Recent epidemiological evidence suggests that many chronic health disorders in the developed world are associated with endogenous toxins formed from the Western diet. The Western diet, which encompasses calorie dense foods, processed foods and increased quantities of red meat, can cause intracellular oxidative stress through increased formation of reactive oxygen species(ROS) and reactive carbonyl species (RCS). A number of micronutrients have been investigated for their protective capacity in in vitro and in vivo models of oxidative stress. This thesis investigated the cytotoxic targets of Fenton-mediated ROS and RCS and the subsequent protective mechanisms of vitamins B1 (thiamin) or B6 (pyridoxal, pyridoxamine or pyridoxine) in an isolated rat hepatocyte model. The approach was to use an “accelerated cytotoxicity mechanism screening” technique (ACMS) to develop an in vitro cell system that mimicked in vivo tissue cytotoxicity. Using this technique, we investigated the protective mechanisms of vitamins B1 and/or B6 against the cytotoxic effects of two endogenous toxins associated with the Western diet: 1) RCS, as exemplified by glyoxal, a glucose/fructose autoxidation product and 2) biological ROS induced by exogenous iron. Firstly, we developed an understanding of the sequence of events contributing to glyoxal-induced oxidative stress, with a focus on protein carbonylation. Next, we determined the mechanisms by which carbonyl scavenging drugs (vitamin B6 included) protected against the intracellular targets of glyoxal-induced toxicity. Our results suggested that the agents used were cytoprotective by multiple mechanisms and glyoxal trapping was only observed when the agents were administered at concentrations equal to glyoxal. We also evaluated the protective capacity of vitamins B1 and B6 against iron-catalyzed cytotoxicity and found that hepatocytes could be rescued from protein and DNA damage when vitamins B1 or B6 were added up to one hour after treatment with iron. The vitamins also varied in their primary mechanisms of protection. Our improved understanding of Western diet-derived endogenous toxins enabled us to identify and prioritize the specific inhibitory mechanisms of vitamins B1 or B6. The ability to delay, inhibit or reverse toxicity using multi-functional B1 or B6 vitamins could prove useful as therapy to minimize oxidative stress in diet-induced chronic conditions.

The USP4 is a deubiquitinating enzyme found elevated in certain human lung and adrenal tumours. USP4 has a very close relative, USP15, which has caused great difficulty in studying only one or the other. We have had generated two antibodies specific to USP4 and USP15, and have confirmed that the two do not cross react. Although there have been previous findings of interacting partners, possible substrates and pathways in which it is involved, the biological role of USP4 is mostly unknown. We have used these antibodies to determine that USP4 and USP15 expression differs across tissue and cell types, and that expression changes as the organism ages. We have shown that USP4 plays a role in canonical Wnt signaling, perhaps by stabilizing Beta-catenin, and identified GRK2 as a kinase, phosphorylating USP4. These data have provided enough information to form a hypothesis, implicating USP4 with the destruction complex in the Wnt signaling pathway.

Radiative decays of B mesons, a good example of Flavor Changing Neutral Currents, are interesting for the study of physics beyond the Standard Model, as new high-energy phenomena can enter in the loop. The LHCb experiment, designed to study b- and c-hadron physics at the LHC, is an ideal candidate for the study of this type of decays. However, in order to effectively study radiative B decays, good trigger performance is needed. Two trigger strategies have been studied, one exclusive and one inclusive: on one side, the already existing exclusive lines have been modified, and, on the other side, a new set of inclusive topological lines, specific for radiative B decays, has been introduced. Their performance in 2011 has been assessed both on simulation and on data, and the strategy for 2012 has been outlined. In addition, the full 2011 dataset collected by LHCb has been used to extract the ratio of branching fractions BR(B → K∗γ)/BR(Bs → ϕγ), which has been measured to be 1.31 ± 0.08(stat) ± 0.04(syst) ± 0.10(fs/fd). From this result, and using the well-known value for B → K∗γ, the branching fraction of Bs → ϕγ has been found to be (3.3 ± 0.3 )x10−5, largely improving previous results. This work puts the basis for future developments within the radiative decays group in LHCb, as it settles the trigger strategy on one hand and provides a detailed study of the backgrounds involved in the two studied decays, on the other. This will be very useful for future analyses, such as the CP asymmetry measurements in B → K∗γ or the photon polarization in Bs → ϕγ. / Les desintegracions dels mesons B són interessants per a l'estudi de Física més enllà del Model Estàndard, ja que són un bon exemple de Corrents Neutres amb Canvi de Sabor, molt sensibles a nova Física a altes energies a través del loop. L'experiment LHCb, dedicat a l'estudi de la física d'hadrons b i c a l'LHC, és un candidat ideal per a l'estudi d'aquest tipus de desintegracions. Tot i així, per a poder estudiar d'una manera efectiva les desintegracions radiative de mesons B a LHCb és necessària una bona resposta del trigger de l'experiment. S'han estudiat dues estratègies de trigger, una d'exclusiva i una d'inclusiva: per un costat, les línies exclusives ja existents han estat modificades, i, per l'altre, s'ha introduït un nou conjunt de línies topològiques específic per a desintegracions radiatives. S'ha estudiat el seu rendiment durant 2011 i, basant-se en els resultats obtinguts, s'ha dissenyat l'estratègia de trigger per a 2012. A més, s'han usat les dades preses per LHCb durant tot 2011 per a extreure la raó de les fraccions d'embrancament BR(B → K∗γ)/BR(Bs → ϕγ), obtenint el resultat de 1.31 ± 0.08(est) ± 0.04(sist) ± 0.10(fs/fd). A partir d'aquest resultat, i fent servir el valor ben mesurat de BR(B → K∗γ), s'ha trobat una raó d'embrancament per a Bs → ϕγ de (3.3 ± 0.3 )x10−5, millorant significativament els resultat anteriors. Aquest treball posa les bases per a futurs desenvolupaments dins del grup de desintegracions radiatives a LHCb, ja que per un costat fixa l'estratègia de trigger i, per l'altre, proporciona un estudi detallat de les diferents fonts de contaminació en la selecció de les desintegracions estudiades. Això resultarà molt útil en futurs anàlisis, tals com les mesures d'asimetria CP en B → K∗γ o la polarització del fotó en Bs → ϕγ.

Les importants aplicacions pràctiques que presenta el cobaltobis(dicarballur), [3,3'-Co(1,2-C2B9H11)2]-, ja sigui com a extractant de radionúclids procedents d'aïgues residuals de centrals nuclears o com a agent dopant de polímers conductors de polipirrol, ens han encoratjat en la recerca d'aquest clúster de bor. Així l'objectiu primordial d'aquest treball és la síntesi i caracterització de nous cobaltocarborans que incorporin substituents tant dels vèrtexs de carboni com en els de bor, per tal d'ésser destinats a aquestes aplicacions. La incorporació de fosfines en els vèrtexs de carboni del cobaltobis(dicarballur) ha estat possible per metal·lació directa d'aquest amb n-BuLi seguida de la reacció amb una clorofosfina (ClPR2: R=Ph, Et, iPr o Cl2PPh). Aquesta reacció ha conduït a la síntesi i separació d'espècies C-difosfinosubstituïdes. La caracterització d'aquestes difosfines per RMN (1H, 13C, 31P i 11B) i difracció de raigs X ha revelat que l'isòmer generat és la mescla racèmica. Únicament s'ha format l'isòmer meso si es duu a terme la mateixa reacció sobre el compost [8,8'-m-C6H4-3,3'-Co(1,2-C2B9H10)2]-. També l'únic cas de mono-C-substitució s'ha observat partint d'aquest compost. Un cop sintetizada tota aquesta nova família de C-fosfino derivats s'han preparat els respectius anàlegs òxids de fosfina per tractament amb H2O2 en acetona. Aquest mètode d'oxidació també s'ha aplicat a closo-carboranildifosfines, en aquests casos però, un cop a tingut lloc l'oxidació dels àtoms de fòsfor té lloc la degradació parcial del clúster closo a nido. Són els òxids de fosfina els que s'han utilitzat en els assaigs d'extracció de radionúclids, en tècniques d'extracció líquid-líquid i en experiments de transport en membranes líquides suportades.La semblança estructural de la cobaltocarboranildifosfina aniònica [3,3'-Co(1-PPh2-1,2-C2B9H10)2]- aquí sintetitzada amb els coneguts lligands BINAP i dppf ens ha motivat a determinar com es comporta aquest cobaltocarborà com a lligand. Per això s'ha complexat amb metalls tals com la Ag, l'Au, el Rh i el Pd. També s'ha dut a terme un anàlisi detallat dels trets geomètrics que diferencien aquests tres lligands tant semblants.Pel que fa a la funcionalització dels vèrtexs de bor, s'ha optimitzat el mètode de síntesi dels derivats iodats [3,3'-Co(8-I-1,2-C2B9H10)(1',2'-C2B9H11)]- i [3,3'-Co(8-I-1,2-C2B9H10)2]- i se n'ha estudiat la seva reactivitat amb reactius de Grignard. La reacció del derivat monoiodat amb magnesians ha permès generar derivats monoalquílics i monoarílics en la posició B8. S'ha estudiat l'efecte del substituent alquil o aril tant experimentalment mitjançant les tècniques de RMN, UV-Visible, voltamperometria cíclica i difracció de raigs X com per càlculs teòrics Extended Hückel i ab initio. D'aquest estudi en resulta el caràcter electroatraient d'un grup alquil quan està enllaçat a bor, i la menor participació dels orbitals d del metall en els orbitals frontera. La reactivitat del derivat diiodat amb magnesians ha generat compostos tant B8,B8'-dialquilsubstituïts com B8-alquil-B8'-hidroxilsubstituïts. A partir del derivat [3,3'-Co(8-Me-1,2-C2B9H10)(8-OH-1',2'-C2B9H10)]- s'ha observat per primer cop en la química dels clústers de bor un procés d'oxodesmetilació. De la reactivitat dels derivats mono i diiodats amb alquins en destaca la reacció del derivat monoiodat amb trimetilsililacetilè la qual ha permès aïllar i caracteritzar els anàlegs en tres dimensions al fenantrè i al 9-vinilfenantrè: [8,8'-m-C2H2-3,3'-Co(1,2-C2B9H10)2]- i [8,8'-m-C4H2(SiMe3)2-3,3'-Co(1,2-C2B9H10)2]-. S'ha proposat un mecanisme basat en etapes d'acoblament B-C, d'hidroboració intramolecular o intermolecular, d'hidrodesililació i "enyne" metàtesis per a explicar la generació d'aquests nous compostos. També s'han sintetitzat nous cobaltocarborans que incorporen cadenes de polièter en la posició B8 per reacció de l'espècie dioxanada [3,3'-Co(8-C4H8O2-1,2-C2B9H10)(1',2'-C2B9H11)] amb alcòxids sòdics. A més a més, per difracció de raigs X s'ha resolt l'estructura cristal·lina de Na[3,3'-Co(8-O(CH2CH2O)2Et-1,2-C2B9H10)(1',2'-C2B9H11)] en la que s'evidencia l'existència d'interaccions B-H◊◊◊Na.Finalment, s'ha polimeritzat electroquímicament el polipirrol amb alguns dels cobaltocarborans B8-substituïts per a avaluar la resistencia a la sobreoxidació del nou material polimèric. / The practical application of cobaltobis(dicarbollide), [3,3'-Co(1,2-C2B9H11)2]-, either as an extractant of radionuclides from nuclear wastes or as a doping agent on conducting organic polymers in particular polypyrrole, has encouraged to research on this boron cluster. The aim of this work has been to synthesize and characterize new cobaltocarborane derivatives with substituents on the carbon vertexes and on the boron vertexes to be used as extractant or doping agents. The incorporation of phosphines in the carbon vertexes of the cobaltobis(dicarbollide) has been possible through direct metallation of the cluster with n-BuLi, followed by reaction with chlorophosphines (ClPR2: R=Ph, Et, iPr or Cl2PPh). This reaction has led to the synthesis and separation of C-diphosphinosubstituted species. Their characterization by NMR spectroscopy (1H, 13C, 31P i 11B) and X-ray diffraction has revealed that among all possible isomers, only the racemic mixture is formed. The meso isomer is only generated if the same reaction is applied to the compound [8,8'-m-C6H4-3,3'-Co(1,2-C2B9H10)2]-. Also the unique case of mono-C-substitution has been observed starting from this compound. After synthesizing all this new family of C-phosphino derivatives, the phosphine oxides analogous has been prepared by treatment with H2O2 in acetone. This oxidation methode has also been applied to closo-carboranyldiphosphines. In this cases, upon oxidation of the phosphorous atoms takes place the partial cluster degradation from closo to nido. The phosphine oxides have been used in radionuclides extraction experiments, liquid-liquid extraction techniques and transport experiments using supporting liquid membranes.The structural similarity of the anionic cobaltocarboranyldiphosphine [3,3'-Co(1-PPh2-1,2-C2B9H10)2]- synthesized here with the well-known BINAP and dppf ligands has motivated to determine how the cobaltocarborane acts as a ligand. In this sense, this has been complexed with metals such as Ag, Au, Rh and Pd. A detailed analysis of the geometrical differences between the three ligands has also been explored.Concerning the functionalization of the boron atoms, the synthetic procedure for the iodated derivatives [3,3'-Co(8-I-1,2-C2B9H10)(1',2'-C2B9H11)]- and [3,3'-Co(8-I-1,2-C2B9H10)2]- as well as their reactivity with Grignard reagents has been studied. The cross-coupling reaction between the monoiodated compound and a Grignard reagent has allowed to generate monoalkylated and monoarylated derivatives on B8 position. The effect of alkyl and aryl substituents has been studied experimentally by NMR, UV/Vis, cyclic voltammetry and X-ray diffraction. Theoretically Extended Hückel and ab initio methods have also been carried out. Experimental and theoretical data agree with the electronwithdrawing character of alkyl groups when bonded to boron, and the less contribution of the metal d orbitals to the frontier orbitals. On the other hand, the reactivity of the diiodated compound with magnesium salts has generated homo-B8,B8'-dialkylsubstituted and hetero-B8-alkyl-B8'-hydroxilsubstituted derivatives. An oxodemethylation process has been observed for the first time in boron cluster chemistry when using [3,3'-Co(8-Me-1,2-C2B9H10)(8-OH-1',2'-C2B9H10)]- in the presence of I2.Remarkable is the reaction between the monoiodated derivative with trimethylsilylacetylene which has permitted the isolation and characterization of the three-dimensional analogous of phenantrene and 9-vinylphenantrene: [8,8'-m-C2H2-3,3'-Co(1,2-C2B9H10)2]- and [8,8'-m-C4H2(SiMe3)2-3,3'-Co(1,2-C2B9H10)2]-. A mechanism based on B-C coupling, intramolecular or intermolecular hydroboration, hydrodesilylation and enyne metathesis reactions has been proposed to explain the formation of these compounds. The synthesis of new cobaltocarboranes that incorporates polyethers chains in B8 vertex has been possible by reaction of the dioxanate species [3,3'-Co(8-C4H8O2-1,2-C2B9H10)(1',2'-C2B9H11)] with sodium alkoxides. Furthermore, through X-ray diffraction has been solved the crystal structure of Na[3,3'-Co(8-O(CH2CH2O)2Et-1,2-C2B9H10)(1',2'-C2B9H11)] that evidenciates the existence of B-H◊◊◊Na interactions. These B8-substituted cobaltocarborane derivatives have been used as doping agents in the electrochemical polymerization of polypyrrol in order to evaluate the overoxidation resistance of the new polymeric materials.

Forskningsfråga Är det möjligt att skapa riskjusterad överavkastning med hjälp av nyckeltal inom industribranschen på den Nordiska aktiemarknaden? Syfte Går det att generera en riskjusterad överavkastning genom att använda en investeringsstrategi baserad på något eller några av nyckeltalen P/S, P/E, P/B, EV/EBITDA samt med en egen modell innehållandes de tre förstnämnda nyckeltalen. Detta undersöker vi genom att samla in data och utföra statistiska tester där vi ställer portföljer med låga värden på nyckeltalen mot portföljer med höga värden på nyckeltalen. Teori Teorin inom området är uppdelat i två läger, de som påstår att marknaden är effektiv som t.ex. Fama och de som påstår att marknaden är ineffektiv som t.ex. Haugen. Vi redovisar många olika studier som har försökt hitta metoder för att skapa överavkastning. Vi har även tagit med teorier inom behavioral finance för att försöka förstå uppkomsten av anomalier på aktiemarknaderna. Metod Vi har genomfört en kvantitativ studie som grundar sig på rådata från tre olika marknader, OMX Stockholm, OMX Helsinki och OMX Copenhagen. Vi valde att bara använda aktier listade inom industribranschen, dels på grund av att det är lättare att jämföra aktier inom samma segment och dels för att det fanns mest företag att tillgå inom industrisektorn. Studien har en undersökningsperiod på åtta år, den sträcker sig från 2003-04-01 till 2011-04-01. Vi har riskjusterat portföljerna med hjälp av Jensens Alpha samt signifikanstestat portföljerna mot varandra med hjälp av Mann-Whitney U testet.  Kunskapsgap Mycket av forskningen kring realtivvärdering är utförd på den amerikanska marknaden. Den Nordiska marknaden har undersökts väldigt sparsamt och det saknas relevant forskning kring nyckeltal och riskjusterade portföljer.  Resultat och slutsats Studiens resultat kan tolkas på olika sätt. Alla portföljer med låga nyckeltal fick riskjusterad överavkastning när de jämfördes med respektive industriindex. Dock var det endast två av portföljerna som visade ett signifikant resultat i Mann-Whitney U testet. Dessa två portföljer var P/B samt den egna modellen på Helsingforsbörsen. Vi tolkar resultaten som att det är möjligt att skapa riskjusterad överavkastning med hjälp av nyckeltalen. Dock hade nyckeltalet EV/EBITDA ett avvikande resultat och gick inte i linje med den tidigare forskningen samt våra andra portföljer eftersom höga EV/EBITDA gav högre avkastning än låga på två marknader.

La incidencia de infecciones fúngicas ha aumentado en los últimos años debido al incremento de situaciones clínicas que comportan alteraciones en los mecanismos de defensa del organismo tales como neoplasias, pacientes portadores de un trasplante y tratados con fármacos inmunosupresores o síndrome de la inmunodeficiencia adquirida (SIDA), entre otros. La anfotericina B (AnB), comercializada en 1956, continúa siendo el fármaco de elección para el tratamiento de las micosis sistémicas, aunque su utilización no está exenta de toxicidad. Las nuevas formulaciones lipídicas de AnB comercializadas a partir de 1995, han supuesto en la práctica clínica una mejora en la optimización de la terapia ya que su administración ha demostrado estar asociada a una menor incidencia de reacciones adversas. Antes de la comercilaización de éstas, ha sido frecuente la utilización de AnB vehiculada en un excipiente de características lipófilas como es el Intralipid 20%, preparada como formulación magistral en el momento de la infusión endovenosa por no disponer de estudios de estabilidad. La aspergilosis pulmonar invasiva es una infección fúngica que puede aparecer como complicación en la clínica de pacientes inmunodeprimidos cuya profilaxis con la formulación de AnB en solución acuosa para inhalación, ha demostrado una buena eficacia clínica exenta de los efectos adversos y toxicidad asociados a la administración endovenosa. En esta memoria se presentan los resultados de tres trabajos en formato de publicaciones en los cuales se estandariza y valida un método para la determinación de AnB en muestras biológicas (suero, secreciones respiratorias) y muestras lipídicas con aplicación a estudios farmacocinéticos y de estabilidad química de AnB cuando ésta se administra en diferentes formas farmacéuticas. / The incidence of fungal infection has increased in recent years due to the increment of clinical situations wich alter the defence mechanisms of the body such as neoplasia, transplantation patients treated with immunosupressive drugs or acquired immunodeficiency (AIDS), among others. Amphotericin B (AmB), licenced in 1956, continues to be the drug of choice for the treatment of systemic mycosis, although its use is not exempt from toxicity. The new AmB lipid formulations licenced from 1995 onwards, have represented in clinical practice an improvement in therapy since its administration has been associated with a declining incidence of adverse reactions. Prior to AmB commercialization, it was normal to inclued AmN in an excipient of lipofilas-like-characteristics such as Intralipid 20%, prepared as a magistral formulation at the moment of intravenous infusion, for lack of stability studies. Invasive pulmonary aspergillosis is a fungal infection which may appear as a complication in immunodepressed patients whose prophylaxis with AmN formulation in aqueous solution for inhalation, has shown good clinical efficacy free from adverse effects and toxicity associated with intravenous administration. In this thesis the results of three studies are presented, in whcih a standardized and validated method for the determination of AmB in biologic samples (serum, respiratory secretions) and liquid samples with application to pharmacokinetic studies and chemical stability of AmB when administered using pharmaceutical procedures.

La diabetis mellitus tipus 1 i la tipus 2 són malalties metabòliques que afecten col·lectivament a un 10% de la població mundial. En ambdós casos l'alteració metabòlica més important és la hiperglucèmia, resultant de la deficiència absoluta (tipus 1) o bé relativa (tipus 2) d'insulina. Concretament, la diabetis tipus 2 es caracteritza per una resistència a la insulina, per part dels teixits perifèrics, acompanyada d'un defecte en la secreció de la hormona, per part de les cèl·lules ? pancreàtiques. La diabetis oberta, però, només es dóna quan les cèl·lules ? no són capaces de continuar compensant la resistència a la insulina. Així doncs, les alteracions en la funcionalitat de les cèl·lules ? serien un component clau en el desenvolupament de la diabetis tipus 2, i no una simple conseqüència de la patologia. Per tant, l'estudi de les cèl·lules ? en els estadis inicials del procés diabètic, resulta ser d'enorme interès per tal d'investigar els mecanismes i les causes que condueixen a la diabetis oberta, Ratolins transgènics que sobreexpressen el factor de creixement IGF-II específicament a les cèl·lules ? pancreàtiques (RIP/IGF-II) presenten un estat pre-diabètic. En aquest treball es van utilitzar aquests animals com a model per estudiar les cèl·lules ? en les fases inicials del procés diabètic i la possible implicació d'IGF-II en el desenvolupament d'aquesta patologia. Es va observar que les cèl·lules ? d'aquests ratolins transgènics presentaven una disminució en la secreció d'insulina en resposta a glucosa. Aquesta disminució podria venir donada per les alteracions funcionals i estructurals presents en aquests illots. S'observava una disminució en l'expressió de Glut2 i insulina, probablement deguda a una reducció dels factors de transcripció que regulen la seva expressió, com Pdx1 i HNF3?. Els illots dels ratolins transgènics presentaven també hiperexpressió de molècules involucrades en la resposta immunitària, com els MHC de classe I i II, tot i no presentar infiltració limfocitària. Així doncs, l'expressió d'IGF-II en les cèl·lules ? dels ratolins transgènics provocava alteracions funcionals en els illots similars a les descrites en models animals o en pacients diabètics.L'evolució del procés diabètic és un procés llarg i varia molt entre individus. En l'evolució d'aquest procés hi intervindrien tant les alteracions presents en les cèl·lules ? de cada individu, com la influència de factors externs. En aquest treball es va estudiar si les alteracions descrites en les cèl·lules ? dels ratolins RIP/IGF-II, podrien predisposar-los a desenvolupar diabetis oberta enfront a factor accelerador. Vam determinar la susceptibilitat dels ratolins RIP/IGF-II enfront dos estímuls diferents: a) el tractament amb molt baixes dosis d'estreptozotocina (STZ), i b) un procés autoimmune, que seria un procés més crònic i comú en la patologia diabètica. Després del tractament amb STZ, es va observar que aquest ratolins transgènics resultaven ser més sensibles a dosis molt baixes, considerades no diabetogèniques pels ratolins control. En segon lloc, per tal d'induir la infiltració limfocitària als ratolins RIP/IGF-II, aquests es creuaren amb ratolins transgènics RIP/hIFN?. L'expressió d'IFN? en cèl·lules ? resulta en una important infiltració dels illots dels ratolins transgènics. D'aquest creuament s'obtingueren ratolins doble transgènics IFN?/IGF-II, un 75% dels quals desenvoluparen diabetis espontània durant els dos primers mesos de vida. Demostrant així que les alteracions pre-diabètiques descrites en les cèl·lules ? dels ratolins IGF-II, incrementaven la susceptibilitat a desenvolupar diabetis oberta en presència d'un factor accelerador.Els resultats d'aquest treball indiquen que alteracions en la funcionalitat de les cèl·lules ? pancreàtiques serien necessàries per incrementar la susceptibilitat a certs factors ambientals que desencadenen la diabetis mellitus. A més, el nostre estudi suggereix que l'increment d'IGF-II en cèl·lules ? podria ser un factor clau en l'inici del procés diabètic. / Type 1 and type 2 diabetes are metabolic diseases with very different etiology that affect collectively 10% of the world-wide population. In both cases the most important metabolic alteration is hyperglycemia, resulting from the absolute (type 1) or relative (type 2) insulin deficiency. In particular, type 2 diabetes mellitus is characterized by decreased response of the liver and peripheral tissues to insulin (insulin resistance) and by inadequate compensatory insulin secretory response. However, overt diabetes only develops when ?-cells fail to compensate for increased insulin demand. Alterations in the functionality of ?-cells would be a primary defect, and not only a simple consequence, in the diabetic pathology. Therefore, studying ?-cells during the initial stages of the diabetic process would be interesting for finding the mechanisms and causes that lead to overt diabetes. Transgenic mice overexpressing IGF-II specifically in ?-cells (RIP-I/IGF-II) develop pre-diabetes. We decided to use these animals as a model in which to study ?-cells in the initial stages of the diabetic process. After the analysis of RIP/IGF-II ?-cells, we observed that transgenic mice showed a decreased insulin secretion in response to glucose. This decrease was likely due to functional and structural alterations found in these islets. Reduction in Glut2 and insulin was observed, probably due to a reduction in the transcription factors that regulate their expression, such as Pdx1 and HNF3?. At structural level these islets showed an increase in the expression of important extracellular matrix components, but showed a decrease in molecules implicated in the intracellular adhesion. Transgenic islets also showed hyperexpression of molecules involved in the immune response, such as MHC class I and II, although no lymphocyte infiltration was observed in their islets. These results suggest that expression of IGF-II in ?-cells of these transgenic mice leads to similar changes to the ones described in other type 2 animal models and diabetic patients. The progression to type 2 diabetes is a long process and varies greatly among individuals. In each individual, alterations present in ?-cells and the influence of external factors would both contribute to the process. In this study, we determined if the alterations described in RIP/IGF-II ?- cells could predispose those animals to develop overt diabetes in the presence of a stimulus that acted as an accelerator factor. We tested the susceptibility of RIP/IGF-II mice to two different stimuli: a) treatment with streptozotocin (STZ), which would stimulate a toxic response specific for ?-cells; and b) an autoimmune process, which would simulate a more chronic effect, more similar to the diabetic pathology.STZ treatment demonstrates that transgenic mice were more sensitive to very low doses of STZ, considered non-diabetogenic for control mice. On the other hand, in order to induce the lymphocyte infiltration to RIP/IGF-II mice, we crossed them with RIP/hIFN transgenic mice. These later mice show a significant infiltration in their islets, induced by the expression of hIFN in their pancreatic ? cells. From this crossbreeding we obtained IFN?/IGF-II double transgenic mice, 75% of which developed spontaneous diabetes during the first two months of age. These results showed that pre-diabetic alterations described in the RIP/IGF-II ?-cells increased their susceptibility to develop overt diabetes in the presence of an accelerator factor.All these results indicate that correct functionality of pancreatic ?-cells is crucial for being able to resist the effect of environmental factors that would lead to the diabetic process. Moreover, our study suggests that the increase of IGF-II in ?-cells could be a key factor in the beginning of the diabetic process.

La Diabetis Mellitus tipus 1 i tipus 2 es caracteritzen pel desenvolupament d'hiperglucèmia, la qual apareix com a conseqüència d'una disminució de la massa de cèl.lula ß i/o d'una pèrdua de funció dels illots. Així doncs, és necessari conèixer els mecanismes implicats en el creixement i la funció del pàncrees endocrí pel seu tractament.Es va demostrar que l'expressió del factor de creixement IGF-I a les cèl·lules ß de ratolins transgènics (RIP-I/IGF-I) era capaç de contrarrestar la hiperglucèmia diabètica i recuperar la massa de cèl.lula ß, després de la inducció de diabetis experimental (George, 2002). En la part I d'aquest treball, vam estudiar els mecanismes mitjançant els quals l'IGF-I era capaç d'induir aquesta recuperació. Els ratolins transgènics IGF-I tractats amb estreptozotocina (STZ) presentaven un increment en la taxa de replicació de les cèl.lules ß. Aquest augment no es donava en els animals IGF-I sense tractar. Això indicava que la regeneració es donava per una proliferació de les cèl.lules ß i, que s'activava principalment després de la inducció d'un dany. En els illots d'animals transgènics IGF-I, es va observar un increment en Cdk-4 (que activa el cicle cel.lular) i una disminució de l'inhibidor p27, suggerint una predisposició a replicar. No obstant, també es va observar un increment de l'expressió de p21, i uns nivells de ciclina D1 (reguladora de Cdk-4) similars als dels illots controls. D'aquesta manera, les cèl.lules ß dels ratolins transgènics IGF-I evitaven una sobreproliferació. Per contra, després del tractament amb STZ, els nivells de p21 disminuïen i els de ciclina D1 augmentaven, induïnt una major taxa de proliferació de les cèl.lules ß. Així doncs, això suggereix que IGF-I podria utilitzar-se com una teràpia per la regeneració del pàncrees endocrí. Per a la reversió de la Diabetis, a més de la regeneració de la massa de cèl.lula ß, és necessari una correcta funció. Recentment, s'ha descrit que la matriu extracel.lular de l'endoteli vascular dels illots promou l'expressió d'insulina i la proliferació de les cèl.lules ß (Nikolova, 2006) i que la microcirculació dels illots controla la secreció d'insulina (Ballian, 2007). Així doncs, en la part II es va estudiar el paper del factor pro-angiogènic VEGF i de l'endoteli en la funcionalitat del pàncrees endocrí i en la regulació de la massa de cèl.lula ß. Amb aquest objectiu, es van generar ratolins transgènics que sobreexpressaven VEGF a les cèl.lules ß (RIP-I/VEGF). Es van obtenir dues línies amb diferent nivell d'expressió del transgén: Tg VEGF 1, amb una elevada expressió i, Tg VEGF 2, amb una expressió més moderada. Els animals transgènics d'ambdues línies presentaven illots desorganitzats amb un increment en la vascularització i un engruixement de la membrana basal, però la massa de cèl.lula ß, i l'homeòstasi de la glucosa no es modificaven. No obstant, amb l'edat, els animals Tg VEGF 1, esdevenien intolerants a la glucosa i, posteriorment, diabètics oberts. El pàncrees endocrí d'aquests ratolins Tg VEGF 1 mostrava un increment en l'expressió de diverses citoquines i una infiltració de macròfags, que portava a la destrucció dels illots pancreàtics. Per la seva banda, els ratolins Tg VEGF 2 desenvolupaven, amb l'edat, una disminució en la secreció d'insulina, sense arribar a desenvolupar diabetis oberta. Els illots d'aquests animals mostraven una lleu infiltració de macròfags i un increment en la producció de citoquines pro-inflamatòries. Per tant, la sobreproducció de VEGF i l'increment en la vascularització dels illots no milloraven ni la viabilitat ni la funcionalitat dels illots. Contràriament, portaven, a llarg termini, a una inflamació crònica del pàncrees endocrí i a alteracions en la cèl.lula ß, induint intolerància a la glucosa i, fins i tot, diabetis oberta. / Both type 1 and type 2 diabetes are considered the most common metabolic disease, which is characterized by the development of hyperglycemia. Higher blood glucose levels are due to a decreased function and/or beta cell mass. That's why restoring a beta cell mass which colud be able to mantain normal blood glucose levels is one of the most important challanges in Regenerative Medicine for Diabetes treatment. Thus, it is necessary to further know mechanisms involved in endocrine pancreas growth and function.Transgenic mice that overexpress IGF-I in beta cells (RIP-I/IGF-I) showed that this growth factor is able to normalize blood glucose levels and restore beta cell mass after induction of diabetes (using STZ treatment) (George, 2002 and, Casellas, 2006). These results suggest that IGF-I could be a key gene for diabetes treatment. Thus, in part I of this work, we studied the putative mechanisms by which IGF-I can regenerate beta cell mass in these mice. STZ-treated transgenic mice presented an increased beta-cell replication comparing to STZ-treated wild-type and to healthy wild-type and transgenic mice. This fact suggested that regeneration of endocrine pancreas could be mainly due to beta-cell proliferation.Islets from transgenic mice showed increased levels of Cdk4 protein (a cell cyle activator) and decreased expression of p27 (a cell cycle inhibitor). However, in parallel, these islets showed increased expresion of p21 (an inhibitor) and normal levels of cyclin D1 (Cdk4 activator). Beta cells from IGF-I-transgenic animals had an equilibrium and did not show an enhanced replication rate. Nevertheless, after STZ treatment, p21 mRNA levels decreased and cyclin D1 expression increased. Consequently, cell cycle machinery could be activated. This would be consistent with increased beta cell proliferation rate in transgenic animals after STZ treatment. Thus, our study suggested that IGF-I could restore beta cell mass by inducing beta cell proliferation. To reverse Diabetes it is necessary not only to restore beta cell mass, but beta cell function as well. Extracellular matrix (ECM) and islet endothelium promote insulin gene expression and beta cell proliferation (Nikolova, 2006). Moreover, islet vascularization controls insulin secretion (Ballian, 2007). Thus, in the part II of this work, we studied the role of the angiogenic factor VEGF in the function of endocrine pancreas and in the control of beta cell mass. To this end, we generated transgenic mice that overexpressed VEGF in beta cells (RIP-I/VEGF). Two different lines were obtained: Tg VEGF 1 (with high levels of VEGF expression) and Tg VEGF 2 (with lower expression levels). Both lines showed disorganized islets with increased vascularization. No differences in glucose homeostasis and in beta cell mass were found. However, Tg VEGF 1 mice firstly developed glucose intolerance and finally became overt diabetic with age. Endocrine pancreas of these mice showed increased expression of proimflamatory cytoquines and macrophage infiltration and higly reduced beta cell mass. On the other hand, Tg VEGF 2 mice showed decreased insulina secretion with age, but never developed overt diabetes. Islets from Tg VEGF 2 mice showed cytoquine production and macrophage infiltration, but they were lower than in Tg VEGF 1 mice.Thus, VEGF overexpression and increased vascularization in islets did not improved beta cell survival and function. But, long-term overexpression of VEGF induced an inflamatory process that decreased insulin secretion and even could induced beta cell loss and overt diabetes.

La diabetes de tipo 1 (T1D) es una enfermedad compleja caracterizada por la desaparición selectiva de las células beta pancreáticas, responsables de la producción de insulina, debido a un proceso autodestructivo mediado por el propio sistema inmunitario. La cepa murina NOD es el modelo animal más ampliamente utilizado en el estudio de la T1D, ya que estos animales desarrollan, de forma espontánea, una forma de diabetes autoinmunitaria similar a la que se observa en humanos. Aunque se conoce que los linfocitos T son las células responsables de la destrucción directa de la masa celular beta, otros tipos celulares del sistema inmunitario también están implicados en el origen y desarrollo de esta respuesta autoinmunitaria. Entre ellos se encuentran los linfocitos B, los cuales también migran, junto con los linfocitos T, a los islotes pancreáticos durante el desarrollo de la diabetes. Nuestra hipótesis es que la población de linfocitos B que forma parte del infiltrado leucocitario en los islotes pancreáticos puede presentar cualidades funcionales distintivas, que aporten la capacidad de regular in situ la actividad de los linfocitos T autorreactivos. El primer objetivo planteado en este estudio ha sido la caracterización fenotípica y funcional de los linfocitos B infiltrantes en islotes pancreáticos, en diferentes modelos murinos de susceptibilidad/resistencia a la diabetes. Así, se ha observado que la migración de los linfocitos B al entorno intrainsular es más destacada en hembras, especialmente en la etapa pre-diabética. Esta población de linfocitos B infiltrantes muestra un fenotipo correspondiente a células maduras, pero la disminución significativa en superfície de la molécula CD19, que forma parte del complejo correceptor del BCR, sugiere un estado funcional reprimido. Los resultados obtenidos tras la estimulación in vitro de estas células indican que dentro del ambiente del infiltrado existen unas condiciones que mantienen este fenotipo reprimido, pero que estas células son especialmente sensibles a la estimulación vía CD40. Estos datos sugieren que estos linfocitos, aunque no presentan cambio de isotipo en su BCR y por tanto no provienen de una reacción de centro germinal, parecen haber estado en contacto previamente con su antígeno. No obstante, a nivel de producción de citoquinas (IL-4, IL-10, IFN?) y de capacidad estimuladora de la proliferación de linfocitos T, no see han detectado diferencias funcionales de estos linfocitos B infiltrantes de islotes, respecto a linfocitos B de poblaciones periféricas. El segundo objerivo de este estudio ha consistido en la identificación del antígeno reconocido predominantemente por esta población de linfocitos B infiltrantes. En un estudio previo, realizado por nuestro grupo, se habían generado hibridomas productores de anticuerpos, a partir de linfocitos B infiltrantes de islotes, y se había demostrado que la mayoría de estos anticuerpos monoclonales reconocían antígenos expresados en las fibras nerviosas que inervan el páncreas. En este estudio, a partir del aislamiento y posterior identificación molecular del antígeno reconocido por 21 anticuerpos monoclonales con el mismo patrón de reconocimiento pero de diferente origen clonal, se ha demostrado que la periferina es la proteína reconocida por todos ellos. Este antígeno neuroendocrino es una proteína de citoesqueleto que se expresa mayoritariamente en las fibras nerviosas periféricas, aunque también, en niveles menores, en las células del islote pancreático. Estos datos apoyan la hipótesis de que el ataque autoinmunirario que se desarrolla en los afectados por T1D, no es exclusivamente dirigido contra las células beta pancreáticas, y que la desestabilización del sistema nervioso pancreático puede ser un factor implicado en el desarrollo de la enfermedad. / Type 1 diabetes (T1D) is a complex autoimmune disease characterized by selective destruction of pancreatic beta cells by the patient's own immune system.Currently, one of the best animal models of type 1 diabetes is the nonobese diabetic (NOD) mouse. NOD mice spontaneously develop a form of diabetes that closely resembles human type 1 diabetes.Islet-infiltrating T-cells are major effectors of beta-cell damage in T1D, however, other cellular elements of the immune system also play a critical role in the initiation and/or progression of T1D. Among these, B-cells are also recruited to pancreatic islets, during disease development. We hypothesize that islet-infiltrating B-cells may have distinctive functional traits, enabling them to regulate autoreactive T-cell activity in situ. The aim of the present study was the phenotypical and functional characterization of islet-infiltrating B cells, in T1D susceptible/resistant T1D murine models. Thus, it was observed that B-cell recruitment into pancreatic islets is higher in female mice, specially just before diabetes onset. Although they are mature B-cells, they interestingly show an abnormal down-regulation of surface CD19 expression, showing a possible hiporesponsive status of these cells, given the relevance of CD19 in regulating BCR activation. Islet-infiltrating B-cells develop a pronounced costimulator phenotype after in vitro stimulation with anti-CD40, thus revealing to be somehow repressed while in the islets. These results suggest that these B-cells, although not presenting immunoglobin class switch recombination, seem to be antigen-experienced. On the other hand, cytokine expression profile (IL-4, IFN?, IL-10) and T-cell activator quality of islet-infiltrating B-cells have been shown to be similar to that from their splenic counterparts.On the other hand, the second objective of this study was the identification of the autoantigen predominantly targeted by islet-infiltrating B-cells. In a previous study in our laboratory, antibody-producing hybridomas were generated from islet-infiltrating C-cells, and it was shown that most of them targeted peripheral nervous elements. In the present study, the isolation and subsequent molecular characterization of the antigen recognized by 21 of these monoclonal antibodies, proved that peripherin is the protein targeted by them all. This neuroendocrine autoantigen is a cytoskeleton protein mainly expressed by peripheral nervous cells, but it is also expressed, although at lower levels, by islet beta-cells. These data support the hypothesis that T1D autoimmune attack is not exclusively focused on pancreatic beta-cells, and that pancreatic nervous system damage may be involved in disease development.

La Inmunodeficiencia Variable Común (IDVC) es la inmunodeficiencia primaria (IDP) sintomática más frecuente. Los pacientes con IDVC presentan un fenotipo clínico (infecciones recurrentes,etc) y un fenotipo inmunológico (hipogammaglobulinemia y respuesta nula de anticuerpos). El diagnóstico de IDVC se realiza por exclusión de otras causas de hipogammaglobulinemia. La existencia de casos atípicos, el solapamiento de fenotipos con otras IDPs y la ausencia de pruebas de laboratorio específicas de IDVC dificulta realizar un diagnóstico diferencial correcto. Recientemente, se han descrito algunos defectos monogénicos (ICOS, CD19, TACI y BAFFR) relacionados con IDVC (~10% pacientes IDVC). En el presente trabajo hemos estudiado: un método de cribaje (expresión de Btk, Lck y SAP), la asociación entre las células B de memoria y la gravedad/evolución clínica y el papel del ICOS como causa genética de la IDVC. El estudio de la expresión de Btk, lck y SAP se realizó mediante western blot (n=55 pacientes-IDVC,37 varones y 18 mujeres, media: 36,6a). El extracto de proteínas se obtuvo a partir de PBMC con NP-40 en condiciones reductoras, la electroforesis se realizó en geles de poliacrilamida de 4-12%, la transferencia en sistema semi-seco en membrana de nitrocelulosa, los anticuerpos primarios utilizados (anti-Btk: ac.mono. BD-Transduction laboratories, anti-lck: ac.mono. BD-Pharmingen, anti- SAP: ac. policlonal de conejo (K. Nichols) y la inmunodetección con un substrato Quimioluminiscente (SuperSignalR West Pico). Del total de los pacientes estudiados sólo en un paciente la expresión de la banda Btk fue negativa, confirmado por estudio de la Btk intracelular en monocitos por citometria de flujo y por análisis genético (P597L). La expresión de Lck y SAP fue normal en todos los pacientes.Se estudiaron las subpoblaciones de linfocitos B de memoria (CD19+CD27+) mediante citometria de flujo (FACSCalibur) en 41 pacientes adultos (21 varones y 20 mujeres, media: 37a) y se clasificaron en 3 grupos: 1) Grupo BM2 incluye pacientes con un número de LB de memoria con (CD19+CD27+IgD-) y sin cambio de isotipo (CD19+CD27+IgD+) dentro de los valores de referencia, n=7, 2) Grupo BM1 incluye pacientes con una reducción significativa de CD19+CD27+IgD- <6%, n=16 y 3) Grupo BM0 incluye pacientes que presentan una reducción significativa de los dos tipos de LB de memoria (CD19+CD27+ <13%), n=18. Se Observó una asociación entre los defectos de LB de memoria y la gravedad fenotípica clínica de los pacientes. En el grupo BM0, el 55% de pacientes con infecciones respiratorias recurrentes, desarrolló bronquiectasias con expectoración habitual, comparado con el 27% de los pacientes del grupo BM1 y el 0% del grupo BM2 (p<0.05). En el grupo BM0, el 50% de los pacientes con síntomas gastrointestinales, desarrolló el síndrome de malabsorción, comparado con el 19% del grupo BM1 y el 0% del BM2 (p<0.05). Los signos de linfoproliferación fueron más frecuentes en el grupo BM0 (50%) que en el grupo BM1 (16%) y BM2 (14%), (p<0.05).Se analizó la expresión de ICOS en la membrana de linfocitos T activados (48h con PMA+ionomicina, anti-ICOS-FITC C398.4A (J.Rojo), FACSCalibur) en pacientes IDVC con historia familiar de IDPs y/o enfermedades autoinmunes (4 familias, n=13). No encontramos ninguna alteración en la expresión de esta molécula en los pacientes estudiados.En conclusión, aunque el error diagnóstico encontrado en nuestro estudio es pequeño y la frecuencia del defecto ICOS es muy baja creemos que se debería incluir en el algoritmo de trabajo de soporte al diagnóstico un sistema de cribaje que incluya el estudio de proteínas asociadas a IDP con fenotipo de IDVC. La asociación entre la alteración inmunofenotípica B (BM0, BM1, BM2) y la gravedad fenotípica clínica justifica la inclusión de la determinación de los LB de memoria en el estudio inmunológico rutinario de los pacientes con IDVC. / Common Variable immunodeficiency (CVID) is a primary immunodeficiency (PID) with symptoms more frequently. The patients with CVID have a clinical phenotype (recurrent infections, etc.) and an immunologic phenotype (hypogammaglobulinemia and poor response an antibody's). The diagnosis of CVID is to make in order to rule out other causes of hypogammaglobulinemia. The existence of atypical cases, flapping of phenotypes with other PIDs and the absence of test specifics of CVID to hinder make a differential diagnosis correct. Recently, was described some monogenic defects (ICOS; CD19, TACI y BAFFR) related with CVID (~ 10% CVID patients).In this work, we are studied: a screening method (expression of btk, lck and SAP), the association between B cells memory and the severity/ clinical evolution and the role of ICOS how genetic cause of CVID. The study of expression of btk, lck, and SAP was making with western blot (n=55 patients-CVID, 37 man and 18 women, media: 36,6y). The extract of proteins was getting of PBMC with NP-40 in reduce conditions the electrophoresis was making in poliacrylamida gels of 4-12%, the transference in semi-dry system in nitrocellulose membrane, the primary antibody were (anti-btk: monoab. -Transduction laboratories, BD, anti-lck: monoab. Pharmingen, BD, anti-SAP: polyclonal ab of rabbit (K. Nichols) and the immunodetection with quimioluminiscente substrate (SuperSignal R West Pico). Of the total patients studied only one, the expression of the btk gang was negative, confirmed for studied of intracellular btk in monocytes for flow cytometry a genetic study (P597L). The expression of lck and SAP was normal in all the patients. The B cells subpopulations of memory (CD19+CD27+) was studied for flow cytometry (FACSCalibur) in 41 adults patients (21 man and 20 women, media 37y) and has been classified in 3 groups: 1) BM2 group include patients with number of memory B cells with (CD19+CD27+IgD-) and without isotype switched (CD19+CD27+IgD+) inside the reference levels, n=7, 2) BM1 group include patients with a significance reduction of CD19+CD27+IgD- <6%, n=16 y 3) BM0 group include patients with significance reduction of two types of memory BL (CD19+CD27+ <13%) n=18. We observed an association between defects of memory B cells and the severity clinical phenotype of the patients. In the group BM0, the 55% of patients with recurrent respiratory infections, development bronchiectasias with usual expectoration compared with the 27% of patients of the BM1 group and 0% of BM2 group (p<0.05). In the group BM0, the 50% of patients with symptoms gastrointestinal development the malabsortion syndrome, compared with the 19% of the group BM1 and the 0% of BM2 (p<0.05). The signs of lymphoproliferation were more frequent in the BM0 group (50%) than BM1 group (16%) and BM2 (14%), (p<0.05).Was analysed the expression of ICOS in the membrane of lymphocytes activated (48h with PMA+ionomicin), anti-ICOS-FITC C398.4A (J.Rojo), FACSCalibur in patients with CVID with familiar history of PIDs and/o autoimmune diseases (4 families, n=13). No find any alteration of the expression of this molecule in the patients studied.In conclusion, even though the error diagnosis fined in our studied is small and the frequency of the ICOS defect is low, we believe that should be include in the algorithm of work support al diagnosis, a system screening that include the protein studied associate a PID with phenotype of CVID. The association between the alteration immunophenotypic B (BM0, BM1, and BM2) and the severity clinical phenotype justify the inclusion of the determination of the memory B cell in the immunologic study routine of the patients with CVID.