L’adénovirus a été étudié dans l’optique de développer de nouveaux traitements pour différentes maladies. Les vecteurs adénoviraux (AdV) sont des outils intéressants du fait qu’ils peuvent être produits en grandes quantités (1X1012 particules par millilitre) et de par leur capacité à infecter des cellules quiescentes ou en division rapide. Les AdVs ont subi bon nombre de modifications pour leur permettre de traiter des cellules tumorales ou pour transporter des séquences génétiques exogènes essentielles pour le traitement de maladies monogéniques. Toutefois, les faibles niveaux d’expression du récepteur primaire de l’adénovirus, le CAR (récepteur à l’adénovirus et au virus coxsackie), réduit grandement l’efficacité de transduction dans plusieurs tumeurs. De plus, certains tissus normaux comme les muscles n’expriment que très peu de CAR, rendant l’utilisation des AdVs moins significative. Pour pallier à cette limitation, plusieurs modifications ont été générées sur les capsides virales. L’objectif de ces modifications était d’augmenter l’affinité des AdVs pour des récepteurs cellulaires spécifiques surexprimés dans les tumeurs et qui seraient exempts dans les tissus sains avoisinant. On peut mentionner dans les approches étudiées: l’utilisation de ligands bispécifiques, l’incorporation de peptides dans différentes régions de la fibre ou la substitution par une fibre de sérotypes différents. Notre hypothèse était que les domaines d’interaction complémentaire (K-Coil et ECoil) permettraient aux ligands de s’associer aux particules virales et d’altérer le tropisme de l’AdV. Pour ce faire, nous avons inclus un domaine d’interaction synthétique, le K-Coil,dans différentes régions de la fibre virale en plus de générer des mutations spécifiques pour abolir le tropisme naturel. Pour permettre la liaison avec les récepteurs d’intérêt dont l’EGF-R, l’IGF-IR et le CEA6, nous avons fusionné le domaine d’interaction complémentaire, le E-Coil, soit dans les ligands des récepteurs ciblés dont l’EGF et l’IGF-I, soit sur un anticorps à un seul domaine reconnaissant la protéine membranaire CEA6, l’AFAI. Suite à la construction des différents ligands de même que des différentes fibres virales modifiées, nous avons determiné tout d’abord que les différents ligands de même que les virus modifiés pouvaient être produits et que les différentes composantes pouvaient interagir ensemble. Les productions virales ont été optimisées par l’utilisation d’un nouveau protocole utilisant l’iodixanol. Ensuite, nous avons démontré que l’association des ligands avec le virus arborant une fibre modifiée pouvait entraîner une augmentation de transduction de 2 à 21 fois dans différentes lignées cellulaires. À cause de la difficulté des adénovirus à infecter les fibres musculaires occasionnée par l’absence du CAR, nous avons cherché à savoir si le changement de tropisme pourrait accroître l’infectivité des AdVs. Nous avons démontré que l’association avec le ligand bispécifique IGF-E5 permettait d’accroître la transduction autant dans les myoblastes que dans les myotubes de souris. Nous avons finalement réussi à démontrer que notre système pouvait induire une augmentation de 1,6 fois de la transduction suite à l’infection des muscles de souriceaux MDX. Ces résultats nous amènent à la conclusion que le système est fonctionnel et qu’il pourrait être évalué dans des AdVs encodant pour différents gènes thérapeutiques. / Adenoviruses have been studied as a way to develop new treatments for different diseases. Adenoviral vectors (AdV) are considered interesting tools for this propose, because they can be produced at high titers (1X1012 particles per millilitre) in laboratory and they have the capacity to infect non-dividing and dividing cells. AdV have been often modified in order to obtain the ability to kill tumour cells or to deliver exogenous genetic sequences essential to treat monogenic disease. However, weak expression of the primary adenovirus receptor, the CAR (Coxsackie and adenovirus receptor) reduces greatly the transduction efficiency of AdV for the tumour cells. Moreover, some normal tissues express low amount of CAR, like the skeletal muscle, reducing the appeal of using AdV as a gene delivery vehicle for this tissue. To address this problematic, many modifications were done on the adenoviral capsid. The goal of these modifications were to generate an AdV able to target specific cellular receptors that were expressed in tumour cells but not in normal cells. Several approaches were done to modify the tropism of AdV, such as incubation with a bispecific ligands, incorporation of peptides within the adenoviral fiber structure or substitution of the viral fiber with a different serotype fiber. The hypothesis of my project was to determine if an interaction domain fused within a ligand could bind the complementary domain incorporated on a virus and change the tropism of the AdV. The first step was to include a synthetic interaction domain, the K-Coil, within specific region of the adenoviral fiber, as well as inserting two point mutations to abolish the natural tropism. To target the EGF-R, IGF-IR and the CEA6, we fused the complementary interaction domain, the E-Coil, to the respective ligand known as the EGF and the IGF-I or to a single domain antibody (known as AFAI) that bind specifically to CEA6. The specific interaction between the E-Coil and K-Coil was used to associate the ligand with the fiber in order to retarget the AdV toward the selected receptor. We showed that the different ligands as well as the modified fibers could be produced and that both E-Coil and K-Coil expressing partners could interact together. We optimized the viral production by using an iodixanol purification protocol. More importantly, we clearly demonstrated that the ligand association with the fiber could increase the transduction efficiency between 2 to 21 fold against various tumour cells. The difficulty of adenovirus to infect muscle cells because of the lack of CAR expression brought us to evaluate the potential of our retargeted AdV to increase the transduction for the tissue. We showed that the use of IGF-E5 could increase the transduction efficiency in myoblasts as wells as in myotubes. We finally demonstrated that our retargeting system could increase the transduction efficiency for skeletal muscle by 1,6 fold in new born MDX mice. In conclusion, our results show that the retargeting system is indeed functional. This system could be assessed using vectors that express therapeutic genes.

The coxsackie-adenovirus receptor (CAR) is a viral receptor for Group B coxsackieviruses (CVB). Physiologically, CAR is a cellular adhesion protein. I report that upregulation of cardiac CAR in the young adult mouse (CAR+/MtTA+ ) caused a cardiomyopathy that was characterized by inflammation and hypertrophy. In the hearts of CAR+/MtTA+ mice c-Jun N terminal kinase (JNK) was specifically activated. JNK activation is known to promote hypertrophy of cardiomyocytes, and disrupt proteins at the intercalated disc. CVB3-infected CAR+/MtTA+ mice did not exhibit increased cardiac viral load or myocarditis severity, but did demonstrate a greater cardiac interferon-γ (IFN-γ) response when compared to littermate controls. CAR-induced expression of this antiviral cytokine may have prevented the increase in myocarditis susceptibility. Further investigation into the activation of protein kinase signaling, and antiviral signaling will provide better understanding of how CAR participates in the pathogenesis of both viral and non-viral heart diseases.

The coxsackie-adenovirus receptor (CAR) is a viral receptor for Group B coxsackieviruses (CVB). Physiologically, CAR is a cellular adhesion protein. I report that upregulation of cardiac CAR in the young adult mouse (CAR+/MtTA+ ) caused a cardiomyopathy that was characterized by inflammation and hypertrophy. In the hearts of CAR+/MtTA+ mice c-Jun N terminal kinase (JNK) was specifically activated. JNK activation is known to promote hypertrophy of cardiomyocytes, and disrupt proteins at the intercalated disc. CVB3-infected CAR+/MtTA+ mice did not exhibit increased cardiac viral load or myocarditis severity, but did demonstrate a greater cardiac interferon-γ (IFN-γ) response when compared to littermate controls. CAR-induced expression of this antiviral cytokine may have prevented the increase in myocarditis susceptibility. Further investigation into the activation of protein kinase signaling, and antiviral signaling will provide better understanding of how CAR participates in the pathogenesis of both viral and non-viral heart diseases.

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Infectant près de 185 millions d’individus dans le monde, le virus de l’hépatite C (VHC) est une cause importante d’hépatite virale chronique, qui mène éventuellement à la cirrhose et au carcinome hépatocellulaire. Dans les pays développés, la principale cause d’infection chez les enfants est la transmission de la mère à l’enfant (TME) durant la grossesse ou lors de l’accouchement et qui se produit dans <10% des cas. L’évolution de l’hépatite C lors de la grossesse est mal comprise, on observe une augmentation de la charge virale au 3e trimestre de la grossesse qui redescend suite à l’accouchement. Cette diminution s’accompagne d’une augmentation significative des marqueurs sériques d’inflammation du foie et d’une détérioration de la fonction hépatique chez une proportion importante des femmes infectées. Le développement de modèles de culture in vitro a permis de reconnaître l’implication de la réponse humorale neutralisante anti-VHC dans la progression clinique de l’hépatite C. Par contre, l’impact des anticorps (AC) neutralisants et non-neutralisants dans la pathologie de l’hépatite C en grossesse reste un sujet peu étudié. Dans cette étude, nous avons mis en évidence que la pression sélective exercée par les réponses neutralisantes anti-VHC menait à une diversification de la quasiespèce du VHC chez les femmes mono-infectées ou co-infectées par le VIH. Cette diversification est associée à une fréquence réduite de TME et à des niveaux d’inflammation hépatique plus faible chez les patientes mono-infectées uniquement. Chez les patientes co-infectées, la diversification de la quasiespèce et la présence de réponses neutralisantes ne suffisent pas à diminuer les risques de TME. Nous proposons également un rôle pour les anticorps (AC) non-neutralisants dans l’exacerbation de l’inflammation hépatique chez les femmes ne présentant pas de réponses neutralisantes anti-VHC. Cette inflammation pourrait être reliée à la cytotoxicité cellulaire dépendante des anticorps (ADCC), dont le rôle dans le contrôle de la virémie reste à déterminer. Les différentes avenues entreprises afin d’élaborer un essai permettant de quantifier la réponse ADCC spécifique au VHC seront exposées dans cet ouvrage. Cette étude a ainsi contribué à mieux comprendre le rôle des réponses humorales neutralisantes et l’implication probable de l’ADCC dans la pathogénèse de l’hépatite C en grossesse. / Almost 185 million people worldwide are infected with hepatitis C virus (HCV) and are at risk of developing cirrhosis and hepatocellular carcinoma. In developed countries, the major cause of infection in children is mother-to-child transmission (MTCT), which occurs in <10% of cases during pregnancy or at delivery. For reasons that remain poorly understood, HCV viral load increases in the third trimester of gestation and decreases following delivery. This situation is often followed by elevated serum markers of liver inflammation and by an exacerbation of hepatic pathology in an important fraction of infected women. The development of in vitro culture models enabled the recognition of the implication of humoral immune responses in the clinical evolution of hepatitis C. Nonetheless, the impact of neutralizing antibodies (AB) and non-neutralizing AB in the pathology of hepatitis C in pregnancy has been under-investigated. In this study, we report evidence that the selective pressure exerted by the neutralizing responses against HCV is responsible for the diversification of HCV quasispecies in HCV mono-infected women and women co-infected with HCV and HIV. This diversification was associated with a reduced frequence of MTCT and with reduced hepatic inflammation in mono-infected patients only. In co-infected patients, quasispecies diversification and the presence of neutralizing antibodies are not sufficient to reduce the risk of MTCT. We also propose a role for non-neutralizing AB in the exacerbation of hepatic inflammation in women without neutralizing activity against HCV. The elevated hepatic inflammation could be linked to the antibody dependent cellular cytotoxicity (ADCC), the role of which has yet to be defined in the control of HCV viremia. In the aim of elaborating a quantitative assay to measure ADCC specific for HCV, different approaches have been tested and will be presented in this monograph. This study has contributed to a better understanding of the role of neutralizing humoral responses and the likely implication of ADCC in the pathogenesis of hepatitis C in pregnancy.

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Au cours d'une infection lytique, le virus de l'herpès simplex de type 1 (VHS-1) doit entreprendre plusieurs étapes de fusion afin de se répliquer et se propager correctement. Ainsi, le virus a évolué afin de tirer avantage de la machinerie cellulaire en utilisant des protéines et facteurs de l’hôte à cet effet. Dans la littérature, les processus sous-jacents à l’entrée du VHS-1 ont été largement élucidés. Cependant, on ne sait toujours pas comment les particules virales nouvellement synthétisées sortent de la cellule hôte et quels facteurs cellulaires sont impliqués dans ce processus. Des résultats publiés par notre laboratoire indiquent que la protéine cellulaire, Extended Synaptotagmin 1 (E-Syt1), a un impact négatif sur la propagation globale du virus lorsqu’inhibée par de l’ARN d’interférence. Conséquemment, la présente étude a pour objectif de confirmer et d'approfondir le rôle d’E-Syt1 sur la propagation virale, en particulier sur la sortie du virus. Étant donné que l’activation d’E-Syt1 est liée à l’augmentation de la concentration de calcium cytoplasmique, nous avons également étudié l'implication du calcium au cours des stades ultérieurs de la réplication virale. Ici, nous avons démontré que la surexpression d’E-Syt1 n’a pas d’effet détectable sur la sortie du VHS-1, mais que le calcium a effet sur la propagation virale. Alors que la séquestration précoce du calcium (4 et 6 heures post-infection) à l'aide de chélateurs réprime la sortie virale, aucun effet significatif a été détecté lorsque les chélateurs ont été ajoutés à un stade avancé de l’infection (12 et 16 heures post-infection). Nos résultats fournissent des données intéressantes sur la nécessité de l’homéostasie du calcium intracellulaire afin que VHS-1 puisse assurer une médiation adéquate de la sortie virale. Ces résultats pourraient conduire à la découverte de nouveaux mécanismes ou protéines cellulaires régulées par le calcium et utilisés par le VHS-1 lors de réplications lytiques virales. / During a lytic infection, Herpes Simplex Virus type 1 (HSV-1) must go through multiple steps of fusion to replicate and propagate properly. For this purpose, the virus has evolved consequently by taking advantage of the cellular machinery using host factors and proteins. In the literature, processes underlying HSV-1’s entry have been extensively elucidated. However, it remains unclear how newly synthesized viral particles egress from the host cell, and what cellular factors are implicated in this process. Results published by our laboratory suggest that the cellular protein, Extended Synaptotagmin 1 (E-Syt1), has a negative and global impact on the viral propagation when down regulated by RNA interference. Consequently, this study aims to confirm and deepen our understanding of E-Syt1’s role on HSV-1, particularly during viral egress. Since activation of E-Syt1 is linked to the increase in cytoplasmic calcium concentration, we also investigated calcium involvement during later stages of viral propagation. Interestingly, overexpression of E-Syt1 had no measurable effect on HSV-1 propagation whereas calcium has a dual effect on viral propagation. While early calcium sequestering (4 and 6 hours post-infection) using chelators represses viral egress, no significant effect was detected when chelators were added at later time points (12 and 16 hours post-infection). Our results give interesting insights on how HSV-1 relies on intracellular calcium homeostasis to properly mediate viral egress. These results may lead to the discovery of new mechanisms or cellular proteins that are regulated by calcium and hijacked by HSV-1 during lytic replication.

La thérapie antirétrovirale (TAR) n'éradique pas le VIH de l'organisme. Le VIH persiste grâce à la prolifération de lymphocytes T CD4+ infectés de manière latente. De plus, bien que la plupart des provirus persistent sous une forme latente, un petit nombre de cellules infectées produisent des protéines virales et des virions. Les immunosuppresseurs administrés aux personnes subissant une greffe de rein, pour prévenir le rejet d’organe, inhibent la prolifération des lymphocytes T et l'activation immunitaire. Nous avons émis l'hypothèse que les immunosuppresseurs pourraient réduire à la fois la taille du réservoir viral latent ainsi que les marqueurs associés à la production résiduelle de VIH. Sept participants vivant avec le VIH sous TAR efficace et ayant subi une transplantation rénale suivie de la prise d’un traitement immunosuppresseur ont été recrutés. Des échantillons sanguins longitudinaux ont été prélevés avant et après la greffe (6-7 échantillons/participant, sur 2 ans). Les effets des immunosuppresseurs sur l'activation des lymphocytes T ainsi que les taux d’anticorps plasmatiques dirigés contre l'enveloppe du VIH (un reflet de la production virale résiduelle) ont été évalués par cytométrie en flux et ELISA, respectivement. L'ADN total du VIH et les transcrits d'ARN-gag-LTR associés aux cellules ont été quantifiés par qPCR et la fréquence des cellules p24+ par HIV-Flow. Pour confirmer les résultats obtenus in vivo, nous avons optimisé un protocole de culture cellulaire pour évaluer l'impact des immunosuppresseurs les plus fréquemment utilisés (MMF, tacrolimus, dasatinib) sur les cellules infectées dans un environnement contrôlé. Suite à la transplantation et à l’initiation du traitement immunosuppresseur, nous avons observé une diminution significative des niveaux d'expression des marqueurs d’activation et de prolifération HLA-DR et Ki67 dans les lymphocytes T CD4+, accompagnée d'une augmentation de la fréquence des cellules mémoires centrales et d'une forte diminution de la fréquence des lymphocytes T régulateurs. Les niveaux d'anticorps ciblant l'enveloppe du VIH ont également diminué pendant le traitement immunosuppresseur. Il y avait une diminution modeste et transitoire des niveaux d'ADN et d'ARN du VIH un mois après la transplantation rénale. Les résultats de HIV-Flow n'ont montré aucun impact significatif des immunosuppresseurs sur le réservoir inductible, avec de grandes variations entre les participants. Le modèle de culture cellulaire in vitro a révélé que de faibles doses d'immunosuppresseurs induisent généralement une diminution des marqueurs du VIH, alors que des doses plus élevées conduisent à des variations dépendantes des donneurs. Ainsi, nos résultats montrent que les traitements immunosuppresseurs diminuent la prolifération et l'activation des lymphocytes T CD4+, ce qui est concomitant avec une diminution modeste et transitoire des taux d'ADN et d'ARN du VIH. Nos résultats indiquent que la combinaison des traitements immunosuppresseurs actuels sont toutefois insuffisants pour affecter profondément et durablement le réservoir du VIH et suggèrent que la taille du réservoir est étroitement régulée par des forces homéostatiques difficiles à contrer. / Antiretroviral therapy (ART) does not eradicate HIV from the body. HIV persists through proliferation of latently infected CD4+T-cells. Moreover, although most proviruses persist in a latent form, a small number of infected cells produce viral protein and virions. Immunosuppressants given to people undergoing kidney transplants to prevent rejection inhibit T-cell proliferation and immune activation. We hypothesized that immunosuppressants could reduce both the size of the latent viral reservoir as well as markers associated with residual production of HIV. Seven participants living with HIV on suppressive ART who underwent kidney transplantation and initiated immunosuppressive therapy were enrolled. Longitudinal blood samples were collected before and after the transplant (6-7 samples/participant, over 2years). The effects of immunosuppressants on T-cell activation as well as plasma HIV-envelope antibody responses (a surrogate of residual viral production) were assessed by flow cytometry and ELISA, respectively. Total HIV-DNA and cell-associated LTR-gag-RNA transcripts were quantified by qPCR and the frequency of p24+ cells by HIV-Flow in isolated CD4+T-cells. To confirm the results saw in vivo, we optimized a cell culture protocol to assess the impact of frequently given immunosuppressants (tacrolimus, MMF and dasatinib) on infected cells in a controlled environment. Following organ transplant and initiation of immunosuppressive treatment, we observed a significant decrease in the expression levels of HLA-DR and Ki67 in CD4+T-cells, which was accompanied by an increase in the frequency of central memory cells and a sharp decrease in the frequency of regulatory T-cells. Antibody levels targeting HIV envelope also decreased during immunosuppressive therapy. There was a modest and transient decrease in HIV DNA and RNA levels one month following kidney transplantation. HIV-Flow results showed no significant impact of immunosuppressants on the inducible reservoir, with large variations between participants. The in vitro cell culture model showed that low doses of immunosuppressants generally induces a reduction in HIV markers, but higher doses lead to variations between donors. Immunosuppressive therapy decreases the proliferation and activation of CD4+ T-cells which is concomitant with a modest and transient decrease in HIV DNA and RNA levels. Our results indicate that current immunosuppressive drugs are insufficient to profoundly and durably affect the HIV reservoir and suggest that the size of the reservoir is tightly regulated by homeostatic forces that are difficult to counteract.

Human coronavirus OC43 (HCoV-OC43) is a beta-coronavirus from the coronaviridae family. In contrast to SARS-CoV-2, HCoV-OC43 causes upper respiratory tract disease. However, because of their close phylogenic proximity but distinct pathologies, HCoV-OC43 is a very interesting surrogate to study and compare beta coronaviruses. As all viruses, the latter hijack cell machinery proteins to complete their life cycle. Cellular proteins, particularly those incorporated into virions are of particular interest since they often play a vital role in the virus life cycle. Our goal is to employ the proteomic pipeline we developed for HSV-1 to characterize the host proteins associated with highly purified extracellular HCoV-OC43 particles and finally expand it to SARS-CoV-2. To this end, high purity in sufficient yields is crucial as mass spectrometers pick up contaminants. The proteins present in cell culture medium serum, as well as the proteins carried by the exosomes produced by the cells or by the exosomes present in the cell culture media serum, are of particular concern. We utilized a series of methods to eliminate cell culture serum protein contaminations, enrich the viral particles, and separate exosomes from viral particles. For example, we have obtained an efficient separation of concentrated HCoV-OC43 virions from exosomes using density gradient fractionation. Mass spectrometry results on the purified fractions validated the enrichment of viral particles in the virus fraction and the lack of viral proteins in the mock samples. Most interestingly, we detected 69 host proteins unique to the virus fraction (compared to the mock), mostly regulating the RNA metabolism pathway followed by metabolite interconversion, protein modifying enzymes, and protein-binding activity modulator pathways. Since we also purified extracellular exosomes in the process, we probed whether the virus alters their protein content. Mass spectrometry revealed 51 unique proteins exclusively found in exosomes produced by HCoV-OC43 infected cells. These included translational proteins, metabolite interconversion enzymes, and scaffold proteins. Our preliminary RNA interference studies showed that knocking down 14 of these host proteins altered HCoV-OC43 titers. Studying host-virus protein interactions allows us to gain a deeper understanding of how viruses take advantage of host cells, and how we can develop novel viral therapeutics. / Le coronavirus humain OC43 (HCoV-OC43) est un bêta-coronavirus de la famille des coronaviridae. Contrairement au SRAS-CoV2, le HCoV-OC43 provoque une maladie des voies respiratoires supérieures. Cependant, en raison de leur proximité phylogénique étroite mais leur pathologie distincte, HCoV-OC43 est un substitut fort intéressant pour étudier et comparer les bêta-coronavirus. Comme tous les virus, ces derniers détournent les protéines de la machinerie cellulaire pour compléter leur cycle de vie. Les protéines cellulaires, en particulier celles incorporées dans les virions, sont particulièrement intéressantes puisqu'elles jouent souvent un rôle vital dans le cycle de vie du virus. Notre objectif est d'utiliser le pipeline protéomique que nous avons développé pour le HSV-1 afin de caractériser les protéines hôtes associées à des particules virales extracellulaires de HCoV-OC43 hautement purifiées et d'étendre cette approche au SRAS-CoV2. À cette fin, une pureté élevée avec des rendements suffisants est cruciale car les spectromètres de masse détectent les contaminants. Les protéines présentes dans le sérum du milieu de culture cellulaire, ainsi que les protéines portées par les exosomes produits par les cellules ou par les exosomes présentes dans le sérum du milieu de culture cellulaire, sont particulièrement concernées. Nous avons utilisé une série de méthodes pour éliminer les contaminations par les protéines sériques des cultures cellulaires, enrichir les particules virales et séparer les exosomes des virus. Nous avons ainsi obtenu une excellente séparation des virions HCoV-OC43 concentrés des exosomes en utilisant le fractionnement par gradient de densité. Les résultats de spectrométrie de masse sur les fractions purifiées ont validé l'enrichissement en particules virales dans la fraction virale et l'absence de protéines virales dans les échantillons contrôles. Plus intéressant encore, nous avons détecté 69 protéines hôtes uniques à la fraction virale (par rapport aux cellules non-infectées). Ces protéines sont principalement associées à la voie du métabolisme de l'ARN suivie de l'interconversion des métabolites, des enzymes modifiant les protéines et des voies modulatrices de l'activité de liaison aux protéines. Puisque nous avons séparés les exosomes des virus, nous en avons profiter pour évaluer si le virus altère leur contenu protéines. La spectrométrie de masse a de facto identifié 51 protéines uniques aux exosomes produits par les cellules infectées par HCoV-OC43. Celles-ci régulent des voies des protéines traductionnelles, des enzymes d'interconversion des métabolites et des voies des protéines d'échafaudage. Nos études préliminaires sur l’interférence ARN ont montré que l’inactivation de 14 de ces protéines hôtes modifiait le titre de HCoV-OC43. L'étude des interactions hôte-protéine virale nous permet de mieux comprendre comment les virus tirent parti des cellules hôtes et comment nous pouvons développer de nouvelles thérapies virales.

Doctor of Philosophy / Department of Diagnostic Medicine and Pathobiology / Raymond R. R. Rowland / Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus (PRRSV) is the most costly virus to the swine industry, worldwide. This study explored the application of deep sequencing techniques to understand better the virus-host interaction. On the virus side, PRRSV exists as a quasispecies. The first application of deep sequencing was to investigate amino acid substitutions in hypervariable regions during acute infection and after virus rebound. The appearance and disappearance of mutations, especially the generation of a new N-glycosylation site in GP5, indicated they are likely the result of immune selection. The second application of deep sequencing was to investigate the quasispecies makeup in pigs with severe combined immunodeficiency (SCID) that lack B and T cells. The results showed the same pattern of amino acid substitutions in SCID and normal littermates and no different mutations were identified between SCID and normal littermates. This suggests the mutations that appear during the early stages of infection are the product of the virus becoming adapted to replication in pigs. The third application of deep sequencing was to investigate the locations of recombination events between GFP-expressing PRRSV infectious clones. The results identified different cross-over occurred within three conserved regions between EGFP and GFPm genes. And finally, the fourth goal was applied to develop a set of sequencing tools for analyzing the host antibody repertoire. A simple method was developed to amplify swine VDJ repertoires. Shared and abundant VDJ sequences that are likely expressed by PRRSV-activated B cells were determined in pigs that had different neutralization activities. These sequences are potentially correlated with different antibody responses.