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Elaboração e caracterização de biomateriais granulados microporosos de fosfatos de cálcio: teste in vivo em ovinos / Elaboration and synthesis of granulates biomaterials of calcium phosphates: in vivo test in sheepDalmonico, Gisele Maria Leite 20 November 2015 (has links)
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Previous issue date: 2015-11-20 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Treatments for bone loss are research topics and involve different areas of scientific knowledge, engineering, physics, chemistry, biology and biomedicine. The biomaterials that stand out as replacement in bone structure treatments are hydroxyapatite, β and α calcium phosphate, biphasic hydroxyapatite/calcium phosphate β and α and hydroxyapatite matrix nanocomposite biomaterials. These biomaterials stand out as bone substitutes because they present a crystallography similar to that of human skeleton bone apatite, being bioactive and biocompatible. Nanostructured biphasic bioceramics are researched and show potential to be bone substitutes in surgical repairing procedures and reconstruction of bone tissue. This project was developed based on research of biomaterials of calcium phosphates, involving the synthesis of two matrices of calcium phosphates: β-calcium phosphate (β-TCP) and hydroxyapatite (HA) and the preparation of microporous granular biomaterials of β-TCP, HA and biphasic compositions HA/β-TCP. All biomaterials were characterized by different techniques: X-ray diffraction, infrared spectroscopy in Fourier transform (FTIR), Raman spectroscopy, specific surface area for BET, particle size by laser diffraction, density of helium pictometria, porosimetry mercury and hydrostatic porosity by Arthur, differential scanning calorimetry, dilatometry, scanning electron microscopy, atomic force microscopy, confocal microscopy, optical microscopy, polarized light microscopy. The interest of this research was to evaluate the performance of biomaterials in in vivo tests for the time periods of 90 and 180 days, in relation to osseointegration and the formation of neoformed bone tissue and determine which biomaterials presented potential as bone replacement for biomedical applications. The results found are encouraging and demonstrate that the granulated microporous biomaterials of calcium phosphate proves to be ability to repair and bone reconstruction for the two test times in vivo evaluated, revealing the osseointegration and bone formation similar between the compositions. / Os tratamentos de perdas ósseas são temas de pesquisa que envolve diferentes áreas do conhecimento científico, engenharia, física, química, biologia e biomédica. Os biomateriais que se destacam como substitutos em tratamentos da estrutura óssea são a hidroxiapatita, os fosfatos de cálcio-β e α, os bifásicos hidroxiapatita/fosfato de cálcio-β, α e os biomateriais nanocompósitos de matriz hidroxiapatita. O destaque destes biomateriais como substitutos ósseos, se deve, por apresentarem cristalografia similar à da apatita óssea do esqueleto humano, por serem bioativos e biocompatíveis. As biocerâmicas bifásicas nanoestruturadas são pesquisadas e demonstram ser promissoras como substitutos ósseos em procedimentos cirúrgicos de reparação e reconstrução do tecido ósseo. Este projeto se desenvolveu com base na investigação de biomateriais de fosfatos de cálcio, envolvendo a síntese de duas matrizes de fosfatos de cálcio: Fosfato de cálcio-β (TCP-β) e hidroxiapatita (HA) e elaboração de biomateriais granulados microporosos de TCP-β, HA e bifásicos HA/TCP-β. Todos os biomateriais granulados foram caracterizados por diferentes técnicas: difratometria de raios X, espectroscopia de infravermelho por transformada de Fourier (FTIR), espectroscopia Raman, área superficial específica por BET, tamanho de partícula por difração a laser, densidade por pictometria de hélio, porosimetria de mercúrio e hidrostática com método de Arthur. Com relação ao comportamento térmico utilizou-se a calorimetria exploratória diferencial, dilatometria. A caracterização microestrutural foi realizada com a microscopia eletrônica de varredura, microscopia de força atômica, microscopia confocal, microscopia óptica, microscopia de luz polarizada. Esse projeto de pesquisa envolveu a elaboração de biomateriais granulados microporosos de fosfatos de cálcio, o interesse foi avaliar o desempenho destes em teste in vivo, para os tempos de 90 e 180 dias em tíbia de ovinos, em relação ao desempenho dos mesmos sobre a osseointegração e a neoformação do novo tecido ósseo. Os resultados encontrados são animadores e demonstram que todas as composições de biomateriais granulados microporos de fosfatos de cálcio, demonstraram capacidade de reparação e reconstrução óssea para os dois tempos de teste in vivo avaliados, revelando a osseointegração e a neoformação óssea semelhante entre as composições.
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Estudo sobre a ocorrência de enterobactérias produtoras de ESBL isoladas de pacientes internados em unidades de pós-operatório de cirurgia cardíaca de um hospital da rede pública do Rio de Janeiro / Study on the occurrence of ESBL-producing enterobacteria isolated from post-surgery and cardiac surgery patients from a Rio de Janeiro public hospitalMárcia Regina Guimarães Vasques 23 June 2009 (has links)
As infecções associadas aos cuidados de saúde constituem um problema grave nas unidades hospitalares bem como nos serviços de atendimento extra-hospitalares. Diferentemente de outros países, no Brasil, existe uma incidência alta dessas infecções causadas por microorganismos Gram-negativos produtores de β-lactamase de espectroestendido (ESBL). Estas enzimas hidrolisam compostos β-lactâmicos e são consideradas mundialmente como de importância clínica, pois a localização de seus genes emelementos móveis facilitam a transmissão cruzada. Este estudo foi realizado com
amostras bacterianas isoladas de material clínico e de fezes de pacientes internados em um hospital da rede pública no Rio de Janeiro, Brasil. Estes pacientes estavam internados
em duas unidades de terapia intensiva cardiológica, no período de janeiro a dezembro de 2007. O estudo teve por objetivo realizar a caracterização fenotípica e genotípica desses isolados associados à colonização ou infecção dos pacientes. Os testes fenotípicos e genotípicos foram realizados na Universidade do Estado do Rio de Janeiro e incluíram provas bioquímicas, teste de susceptibilidade, teste confirmatório para a expressão da produção da enzima ESBL e Reação de Polimerase em Cadeia (PCR) com iniciadores
específicos para cinco genes: blaTEM, blaSHV, CTX-M1, Toho1 e AmpC. As espécies bactérianas mais frequentemente isoladas foram Escherichia coli (25%) e Klebsiella
pneumoniae (30,56%), e os genes mais prevalentes foram blaTEM (41,6%), AMPC (41,6%) blaSHV (33,3%), CTX-M1 (25%), e Toho1 (19,44%). Identificamos em 25% das
amostras enterobactérias que não eram E. coli, K. pneumoniae ou Proteus sp, com fenótipo para ESBL e a expressão dos mesmos genes, confirmando a necessidade de
investigação nestes grupos microbianos. O substrato mais sensível para a expressão da área de sinergismo no Teste de Aproximação foi o ceftriaxone (80%). Identificamos também que 17% das amostras positivas para ESBL apresentaram co-produção para AmpC e 50% apresentaram mais de um gene para os iniciadores testados. A presença da
carbapenemase foi avaliada em amostras bacterianas com susceptibilidade intermediária para ertapenem, através do Teste de Hodge modificado. Os achados do presente estudo
caracterizaram a co-produção de AmpC e ESBL, bem como sugerem a necessidade da revisão e a ampliação dos métodos para a detecção de outros padrões de resistência na
nossa Instituição. / Healthcare-associated infections are a major problem in hospital units as well as in units outside hospital, where procedures are performed. In Brazil, differently from other countries, a large proportion of these infections are caused by extended spectrum beta-lactamase (ESBL) producing Gram-negative microorganisms. These enzymes, which hydrolyse β-lactams, are considered of clinical importance worldwide. Their localization in genes that are located in móbile structures facilitate cross infection. This study was performed with bacterial isolates found in clinical specimens and faeces of patients hospitalized in a public hospital in the city of Rio de Janeiro, Brazil. These patients were in two different cardiological intensive care units from January till December 2007. The goal of the study was the phenotypic and genotypic characterization of the bacterial isolates which were associated with colonization or infection. Phenotypic and genotypic tests were performed in Universidade do Estado do Rio de Janeiro (Rio de Janeiro State University) and included biochemical tests, susceptibility tests, a comfirmatory test for the expression of ESBL, and polymerase chain reaction (PCR) with specific primers for five gentes : blaTEM, blaSHV, CTX-M1, Toho1 and AmpC. The most frequently isolated bactéria were Escherichia coli (25%) and Klebsiella pneumoniae (30,56%), and the most prevalent genes were blaTEM (41,6%), AMPC (41,6%) blaSHV (33,3%), CTX-M1 (25%), and Toho1 (19,44%). In 25% of samples we identified enterobacteria that were not E. coli, K. pneumoniae oor Proteus spp, but with the ESBL phenotype and the expression of the same genes, suggesting these microbes needed investigating. The most sensitive substrate for expressing synergism in the double-disk diffusion test was ceftriaxone (80%). We also identified that 17% of ESBL positive isolates showed co-production of AmpC and 50% showed more than one gene tested by PCR. The presence of carbapenemase was studied in bacterial isolates with intermediate susceptibility to ertapenem, by a modified Hodge test. The findings in the present study characterize the co-production of AmpC and ESBL, and suggest the need for reviewing detection methods used and possibly using other methods for the detection of other resistance patterns in our Institution.
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Estudo para viabilização da cementação gasosa através da dissociação do etanol diluído com gás nitrogênio / Viability study of carburizing dissociation of ethanol diluted in nitrogenLuiz Paulo Cadiolli 02 April 1998 (has links)
Devido a necessidade de redução do consumo dos derivados de petróleo, faz-se necessária a procura da substituição destes por outras fontes viáveis no processo de cementação. Este trabalho apresenta um estudo para viabilização da cementação gasosa através da dissociação do álcool etílico diluído com gás nitrogênio. Foram feitos estudos termodinâmicos, com base em análise química das amostras dos gases retiradas do forno, analisados por um infra vermelho. Com análise dos gases CO, CO2, CH4 pode-se determinar as atividades do carbono nos gases (ag) e o coeficiente de velocidade de transporte de carbono da atmosfera para a superfície metálica (β), nas temperaturas de 870ºC, 900ºC, 930ºC, sendo que as atmosferas cementantes nestas temperaturas foram diluídas com diferentes porcentagens de gás nitrogênio. Com os resultados foi possível concluir que as diluições não interferiram no potencial de carbono, mas foi a grande responsável na diminuição no tamanho das camadas cementadas. / Nowadays, due to the need of reduction of the consume of petroleum derivative products, the substitution of these products for others sources is really necessary. This work presents a viability study of carburizing dissociation of ethanol diluted in nitrogen study gas. Thermodynamics studies were carried out with chemical analysis of gas samples from furnace using infrared analyser. CO, CO2 and CH4 gas analysis were used to determine the gas carbon activity (ag) and the carbon coefficient of transport velocity from atmosphere to the metallic surface (β), for the temperature of 870°C, 900°C and 930°C. The carbuzing atmosphere for these temperatures were diluted with different percentages of nitrogen gas. With carbon potential, but it was the mean responsible for the size reduction of case carburized.
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Caquexia associada ao câncer: a contribuição da via de sinalização do TGFβ na fibrose do tecido adiposo. / Cancer cachexia: TGFβ pathway contribution in adipose tissue fibrosis.Michele Joana Alves 13 July 2016 (has links)
O objetivo do estudo foi investigar o remodelamento tecidual e fatores modulados pela via do TGFβ no tecido adiposo subcutâneo na vigência da caquexia associada ao câncer gastrointestinal. O estudo incluiu 59 pacientes divididos em três grupos: Controle, Câncer de peso estável (WSC) e Câncer e Caquexia (CC). Foram observadas alterações morfológicas exclusivas ao tecido adiposo do grupo CC. Houve o aumento na deposição de colágeno, glicoproteínas associadas, e fibras do sistema elásticas. A imunohistoquímica revelou alterações no conteúdo dos colágenos do tipo I, III e VI, e da fibronectina no grupo CC em relação ao grupo Controle e WSC. A presença de miofibroblastos no grupo CC foi confirmada pela imunomarcação para αSMA, e o aumento de 20 vezes do gene FSP1 no tecido adiposo, em associação com expressiva marcação de vimentina em fibroblastos isolados. As concentrações do TGFβ3 estavam aumentadas no tecido adiposo, e TGFβ1 e TGFβ3 nos adipócitos, dos pacientes caquéticos. A imunolocalização revelou maior intensidade para SMAD3 e SMAD4 no grupo CC. Em conclusão, na caquexia associada ao câncer, a via do TGFβ contribui para o comprometimento da biologia do tecido adiposo e o desenvolvimento da fibrose. / Aim of the study was to investigate tissue remodelling and factors modulated by TGFβ pathway in the subcutaneous adipose tissue in gastrointestinal cancer cachexia. The study included 59 patients enrolled into three groups: Control, Weight-stable Cancer (WSC) and Cancer Cachexia (CC). Morphological alterations (HE) were observed in adipose tissue from CC group solely, with reduction in the content of fat cells (area, diameter and circumference). Markedly stain to collagens type I, III, IV and fibronectin by immunohistochemistry revealed changes in the CC group as compared to the control and WSC group. Presence of myofibroblasts in CC group was observed by immunostaining for αSMA, and 20-fold increase of the FSP1 gene in adipose tissue. In association, was reported higher expression for vimentin in isolated fibroblasts. TGFβ3 concentrations were enhanced in adipose tissue, and TGFβ1 and TGFβ3 in adipocytes of cachectic patients in relation to control group. Immunolocalization revealed greater intensity for SMAD3 and SMAD4 in the CC group. Thus, during cancer cachexia the TGFβ pathway contributes to disruption of adipose tissue biology and fibrosis development.
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Identificação de domínios em β-glicosidases GH1 através da análise de sua estabilidade / Domains identification on GH1 β-glucosidases through stability analysisVitor Medeiros Almeida 14 June 2016 (has links)
Introdução e objetivos: β-glicosidases da família GH1 das glicosil-hidrolases possuem um dobramento do tipo barril (β/α)8. Propõe-se que proteínas com este dobramento, que usualmente classificam-se como tendo um único domínio, na verdade são compostas por dois domínios, cada um deles correspondendo a um \"meio barril\" (β/α)4. Assim, as proteínas com dobramento barril (β/α)8 seriam provenientes de uma duplicação e fusão gênica de um ancestral \"meio barril\" (β/α)4. O objetivo geral deste projeto é investigar a existência de dois domínios (β/α)4, as metades N- e C-terminal, na estrutura (β/α)8 barril da β-glicosidase A de Thermotoga maritima (bglTm) e β-glicosidase B de Paenibacillus polymyxa (bglB) por meio de análise da desnaturação térmica e química dessas enzimas. Resultados: Para atingir esse objetivo foram introduzidas mutações que rompem contatos não covalentes entre os supostos domínios destas β-glicosidases. Os segmentos de DNA que codificam as enzimas selvagem e mutantes foram clonados em plasmídeo de expressão pLATE51 e as enzimas recombinantes expressas em Escherichia coli BL21(DE3). Foram purificadas com sucesso as enzimas selvagens e duas mutantes de bglTm, denominadas T1 e T2, que possuem 2 e 4 mutações respectivamente em resíduos na interface inter-metades. Para confirmar o enovelamento destas proteínas recombinantes foi empregada a análise de estruturas secundárias por dicroísmo circular, também o espectro de fluorescência intrínseca de triptofano e sua supressão por acrilamida e finalmente foram determinados parâmetros cinéticos. Observou-se que não houve mudanças significativas na exposição dos triptofanos das proteínas recombinantes, sugerindo que se encontram enoveladas, o que está de acordo com a observação de que as proteínas recombinantes mantêm sua atividade catalítica. Já pela análise de dicroísmo circular concluiu-se que a mutante T1 possui dobramento semelhante à selvagem bglTm e que T2 apresenta diferenças significativas, sendo as porcentagens de α-hélice de 21%, 22% e 10% para bglTm, T1 e T2, respectivamente. Em seguida demonstrou-se que T1 mantém a termo estabilidade semelhante à selvagem, enquanto que T2 tem termo estabilidade reduzida, apresentando kobs de 0,3 min-1 em 80°C e de 0,06 min-1 em 75 °C.. O cálculo de Tm através de Differential Scanning Fluorimetry foi feito para bglB e T2 (42 e 81.7 °C respectivamente), enquanto que bglTm e T1 mantiveram-se estáveis na faixa de temperatura analisada (até 95°C). Na análise do efeito da temperatura sobre a estrutura das mutantes T1 e T2 não se observou nenhuma evidência da presença dos dois supostos domínios (β/α)4. A análise da desnaturação por cloreto de guanidina mostrou que o c50 diminuiu para T2 (2,4 M), mas não mostrou alteração para T1 (4,5 M) em comparação à bglTm (4,3 M). Coerentemente, a estabilidade da enzima selvagem e de T1 na ausência de desnaturante é a mesma (ΔGH2O = 5,2 kcal/mol), mas se reduziu para a T2 (ΔGH2O = 3,5 kcal/mol). Os cálculos do parâmetro m mostraram uma cooperatividade semelhante na desnaturação de bglTm, T1 e T2, não evidenciando independência entre os dois supostos domínios (β/α)4. Em conclusão, a análise estabilidade da β-glicosidase bglTm frente à temperatura e ao cloreto de guanidina não revelaram a presença dos domínios (β/α)4 que correspondem às metades N- e C-terminal desta β-glicosidase. / Introduction and Aims: β-glucosidases from the family GH1 of the glycosil-hidrolases presents a (β/α)8 barrel folding. These proteins are usually classified as single domain, however it has been alternatively proposed that they actually are formed by two \"half barrel\" (β/α)4. Thus, (β/α)8 barrel proteins had evolved from an \"half barrel\" ancestor that underwent a duplication-fusion event. The general goal of this project is the search for the two putative (β/α)4 domains, which form the N- and C-terminal ends of the β-glucosidase A from Thermotoga maritima (bglTm) and β-glucosidase B from Paenibacillus polymyxa (bglB), detecting their presence through the thermal and chemical stability of these (β/α)8 barrel proteins. Results: Site-directed mutagenesis was employed to replace residues forming non-covalent interaction between the putative (β/α)4 domains. DNA segments coding for bglB, bglTm and mutant bglTm were cloned into the pLATE51 expression vector and produced as recombinant proteins in E. coli BL21(DE3). The bglB, bglTm and two mutant bglTm, hereafter called T1 and T2, with 2 and 4 mutations respectively on residues in the interface between the protein halves, were purified. They were stable folded as shown by detecting their catalytic activity upon two different substrates and also by circular dichroism (CD) and tryptophan fluorescence analysis. Nevertheless, T2 showed a decrease in the α-helix content (10 %) in the CD analysis, whereas bglTm and T1 are similar (22 %). The wild-type bglTm and T1 are thermostable, whereas T2 was inactivated after pre-incubation at high temperature (kobs = 0,3 min-1 at 80 °C and 0,06 min-1 at 75 °C). The Differential Scanning Fluorimetry experiments revealed Tm of 42 e 81.7 °C for bglB and T2, respectively, whereas wild-type bglTm and mutant T1 did not showed any thermal transition up to 95 °C. Indeed, the analysis of the thermal stability of T1 and T2 did not reveal any evidence of the putative (β/α)4 domains. Following that, the analysis of the protein denaturation by guanidine hydrochloride showed that the c50 for T2 was reduced (2.4 M), whereas no modification was observed for bglTm and T1 (4,3 and 4,5 M, respectively). In agreement the stability of bglTm and T1 (ΔGH2O = 5,2 kcal/mol) is similar, but it was reduced for T2 (ΔGH2O = 3,5 kcal/mol). The m parameter showed a similar cooperative denaturation for wild-type bglTm and mutants T1 and T2, but no evidence of the independent unfolding of the putative (β/α)4 domains was found. Conclusion: In conclusion, the analysis of the thermal and chemical stability of the bglTm did not reveal the presence of the putative (β/α)4 domains that form the N- and C-terminal end of these β-glucosidase.
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O papel da sílica mesoporosa nanoestruturada SBA-15 na ativação do inflamassoma NLRP3. / The role of nanostructured mesoporous silica SBA-15 in the nlrp3 inflammasome activation.Joel José Megale Gabrili 24 March 2016 (has links)
Embora já tenha sido comprovada a ação adjuvante da SBA-15, pouco se sabe sobre o seu mecanismo molecular que leva a modulação positiva da resposta imunológica. Foi avaliada a ativação do inflamassoma NLRP3, sobre estímulos de SBA-15, em macrófagos de camundongos C57BL/6. Como parâmetro dessa ativação, foi analisada a produção de IL-1β por ELISA. A SBA-15 foi capaz de induzir a produção de IL-1β a níveis semelhantes quando comparado com um agonista de NLRP3 (Nano-SiO2), sugerindo a ativação do inflamassoma. Para avaliar o envolvimento da caspase-1, nos resultados obtidos com a SBA-15, os macrófagos foram estimulados com sílica na presença do inibidor de caspase-1, e como esperado, a produção de IL-1β foi restaurada para o seu nível basal. A ativação do inflamassoma, por estímulos da SBA-15, parece ser parcialmente dependente da fagocitose e da produção das espécies reativas do oxigênio. Além disso, foi visto que a SBA-15 não induz a produção de IL-6, confirmando que essa sílica está envolvida na via do inflamassoma e não em outras vias, como por exemplo, NF-κB. / Although it has already been proven adjuvant action of SBA-15, little is known about its molecular mechanism leading to positive modulation of the immune response. NLRP3 inflammasome activation was evaluated on SBA-15 stimulation in C57BL/6 mice macrophages. As this parameter activation, it analyzed the production of IL-1β by ELISA. The SBA-15 was able to induce the production of IL-1β at levels similar when compared to an agonist of NLRP3 (Nano-SiO2), suggesting the activation of the inflammasome. To assess the involvement of caspase-1, the results obtained with SBA-15, the macrophages were stimulated with silica in the presence of caspase-1 inhibitor, and as expected, IL-1β production was restored to its baseline level. Activation of the inflammasome, by stimuli of SBA-15, appears to be partly dependent on phagocytosis and production of reactive oxygen species. In addition, it was seen that the SBA-15 does not induce IL-6 production, confirming that silica is involved inflammasome the path of and not in other ways, eg, NF-κB.
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Aproveitamento de rejeitos da indústria de atomatados para a produção e caracterização de extratos ricos em licopeno, β-Caroteno e Vitamina E / The use of waste tomato industry for production and characterization of rich extract in lycopene, β-Carotene e vitamin ESILVA, Fernanda Dias 17 March 2006 (has links)
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Previous issue date: 2006-03-17 / The production of industrial foods derived from tomato generates high levels of rejects that are composed basically of seeds and tomato peels. This reject it is rich in carotenoids, especially lycopene and β-carotene, which are pigments whose ingestion is directly linked to the decrease of the risk of chronic-degenerative diseases. The present study has as objective develops simplified and efficient extraction and analysis methods of lycopene and β-carotene starting from this reject using palm oil as coadjutant, seeking the subsequent use of this extract for enrichment of products of easy access to classes economically inferior of the population and as a vehicle of medicines. Initially it was developed the chromatographic analysis method for three columns of RP-HPLC: C18 Chromolith SpeedROD (50 mm x 4,6 mm), C18 Nova-Pack (300 mm x 3,9 mm x 4 µm) and C30 YMC Carotenoid (250 mm x 4,6 mm x 5 µm). All the columns present a considerable reduction in the time of analysis and efficient separation between lycopene and β-carotene, when compared to the analysis reported on scientific literature. Later it was done a study of the thermal stability of the pigments by means of TG, DSC and RP-HPLC seeking to evaluate the maximum temperature which the reject can be heated without the occurrence of considerable losses of the pigments. The thermogravimetric curves demonstrated that the loss of mass happens to temperatures higher than those observed by the degradations of the pigments by RP-HPLC. It means that occurs the transformation of lycopene and β-carotene in intermediary compounds which are volatilized in higher temperatures. For the development of the extraction method several variables were tested being obtained the following optimized condition: 25 g of sample was dissolved in 50 mL of hexane and 0.1 mL of palm oil, shaking by 90 minutes under 50ºC. The proposed method demonstrated to be viable once it happens in only one stage, with the use of only an solvent which can be used again after the process. The time of extraction is completely acceptable, as well as the amount of solvent used, being all the parameters compatible with industrial implementation. The oily extract was still characterized with regard to the tocopherols and tocotrienols levels in the palm oil as well as the fatty acid and triacylglicerol compositions. It was obtained the prevalence of y-tocotrienol, oleic and palmitic acids and POO and POP triacylglicerides. / A produção de alimentos industriais derivados do tomate gera elevados níveis de rejeitos que são compostos basicamente de sementes e cascas de tomate. Este rejeito é extramente rico em carotenóides, especialmente licopeno e β-caroteno, pigmentos cuja ingestão está diretamente ligada à diminuição do risco de doenças crônico-degenerativas. O presente estudo tem como objetivo desenvolver métodos de extração e análise simplificados e eficientes de licopeno e β-caroteno a partir deste rejeito utilizando azeite de dendê como coadjuvante, visando a posterior utilização deste extrato para enriquecimento de produtos de fácil acesso ás camadas economicamente inferiores da população e como veículo de medicamentos. Inicialmente, foi desenvolvido o método cromatográfico de análise para três colunas de RP-HPLC: C18 Chromolith SpeedROD (50 mm x 4,6 mm), C18 Nova-Pack (300 mm x 3,9 mm x 4 µm) e C30 YMC Carotenoid (250 mm x 4,6 mm x 5 µm). Todas as colunas apresentaram uma redução considerável no tempo de análise e eficiente separação entre licopeno e β-caroteno, quando comparadas as análises publicadas na literatura científica. Posteriormente, foi realizado um estudo da estabilidade térmica dos pigmentos através de TG, DSC e RP-HPLC visando avaliar a máxima temperatura na qual o rejeito pode ser aquecido sem que ocorram perdas consideráveis de pigmentos. As curvas termogravimétricas demonstraram que o inicio da perda de massa ocorre à temperaturas muito superiores aquelas observadas para a degradação dos pigmentos via RP-HPLC. Isso significa que ocorre a transformação do licopeno e β-caroteno em compostos intermediários que serão volatilizados somente em temperaturas superiores. Para o desenvolvimento do método de extração foram testadas diversas variáveis sendo obtida a seguinte condição otimizada: 12,5 g de amostra solubilizada em 25 mL de hexano e 0,1 mL de azeite de dendê, com agitação de 90 minutos à 50ºC. O método proposto demonstrou ser viável uma vez que ocorre em uma única etapa, e com a utilização de um único solvente passível de reutilização após o processo. O tempo de extração é completamente aceitável, assim como a quantidade de solvente utilizada, sendo todos os parâmetros compatíveis com a implementação industrial. O extrato oleoso foi ainda caracterizado com respeito aos teores de tocoferóis e tocotrienóis no azeite de dendê, bem como sua composição em ácidos graxos e triacilglicerídeos. Obteve-se o predomínio de y-tocotrienol, ácidos oléico (O) e palmítico (P) e triacilglicerídeos POO e POP.
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Avaliação da permeabilidade intestinal da furosemida e da furosemida complexada com hidroxipropil-β-ciclodextrina por meio do modelo de perfusão in situ de passagem tripla em ratos / Assessment of intestinal permeability of furosemide and furosemide complexed with hydroxypropyl-β-cyclodextrin by means of triple in situ perfusion model in rats.Juliana Pereira Maura Rossato 18 February 2016 (has links)
A furosemida é um fármaco de ação diurética e amplamente utilizado em tratamentos de doenças renais, cardíacas e pulmonares. Sua absorção é problemática e de alta variabilidade inter e intraindividual. Este fármaco tem sido classificado como pertencente às classes II (baixa solubilidade e alta permeabilidade) ou IV (baixa permeabilidade e baixa solubilidade) do Sistema de Classificação de Biofarmacêutica (SCB). Em estudos anteriores da equipe de pesquisa, SPRICIGO e colaboradores (2008) e SILVA (2014) desenvolveram complexos de furosemida com hidroxipropil-β-ciclodextrina que permitiram a otimização da solubilidade deste fármaco. Entretanto, dados sobre a sua permeabilidade intestinal, quando complexado, não foram determinados. Somando-se a isto, a literatura apresenta informações distintas em relação a este parâmetro, o que corrobora a importância de se avaliar a permeabilidade deste fármaco. Diversas técnicas têm sido empregadas para a avaliação da permeabilidade intestinal dos fármacos. No presente trabalho empregou-se o modelo de perfusão in situ de passagem tripla, cuja técnica possibilita avaliar a permeabilidade em três segmentos diferentes em um mesmo animal e ainda, apresenta características interessantes, pois trata-se de um método que proporciona, durante todo o experimento, condições mais próximas daquelas encontradas durante o processo in vivo de absorção de fármacos no intestino tais como: suprimento sanguíneo, inervação intacta, preservação das proteínas transportadoras de membranas e presença da camada de muco. O presente trabalho foi dividido nas seguintes etapas: (i) obtenção da furosemida complexada com hidroxipropil-β-ciclodextrina, (ii) caracterização dos fármacos utilizando técnicas de análises térmicas, (iii) estudo de perfusão in situ de passagem tripla nos três segmentos intestinais (duodeno, jejuno e íleo) de ratos machos Wistar na ausência e na presença de inibidores da glicoproteína P e de enzimas metabolizadoras CYP3A4 com posterior análise estatística do impacto da ciclodextrina e inibidores na permeabilidade da furosemida e; (iv) análise histológica das microvilosidades intestinais após o ensaio de perfusão in situ nos três segmentos intestinais. Os valores encontrados em cada segmento para furosemida complexada foram: 8,58 ± 0,002 x 10-5 cm.s-1; 9,15 ± 0,003 x10-5 cm.s-1 e; 8,06 ± 0,002 x 10-5 cm.s-1, respectivamente para duodeno, jejuno e íleo enquanto que para furosemida pura encontraram-se os seguintes: 3,42 ± 0,08 x 10-5 cm.s-1 para duodeno; 3,87 ± 0,11 x 10-5 cm.s-1 para jejuno e 3,08 ± 0,001 x 10-5 cm.s-1 para íleo. Assim sendo, os valores obtidos para a permeabilidade da furosemida complexada foram significativamente superiores (p < 0,05) aos da furosemida pura, sugerindo que, a ciclodextrina pode ter influência no mecanismo de transporte da furosemida, que é via passiva paracelular. Quanto aos mecanismos envolvidos na permeabilidade da furosemida através dos enterócitos, pode-se sugerir que observou-se pouca influência dos inibidores da glicoproteína P (P-gp) e da enzima CYP3A4, sugerindo que não há uma participação importante destes mecanismos em sua absorção intestinal. / Furosemide, which is a diuretic drug, is widely used in heart, kidney and pulmonary disease treatments. The absorption is problematic with high variability inter and intra individuals. This drug has been classified as belonging to class II (low solubility and high permeability) or IV (low permeability and low solubility) of the Biopharmaceutical Classification System (BCS). In previous studies of the research team, Spricigo and colleagues (2008) and Silva (2014) developed complex of furosemide with hydroxypropyl-β-cyclodextrin which allowed the optimization of the solubility of this drug. However, datas concerning it\'s intestinal permeability, when complexed, have not been determined. Addicted to this, the literature shows many information regarding to this parameter, which confirms the importance of the evaluation of the permeability of this drug. Some techniques have been employed in order to evaluate the intestinal permeability of drugs. In the present work, a triple single-pass intestinal perfusion technique was used for three different segments. This technique enables the evaluation of the permeability of different segments in the same animal and also has interesting features such as: it provides during all the experiment conditions closer to those found in in vivo process of a drug absorption in the gut; blood supply; intact innervations; preservation of membrane transporter proteins and presence of mucus layer. This study was divided into the following steps: (i) obtaining furosemide complexed with hydroxypropyl-β-cyclodextrin, (ii) characterization of drugs using techniques of thermal analysis, (iii) perfusion study in situ triple passage in three segments (duodenum, jejunum and ileum) from male Wistar rats in the absence and presence of inhibitors of P-glycoprotein and metabolizing enzymes CYP3A4 and subsequential statistical analysis of the impact of the cyclodextrin and the inhibitors in the permeability of furosemide and (iv) histological analysis of intestinal microvilli after in situ perfusion assay in three segments. The values found in each segment for complexed furosemide were: 8,58 ± 0,002 x 10-5 cm.s-1; 9,15 ± 0,003 x 10-5 cm.s-1; 8,06 ± 0,002 x 10-5 cm.s-1, respectively for duodenum, jejunum and ileum while for pure furosemide, the values were: 3,42 ± 0,08 x 10-5 cm.s-1 to duodenum; 3,87 ± 0,11 x 10-5 cm.s-1 to jejunum and 3,08 ± 0,001 x 10-5 cm.s-1 to ileum. Thus, the values obtained for the permeability of the complexed furosemide were significantly higher (p < 0,05) than those found for pure furosemide, suggesting that the cyclodextrin might have an influence on the transport mechanism of furosemide, which is passive paracellular route. About the mechanisms involved in the permeability of furosemide through the enterocytes, it can be suggested that there was little effect of P-glycoprotein (P-gp) inhibitors and CYP3A4 enzyme, suggesting that there is an important role of these mechanisms in the furosemide intestinal absorption.
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Adições de aza-Michael em diazocetonas α,β-insaturadas e reações de inserção em ilídeos β-cetosulfoxônios / α,β-unsaturated diazoketones in Aza-Michael additions and β-keto sulfoxonium ylides in insertion reactionsRafael Mafra de Paula Dias 06 November 2015 (has links)
O trabalho de tese é dividido em dois capítulos e visou explorar a química das diazocetonas α,β-insaturadas bem como dos ilídeos β-cetosulfoxônios. No primeiro capítulo é apresentado o emprego das diazocetonas α,β-insaturadas como novos aceptores em reações de aza-Michael. A adição conjugada de aminas primárias e secundárias foi explorada, assim como o uso de aminas quirais para avaliar a versão assimétrica da reação. Além da formação desses adutos, também foram investigadas estratégias para a construção de heterocíclicos nitrogenados a partir destes ou via protocolos \"one-pot\" (partindo das diazocetonas α,β-insaturadas) levando à formação de 2- e 3-pirrolidinonas. Por fim, foi avaliada a aplicação da metodologia desenvolvida na síntese do produto natural Barmumicina. O segundo capítulo se dispôs a investigar o emprego dos ilídeos β-cetosulfoxônios como substitutos de compostos diazocarbonílicos em reações de inserção. Num primeiro momento, avaliaram-se reações de inserção S-H intermolecular, visando a construção do fragmento β-cetotioéter. Alguns estudos competitivos e mecanísticos, bem como estratégias assimétricas também compõem o escopo. Num segundo momento, os ilídeos foram empregados em reações de inserção N-H intramolecular, no qual, a partir de sulfoxônios derivados de aminoácidos, vislumbrou-se a formação de 3-azetidinonas. / This thesis is divided into two chapters which are related to the chemistry of α,β-unsaturated diazoketones and β-ketosulfoxonium ylides. The first chapter presents the utility of α,β-unsaturated diazoketones as new aza-Michael acceptors. Conjugate addition of primary and secondary amines was explored, as well as the use of chiral amines to evaluate the asymmetric version of the reaction. In addition to the formation of these adducts, it was also investigated some strategies for the synthesis of 2- and 3-pyrrolidinones via the \"one-pot\" protocols (starting directly from the α,β-unsaturated diazoketones). Finally, the synthesis of the natural product Barmumicyn was evaluated from this methodology. The second chapter aimed to investigate the use of β-ketosulfoxonium ylides as diazocarbonyl compounds substitutes in insertion reactions. At first, the intermolecular S-H insertion reaction was studied aiming the construction of the β-ketothioether fragment. Some competitive and mechanistic studies, as well as asymmetric versions are also part of the scope. Secondly, some ylides were also employed in intramolecular N-H insertion reactions (from sulfoxonium amino acid derivatives) aiming the formation of 3-azetidinones.
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Papel de TGFβ-1 na regulação da expressão de MMPs seus inibidores (TIMPs e Reck) em modelo de carcinoma mamário humano: análise funcional de RECK e sua correlação com dados clínico-patológicos / Role of TGFβ-1 as a common regulator of MMPs and their inhibitors (TIMPs e RECK) in human breast cancer cell model: functional analysis of RECK and its correlation with clinical-pathologicalLuciana Rodrigues Gomes 14 October 2011 (has links)
A causa de morte da maioria das pacientes com câncer de mama se deve à doença metastática desenvolvida a partir do tumor primário. A degradação dos componentes da matriz extracelular (MEC), um dos principais eventos do processo metastático, é regulada pelo balanço entre as atividades das metaloproteinases de matriz (MMPs) e dos seus inibidores, tanto os inibidores teciduais (TIMPs) como o inibidor associado à membrana (RECK). Contudo, ainda existe pouca informação sobre os mecanismos moleculares responsáveis pela manutenção deste balanço. No presente trabalho, foi investigado o envolvimento de TGF-β1 (Transforming Growth Factor-β1), uma citocina multifuncional é capaz tanto de inibir o crescimento celular, quanto de promover invasão e metástase, dependendo do estadiamento e do tipo de tumor, na regulação da expressão de MMPs, TIMPs e RECK, em modelo de câncer de mama. Primeiramente, examinou-se os níveis de expressão de mRNA das isoformas e receptores de TGF-β, em um painel de cinco linhagens de carcinoma mamário humano, com diferentes potenciais invasivos e metastáticos, por qRT-PCR. Os resultados obtidos demonstraram uma correlação positiva entre a expressão dessas moléculas, e a progressão do caráter invasivo e metastático celular. Em seguida, a linhagem altamente invasiva, MDA-MB-231, foi tratada com diferentes concentrações de TGF-β1 recombinante. Esta citocina foi capaz de modular a expressão gênica de MMPs (MMP-2 e MMP-9) e de seus inibidores (TIMP- 2 e RECK). Tanto ERK½, quanto p38MAPK mostraram-se envolvidas neste mecanismo. Foi demonstrado que a inibição da atividade de ERK½ alterou a expressão das proteínas MMP-9, TIMP-2 e RECK, enquanto o bloqueio de p38 MAPK afetou os níveis protéicos de MMP-2 e TIMP-2. O aumento do potencial migratório e invasivo da linhagem MDA-MB-231, induzido por TGF-β1, mostrou-se também dependente da atividade de MMPs, ERK½ e p38MAPK. Dada a ausência de informações sobre o papel de RECK em modelo mamário, a função deste inibidor de MMPs também foi investigada. Primeiramente, analisou-se a expressão de RECK ao longo do desenvolvimento da mama e, posteriormente, em 1040 amostras tumorais de mama humana, através da metodologia de Tissue Microarray, tendo sido possível demonstrar que a alta expressão de RECK associa-se a menor tempo de sobrevida global e livre de doença em 10 anos. Os resultados obtidos indicaram que a expressão da proteína RECK, em oposição ao verificado em outros tipos de tumores, está relacionada ao fenótipo mais agressivo de tumores de mama. Entretanto, a análise funcional de RECK, realizada por meio da utilização de vetores shRNA específicos para a inibição desta proteína, demonstrou que RECK também atua como um inibidor de invasão celular e da expressão de MMP-9, na linhagem MDA-MB-231. Em conjunto, os resultados obtidos neste trabalho contribuíram para a elucidação dos mecanismos moleculares de regulação de RECK, por clássicas moléculas associadas ao processo de tumorigênese (TGF-β1 e MAPKs), bem como para o esclarecimento de suas funções em modelo mamário, sugerindo-o como mais um promissor candidato a marcador prognóstico e alvo molecular para a terapia do câncer de mama. / The metastatic disease is the main mortality cause of breast cancer patients. The metastatic process involves a complex cascade of events, including the organized breakdown of the extracellular matrix (ECM) compounds. The degradation of ECM is tightly regulated by the balance between the activities of matrix metalloproteinases (MMPs) and their inhibitors, the tissue inhibitors (TIMPs) and the membrane-associated inhibitor (RECK). Among the several molecules released and activated by ECM remodeling, TGF-β1 (Transforming Growth Factor-β1) is a multifunctional cytokine able to regulate both cell growth inhibition and invasion and metastasis promotion, depending on the tumor stage and type. Since the molecular mechanisms involved in the ECM remodeling control are still not completed understood, in this study, we investigated the involvement of TGF-β1 in regulating of MMPs, TIMPs and RECK expression, in the breast cancer model. By qRT-PCR, we first examined the gene expression levels of TGF-β isoforms and receptors, in a panel of five human breast cancer cell lines displaying different degrees of invasiveness and metastatic potential. Our results suggest a positive correlation between the mRNA expression of these molecules and the breast cancer progression. Moreover, the highly invasive breast cancer cell line MDA-MB-231 was treated with different concentrations of recombinant TGF-β1. We described that this cytokine was able to modulate the gene expression of MMPs (MMP-2 and MMP-9) and MMPs inhibitors (TIMP-2 and RECK) at both the mRNA and protein levels, with ERK½ and p38 MAPK being involved in this molecular mechanism. However, while ERK½ activity inhibition altered MMP-9, TIMP-2 and RECK expression, the p38 MAPK blockage affected the protein levels of MMP-2 and TIMP-2. Finally, we reposted that the TGF-β1-enhanced migration and invasion capacities of MDA-MB- 231 cells were blocked by MMPs, ERK½ and p38 MAPK inhibitors. Analysis of the RECK function in the breast model was also an objective of this study. We analyzed RECK expression during mammary gland development. We evaluated the RECK protein profile in 1040 breast tumor tissue samples using Tissue Microarray assays. We demonstrated that high expression levels of RECK were associated with shorter overall and disease-free survival in 10 years. Moreover, we verified that RECK is a biomarker of poor prognosis mainly for patients diagnosed with less aggressive breast tumor. Therefore, in contrast to other tumor types, our results indicate that high protein expression levels of RECK are related to a more aggressive phenotype. In fact, the RECK functional analysis, performed by using of shRNA vectors, showed that RECK function remains as an inhibitor of cellular invasion and MMP-9 expression, in MDA-MB-231 cells. Taken together, our results contribute to better understanding of the molecular mechanisms associated to RECK regulation by TGF-β1 and MAPK as well as to clarify its role in breast model. Thus, we suggests RECK as a new and promising prognostic marker and molecular target candidate for breast cancer therapy.
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