Les virus du Chikungunya (CHIKV) et de la dengue (DENV) sont deux virus émergents qui sévissent dans les régions tropicales et subtropicales du monde entier et qui sont transmis par les moustiques du genre Aedes. Ces dernières années, leur transmission a surtout progressé dans les zones urbaines et périurbaines touchant des millions d’individus et faisant de ces deux pathogènes des sujets majeurs de préoccupation pour la santé publique. Le Chikungunya et la Dengue sont des infections dites aiguës entrainant une mise en place rapide de la réponse immunitaire innée qui joue un rôle majeur dans le contrôle et l’évolution de la maladie. Les cellules Natural Killer (NK) représentent une population cellulaire clé de la réponse innée et jouent un rôle crucial dans les mécanismes de défense mis en place. A travers une étude ex vivo et in vitro, nous nous sommes intéressées à la caractérisation des cellules NK à travers (i) une étude phénotypique et fonctionnelle des cellules NK chez des patients infectés en phase aiguë par le CHIKV, DENV-2 ou par les deux virus et (ii) à la caractérisation des interactions entre les cellules NK et les cellules cibles infectées par le virus. L’ensemble de ces données contribue à mieux identifier l’implication des cellules NK dans le contrôle des infections par le CHIKV et DENV-2 permettant ainsi de mieux comprendre les mécanismes à l’origine des dérèglements de la réponse immunitaire. Au cours des dernières épidémies, plusieurs cas de patients coinfectés par les deux virus ont été répertoriés. De plus, l’expansion géographique des moustiques Aedes pourrait amener à une augmentation du nombre de cas de coinfections sans que les mécanismes sous jacents aux coinfections ne soient étudiés. Afin de pouvoir réponse à certaines questions concernant ce phénomène, nous avons mis en place un modèle expérimental de coinfection par CHIKV et DENV-2 chez le macaque Rhésus. / Chikungunya (CHIKV) and Dengue (DENV) virus are both re-emerging viruses transmitted by Aedes mosquitoes and responsible of widespread outbreaks in tropical and subtropical country. Recently, transmission of both viruses had emerged in urban and peri-urban area infecting millions of persons. Chikungunya and Dengue are both acute infections where innate immunity rapidly takes place and play a crucial role in the control and in the evolution of the disease. Natural Killer cells (NK) represent one of the major cellular population of innate immunity and play a crucial role in defense mechanism. By way of ex vivo and in vitro studies, we characterized NK cells by (i) a phenotypic and functional study of NK cells in CHIKV, DENV-2 infected patients or CHIKV/DENV-2 co-infected patients and (ii) characterization of NK cells interactions with infected target cells. During last outbreaks, several cases of co-infected patients were reported. Moreover, geographic spread of Aedes mosquitoes could increase number of coinfection cases without underlying mechanisms being explored. In order to respond to certain questions regarding coinfections, we realized a co-infected CHIKV and DENV-2 experimental model in Rhesus macaques.Together, these data will contribute to better identify NK cells implication in the control of CHIKV and DENV-2 infections allowing a better comprehension of mechanisms that causes immune system disorder.

Le traitement du VHC connaît une évolution rapide avec le développement d'antiviraux à action directe plus efficaces et mieux tolérés qui vont modifier les stratégies thérapeutiques, les facteurs prédictifs de réponse et les modalités de suivi des patients. Notre travail s'intéresse aux paramètres de suivi du traitement que sont les dosages pharmacologiques de ribavirine et le suivi des cinétiques virales lors d'une trithérapie. L'étude d'une cohorte prospective incluant 186 patients sous trithérapie par IP montre que 60% d'entre-eux présentent une SVR12 et que les facteurs prédictifs sont le génotype de l'IL28B et la réponse au précédent traitement. Une diminution de la filtration glomérulaire réversible est également observée. La mesure du taux résiduel de ribavirine permet de réduire les risques hématologiques chez des patients insuffisants rénaux, la réalisation de l'ASC témoigne d'une moins bonne exposition à la ribavirine chez des patients co-infectés par le VIH/VHC et la biodisponibilité de la ribavirine et la sévérité des anémies augmentent chez des patients traités par télaprévir. Au sein de la cohorte CUPIC, la négativation ou la diminution >50-70% de la charge virale initiale à S2 de trithérapie sont fortement prédictives de la SVR12. Cette mesure à S2 permet aussi de dépister les échappements viraux précoces. La place de la ribavirine est importante dans les associations thérapeutiques actuelles et futures. Sa surveillance pharmacologique peut avoir un intérêt au cours de futures multi-thérapies exposant à d'éventuelles interactions médicamenteuses / The rapid development of new direct antiviral agents (DAA) against HCV gives hope of more potent and well tolerated treatments. These new compounds will deeply modify therapeutic schedules, virological response prognostic factors and patients’ monitoring. The aim of our work was to define the relevance of ribavirin plasma concentration and viral kinetics monitoring during triple therapy. The study of a prospective cohort including 186 patients under triple therapy showed an SVR12 rate of 60%. Associated predictive factors were IL-28B genotype and previous treatment response. A reversible decrease of glomerular filtration rate was also observed. Ribavirin plasma concentration monitoring reduced hematological risks among patients with renal insufficiency. Early ribavirin plasma exposure showed an underexposure among HIV/HCV patients and ribavirin biodisponibility with severe anemia increased among telaprevir-treated patients. Within the CUPIC cohort, the initial viral load undetectability or decrease up to 50% or 70% at week 2 of triple therapy were predictive of SVR12. Moreover, this week 2 viral load assessment allowed the detection of early viral breakthrough. Ribavirin still plays a major role in current and future therapeutic strategies. Ribavirin monitoring could also be important during future multi-drug therapy that could be associated with drug interactions

Même si les traitements thermiques ou la désinfection par les oxydants ont démontré leur efficacité virucide, les mécanismes liés à la perte du caractère infectieux ne sont pas connus. Ceci pose un réel problème d’interprétation de la présence de génome viral en matière de risque infectieux dans les aliments. Ce travail de thèse a pour objectif d’étudier l’évolution des propriétés de surface (charge et hydrophobie) de virus modèles, bactériophage MS2 et norovirus murin, au cours de l’inactivation par la chaleur, l’hypochlorite de sodium et l’ozone. Pour nos deux virus, nous démontrons l’existence d’une température critique au-delà de laquelle la particule virale se déstructure en libérant son génome. Un simple traitement à la RNase permettrait alors de ne détecter que des virus infectieux par biologie moléculaire. Le traitement thermique implique aussi une augmentation de l’hydrophobie soulignant des modifications conformationnelles de la capside. L’hypochlorite de sodium ne modifie que peu les propriétés de surface mais des phénomènes d’oxydation ont lieu au niveau de la capside puisque la charge du bactériophage MS2 est légèrement modifiée. Ces modifications diminuent la résistance thermique du virus. Nous démontrons un effet synergique de l’hypochlorite de sodium et la chaleur sur le bactériophage MS2 (inactivation, RNase et hydrophobie). Quant à l’ozone gazeux, nous soulignons son intérêt pour le traitement virucide des aliments fragiles. Ainsi, ce travail précise les mécanismes d’inactivation des virus et ouvre de nouvelles perspectives tant pour discriminer les virus infectieux et non-infectieux que pour proposer l’exploration de nouveaux traitements technologiques / Although heat treatments or disinfections by oxidants have proven their virucidal efficiencies, mechanisms related to the loss of infectivity are not known. This statement could lead to a misinterpretation of the presence of viral genome on infection risk for humans in food matrices. This thesis aimed to study the evolution of surface properties (charge and hydrophobicity) for model viruses, bacteriophage MS2 and murine norovirus, during the heat, sodium hypochlorite and ozone inactivations. For both viruses, the existence of a critical temperature beyond which the viral particle was disrupted and released its genome was demonstrated. Simple treatment with RNase would then only detect infectious virus by molecular biology. The heat treatment also involved a transient increase in the hydrophobicity which highlighted conformational changes of the viral capsid. Sodium hypochlorite slightly modified the surface properties but oxidation phenomena occurred onto capsid since the bacteriophage MS2 charge has changed a little. These changes decreased the thermal resistance of the virus. Synergistic effects of both sodium hypochlorite and heat were observed on the inactivation of MS2 phages, the sensitivity of their genome to RNases and the increase in hydrophobicity of remaining infectious particles. Regarding gaseous ozone, we underlined its interest in the case of virucidal treatment of fragile food matrices. Therefore, this work specified the virus inactivation mechanisms and opened up new perspectives to discriminate infectious from non-infectious viruses but also to propose the exploration of new technological processes

Le virus T lymphotrope humain de type 1 (HTLV-1, Human T-cell Leukemia Virus type 1) est le premier rétrovirus oncogène humain à avoir été découvert. Sa protéine régulatrice Tax est la principale responsable du processus d’immortalisation et de transformation des lymphocytes T, cibles préférentielles d’HTLV-1 in vivo, qui est associé au développement de leucémies à cellules T de l’adulte. Ce mécanisme oncogénique est dû à la capacité de Tax à interagir avec de nombreux acteurs cellulaires, détournant ainsi différentes voies qui contrôlent notamment la prolifération et la survie des cellules. L’un des événements majeurs de ce mécanisme est l’activation constitutive de la voie NF-κB induite par Tax. Notre laboratoire ainsi que d’autres équipes ont montré que l’ubiquitinylation de Tax, notamment avec des chaînes liées en K63, est nécessaire pour que Tax recrute et active le complexe IKK (IκB Kinase), en se liant à sa sous-unité régulatrice NEMO dans le cytoplasme. Par ailleurs, il a également été décrit que Tax est SUMOylée ce qui lui permet de recruter les dimères NF-κB dans des corps nucléaires pour activer la transcription de leurs gènes cibles. Toutefois, de nombreuses interrogations persistent autour de l’implication et du mode d’action de chacune de ces modifications post-traductionnelles de Tax dans l’activation de la voie NF-κB. L’importance de la SUMOylation de Tax a en effet été remise en cause par notre laboratoire, suscitant une controverse qui nous décida à réexaminer complètement son rôle dans l’activation de la voie NF-κB. Pour cela, nous avons élaboré une nouvelle stratégie basée sur l’inhibition de la machinerie de SUMOylation endogène, grâce au blocage de l’unique enzyme E2 identifiée dans ce processus, l’enzyme Ubc9. Nous avons prouvé qu’une protéine Tax non SUMOylée, mais toujours ubiquitinylée, active la transcription à partir de promoteurs dépendants de NF-κB, qu’ils soient transfectés, intégrés stablement dans la chromatine cellulaire ou endogènes, démontrant ainsi que la SUMOylation de Tax n’est pas nécessaire à l’activation de la voie NF-κB, contrairement à son ubiquitinylation. Un autre point de questionnement concerne l’association de Tax au complexe NEMO/IKKα/IKKβ, pour laquelle l’ubiquitinylation de Tax est essentielle. Nous avons étudié l’implication de l’enzyme TRAF5 dans ces mécanismes, qui semblait être une potentielle E3 ligase de Tax, celle-ci restant encore inconnue. Grâce au blocage de TRAF5, nous avons montré que cette protéine interagit avec Tax et qu’elle est nécessaire à son ubiquitinylation, notamment avec des chaînes K63, sans toutefois que son activité ligase n’entre en jeu, excluant donc son rôle en tant qu’E3 ligase de Tax. Nous avons également découvert que TRAF5 induit la formation du complexe Tax/IKKα/IKKβ, mais n’est pas impliquée dans l’association Tax/NEMO, dessinant alors un nouveau modèle pour le recrutement et l’activation du complexe IKK par Tax. Ce travail permet donc d’apporter un nouvel éclairage sur l’impact de la SUMOylation et de l’ubiquitinylation de Tax dans l’activation de la voie NF-κB et de décrypter les étapes de cet événement crucial dans le mécanisme oncogénique déclenché par la protéine Tax du virus HTLV-1. / The Human T-cell Leukemia Virus type I is the first human oncoretrovirus discovered. The regulatory Tax protein is the main responsible of the immortalization process of primary CD4+ T lymphocytes, the preferential target cells of HTLV-1 in vivo, which is associated with adult T-cell leukemia/lymphoma (ATLL), a highly aggressive malignant proliferation of CD4+ T lymphocytes. The oncogenic property of Tax is mainly due to its capacity to interact with many different cellular proteins belong to several pathways which control cell proliferation and survival. Constitutive activation of the NF-κB pathway induced by Tax plays a crucial role in this oncogenic mechanism. Our laboratory, and others, demonstrated that Tax ubiquitination, notably with K63-linked ubiquitin (Ub) chains, is required for the activation of the cytoplasmic IκB kinase (IKK) complex by directly interacting with the regulatory subunit NEMO. Moreover, in previous studies, we and others describe that Tax is also conjugated to either SUMO-1 or SUMO-2/3 molecules which facilitates its interaction with the NF-κB dimers in particular structures named Tax nuclear bodies, inducing promoter activation of target genes in the nucleus. However, many questions remain concerning the exact role of each Tax post-translational modification in the NF-κB pathway activation process. In the laboratory, we recently reconsidered the importance of Tax SUMOylation, provoking a controversy in our field. So, we decided to reexamine the role of this modification on NF-κB activation. To do this, we designed a novel strategy based on the inhibition of the endogenous SUMOylation machinery by blocking or silencing Ubc9, the unique E2-conjugating enzyme involves in this process. We found that an ubiquitinated but not SUMOylated Tax protein is still able to activate a transfected, an integrated or an endogenous NF-κB promoters, demonstrating that Tax SUMOylation is not required for Tax induced NF-κB pathway activation contrary to its ubiquitination. Another interrogation concerning the formation of the Tax/NEMO/IKKα/IKKβ complex, in which Tax ubiquitination is critical. We studied the role of TRAF5 in these mechanisms because this enzyme could be a potential Ub E3-ligase of Tax, which remains unknown. Thanks to the blockage of TRAF5, we showed that this protein interacts with Tax and that TRAF5 is necessary for Tax ubiquitination, notably with K63-linked Ub chains. However, TRAF5 is not the direct E3-ligase of Tax since we demonstrated that its ligase activity is not involved in Tax conjugation to ubiquitin. We also discovered that TRAF5 induces the formation of the Tax/ IKKα/IKKβ complex but not the association between Tax and NEMO, showing a new model for the recruitment and the activation of the IKK complex by Tax. In conclusion, our results led us to propose a new light on the impact of Tax SUMOylation and ubiquitination in the NF-κB pathway activation and to figure out the different steps of this process, which is crucial for the oncogenic mechanism induced by the HTLV-1 Tax protein.

Le projet a permis d’identifier des répertoires de protéines interagissant avec différentes espèces d’acides nucléiques caractéristiques des virus chez cinq espèces animales (Homme, souris, poulet, drosophile, nématode). Ces protéines représentent des candidats pour remplir des fonctions de récepteurs de l’immunité innée ou de molécules antivirales. Certaines d’entre elles ont été conservées au cours de l’évolution, ce qui m’a permis de tester leur fonction dans la drosophile. J’ai réalisé un crible impliquant des infections avec cinq virus différents sur 100 protéines conservées. Ce crible m’a permis d’identifier huit protéines dont l’inhibition impacte la réplication virale. Deux d’entres elles, CG5641 et Zn72D, sont nécessaires pour la réplication des virus de type picornavirus (CrPV). Le candidat le plus intéressant identifié est cependant la protéine Tao, dont l’inhibition entraîne une augmentation de la réplication de virus appartenant à plusieurs familles, chez la drosophile et dans les cellules de mammifères. / Antiviral response largely relies on the recognition of viral nucleic acids. The aim of the project was to characterize the range of nucleic acid binding proteins in the context of viral infection in flies. We identified a wide repertoire of proteins, which recognize viral nucleic acids in five species (human, mouse, chicken, fruit fly and roundworm). Among these proteins, there are ones, which are conserved in insects and humans, and therefore their function can be easily studied in the fruit fly model. Afterwards, we have performed a large screen in flies to study more precisely the function of 100 proteins in infection with 5 different viruses. We have found eight promising candidates as a result of this screen. We identified two Drosophila proteins CG5641 and Zn72D, which are also present in humans, as proviral factors. We also identified a protein Tao, which is conserved in humans, and is antiviral against several types of viruses.

La latence post-intégrative du VIH-1 génère des réservoirs qui empêchent l'éradication du virus avec les thérapies actuelles. La compréhension des mécanismes moléculaires de la latence servirait à l'identification de nouvelles cibles thérapeutiques et le développement de molécules de type LRA (Latency Reversing Agent) permettant la guérison fonctionnelle des patients et un arrêt des traitements. Nous avons démontré que la combinaison de deux types différents de LRAs à base de composés libérant P-TEFb (JQ1, I-BET, I-BET151 et HMBA) ou des agonistes de PKC (prostratine, bryostatine-1 et Ing-B) conduit à une robuste activation synergique de la production du VIH-1 dans divers modèles cellulaires de latence post-intégrative et dans des réservoirs de lymphocytes T CD4+ primaires. Le répresseur transcriptionnel CTIP2 recrute des complexes multienzymatiques pour favoriser l'établissement et la persistance de la latence du VIH-1 dans les cellules microgliales, le principal réservoir viral du système nerveux central. De plus, CTIP2 s’associe au complexe 7SK snRNP pour inhiber P-TEFb, un facteur d’élongation indispensable à l’expression du VIH-1 et à la réactivation des provirus latents. Des expériences d’immunoprécipitations de CTIP2, couplées à la spectrométrie de masse, nous ont permis d’identifier près de 900 partenaires protéiques de CTIP2. Parmi ces nouveaux partenaires, nous avons identifié la SUMO E3 ligase KAP1. Nous montrons que KAP1 réprime les phases précoce et tardive Tat dépendante de la transcription du VIH-1. KAP1 induit une dégradation de Tat, qui est sensible aux modulations de la voie SUMO. En effet, la sumoylation favorise l'association de Tat avec KAP1, de même que sa dégradation. Globalement, nos résultats suggèrent que KAP1 contribue à l'établissement et à la persistance des réservoirs latents du VIH-1. Cibler les voies SUMO constituerait un nouveau champ d'investigation dans le cadre du développement de nouvelles classes de LRAs. / The HIV-1 post-integration latency generates reservoirs that prevent the eradication of the virus with the current therapies. The understanding of the molecular mechanisms of this latency enable the identification of new therapeutic targets and the development of LRA (Latency Reversing Agent) for functional cure and treatments interruption. We have demonstrated that the combination of two different LRAs based on P-TEFb releasing compounds (JQ1, I-BET, I- BET151 and HMBA) or PKC agonists (prostratin, bryostatin-1 and Ing-B) leads to robust synergistic activation of HIV-1 production in various cellular models of post-integration latency and in primary CD4+ T cells reservoirs. The transcriptional repressor CTIP2 recruits multienzymatic complexes to promote the establishment and persistence of HIV-1 latency in microglial cells, the main viral reservoir of the central nervous system. Furthermore, CTIP2 binds to the 7SK snRNP complex to inhibit P-TEFb, an elongation factor essential for HIV-1 expression and reactivation of latent proviruses. Immunoprecipitation experiments of CTIP2 coupled to mass spectrometry allowed us to identify almost 900 proteins partners of CTIP2. Among these new partners, we have identified the E3 SUMO ligase KAP1. We found that KAP1 contributes to HIV-1 gene silencing by repressing the initiation and the Tat–dependent steps of the viral gene transcription. KAP1 induces Tat degradation via a SUMO-sensitive pathway. Indeed, favoring the sumoylation promotes Tat association with KAP1 and the resulted Tat degradation. Altogether, our results suggest that KAP1 contributes to the establishment and the persistence of the latently infected HIV-1 reservoirs. Moreover, these results suggest that targeting the SUMO pathways may be a new field of investigation to develop new classes of LRAs for cure strategies.

Sanofi Pasteur travaille depuis plus de 20 ans au développement d’un vaccin contre la Dengue, maladie virale pouvant présenter des formes sévères. Ce vaccin, dénommé Dengue CYD est composé de quatre virus recombinants basés sur la souche vaccinale contre la Fièvre Jaune dans laquelle les gènes codant les protéines prM et E ont été remplacés par ceux des différents sérotypes de virus Dengue.Dans les études décrites ici, nous avons démontré la stabilité génétique des souches vaccinales au cours des étapes de production, et nous avons mis au point un système de qRT-PCR pour quantifier le génome viral afin de caractériser les lots et suivre les virémies post-vaccinales.De plus, différentes études précliniques menées chez le macaque ont permis :1) d’évaluer l’immunogénicité du vaccin après immunisation par différentes formulations vaccinales et selon différents schémas visant à réduire les interférences entre les sérotypes. L’administration de vaccins bivalents complémentaires à des sites anatomiques différents ou de façon séquentielle, l’établissement d’une pré-immunité hétérologue, une moindre dose relative du sérotype vaccinal dominant ou l’administration d’un rappel à un an ont ainsi permis de mettre en évidence des pistes d’amélioration du schéma vaccinal.2) d’évaluer la biodistribution et l’excrétion du vaccin afin de confirmer son innocuité.3) de tester la neutralisation d’un panel de souches virales par des sérums des singes vaccinés pour montrer que les anticorps induits par le vaccin peuvent neutraliser des souches Dengue circulantes d’origines géographiques et de génotypes variés.Enfin, l’absence de risque de dissémination du virus dans l’environnement via les tiques, arthropodes vecteurs d’autres Flavivirus, a été confirmée.Ces études ont permis d’apporter des éléments démontrant l’intérêt du vaccin Dengue CYD pour lancer des études cliniques et compléter les dossiers réglementaires visant à l’enregistrement du vaccin Dengvaxia® / Sanofi Pasteur has been working for more than 20 years to develop a vaccine against Dengue, viral disease that can cause life-threatening forms. The CYD Dengue vaccine is a tetravalent recombinant virus based on Yellow fever vaccine strain in which genes encoding prM and E proteins have been replaced by the corresponding genes from the different Dengue virus serotypes.In the studies described here, we demonstrated the genetic stability of the vaccine strains during the manufacturing steps and we set-up a qRT-PCR system to quantify viral genome in order to characterize batches and to follow post-vaccination viremia.In addition, different pre-clinical studies were conducted in macaques in order:1) To evaluate the vaccine immunogenicity after immunizations according to different schedules and formulations aiming at decreasing interferences between serotypes. Different parameters were shown to improve vaccine immunogenicity, such as administration of complementary bivalent vaccines at separate anatomical sites or sequentially, establishment of a heterologous pre-immunity, adaptation of the formulation by decreasing the dose of the dominant serotype or administration of a 1-year booster.2) To evaluate the biodistribution and shedding of the vaccine to confirm its safety3) To test neutralization by vaccinated-monkey sera of a panel of circulating viral strains to demonstrate that antibodies elicited by the vaccine should neutralize Dengue strains from different geographical origins and genotypesFinally, the absence of risk of dissemination of the virus in the environment via ticks, i.e. arthropods responsible for transmission of other Flaviviruses, was confirmed.These studies brought elements demonstrating the interest of the CYD Dengue vaccine to allow starting clinical trials and filing of technical dossiers supporting Dengvaxia® submission and registration

Les cellules dendritiques plasmacytoïdes (pDC) sont infectées par le VIH-1 et la diminution de leur nombre dans la circulation sanguine est corrélée avec la virémie des patients. Au cours de mes travaux de thèse, nous avons montré que les anticorps neutralisants (AcN) spécifiques du VIH-1 inhibent l’infection des pDC par des isolats primaires de VIH-1. Contrairement aux mDC, le mécanisme d’inhibition de l’infection des pDC est indépendant du RFcγII présent à leur surface. En parallèle, nos résultats indiquent que les pDC produisent de l’interféron-α et d’autres cytokines et chimiokines en réponse au VIH-1, même lorsque l’infection des cellules est inhibée par les AcN. Enfin, nous avons observé l’inhibition du transfert en cis et en trans du VIH-1 des pDC aux lymphocytes T CD4 par les AcN.Dans un contexte d’induction d’AcN par vaccination, l’inhibition de la réplication du VIH-1 dans les pDC associé au maintien de la sécrétion de cytokines pro-inflammatoire par ces cellules pourrait favoriser l’élimination du virus et ralentir sa dissémination dans l’organisme. / Plasmacytoid dendritic cells (pDC) are able to replicate HIV-1, and the decrease of pDC number in blood is correlated with HIV-1 viremia in patients. During my thesis, we showed that HIV-1-specific neutralizing antibodies (NAb) inhibited the infection of pDC by HIV-1primary isolates. Unlike mDC, the mechanism of inhibition of pDC infection was independent of FcγRII expressed on these cells. In parallel, our results indicated that pDC produce interferon-α and other cytokines and chemokines in response to HIV-1, even when HIV-1 infection of these cells was inhibited by NAb. Finally, we showed that NAb were able to inhibit HIV-1 transfer in cis and trans from pDC to CD4 T cells.In the context of antibodies induction by vaccination, the inhibition of HIV-1 replication in pDC associated with the maintenance of pro-inflammatory cytokines released by these cells may help to eliminate the virus and impede its dissemination in the body.

Le virus de l'hépatite B (HBV) infecte de manière chronique 240 millions de personnes dans le monde, et est la principale cause de carcinome hépatocellulaire. Actuellement, les traitements standards permettent une suppression virale à long terme, mais ne sont pas capables d'éliminer complètement le virus, en raison de la persistance de l'ADN circulaire et clos de façon covalente (ADNccc). Ce minichromosome viral réside dans le noyau des hépatocytes infectés, grâce à sa structure chromatinienne. En effet, lors de l'infection d'un hépatocyte, l'ADN viral partiellement double brin (ADN relâché circulaire (rc)) est libéré dans le noyau, où il est réparé et enveloppé par des protéines histones, afin de former une structure d'épisome chromatinisé. Les mécanismes conduisant à la formation ainsi qu'à la chromatinisation de l'ADNccc sont encore largement inconnus, et leur élucidation constituerait une première étape vers l'identification de nouvelles cibles thérapeutiques, susceptibles d'altérer la persistance de l'ADNccc. Dans ce but, nous avons étudié le rôle des facteurs hôtes de réparation de l'ADN, et des voies d'assemblage des nucléosomes, dans la formation de l'ADNccc, à des stades précoces (entre 30 minutes et 72 heures) de l'infection, dans des lignées cellulaires d'HepG2-NTCP, ainsi que dans des hépatocytes primaires humains. Nous nous sommes particulièrement concentrés sur la protéine chaperone d'histones, HIRA, qui est connue pour déposer le variant d'histone 3.3 (H3.3) sur l'ADN cellulaire d'une manière indépendante de la réplication et en association avec le remaniement des nucléosomes pendant la transcription et la réparation de l'ADN. Nous avons été capables de détecter l'ADNccc dans la fraction nucléaire des hépatocytes dès 30 minutes et 24 heures post-infection, par qPCR et Southern Blotting (SB), respectivement. L'extinction de HIRA par ARN interférent (siARN) avant l'inoculation du virus, a conduit à une forte diminution de l'accumulation de l'ADNccc (à la fois par qPCR et Southern Blot), qui était indépendante de la protéine HBx (en utilisant un virus HBx-défectueux). Les niveaux d'ADNrc sont restés stables, indiquant soit une éventuelle transition de l'ADNrc en ADNccc incomplète, ou retardée. L'analyse par immunoprécipitation de la chromatine a montré que HIRA était liée à l'ADNccc dès 30 minutes après infection, et que son recrutement était concomitant avec le dépôt de l'histone H3.3, ainsi que la liaison de la protéine de capside du HBV (HBc). Après 24 heures d'infection, une augmentation de la liaison de H3.3 et de l'ARN polymérase II sur l'ADNccc a été observée, en corrélation avec l'initiation de la transcription de l'ARN viral de 3.5 kb. Par des expériences de co-immunoprécipitation et de test de proximité entre protéines (PLA), nous avons montré que HIRA était capable d'interagir avec HBc dans des hépatocytes infectés et dans une lignée cellulaire HepaRG exprimant HBc de manière inductible. En conclusion, nos résultats suggèrent que la chromatinisation de l'ADN viral entrant est un événement très précoce, nécessitant l'histone chaperone HIRA. Bien que HBx ne soit pas requis pour ce processus, HBc pourrait jouer un rôle majeur, suggérant que l'interaction entre HIRA et HBc pourrait représenter une nouvelle cible thérapeutique à étudier / Hepatitis B virus (HBV) chronically infects 240 million people worldwide and is the major cause of hepatocellular carcinoma (HCC). Currently standard-of-care treatments can achieve longterm viral suppression, but are not able to completely eliminate the virus, due to the persistence of the covalently closed circular DNA (cccDNA). cccDNA, the viral minichromosome, resides in the nucleus of infected hepatocytes by virtue of its chromatin structure. Indeed, upon entry into hepatocytes, the partially double stranded viral DNA (relaxed circular (rc)DNA) is released into the nucleus, where it is repaired and wrapped by histones to form an episomal chromatinized structure. The mechanisms leading to cccDNA formation and chromatinization are still largely unknown and their elucidation would be a first step toward the identification of new therapeutic targets to impair cccDNA persistence. To this aim, we investigated the role of host factors belonging to DNA repair and nucleosome assembly pathways in cccDNA formation at early time points (i.e. between 30 minutes and 72 hours) post-infection in both HepG2-NTCP cell line and Primary Human Hepatocytes (PHH). We particularly focused on the histone chaperone Hira, which is known to deposit histone variant 3.3 (H3.3) onto cellular DNA in a replication-independent manner and in association to nucleosome reshuffling during transcription and DNA repair. We were able to detect cccDNA in the nuclear fraction of hepatocytes as early as 30 minutes and 24h post-infection, by qPCR and Southern Blotting (SB), respectively. Knock-down of Hira by RNA interference before virus inoculation led to a strong decrease in cccDNA accumulation (both in qPCR and SB) which was independent from HBx protein expression (using an HBx defective virus). rcDNA levels remained stable, indicating either a possible incomplete or delayed rcDNA to cccDNA transition. Chromatin Immunoprecipitation analysis showed that Hira was bound to cccDNA already at 2 hours post-infection and that its recruitment was concomitant with the deposition of histone H3.3 and the binding of HBV capsid protein (HBc). After 24 hours of infection, an increase of H3.3 and Pol2 binding on cccDNA was observed, correlating with the initiation of the transcription of the 3.5 kb RNA. By Co-Immunoprecipitation and Proximity Ligation Assay experiments, we showed that Hira was able to interact with HBc in infected hepatocytes and in a HepaRG cell line expressing HBc in an inducible manner. Altogether, our results suggest that chromatinization of incoming viral DNA is a very early event, requiring the histone chaperone Hira. While HBx is not required for this process, HBc could play a major role, suggesting that the interaction between Hira and HBc could represent a new therapeutic target to be investigated

Les polérovirus infectent de nombreuses plantes d’intérêt économique telles que la pomme de terre, la betterave à sucre et les cucurbitacées. Ces virus icosaédriques renferment un ARN simple brin et leur capside est constituée d’une protéine majeure (CP) et d’un composant mineur (RT*) localisé à la surface des virions. Ces virus sont restreints aux cellules du phloème dans lesquelles ils se multiplient et se déplacent. Les protéines CP et RT sont essentielles à la dissémination du virus par le puceron vecteur et à son mouvement dans la plante. L’objectif de cette étude a consisté à identifier dans les cellules du phloème, les protéines associées aux virions susceptibles d’intervenir dans le cycle viral en criblant une banque d’ADNc de cellules compagnes (CC) d’A. thaliana avec les protéines de structure ou des domaines protéiques du CABYV. Quatre gènes codant pour une protéine Heat Shock (HSP), la profiline 3 (PRF3) une glysosyl hydrolase ; et la protéine « Response to low sulfur 3 » ont été identifiés. Tous ces gènes candidats interagissent avec le domaine RTC-ter du CABYV et avec la protéine RT* pour la protéine HSP. En plus de ces gènes candidats, je me suis intéressée à la protéine ALY, identifiée au laboratoire, au cours du criblage d’une banque d’ADNc de puceron entier avec les deux protéines de structure du Turnip yellows virus (un autre polérovirus). Cette protéine possède quatre orthologues chez Arabidopsis susceptibles d’être impliquées dans le mécanisme de gene silencing mis en place contre le Tomato Bushy Stunt Virus. Les protéines ALY sont donc des candidats intéressants et j’ai montré une interaction entre les protéines de structure du CABYV et du TuYV et les quatre orthologues d’Arabidopsis. L’implication de ces gènes candidats n’a pas pu être confirmée à ce jour dans des mutants knock-out d’arabidopsis. Les résultats complexes obtenus pour le candidat PRF3 au cours des analyses de validation fonctionnelle, m’a conduit à étudier l’interaction entre ce candidat et le domaine RTC-ter du CABYV in planta par FLIM mais aucune interaction n’a pu être confirmée à ce jour. Tous les candidats isolés lors du criblage de la banque d’ADNc de CC interagissant avec le domaine RTC-ter du CABYV, ce travail m’a conduit à analyser le rôle dans le cycle viral de ce domaine et de la protéine RT (sous sa forme complète ou dépourvue du domaine RTC-ter), en étudiant l’accumulation de ces mutants dans les plantes et le clivage de la protéine RT. Tout d’abord, afin de localiser précisément le site de clivage de la protéine RT, des mutants ponctuels dans la zone de clivage ont été réalisés ce qui a permis de montrer que la structure secondaire de la protéine est importante pour son clivage. Puis, afin d’analyser le rôle du domaine RTC-ter dans le cycle viral, j’ai obtenu par délétion, un mutant n’exprimant plus ce domaine. Ce mutant synthétise uniquement la protéine RT tronquée, forme des particules virales semblables au virus sauvage et est transmissible par puceron. Par contre, de façon surprenante, ce mutant est incapable d’envahir les feuilles non-inoculées d’une plante. Ce résultat suggère que les deux formes de la protéine RT (complète et tronquée) sont indispensables au mouvement à longue distance du virus et nous proposons un modèle dans lequel le domaine C-terminal de la protéine RT agit en trans sur la particule virale pour promouvoir le mouvement du CABYV à longue distance. / Poleroviruses infect a wide range of cultivated plants such as potatoes, sugar beet and plants of Cucurbitaceae family. These viruses are restricted to phloem tissue where they replicate in nucleated cells and translocate over long distances through sieve elements. Polerovirus capsid is composed of the major coat protein (CP) and of a minor component referred to as the readthrough (RT*) protein and exposed at the outside of the particles. CP and RT proteins are essential for virus movement and transmission by aphids. The aim of this study is to identify phloem proteins interacting with viral proteins and potentially involved in viral cycle, by screening an A. thaliana companion cell (CC) cDNA library with structural proteins or protein domains of CABYV. Four genes encoding for a heat shock protein (HSP), a profilin (PRF3), a glycosyl hydrolase and the protein ”Response to low sulfur ” (LSU3) were identified and interact with the C-terminal part of the RT protein (RTC‑ter) and with the RT* protein for the HSP. An additional gene encoding for the protein ALY, identified in the laboratory, by screening an aphid cDNA library with structural proteins of the Turnip yellows virus (another polerovirus) was studied. This protein has four orthologues in Arabidopsis, involved in the gene silencing mechanism against Tomato Bushy Stunt Virus. Here we show that CABYV and TuYV structural proteins interact with the four orthologues of Arabidopsis. Involvement of these candidate genes was not confirmed in Arabidopsis knock-out mutants. In functional experiments, ambiguous results were obtained with PRF3 arabidopsis mutants, and this lead me to study the interaction between PRF3 protein CABYV RT c-ter domain by FLIM, but no interaction was found so far. As all candidat interact with the RTC-ter domain, we studied more precisely the role of this domain in the viral cycle and the role of the complete RT protein. We studied the in vivo RT protein processing and its consequences on systemic movement of CABYV mutants. Using a collection of point mutations introduced in the central domain of the CABYV RT protein, we approached the site of the RT processing and proposed that this process is affected by the secondary structure around the cleavage site. We also reported for the first time the generation of a polerovirus mutant able to synthesize only the RT* protein and to incorporate it into the particle. This mutant was unable to move systemically. Conversely another mutant producing a full-length RT protein impaired in correct processing and incorporating a shorter version of the RT* protein showed very weak systemic infection. These data are strongly in favor of a role of both RT proteins in efficient CABYV movement. An inefficient virus transport was still maintained in the absence of RT proteins suggesting an RT-independent movement pathway. Based on these results, we propose a model for CABYV long-distance transport in which the complete RT protein, or its C-terminal part, acts in trans on wild-type virions to promote their efficient long-distance transport.