OA) is the most common degenerative joint disease. It is characterised by progressive destruction of articular cartilage, synovial inflammation and subchondral bone remodelling. The complete etiology of OA is still not well defined. Several studies have been carried out to elucidate the molecular and cellular mechanisms involved in OA development. The protective effects of Peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPARγ) in OA have been well documented. It has been demonstrated that PPARγ exhibit anti-inflammatory and anti-catabolic properties. Although many stimuli have been reported to regulate the expression of PPARγ in several cell types. However, little information is available on the exact mechanisms that govern its regulation as well as the expression profile of this recepteur during the course of the disease. In the first part of this work, we tried to elucidate the mechanisms involved in the alteration of PPARγ expression in OA. Our findings confirm that interleukin-1 beta (IL-1β), a proinflammatory cytokine, down regulate the expression of PPARγ in articular chondrocytes. This effect coincided with the induction of early growth response protein-1 (Egr-1) expression. In addition, down regulation of PPARγ expression was associated with Egr-1 recruitment to and concomitant reduction in Sp1 occupancy at PPARγ promoter. In the second part of this work, we evaluated the expression profile of this receptor in cartilage during the progression of OA. Spontaneous Hartley guinea pig model and anterior cruciate ligament transection (ACLT) dog model were used to follow the expression of three isoforms of PPARs: PPAR alpha (α), PPAR beta (β) and PPAR gamma (γ) as well as hematopoietic prostaglandin D synthase (H-PGDS) and lipocalin-type prostaglandin D synthase (L-PGDS) two enzymes involved in the production of the natural agonist PAARγ, 15-Deoxy-delta(12,14)-prostaglandin J(2) (15d PGJ2). Our reultats showed changes in the expression of PPARγ and L-PGDS. In contrast, the level of PPARα, PPARβ and H-PGDS was constant over time. The decrease in PPARγ levels in articular chondrocytes suggest that it may be a contributing factor in OA development in both animal models used in this study. Furthermore, siRNA silencing of PPARγ resulted in an enhanced production of osteoarthric mediators such as matrix metalloproteinase-13 (MMP-13) and nitric oxide (NO). Thus, confirming the anti-arthritic role of this receptor. In contrast, unlike the later, there was an increase in the expression level of L-PGDS during disease progression. The overexpression of L-PGDS in human chondrocytes was associated with reduced production of these osteoarthric mediators, suggesting its involvement in repair process. In summary, our data suggest that the modulation of PPARγ, L-PGDS and Egr-1 expression levels in articular cartilage may be a potential therapeutic approach in the treatment of OA and probably other forms of arthritis.

Nous avons investigué la relation entre les polymorphismes de nucléotides simples (SNPs) chez trois gènes/loci candidats : DARC, CXCL2 et le loci ORMDL3-GSDMA-CSF3 situés sur le chromosome 17q21 et les complications neutropéniques et infectieuses qui en résultent durant la chimiothérapie chez les patients atteints de la leucémie lymphoblastique aigue. Ces loci codent pour certaines composantes du système immunitaire altérant la concentration de chémokines et leur distribution (DARC), stimulant le relâchement et la migration des neutophiles de la moelle épinière (CXCL2) et régulant la prolifération et la survie des granulocytes (G-CSF). Il est possible que des polymorphismes dans ces loci lorsqu’associés à de la chimiothérapie puissent mettre des individus suceptibles à un risque plus élevé de complication reliées à la chimiothérapie. Une sélection des marqueurs SNPs dans ces gènes ont été génotypés chez des enfants traités au CHU Ste-Justine pour une ALL entre 1989 et 2005. Après correction pour tests multiples, un polymorphisme DARC rs3027012 situé dans le 5’UTR a été associé à un compte phagocytaire peu élevé (APC<500 et <1000 cellules/µL, p=0.001 and p=0.0005, respectivement) ainsi qu’une hospitalisation due à une neutropénie (p=0.007) ou due à une infection et/ou neutropénie (p=0.007). Un effet protecteur a été identifié pour la mutation non sense Gly42Asp variant rs12075 (p=0.006). Des polymorphismes sur le chromosome 17q2 étaient associés à une hospitalisation due à une infection (rs3859192, p= 0.004) et à une neutropénie (rs17609240, p=0.006) L’infection était aussi modulée par CXCL2 (rs16850408, p=0.008) Cette étude identifie pour la première fois que les loci modulant le décompte des leucocytes et des neutrophiles pourraient jouer un rôle dans de déclenchement de complications dues à la chimiothérapie et pourraient ainsi servir de marqueurs pour un ajustement et un suivi du traitement. / We investigated the relationship between single nucleotide polymorphisms (SNPs) in 3 candidate genes/chromosomal loci: DARC, CXCL2 and ORMDL3-GSDMA-CSF3 locus on chromosome 17q21, and neutropenic and infectious complications during chemotherapy in pediatric acute lymphoblastic leukemia (ALL) patients. These loci encode the components of immune system altering chemokine concentration and distribution (DARC), stimulating neutrophil release from bone marrow and migration (CXCL2) and regulating granulocyte proliferation and survival (G-CSF). It is possible that polymorphisms of these loci when associated with chemotherapy may put susceptible individuals at higher risk of chemotherapy complications. Selected tag SNPs in these genes are genotyped in children treated at the CHU Sainte-Justine for (ALL) between 1989 and 2005. After correction for multiple testing, DARC polymorphism rs3027012 in 5’UTR was associated with low absolute phagocyte count (APC<500 and <1000 cells/µL, p=0.001 and p=0.0005, respectively) and hospitalisation due to febrile neutropenia (p=0.007) or due to infection and/or febrile neutropenia (p=0.007). A protective effect was instead noted for missense Gly42Asp variant rs12075 (p=0.006). The polymorphisms on chromosome 17q2 were associated with hospitalisation due to infection (rs3859192, p= 0.004) and neutropenia (rs17609240, p=0.006). Infection was also modulated by CXCL2 (rs16850408, p=0.008) This study identifies for the first time that the loci modulating white blood cell and neutrophil count may play a role in the onset of chemotherapy complications and may thus serve as markers for adjustment or follow-up of the treatment.

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