As infecções associadas aos cuidados de saúde constituem um problema grave nas unidades hospitalares bem como nos serviços de atendimento extra-hospitalares. Diferentemente de outros países, no Brasil, existe uma incidência alta dessas infecções causadas por microorganismos Gram-negativos produtores de β-lactamase de espectroestendido (ESBL). Estas enzimas hidrolisam compostos β-lactâmicos e são consideradas mundialmente como de importância clínica, pois a localização de seus genes emelementos móveis facilitam a transmissão cruzada. Este estudo foi realizado com amostras bacterianas isoladas de material clínico e de fezes de pacientes internados em um hospital da rede pública no Rio de Janeiro, Brasil. Estes pacientes estavam internados em duas unidades de terapia intensiva cardiológica, no período de janeiro a dezembro de 2007. O estudo teve por objetivo realizar a caracterização fenotípica e genotípica desses isolados associados à colonização ou infecção dos pacientes. Os testes fenotípicos e genotípicos foram realizados na Universidade do Estado do Rio de Janeiro e incluíram provas bioquímicas, teste de susceptibilidade, teste confirmatório para a expressão da produção da enzima ESBL e Reação de Polimerase em Cadeia (PCR) com iniciadores específicos para cinco genes: blaTEM, blaSHV, CTX-M1, Toho1 e AmpC. As espécies bactérianas mais frequentemente isoladas foram Escherichia coli (25%) e Klebsiella pneumoniae (30,56%), e os genes mais prevalentes foram blaTEM (41,6%), AMPC (41,6%) blaSHV (33,3%), CTX-M1 (25%), e Toho1 (19,44%). Identificamos em 25% das amostras enterobactérias que não eram E. coli, K. pneumoniae ou Proteus sp, com fenótipo para ESBL e a expressão dos mesmos genes, confirmando a necessidade de investigação nestes grupos microbianos. O substrato mais sensível para a expressão da área de sinergismo no Teste de Aproximação foi o ceftriaxone (80%). Identificamos também que 17% das amostras positivas para ESBL apresentaram co-produção para AmpC e 50% apresentaram mais de um gene para os iniciadores testados. A presença da carbapenemase foi avaliada em amostras bacterianas com susceptibilidade intermediária para ertapenem, através do Teste de Hodge modificado. Os achados do presente estudo caracterizaram a co-produção de AmpC e ESBL, bem como sugerem a necessidade da revisão e a ampliação dos métodos para a detecção de outros padrões de resistência na nossa Instituição. / Healthcare-associated infections are a major problem in hospital units as well as in units outside hospital, where procedures are performed. In Brazil, differently from other countries, a large proportion of these infections are caused by extended spectrum beta-lactamase (ESBL) producing Gram-negative microorganisms. These enzymes, which hydrolyse β-lactams, are considered of clinical importance worldwide. Their localization in genes that are located in móbile structures facilitate cross infection. This study was performed with bacterial isolates found in clinical specimens and faeces of patients hospitalized in a public hospital in the city of Rio de Janeiro, Brazil. These patients were in two different cardiological intensive care units from January till December 2007. The goal of the study was the phenotypic and genotypic characterization of the bacterial isolates which were associated with colonization or infection. Phenotypic and genotypic tests were performed in Universidade do Estado do Rio de Janeiro (Rio de Janeiro State University) and included biochemical tests, susceptibility tests, a comfirmatory test for the expression of ESBL, and polymerase chain reaction (PCR) with specific primers for five gentes : blaTEM, blaSHV, CTX-M1, Toho1 and AmpC. The most frequently isolated bactéria were Escherichia coli (25%) and Klebsiella pneumoniae (30,56%), and the most prevalent genes were blaTEM (41,6%), AMPC (41,6%) blaSHV (33,3%), CTX-M1 (25%), and Toho1 (19,44%). In 25% of samples we identified enterobacteria that were not E. coli, K. pneumoniae oor Proteus spp, but with the ESBL phenotype and the expression of the same genes, suggesting these microbes needed investigating. The most sensitive substrate for expressing synergism in the double-disk diffusion test was ceftriaxone (80%). We also identified that 17% of ESBL positive isolates showed co-production of AmpC and 50% showed more than one gene tested by PCR. The presence of carbapenemase was studied in bacterial isolates with intermediate susceptibility to ertapenem, by a modified Hodge test. The findings in the present study characterize the co-production of AmpC and ESBL, and suggest the need for reviewing detection methods used and possibly using other methods for the detection of other resistance patterns in our Institution.

Made available in DSpace on 2016-12-08T15:56:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Gisele Dalmonico.pdf: 8818399 bytes, checksum: 54cd754bf0a330bb5a3710ceaea2c8ed (MD5) Previous issue date: 2015-11-20 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Treatments for bone loss are research topics and involve different areas of scientific knowledge, engineering, physics, chemistry, biology and biomedicine. The biomaterials that stand out as replacement in bone structure treatments are hydroxyapatite, β and α calcium phosphate, biphasic hydroxyapatite/calcium phosphate β and α and hydroxyapatite matrix nanocomposite biomaterials. These biomaterials stand out as bone substitutes because they present a crystallography similar to that of human skeleton bone apatite, being bioactive and biocompatible. Nanostructured biphasic bioceramics are researched and show potential to be bone substitutes in surgical repairing procedures and reconstruction of bone tissue. This project was developed based on research of biomaterials of calcium phosphates, involving the synthesis of two matrices of calcium phosphates: β-calcium phosphate (β-TCP) and hydroxyapatite (HA) and the preparation of microporous granular biomaterials of β-TCP, HA and biphasic compositions HA/β-TCP. All biomaterials were characterized by different techniques: X-ray diffraction, infrared spectroscopy in Fourier transform (FTIR), Raman spectroscopy, specific surface area for BET, particle size by laser diffraction, density of helium pictometria, porosimetry mercury and hydrostatic porosity by Arthur, differential scanning calorimetry, dilatometry, scanning electron microscopy, atomic force microscopy, confocal microscopy, optical microscopy, polarized light microscopy. The interest of this research was to evaluate the performance of biomaterials in in vivo tests for the time periods of 90 and 180 days, in relation to osseointegration and the formation of neoformed bone tissue and determine which biomaterials presented potential as bone replacement for biomedical applications. The results found are encouraging and demonstrate that the granulated microporous biomaterials of calcium phosphate proves to be ability to repair and bone reconstruction for the two test times in vivo evaluated, revealing the osseointegration and bone formation similar between the compositions. / Os tratamentos de perdas ósseas são temas de pesquisa que envolve diferentes áreas do conhecimento científico, engenharia, física, química, biologia e biomédica. Os biomateriais que se destacam como substitutos em tratamentos da estrutura óssea são a hidroxiapatita, os fosfatos de cálcio-β e α, os bifásicos hidroxiapatita/fosfato de cálcio-β, α e os biomateriais nanocompósitos de matriz hidroxiapatita. O destaque destes biomateriais como substitutos ósseos, se deve, por apresentarem cristalografia similar à da apatita óssea do esqueleto humano, por serem bioativos e biocompatíveis. As biocerâmicas bifásicas nanoestruturadas são pesquisadas e demonstram ser promissoras como substitutos ósseos em procedimentos cirúrgicos de reparação e reconstrução do tecido ósseo. Este projeto se desenvolveu com base na investigação de biomateriais de fosfatos de cálcio, envolvendo a síntese de duas matrizes de fosfatos de cálcio: Fosfato de cálcio-β (TCP-β) e hidroxiapatita (HA) e elaboração de biomateriais granulados microporosos de TCP-β, HA e bifásicos HA/TCP-β. Todos os biomateriais granulados foram caracterizados por diferentes técnicas: difratometria de raios X, espectroscopia de infravermelho por transformada de Fourier (FTIR), espectroscopia Raman, área superficial específica por BET, tamanho de partícula por difração a laser, densidade por pictometria de hélio, porosimetria de mercúrio e hidrostática com método de Arthur. Com relação ao comportamento térmico utilizou-se a calorimetria exploratória diferencial, dilatometria. A caracterização microestrutural foi realizada com a microscopia eletrônica de varredura, microscopia de força atômica, microscopia confocal, microscopia óptica, microscopia de luz polarizada. Esse projeto de pesquisa envolveu a elaboração de biomateriais granulados microporosos de fosfatos de cálcio, o interesse foi avaliar o desempenho destes em teste in vivo, para os tempos de 90 e 180 dias em tíbia de ovinos, em relação ao desempenho dos mesmos sobre a osseointegração e a neoformação do novo tecido ósseo. Os resultados encontrados são animadores e demonstram que todas as composições de biomateriais granulados microporos de fosfatos de cálcio, demonstraram capacidade de reparação e reconstrução óssea para os dois tempos de teste in vivo avaliados, revelando a osseointegração e a neoformação óssea semelhante entre as composições.

Made available in DSpace on 2014-12-17T15:34:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 MiguelASFC_DISSERT.pdf: 664410 bytes, checksum: ea1412fbbc90b4e28d5ec902a12a2ff5 (MD5) Previous issue date: 2011-08-29 / Universidade Federal do Rio Grande do Norte / The objective of this study was to identify DNA polymorphisms at the genes leptin, β-lactoglobulin and pituitary-specific transcription factor in three genetic groups of Holstein x Guzerat dairy cows and investigate the relationship between their genotypes and the composition and quality of milk of dairy cows. Samples were collected in August 2009, being 113 blood samples from lactating crossbred cows and 58 milk samples. For analysis of DNA polymorphisms blood samples were collected, analyzed later in the Genetic Laboratory affiliated to the Zootechny Institute of S?o Paulo and individual milk samples were collected according to standards established by the laboratory of Management Program of Northeast Dairy Herds (PROGEN), at Federal Rural University of Pernambuco (UFRPE) for analysis of milk composition and quality. The characterization of genotypes was performed by PCR-RFLP, for which were designed specific primers for each studied gene and restriction enzymes Kpn2I, HaeIII and HinfI that cut the DNA of the following genes: leptin, β-lactoglobulin and a PIT, respectively. The leptin estimate genotypic frequence were CC 0.112, TT 0.225 and CT 0.661, for β-lactoglobulin were AA 0.136, AB 0.323 and BB 0.539, and for PIT were ++ 0.655, -- 0.311 and +- 0.032. The results show that the population is in Hardy-Weinberg disequilibrium for leptin, β-lactoglobulin and a PIT due to excess of heterozygotes in the population, however, as these genes are associated with the milk production it is considered that the animals have genetic potential for milk production in the Brazilian semi-arid conditions. Through the characterization of the studied herd there were not found implications of the polymorphism of leptin, β-lactoglobulin and PIT in the composition and quality of milk from cows in the different genetic groups 1/2, 3/4 and 7/8 Holstein x Guzerat. Key words: β-lactoglobulin, crossbred cows, leptin, PCR-RFLP, PIT1, semi-arid. / O objetivo do presente estudo ? identificar os polimorfismos de DNA nos genes leptina, β-lactoglobulina e fator de transcri??o pituit?rio espec?fico, em tr?s grupos gen?ticos de vacas leiteiras Holand?s x Guzer? e verificar a rela??o entre seus gen?tipos com a composi??o e qualidade do leite de vacas leiteiras. As amostras foram coletadas em agosto de 2009, sendo 113 amostras de sangue de vacas mesti?as em lacta??o e 58 amostras de leite. Para a an?lise do polimorfismo de DNA foram coletadas amostras de sangue, analisadas posteriormente no Laborat?rio de Gen?tica do Instituto de Zootecnia do Estado de S?o Paulo. As amostras individuais de leite foram coletadas segundo os padr?es estabelecidos pelo laborat?rio do Programa de Gerenciamento de Rebanhos Leiteiros do Nordeste (PROGENE), da Universidade Federal Rural de Pernambuco (UFRPE) para as an?lises de composi??o e qualidade do leite. A caracteriza??o dos gen?tipos foi realizada atrav?s da t?cnica de PCR-RFLP, em que foram utilizados primers espec?ficos para cada gene estudado e enzimas de restri??o Kpn2I, HaeIII e HinfI, promotoras de cortes nos genes leptina, β- lactoglobulina e PIT1, respectivamente. A freq??ncia genot?pica estimada da leptina foi CC 0,112 , TT 0,225 e CT 0,661, da β-lactoglobulina foi AA 0,136, BB 0,323 e AB 0,539 e PIT1 ++ 0,655, -- 0,311 e +- 0,032. Os resultados mostram que a popula??o se encontra em desequil?brio de Hardy-Weinberg para a leptina, β-lactoglobulina e PIT1 devido ao excesso de heterozigotos presentes na popula??o, entretanto, como estes genes est?o associados ? produ??o de leite, considera-se que os animais t?m potencial gen?tico para a produ??o leiteira nas condi??es do semi?rido brasileiro. Atrav?s da caracteriza??o do rebanho estudado n?o foram encontradas implica??es referentes ao polimorfismo da leptina, β lactoglobulina e PIT1 na composi??o e qualidade do leite de vacas nos grupos gen?ticos 1/2, 3/4 e 7/8 Holand?s x Guzer?

As infecções associadas aos cuidados de saúde constituem um problema grave nas unidades hospitalares bem como nos serviços de atendimento extra-hospitalares. Diferentemente de outros países, no Brasil, existe uma incidência alta dessas infecções causadas por microorganismos Gram-negativos produtores de β-lactamase de espectroestendido (ESBL). Estas enzimas hidrolisam compostos β-lactâmicos e são consideradas mundialmente como de importância clínica, pois a localização de seus genes emelementos móveis facilitam a transmissão cruzada. Este estudo foi realizado com amostras bacterianas isoladas de material clínico e de fezes de pacientes internados em um hospital da rede pública no Rio de Janeiro, Brasil. Estes pacientes estavam internados em duas unidades de terapia intensiva cardiológica, no período de janeiro a dezembro de 2007. O estudo teve por objetivo realizar a caracterização fenotípica e genotípica desses isolados associados à colonização ou infecção dos pacientes. Os testes fenotípicos e genotípicos foram realizados na Universidade do Estado do Rio de Janeiro e incluíram provas bioquímicas, teste de susceptibilidade, teste confirmatório para a expressão da produção da enzima ESBL e Reação de Polimerase em Cadeia (PCR) com iniciadores específicos para cinco genes: blaTEM, blaSHV, CTX-M1, Toho1 e AmpC. As espécies bactérianas mais frequentemente isoladas foram Escherichia coli (25%) e Klebsiella pneumoniae (30,56%), e os genes mais prevalentes foram blaTEM (41,6%), AMPC (41,6%) blaSHV (33,3%), CTX-M1 (25%), e Toho1 (19,44%). Identificamos em 25% das amostras enterobactérias que não eram E. coli, K. pneumoniae ou Proteus sp, com fenótipo para ESBL e a expressão dos mesmos genes, confirmando a necessidade de investigação nestes grupos microbianos. O substrato mais sensível para a expressão da área de sinergismo no Teste de Aproximação foi o ceftriaxone (80%). Identificamos também que 17% das amostras positivas para ESBL apresentaram co-produção para AmpC e 50% apresentaram mais de um gene para os iniciadores testados. A presença da carbapenemase foi avaliada em amostras bacterianas com susceptibilidade intermediária para ertapenem, através do Teste de Hodge modificado. Os achados do presente estudo caracterizaram a co-produção de AmpC e ESBL, bem como sugerem a necessidade da revisão e a ampliação dos métodos para a detecção de outros padrões de resistência na nossa Instituição. / Healthcare-associated infections are a major problem in hospital units as well as in units outside hospital, where procedures are performed. In Brazil, differently from other countries, a large proportion of these infections are caused by extended spectrum beta-lactamase (ESBL) producing Gram-negative microorganisms. These enzymes, which hydrolyse β-lactams, are considered of clinical importance worldwide. Their localization in genes that are located in móbile structures facilitate cross infection. This study was performed with bacterial isolates found in clinical specimens and faeces of patients hospitalized in a public hospital in the city of Rio de Janeiro, Brazil. These patients were in two different cardiological intensive care units from January till December 2007. The goal of the study was the phenotypic and genotypic characterization of the bacterial isolates which were associated with colonization or infection. Phenotypic and genotypic tests were performed in Universidade do Estado do Rio de Janeiro (Rio de Janeiro State University) and included biochemical tests, susceptibility tests, a comfirmatory test for the expression of ESBL, and polymerase chain reaction (PCR) with specific primers for five gentes : blaTEM, blaSHV, CTX-M1, Toho1 and AmpC. The most frequently isolated bactéria were Escherichia coli (25%) and Klebsiella pneumoniae (30,56%), and the most prevalent genes were blaTEM (41,6%), AMPC (41,6%) blaSHV (33,3%), CTX-M1 (25%), and Toho1 (19,44%). In 25% of samples we identified enterobacteria that were not E. coli, K. pneumoniae oor Proteus spp, but with the ESBL phenotype and the expression of the same genes, suggesting these microbes needed investigating. The most sensitive substrate for expressing synergism in the double-disk diffusion test was ceftriaxone (80%). We also identified that 17% of ESBL positive isolates showed co-production of AmpC and 50% showed more than one gene tested by PCR. The presence of carbapenemase was studied in bacterial isolates with intermediate susceptibility to ertapenem, by a modified Hodge test. The findings in the present study characterize the co-production of AmpC and ESBL, and suggest the need for reviewing detection methods used and possibly using other methods for the detection of other resistance patterns in our Institution.

Devido a necessidade de redução do consumo dos derivados de petróleo, faz-se necessária a procura da substituição destes por outras fontes viáveis no processo de cementação. Este trabalho apresenta um estudo para viabilização da cementação gasosa através da dissociação do álcool etílico diluído com gás nitrogênio. Foram feitos estudos termodinâmicos, com base em análise química das amostras dos gases retiradas do forno, analisados por um infra vermelho. Com análise dos gases CO, CO2, CH4 pode-se determinar as atividades do carbono nos gases (ag) e o coeficiente de velocidade de transporte de carbono da atmosfera para a superfície metálica (&#946), nas temperaturas de 870ºC, 900ºC, 930ºC, sendo que as atmosferas cementantes nestas temperaturas foram diluídas com diferentes porcentagens de gás nitrogênio. Com os resultados foi possível concluir que as diluições não interferiram no potencial de carbono, mas foi a grande responsável na diminuição no tamanho das camadas cementadas. / Nowadays, due to the need of reduction of the consume of petroleum derivative products, the substitution of these products for others sources is really necessary. This work presents a viability study of carburizing dissociation of ethanol diluted in nitrogen study gas. Thermodynamics studies were carried out with chemical analysis of gas samples from furnace using infrared analyser. CO, CO2 and CH4 gas analysis were used to determine the gas carbon activity (ag) and the carbon coefficient of transport velocity from atmosphere to the metallic surface (&#946), for the temperature of 870°C, 900°C and 930°C. The carbuzing atmosphere for these temperatures were diluted with different percentages of nitrogen gas. With carbon potential, but it was the mean responsible for the size reduction of case carburized.

O objetivo do estudo foi investigar o remodelamento tecidual e fatores modulados pela via do TGFβ no tecido adiposo subcutâneo na vigência da caquexia associada ao câncer gastrointestinal. O estudo incluiu 59 pacientes divididos em três grupos: Controle, Câncer de peso estável (WSC) e Câncer e Caquexia (CC). Foram observadas alterações morfológicas exclusivas ao tecido adiposo do grupo CC. Houve o aumento na deposição de colágeno, glicoproteínas associadas, e fibras do sistema elásticas. A imunohistoquímica revelou alterações no conteúdo dos colágenos do tipo I, III e VI, e da fibronectina no grupo CC em relação ao grupo Controle e WSC. A presença de miofibroblastos no grupo CC foi confirmada pela imunomarcação para αSMA, e o aumento de 20 vezes do gene FSP1 no tecido adiposo, em associação com expressiva marcação de vimentina em fibroblastos isolados. As concentrações do TGFβ3 estavam aumentadas no tecido adiposo, e TGFβ1 e TGFβ3 nos adipócitos, dos pacientes caquéticos. A imunolocalização revelou maior intensidade para SMAD3 e SMAD4 no grupo CC. Em conclusão, na caquexia associada ao câncer, a via do TGFβ contribui para o comprometimento da biologia do tecido adiposo e o desenvolvimento da fibrose. / Aim of the study was to investigate tissue remodelling and factors modulated by TGFβ pathway in the subcutaneous adipose tissue in gastrointestinal cancer cachexia. The study included 59 patients enrolled into three groups: Control, Weight-stable Cancer (WSC) and Cancer Cachexia (CC). Morphological alterations (HE) were observed in adipose tissue from CC group solely, with reduction in the content of fat cells (area, diameter and circumference). Markedly stain to collagens type I, III, IV and fibronectin by immunohistochemistry revealed changes in the CC group as compared to the control and WSC group. Presence of myofibroblasts in CC group was observed by immunostaining for αSMA, and 20-fold increase of the FSP1 gene in adipose tissue. In association, was reported higher expression for vimentin in isolated fibroblasts. TGFβ3 concentrations were enhanced in adipose tissue, and TGFβ1 and TGFβ3 in adipocytes of cachectic patients in relation to control group. Immunolocalization revealed greater intensity for SMAD3 and SMAD4 in the CC group. Thus, during cancer cachexia the TGFβ pathway contributes to disruption of adipose tissue biology and fibrosis development.

Introdução e objetivos: β-glicosidases da família GH1 das glicosil-hidrolases possuem um dobramento do tipo barril (β/α)8. Propõe-se que proteínas com este dobramento, que usualmente classificam-se como tendo um único domínio, na verdade são compostas por dois domínios, cada um deles correspondendo a um \"meio barril\" (β/α)4. Assim, as proteínas com dobramento barril (β/α)8 seriam provenientes de uma duplicação e fusão gênica de um ancestral \"meio barril\" (β/α)4. O objetivo geral deste projeto é investigar a existência de dois domínios (β/α)4, as metades N- e C-terminal, na estrutura (β/α)8 barril da β-glicosidase A de Thermotoga maritima (bglTm) e β-glicosidase B de Paenibacillus polymyxa (bglB) por meio de análise da desnaturação térmica e química dessas enzimas. Resultados: Para atingir esse objetivo foram introduzidas mutações que rompem contatos não covalentes entre os supostos domínios destas β-glicosidases. Os segmentos de DNA que codificam as enzimas selvagem e mutantes foram clonados em plasmídeo de expressão pLATE51 e as enzimas recombinantes expressas em Escherichia coli BL21(DE3). Foram purificadas com sucesso as enzimas selvagens e duas mutantes de bglTm, denominadas T1 e T2, que possuem 2 e 4 mutações respectivamente em resíduos na interface inter-metades. Para confirmar o enovelamento destas proteínas recombinantes foi empregada a análise de estruturas secundárias por dicroísmo circular, também o espectro de fluorescência intrínseca de triptofano e sua supressão por acrilamida e finalmente foram determinados parâmetros cinéticos. Observou-se que não houve mudanças significativas na exposição dos triptofanos das proteínas recombinantes, sugerindo que se encontram enoveladas, o que está de acordo com a observação de que as proteínas recombinantes mantêm sua atividade catalítica. Já pela análise de dicroísmo circular concluiu-se que a mutante T1 possui dobramento semelhante à selvagem bglTm e que T2 apresenta diferenças significativas, sendo as porcentagens de α-hélice de 21%, 22% e 10% para bglTm, T1 e T2, respectivamente. Em seguida demonstrou-se que T1 mantém a termo estabilidade semelhante à selvagem, enquanto que T2 tem termo estabilidade reduzida, apresentando kobs de 0,3 min-1 em 80°C e de 0,06 min-1 em 75 °C.. O cálculo de Tm através de Differential Scanning Fluorimetry foi feito para bglB e T2 (42 e 81.7 °C respectivamente), enquanto que bglTm e T1 mantiveram-se estáveis na faixa de temperatura analisada (até 95°C). Na análise do efeito da temperatura sobre a estrutura das mutantes T1 e T2 não se observou nenhuma evidência da presença dos dois supostos domínios (β/α)4. A análise da desnaturação por cloreto de guanidina mostrou que o c50 diminuiu para T2 (2,4 M), mas não mostrou alteração para T1 (4,5 M) em comparação à bglTm (4,3 M). Coerentemente, a estabilidade da enzima selvagem e de T1 na ausência de desnaturante é a mesma (ΔGH2O = 5,2 kcal/mol), mas se reduziu para a T2 (ΔGH2O = 3,5 kcal/mol). Os cálculos do parâmetro m mostraram uma cooperatividade semelhante na desnaturação de bglTm, T1 e T2, não evidenciando independência entre os dois supostos domínios (β/α)4. Em conclusão, a análise estabilidade da β-glicosidase bglTm frente à temperatura e ao cloreto de guanidina não revelaram a presença dos domínios (β/α)4 que correspondem às metades N- e C-terminal desta β-glicosidase. / Introduction and Aims: β-glucosidases from the family GH1 of the glycosil-hidrolases presents a (β/α)8 barrel folding. These proteins are usually classified as single domain, however it has been alternatively proposed that they actually are formed by two \"half barrel\" (β/α)4. Thus, (β/α)8 barrel proteins had evolved from an \"half barrel\" ancestor that underwent a duplication-fusion event. The general goal of this project is the search for the two putative (β/α)4 domains, which form the N- and C-terminal ends of the β-glucosidase A from Thermotoga maritima (bglTm) and β-glucosidase B from Paenibacillus polymyxa (bglB), detecting their presence through the thermal and chemical stability of these (β/α)8 barrel proteins. Results: Site-directed mutagenesis was employed to replace residues forming non-covalent interaction between the putative (β/α)4 domains. DNA segments coding for bglB, bglTm and mutant bglTm were cloned into the pLATE51 expression vector and produced as recombinant proteins in E. coli BL21(DE3). The bglB, bglTm and two mutant bglTm, hereafter called T1 and T2, with 2 and 4 mutations respectively on residues in the interface between the protein halves, were purified. They were stable folded as shown by detecting their catalytic activity upon two different substrates and also by circular dichroism (CD) and tryptophan fluorescence analysis. Nevertheless, T2 showed a decrease in the α-helix content (10 %) in the CD analysis, whereas bglTm and T1 are similar (22 %). The wild-type bglTm and T1 are thermostable, whereas T2 was inactivated after pre-incubation at high temperature (kobs = 0,3 min-1 at 80 °C and 0,06 min-1 at 75 °C). The Differential Scanning Fluorimetry experiments revealed Tm of 42 e 81.7 °C for bglB and T2, respectively, whereas wild-type bglTm and mutant T1 did not showed any thermal transition up to 95 °C. Indeed, the analysis of the thermal stability of T1 and T2 did not reveal any evidence of the putative (β/α)4 domains. Following that, the analysis of the protein denaturation by guanidine hydrochloride showed that the c50 for T2 was reduced (2.4 M), whereas no modification was observed for bglTm and T1 (4,3 and 4,5 M, respectively). In agreement the stability of bglTm and T1 (ΔGH2O = 5,2 kcal/mol) is similar, but it was reduced for T2 (ΔGH2O = 3,5 kcal/mol). The m parameter showed a similar cooperative denaturation for wild-type bglTm and mutants T1 and T2, but no evidence of the independent unfolding of the putative (β/α)4 domains was found. Conclusion: In conclusion, the analysis of the thermal and chemical stability of the bglTm did not reveal the presence of the putative (β/α)4 domains that form the N- and C-terminal end of these β-glucosidase.

Embora já tenha sido comprovada a ação adjuvante da SBA-15, pouco se sabe sobre o seu mecanismo molecular que leva a modulação positiva da resposta imunológica. Foi avaliada a ativação do inflamassoma NLRP3, sobre estímulos de SBA-15, em macrófagos de camundongos C57BL/6. Como parâmetro dessa ativação, foi analisada a produção de IL-1β por ELISA. A SBA-15 foi capaz de induzir a produção de IL-1β a níveis semelhantes quando comparado com um agonista de NLRP3 (Nano-SiO2), sugerindo a ativação do inflamassoma. Para avaliar o envolvimento da caspase-1, nos resultados obtidos com a SBA-15, os macrófagos foram estimulados com sílica na presença do inibidor de caspase-1, e como esperado, a produção de IL-1β foi restaurada para o seu nível basal. A ativação do inflamassoma, por estímulos da SBA-15, parece ser parcialmente dependente da fagocitose e da produção das espécies reativas do oxigênio. Além disso, foi visto que a SBA-15 não induz a produção de IL-6, confirmando que essa sílica está envolvida na via do inflamassoma e não em outras vias, como por exemplo, NF-κB. / Although it has already been proven adjuvant action of SBA-15, little is known about its molecular mechanism leading to positive modulation of the immune response. NLRP3 inflammasome activation was evaluated on SBA-15 stimulation in C57BL/6 mice macrophages. As this parameter activation, it analyzed the production of IL-1β by ELISA. The SBA-15 was able to induce the production of IL-1β at levels similar when compared to an agonist of NLRP3 (Nano-SiO2), suggesting the activation of the inflammasome. To assess the involvement of caspase-1, the results obtained with SBA-15, the macrophages were stimulated with silica in the presence of caspase-1 inhibitor, and as expected, IL-1β production was restored to its baseline level. Activation of the inflammasome, by stimuli of SBA-15, appears to be partly dependent on phagocytosis and production of reactive oxygen species. In addition, it was seen that the SBA-15 does not induce IL-6 production, confirming that silica is involved inflammasome the path of and not in other ways, eg, NF-κB.

Made available in DSpace on 2014-07-29T15:12:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao Fernanda Dias Silva.pdf: 112667 bytes, checksum: 9ef746769100aea66ac5ebc1d67874c6 (MD5) Previous issue date: 2006-03-17 / The production of industrial foods derived from tomato generates high levels of rejects that are composed basically of seeds and tomato peels. This reject it is rich in carotenoids, especially lycopene and β-carotene, which are pigments whose ingestion is directly linked to the decrease of the risk of chronic-degenerative diseases. The present study has as objective develops simplified and efficient extraction and analysis methods of lycopene and β-carotene starting from this reject using palm oil as coadjutant, seeking the subsequent use of this extract for enrichment of products of easy access to classes economically inferior of the population and as a vehicle of medicines. Initially it was developed the chromatographic analysis method for three columns of RP-HPLC: C18 Chromolith SpeedROD (50 mm x 4,6 mm), C18 Nova-Pack (300 mm x 3,9 mm x 4 µm) and C30 YMC Carotenoid (250 mm x 4,6 mm x 5 µm). All the columns present a considerable reduction in the time of analysis and efficient separation between lycopene and β-carotene, when compared to the analysis reported on scientific literature. Later it was done a study of the thermal stability of the pigments by means of TG, DSC and RP-HPLC seeking to evaluate the maximum temperature which the reject can be heated without the occurrence of considerable losses of the pigments. The thermogravimetric curves demonstrated that the loss of mass happens to temperatures higher than those observed by the degradations of the pigments by RP-HPLC. It means that occurs the transformation of lycopene and β-carotene in intermediary compounds which are volatilized in higher temperatures. For the development of the extraction method several variables were tested being obtained the following optimized condition: 25 g of sample was dissolved in 50 mL of hexane and 0.1 mL of palm oil, shaking by 90 minutes under 50ºC. The proposed method demonstrated to be viable once it happens in only one stage, with the use of only an solvent which can be used again after the process. The time of extraction is completely acceptable, as well as the amount of solvent used, being all the parameters compatible with industrial implementation. The oily extract was still characterized with regard to the tocopherols and tocotrienols levels in the palm oil as well as the fatty acid and triacylglicerol compositions. It was obtained the prevalence of y-tocotrienol, oleic and palmitic acids and POO and POP triacylglicerides. / A produção de alimentos industriais derivados do tomate gera elevados níveis de rejeitos que são compostos basicamente de sementes e cascas de tomate. Este rejeito é extramente rico em carotenóides, especialmente licopeno e β-caroteno, pigmentos cuja ingestão está diretamente ligada à diminuição do risco de doenças crônico-degenerativas. O presente estudo tem como objetivo desenvolver métodos de extração e análise simplificados e eficientes de licopeno e β-caroteno a partir deste rejeito utilizando azeite de dendê como coadjuvante, visando a posterior utilização deste extrato para enriquecimento de produtos de fácil acesso ás camadas economicamente inferiores da população e como veículo de medicamentos. Inicialmente, foi desenvolvido o método cromatográfico de análise para três colunas de RP-HPLC: C18 Chromolith SpeedROD (50 mm x 4,6 mm), C18 Nova-Pack (300 mm x 3,9 mm x 4 µm) e C30 YMC Carotenoid (250 mm x 4,6 mm x 5 µm). Todas as colunas apresentaram uma redução considerável no tempo de análise e eficiente separação entre licopeno e β-caroteno, quando comparadas as análises publicadas na literatura científica. Posteriormente, foi realizado um estudo da estabilidade térmica dos pigmentos através de TG, DSC e RP-HPLC visando avaliar a máxima temperatura na qual o rejeito pode ser aquecido sem que ocorram perdas consideráveis de pigmentos. As curvas termogravimétricas demonstraram que o inicio da perda de massa ocorre à temperaturas muito superiores aquelas observadas para a degradação dos pigmentos via RP-HPLC. Isso significa que ocorre a transformação do licopeno e β-caroteno em compostos intermediários que serão volatilizados somente em temperaturas superiores. Para o desenvolvimento do método de extração foram testadas diversas variáveis sendo obtida a seguinte condição otimizada: 12,5 g de amostra solubilizada em 25 mL de hexano e 0,1 mL de azeite de dendê, com agitação de 90 minutos à 50ºC. O método proposto demonstrou ser viável uma vez que ocorre em uma única etapa, e com a utilização de um único solvente passível de reutilização após o processo. O tempo de extração é completamente aceitável, assim como a quantidade de solvente utilizada, sendo todos os parâmetros compatíveis com a implementação industrial. O extrato oleoso foi ainda caracterizado com respeito aos teores de tocoferóis e tocotrienóis no azeite de dendê, bem como sua composição em ácidos graxos e triacilglicerídeos. Obteve-se o predomínio de y-tocotrienol, ácidos oléico (O) e palmítico (P) e triacilglicerídeos POO e POP.

Nesta monografia foram desenvolvidas metodologias sintéticas para a funcionalização das 2-(S)-isopropil-5-iodo-pirimidinonas, utilizando a reação de acoplamento cruzado de Suzuki-Miyaura e a reação de cicloadição azida-acetileno com cobre, através de estratégias simples e eficientes que permitiram a preparação de uma série de compostos com grande diversidade estrutural. Inicialmente descreve-se a síntese da 2-(S)-isopropil-5-iodo-pirimidinona (S)- 3, a partir da (S)-asparagina enantiomericamente pura 1, um aminoácido barato e de fácil acesso, produzindo na primeira etapa o 2-(S)-isopropil-peridropirimidinona-6- ácido carboxílico (2S,6S)-2, que reagindo com diacetoxiiodo benzeno/iodo e BF3.OEt2, gera a pirimidinona (S)-3. Em seguida, preparou-se uma série de 2-(S)-isopropil-5-aril-pirimidinonas (S)- 6a-q e 2-(S)-isopropil-5-alquinil-pirimidinonas (S)-7a-q, através da reação de acoplamento cruzado de Suzuki-Miyaura, sob catálise de paládio, utilizando aril- (4aq) e alquiniltrifluoroboratos de potássio (5a-q), respectivamente. Desta forma sintetizou-se uma variedade de pirimidinonas com alterações programadas de substituintes na posição 5 do anel, com rendimentos de 15% a 95%. Ainda a fim de obter algumas pirimidinonas com substituintes acetilênicos alquílicos 9a-f, utilizou-se a metodologia de acoplamento de Sonogashira. Em todos os casos obtiveram-se bons rendimentos. Dando sequência ao projeto, sintetizou-se as 2-(S)-isopropil-pirimidinonas funcionalizadas na posição C5 com anéis triazólicos substituídos na posição N1 (S)- 11a-k, através da reação de cicloadição azida-acetileno utilizando CuI como fonte de cobre e ondas ultra-sônicas como fonte de energia. Preparou-se diversos compostos, todos com rendimentos variando de 79% a 87% em 5 minutos de reação. Por último, através da redução da dupla ligação endocíclica dos compostos (S)-6a, 6b, 6g, 6l e 6n e posterior hidrólise utilizando radiação microondas proporcionou a obtenção de α-aril β-aminoácidos altamente enantioenriquecidos. / This monograph shows the development of a synthetic methodology for the functionalization of 2-(S)-isopropyl-5-iodo-pyrimidinones using either Suzuki-Miyaura cross-coupling reactions or cycloaddition reactions of azide-acetylenes with copper, through a simple and efficient pathway enabling the preparation of a series of structurally diverse compounds. This paper begins by describing the synthesis of 2-(S)-isopropyl-5-iodopyrimidinones (S)-3, from enantiomerically pure (S)-asparagine 1. This inexpensive and readily available amino acid forms 2-(S)-isopropyl-perhidropyrimidinone-6- carboxylic acid (2S, 6S)-2, which is reacted with DIB / iodine and BF3·OEt2 to form pyrimidinone (S)-3. Using palladium-catalyzed Suzuki-Miyaura cross-coupling reactions, a series of 2-(S)-isopropyl-5-arylpyrimidinones (S)-6a-q and 2-(S)-isopropyl-5- alkynylpyrimidinones (S)-7a-q were prepared using potassium aryl- (4a-q) and alkynyltrifluoroborates (5a-q), respectively. With this reaction, a variety of pyrimidinones with different substituents at position 5 of the ring were synthesized, with yields ranging from 15% to 95%. The Sonogashira coupling reaction was used to prepare pyrimidinones with alkyl acetylenic substituents (S)-9a-f, giving good yields in all cases. 2-(S)-Isopropylpyrimidinones were then functionalized in the C5 position with N1 (S)-11a-k substituted triazole rings. These functionalizations were performed by the cycloaddition of azide-acetylenes using CuI and ultrasonic waves, which provided enough energy to reduce the reaction time to only five minutes. Several different variations of this compound were prepared, all with yields between 78% and 87%. Finally, the endocyclic double bonds in compounds (S)-6a, 6b, 6g, 6l and 6n were reduced, followed by a hydrolysis using microwave radiation to afford the highly enantioenriched α-aryl β-amino acids.