Os transportadores de membrana do tipo ATP Binding Cassette (ABC) e solute carriers (SLC) regulam a homeostase intracelular de fármacos, modificando a biodisponibilidade e possivelmente a eficácia terapêutica. A variabilidade na resposta a hipolipemiantes, como as vastatinas, tem sido associada a vários fatores genéticos e ambientais. Com a finalidade de avaliarmos os mecanismos de regulação da expressão dos transportadores pela atorvastatina, a expressão de RNAm de transportadores ABC (ABCB1, ABCG2 e ABCC2) e SLC (SLCO1B1, SLCO2B1 e SLC22A1) foi avaliada por RT-PCRq em células mononucleares do sangue periférico (CMSP) de 18 indivíduos normolipidêmicos (NL) e 22 pacientes hipercolesterolêmicos (HC) tratados com atorvastatina (10mg/dia/4 semanas). A possível associação entre o polimorfismo ABCB1 C3435T e a expressão de RNAm também foi avaliada. Os estudos in vitro foram realizados com as células das linhagens HepG2 e Caco-2. Foram avaliados os efeitos da atorvastatina na ativação de fatores de transcrição (NF-kappaB, NF-Y, c-jun, SP-1 e PXR) por ensaio de mobilidade eletroforética retardada em gel de poliacrilamida (EMSA) e na meia-vida do RNAm do gene ABCB1 por RT-PCRq, e a expressão e atividade funcional da proteína ABCB1 por Western blot, imunohistoquimica e citometria de fluxo. A proteina ABCB1 foi localizada por imunohistoquimica na membrana apical do canalículo biliar das celulas HepG2 e na membrana apical das Caco-2. O tratamento das células HepG2 com atorvastatina causou redução da expressão de RNAm do gene ABCB1 e aumento na expressão dos genes ABCG2 e ABCC2. Esses efeitos foram dose e tempo dependentes. O tratamento com atorvastatina das células Caco-2 não modificou a expressão dos transportadores de efluxo após 30 a 120 min. Nas células HepG2, as concentrações de 10 e 20 M de atorvastatina causaram diminuição da expressão de ABCB1 (0 &#181;M: 1,00 ± 0,06; 10 &#181;M: 0,69 ± 0,25, p< 0,05; 20 &#181;M: 0,69 ± 0,06, p< 0,05). A atividade da ABCB1, avaliada pelo efluxo de Rh123, mostrou-se estar reduzida em 41% nas células HepG2, após tratamento com atorvastatina 20 &#181;M. Embora a diminuição da expressão do ABCB1 não tenha sido decorrente de uma menor ativação transcricional, avaliada indiretamente por EMSA, estudos de mecanismos de regulação pós-transcricionais, revelaram que a atorvastatina diminui a estabilidade de RNAm do gene ABCB1. Esse resultado parece estar de acordo com o ocorrido nas CMSP, já que o tratamento com atorvastatina diminuiu a expressão de RNAm do gene ABCB1 nos indivíduos HC. Essa modulação, no entanto não está associada à presença do polimorfismo ABCB1 C3435T. Em relação aos transportadores de captação, a expressão do SLC22A1 nas células Caco-2 diminui após tratamento com atorvastatina por 30 min e não foi modificada nas células HepG2. Já o gene SLCO2B1 encontrou-se muito aumentado após 24 h de tratamento nas células HepG2. Estudos in vivo nas CMSP, mostrou que a expressão de mRNA basal dos transportadores nos HC foi 10 vezes maior que nos NL e diminuiu após tratamento com atorvastatina nos HC. Com os resultados obtidos podemos sugerir que diferenças no efeito da atorvastatina nos tipos celulares podem ser em decorrência da expressão tecido-específica de fatores de transcrição. No modelo de hepatócito, HepG2, a atorvastatina é um inibidor do transporte mediado pela ABCB1 e é capaz de diminuir a síntese e a função da ABCB1, via aumento da degradação de RNAm do gene ABCB1. Em conseqüência ocorre uma redução do efluxo pelo sistema biliar, causando aumento da concentração intracelular. Ainda, podemos concluir que em CMSP o colesterol pode ser o responsável pela modulação dos genes dos transportadores de membrana e que isso pode implicar em diferenças na eficácia da atorvastatina. / Specific membrane transporters have a significant impact on drug absorption and disposition. Most of them belong to two super-families, ABC (ATP-binding cassette) and SLC (solute-linked carrier). Statins are important therapeutic agents in the management of hypercholesterolemia, and considerable inter-individual variation exists in response to its therapy. The effects of atorvastatin expression of efflux (ABCG2 and ABCC2) and uptake (SLCO1B1, SLCO2B1 and SLC22A1) drug transporters were investigated by qPCR in Caco-2 and HepG2 cell lines and in peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) of eighteen normolipidemic (NL) and twenty two hypercholesterolemic (HC) individuals treated with atorvastatin (10mg/day/4 weeks). The possible involvement of ABCB1 C3435T polymorphism in ABCB1 mRNA expression was also evaluated. In vitro studies with the cell lines HepG2 and Caco-2 were also performed. The effect of atorvastatin on the activation of the promoter of ABCB1 by transcription factors (NF-kappaB, NF-Y, c-jun, SP-1, and PXR) was evaluated by electrophoretic mobility shift assay (EMSA), and ABCB1 mRNA half-life were measured by PCRq. The expression and functional activity of ABCB1 were investigated by Western blot, imunohistochemistry and flow cytometry. Immunohystochemical analysis revealed that ABCB1 is located at the apical membrane of the bile canaliculi in HepG2, and in apical membrane of Caco-2 cells. Atorvastatin treatment of HepG2 cells caused a decreased in ABCB1 and an increase in ABCC2 and ABCG2 transcript levels. These effects were time and dose-dependent. Treatment of Caco-2 cells did not present any differences in efflux transporters mRNA levels. Treatment of HepG2 cells with 10 and 20 M atorvastatin caused a reduction on ABCB1 expression (0 &#181;M: 1,00 ± 0,06; 10 &#181;M: 0,69 ± 0,25, p< 0,05; 20 &#181;M: 0,69 ± 0,06, p< 0,05), and a 41% decrease in ABCB1-mediated efflux of Rhodamine123 (p < 0.01). Although reduced ABCB1 mRNA expression was not due to any repressor protein suppressing ABCB1 promoter activation, mRNA stability studies revealed that mRNA stability of ABCB1 was markedly decreased by atorvastatin treatment (2h versus 7h for control). In agrrement with these results, in PBMCs of HC individuals, atorvastatin treatment also reduced ABCB1 mRNA expression. However, the down-regulation was not associated with the presence of 3435T allele. For the uptake transporters, atorvastatin decreased SLC22A1 transcript levels after 30min-treatment and it was not regulated in HepG2. On the other hand, SLCO2B1 was up-regulated after 24h-treatment of HepG2 cells. In vivo studies with PBMCs revealed that during hypercholesterolemia all the drug transporters analyzed were increased almost 10-fold (p< 0.05), and after atorvastatin therapy the efflux and uptake transporters transcript levels were all down-regulated. These findings suggest that atorvastatin exhibits differential effects on mRNA expression of drug transporters depending on the cell type, which may be related to tissue-specific expression of transcription factors. Atorvastatin leads to decreased ABCB1 function and synthesis in HepG2 cells by increasing degradation of ABCB1 mRNA. Therefore, inhibition of ABCB1 may reduce atorvastatin elimination via bile, increasing its cellular concentrations. We also may suggest that in PBMCs cholesterol modulates mRNA expression of drug transporters, and this may contribute to the variability of response to atorvastatin.

A captação de maltose em bactérias é feita por um sistema transportador do tipo ABC composto por uma proteína ligadora de substrato (MalE), duas proteínas transmembrana e uma ATPase. No presente trabalho descrevemos a clonagem, expressão e análise bioquímica e estrutural da proteína MalE da bactéria fitopatogênica Xanthomonas axonopodis pv citri (Xac) O gene malE de Xac foi clonado em vetor de expressão pET28a, a proteína recombinante foi expressa em Escherichia coli e purificada por cromatografia de afinidade ao níquel. Amostras da proteína solúvel foram analisadas quanto à estrutura secundária, interação com possíveis ligantes, estabilidade frente a diferentes condições físico-químicas. Ensaios de cristalização possibilitaram a obtenção de cristais em diferentes condições, um deles apresentou grupo espacial P6122, mas não foi possível resolver a estrutura. Com base nas estruturas conhecidas de ortólogos de MalE, geramos um modelo estrutural para a proteína de Xac e foram feitas análises quanto à interação com trealose e maltose. Modelos estruturais dos componentes transmembrana (LacF e LacG) e ATPase (UgpC) do sistema transportador de maltose de Xac também foram gerados. Os resultados representam uma contribuição importante para o conhecimento sobre a fisiologia e sistemas de transporte de Xac. / Maltose uptake in bacteria is mediated by an ABC transporter comprising a substrate binding protein (MalE), two transmembrane proteins, and one ATPase. In the present study, we describe the cloning, expression and biochemical as well as structural analyses of the MalE protein of the phytopagen Xanthomonas axonopodis pv citri (Xac). The malE gene of Xac was cloned in the pET28a expression vector, the recombinant protein was expressed in Escherichia coli and, subsequently, purified by nickel affinity chromatography. Samples of soluble protein were analyzed regarding secondary structure, interaction with putative ligants and stability under different physico-chemical conditions. Crystallization trials were carried out under different conditions, one particular condition yielded crystal with a P6122space group, but the structure was not solved. Based on known ortholog structures, a structural model for Xac MalE was obtained allowing interaction with modeled threhalose and maltose. Structural models the transmembrane (LacF and LacG) and ATPase (UgpC) components were also obtained. The present results represent an important contribution to the knowledge of the physiology and transporter systems found in Xac.

Biliary excretion is an important elimination route for many drugs and metabolites. For such compounds, it is important to know the extent of excretion and drug exposure in the bile, e.g., for the risk assessment of drug interactions, liver toxicity and the effects of genetic variants. In this thesis, duodenal aspiration of bile was performed in healthy volunteers and complemented with experiments in an in vivo model in pigs to increase the understanding of the intestinal and hepatobiliary disposition of two direct thrombin inhibitors. The compounds investigated, ximelagatran and AZD0837, are both prodrugs that require bioactivation to exert their pharmacological effect. Upon co-administration with erythromycin and ketoconazole, respectively, altered plasma exposure to ximelagatran and AZD0837 and their respective metabolites has been observed. The main objective of this thesis was to characterize the biliary excretion of the compounds, and investigate whether this elimination route explains the observed drug-drug interactions. High plasma-to-bile AUC ratios were observed, in particular for ximelagatran, its active metabolite melagatran, and AR-H067637, the active metabolite of AZD0837. These high ratios indicate the involvement of active transporters in the biliary excretion of the compounds, which is important since transporters constitute possible sites for drug interactions. The effects of erythromycin and ketoconazole on the plasma exposure of the prodrugs and metabolites were confirmed in both the pig and the clinical studies. The changes seen in plasma for ximelagatran and its metabolites were partly explained by reduced biliary clearance. Inhibited CYP3A4 metabolism likely caused the elevated plasma levels of AZD0837, whereas reduced biliary clearance was seen for AR-H067637 suggesting an effect on its excretion into bile. In summary, the studies led to mechanistic insights in the hepatobiliary disposition of ximelagatran and AZD0837, and demonstrate the value of combined clinical and animal studies for the investigation of the biliary drug excretion.

Chez les procaryotes, les systèmes ABC (ATP-binding cassette) canoniques permettent un import efficace et de haute affinité du nickel, en grande partie via l'action de la Ni-BP (nickel-binding protein) qui va jouer le rôle de récepteur extracytoplasmique du nickel avant son passage à travers la membrane interne. Dans ces travaux, nous avons cherché à mieux caractériser les stratégies d'import de nickel par les bactéries, notamment par l'étude cristallographique des Ni-BP. La résolution des structures de cinq de ces protéines, en interaction avec du nickel, nous a permis d'identifier les sites de fixation et ainsi de mettre en évidence les différents modes d'interaction de ce métal avec les Ni-BP. Nos résultats montrent notamment que la coordination du nickel requiert toujours la présence d'un métallophore exogène, appelé nickelophore. En parallèle, des études in vivo ont été conduites sur Escherichia coli, montrant que cette bactérie semble être capable de synthétiser son propre nickelophore. D'autre part, ces travaux ont permis la résolution de la structure de HypB de Helicobacter pylori en interaction avec du nickel. Celle-ci permet de mieux appréhender le rôle central de cette protéine au sein des voies de maturation des enzymes à nickel. / In prokaryotes, canonical ABC (ATP-binding cassette) importers allow an efficient uptake of nickel with high affinity through the inner membrane, largely via the action of the extracytoplasmic nickel-binding protein (Ni-BP). In this work, we intended to better understand the strategies developed by bacteria to scavenge nickel in the environment, especially through the structural studies of several Ni-BP. The resolution of the crystal structures of five Ni-BPs from diverse bacteria, in interaction with nickel, led us to identify their nickel-binding sites and shed light on the different binding modes. Our results show that the presence of an exogenous metallophore, called nickelophore, is always required. In vivo studies in Escherichia coli were also conducted, showing that this bacteria seems to be able to synthesize its own nickelophore. In addition, we have solved the crystal structure of Helicobacter pylori HypB in complex with nickel. This result provides insight into its cellular function in nickel enzyme maturation pathways.

Submitted by Viviane Lima da Cunha (viviane@biblioteca.ufpb.br) on 2016-03-30T12:47:08Z No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 5765501 bytes, checksum: d810d02b334ee8a11679326d3a4f57aa (MD5) / Made available in DSpace on 2016-03-30T12:47:09Z (GMT). No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 5765501 bytes, checksum: d810d02b334ee8a11679326d3a4f57aa (MD5) Previous issue date: 2015-02-25 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / Ultraviolet radiation (UV) environmental levels have increased in last years and high values are expected until half of this century. Gametes and embryos of marine organisms, whose embryonic development occurs externally, are particularly sensitive to UVA and UVB radiations. The first line of cellular defense against chemical or physical stress is the activity of ABC transporters. The aim of present work was investigate the involvement of ABC transporters on UVA or UVB effects on gametes or embryos of the sea urchin Echinometra lucunter, and investigate the photoactivity and the ABC transporter blocker activity of coumarin and 3-hydroxycoumarin in gametes and embryos of E. lucunter. Gametes or embryos were exposed to UVA (3.6 – 14.4 kJ m-2) or UVB (0.112 – 14.4 kJ m-2), and the embryonic development was monitored by optical microscopy at different developmental stages in the presence or absence of the ABC-transporter blockers reversin205 (ABCB1 blocker) ou MK571 (ABCC1 blocker). E. lucunter eggs, spermatozoa and embryos were resistant to UVA exposure. Resistance to the harmful effects of UVB was strongly associated to ABC transporter activity (embryos > eggs > spermatozoa). ABCB1 or ABCC1 blockage promoted injurious effects on spermatozoa exposed to UVA. ABCC1 transporter blockage increased UVB-dependent damage in eggs while ABCB1 transporter inhibition increased harmful effects of UVB in embryonic cells. ABC transporters blockers also induced abnormalities in larval development derived from spermatozoa or eggs irradiated to UVB. However, ABC transporter activity was not affected by UVB exposure. Additionally, we demonstrate the photoprotective activity of coumarin and 3-hidroxycoumarin against the deleterious effects of UVB on E. lucunter gametes and embryonic cells, and the ABC transporter blocker activity of the 3-hydroxycoumarin. In conclusion, the present study is the first report of the protective role of ABC transporters against UVA and UVB injurious effects in sea urchins gametes and embryonic cells. Furthermore, our results inserts new alternative for the treatment of various diseases related to UVB excessive exposure and also provides alternatives for clinical reversal of multidrug resistance phenotype. / Os níveis ambientais de radiação ultravioleta (UV) têm aumentado significativamente nas últimas décadas e a tendência é que os valores elevados permaneçam até meados deste século. Gametas e embriões de organismos marinhos, cujo desenvolvimento embrionário ocorre no ambiente externo, são particularmente sensíveis às radiações UVA e UVB. A primeira linha de defesa desses organismos contra estresses químicos e físicos é a atividade de efluxo de bombas conhecidas como transportadores ABC. O objetivo do presente trabalho foi investigar o efeito fotoprotetor de transportadores ABC em gametas e embriões do ouriço-do-mar Echinometra lucunter expostos à UVA ou UVB, bem como investigar a fotoatividade e a atividade bloqueadora de proteínas ABC da cumarina e de seus derivados em gametas e embriões de E. lucunter. Os gametas ou embriões foram expostos à UVA (3,6 a 14,4 kJ m-2) ou à UVB (0,112 a 14,4 kJ m-2), na presença ou ausência dos bloqueadores de transportadores ABC: reversina205 (bloqueador de ABCB1); e MK571 (bloqueador de ABCC1). O desenvolvimento embrionário foi monitorado em microscopia óptica comum. Os gametas e zigotos de E. lucunter foram resistentes à UVA. A resistência das células supracitadas à UVB foi fortemente associada à intensidade da atividade dos transportadores ABC (zigotos > óvulos > espermatozoides). O bloqueio dos transportadores ABCB1 e ABCC1 promoveu inibição no desenvolvimento de embriões derivados de espermatozoides expostos à UVA. O bloqueio do transportador ABCC1 aumentou, em 35,9 + 5,8%, os danos aos óvulos expostos à UVB enquanto que o bloqueio de ABCB1 intensificou, em 36,1 + 2,7%, os danos aos zigotos, induzidos pela UVB. Os bloqueadores de transportadores ABC também induziram malformações ao desenvolvimento larval derivado de espermatozoides ou óvulos expostos à UVB. Entretanto, a atividade dos transportadores ABC não foi afetada pela exposição à UVB. Adicionalmente, demonstramos a atividade fotoprotetora da cumarina e seus derivados contra os efeitos deletérios da UVB em gametas e células embrionárias de E.lucunter, e a atividade bloqueadora de transportadores ABC da 3-hidroxicumarina. Em conclusão, o presente estudo é o primeiro relato do papel protetor de transportadores ABC contra os efeitos deletérios da UVA ou UVB em gametas e células embrionárias de ouriços-do-mar. Além disso, esse trabalho também relata, de forma inédita, a atividade fotoprotetora da cumarina e da 3-hidroxicumarina contra a UVB em gametas e embriões irradiados. Estudos posteriores serão necessários para a inserção terapêutica desses compostos para o tratamento de diversas enfermidades relacionadas com a exposição excessiva à UVB.

A eficácia das estatinas em reduzir o risco de eventos coronarianos não é completamente explicada por seus efeitos em diminuir colesterol de lipoproteína de baixa densidade (LDL-C). Um dos seus efeitos adicionais pode ser decorrente da modificação na concentração de lipoproteína de alta densidade (HDL), reconhecida como ateroprotetora, principalmente por seu papel no transporte reverso do colesterol (TRC). Os transportadores de membrana do tipo ATP-binding cassette, ABCA1 e ABCG1, e o scavenger receptor BI (SRBI) são proteínas importantes envolvidas no TRC e seus genes são regulados por vários fatores de transcrição, entre eles os liver-x-receptors (LXRs). Com a finalidade de avaliarmos os efeitos dos hipolipemiantes sobre expressão dos transportadores ABC e do receptor SRBI, a expressão de RNAm do ABCA1, ABCG1, SCARB1, NR1H3 (LXR&#945;) e NR1H2 (LRX&#946;) foi avaliada por PCR em tempo real em células das linhagens HepG2 (origem hepática) e Caco-2 (origem intestinal) tratadas com atorvastatina ou sinvastatina (10 µM) e/ou ezetimiba (até 5 µM) por até 24 horas. Além disso, a expressão desses genes também foi avaliada em células mononucleares do sangue periférico (CMSP) de 50 pacientes normolipidêmicos (NL) e 71 hipercolesterolêmicos (HC) tratados com atorvastatina (10mg/dia/4semanas, n=48) ou sinvastatina e/ou ezetimiba (10mg/dia/4 ou 8 semanas, n=23). A possível associação entre os polimorfismos ABCA1 C-14T e R219K e a expressão de RNAm em CMSP também foi avaliada por PCR-RFLP. O SCARB1 foi o gene mais expresso nas células HepG2 e Caco-2, seguido por NR1H2, NR1H3, ABCG1 e ABCA1 em HepG2 ou por ABCA1 e ABCG1 em Caco-2. O tratamento com estatinas (1 ou 10 µM) ou ezetimiba (5 µM), por 12 ou 24 horas, aumentou a expressão de RNAm do ABCG1, mas não de ABCA1 e SCARB1, em células HepG2. Ainda nesta linhagem, o aumento na transcrição dos genes NR1H2 e NR1H3 foi observado somente com a maior concentração de atorvastatina (10 µM) e, ao contrário, o tratamento com ezetimiba causou redução na transcrição de NR1H2, sem alteração de NR1H3. Em células Caco-2, o tratamento com atorvastatina ou sinvastatina por 12 ou 24 horas reduziu a quantidade do transcrito ABCA1 e não alterou a expressão do SCARB1 e do ABCG1, embora, para este último, tenha havido uma tendência à diminuição da expressão após tratamento com sinvastatina (p=0,07). Após tratamento com ezetimiba isolada (até 5 µM) nenhuma alteração de expressão de RNAm foi observada em células Caco-2; no entanto, após 24 horas de tratamento com sinvastatina e ezetimiba, foi reduzida a taxa de transcrição de ABCA1 e ABCG1, mas não de SCARB1. Ao contrário das linhagens celulares, em CMSP os genes NR1H2 e ABCG1 foram os mais expressos, seguidos pelos genes SCARB1 e ABCA1 e, finalmente, pelo NR1H3. Indivíduos HC tiveram maior expressão basal de NR1H2 e NR1H3, mas não de outros genes, quando comparados aos NL (p<0,05). Além disso, nos indivíduos HC, a expressão basal de ABCA1 foi maior em portadores do alelo -14T do polimorfismo ABCA1 -14C>T quando comparados aos portadores do genótipo -14CC (p=0,034). O tratamento com estatinas, com ezetimiba ou com a terapia combinada diminuiu a transcrição de ABCA1 e ABCG1. Para o SCARB1, NR1H2 e NR1H3, nenhuma alteração de expressão de RNAm em CMSP foi detectada após os tratamentos in vivo. Após todas as fases de tratamento, ABCA1 e ABCG1 e também NR1H2 e NR1H3 foram significativamente correlacionados entre si, mas nenhuma correlação com perfil lipídico sérico foi relevante. Coletivamente, esses resultados dão indícios de que os hipolipemiantes analisados (estatinas e ezetimiba) têm um importante papel na regulação da expressão de genes envolvidos no transporte reverso do colesterol e sugerem a existência de regulação tecido-específica para os dois transportadores ABC. Além disso, o efeito das estatinas ou da ezetimiba sobre a expressão do ABCA1, do ABCG1 ou do SCARB1 não sofreu influencia de alterações diretas da transcrição dos LXRs. / The efficacy of statins in reducing the risk of coronary events is not completely explained by their effects in decreasing cholesterol low-density lipoprotein (LDL-C). One of their additional effects may result from the change in concentration of high-density lipoprotein (HDL), recognized as atheroprotective, mainly for the role in reverse cholesterol transport (RCT). The membrane transporters, as ATP-binding cassette, ABCA1 and ABCG1, and scavenger receptor BI (SRBI) are important proteins involved in the RCT and their genes are regulated by various transcription factors, including the liver-X-receptors (LXRs) . In order to evaluate the effects of lipid lowering on expression of ABC transporters and SRBI receptor, the mRNA expression of ABCA1, ABCG1, SCARB1, NR1H3 (LXR&#945;) and NR1H2 (LRX&#946;) was assessed by real time PCR in HepG2 (hepatic origin) and Caco-2 (intestinal origin) cells treated with atorvastatin or simvastatin (10 µM) and/or ezetimibe (up to 5 µM) for 24 hours. Furthermore, the expression of these genes was evaluated in peripheral blood mononuclear cells (PBMC) of 50 normolipidemic (NL) and 71 hypercholesterolemic (HC) patients treated with atorvastatin (10mg/d/4 weeks, n = 48) or simvastatin and/or ezetimibe (10mg/d/4 or 8 weeks, n = 23). The possible association between ABCA1 C-14T and R219K polymorphisms and mRNA expression in PBMC was also evaluated by PCR-RFLP. SCARB1 was the most expressed in HepG2 and Caco-2 cells, followed by NR1H2, NR1H3, ABCG1 and ABCA1 in HepG2 or by ABCG1 and ABCA1 in Caco-2. The treatment with statins (1 or 10 µM) or ezetimibe (5 µM) for 12 or 24 hours, increased mRNA expression of ABCG1 but not ABCA1 and SCARB1 in HepG2 cells. Moreover, in HepG2 cells, atorvastatin also upregulated NR1H2 and NR1H3 only at 10.0 &#181;M, meanwhile ezetimibe downregulated NR1H2 but did not change NR1H3 expression. In Caco-2 cells, atorvastatin or simvastatin treatment for 12 or 24 hours reduced the amount of ABCA1 transcript and did not alter the ABCG1 and SCARB1 expressions, despite the tendency to decrease ABCG1 mRNA expression after simvastatin treatment (p = 0.07). After treatment with ezetimibe alone (up to 5 &#181;M) no change in mRNA expression was observed in Caco-2 cells; however, after 24 hours- simvastatin and ezetimibe treatments decreased the transcription of ABCA1 and ABCG1, but not of SCARB1. Unlike cell lines, in PBMC, NR1H2 and ABCG1 were the most expressed, followed by SCARB1 and ABCA1 and finally by the NR1H3. HC patients showed higher NR1H2 and NR1H3 basal expressions, but not of other genes, compared to NL (p <0.05). Moreover, in HC individuals, the ABCA1 basal expression was higher in individuals carrying -14T allele of -14C> T polymorphism when compared with -14CC carriers (p = 0.034). Treatment with statins, ezetimibe, or combined therapy downregulated ABCA1 and ABCG1 expression. For SCARB1, NR1H2 and NR1H3, no change in mRNA expression in PBMC was detected after treatments. After all phases of treatment, ABCA1 and ABCG1 as well as NR1H2 and NR1H3 were significantly correlated, but no correlation with serum lipid profile was relevant. Collectively, these results provide evidences that the lipid lowering (statins and ezetimibe) have an important role in mRNA expression regulation of genes involved in reverse cholesterol transport and suggest the existence of tissue-specific regulation for the ABC transporters. Furthermore, the effect of statins or ezetimibe on ABCA1, ABCG1 or SCARB1 expression was not directly influenced by changes of LXR transcription.

A captação de maltose em bactérias é feita por um sistema transportador do tipo ABC composto por uma proteína ligadora de substrato (MalE), duas proteínas transmembrana e uma ATPase. No presente trabalho descrevemos a clonagem, expressão e análise bioquímica e estrutural da proteína MalE da bactéria fitopatogênica Xanthomonas axonopodis pv citri (Xac) O gene malE de Xac foi clonado em vetor de expressão pET28a, a proteína recombinante foi expressa em Escherichia coli e purificada por cromatografia de afinidade ao níquel. Amostras da proteína solúvel foram analisadas quanto à estrutura secundária, interação com possíveis ligantes, estabilidade frente a diferentes condições físico-químicas. Ensaios de cristalização possibilitaram a obtenção de cristais em diferentes condições, um deles apresentou grupo espacial P6122, mas não foi possível resolver a estrutura. Com base nas estruturas conhecidas de ortólogos de MalE, geramos um modelo estrutural para a proteína de Xac e foram feitas análises quanto à interação com trealose e maltose. Modelos estruturais dos componentes transmembrana (LacF e LacG) e ATPase (UgpC) do sistema transportador de maltose de Xac também foram gerados. Os resultados representam uma contribuição importante para o conhecimento sobre a fisiologia e sistemas de transporte de Xac. / Maltose uptake in bacteria is mediated by an ABC transporter comprising a substrate binding protein (MalE), two transmembrane proteins, and one ATPase. In the present study, we describe the cloning, expression and biochemical as well as structural analyses of the MalE protein of the phytopagen Xanthomonas axonopodis pv citri (Xac). The malE gene of Xac was cloned in the pET28a expression vector, the recombinant protein was expressed in Escherichia coli and, subsequently, purified by nickel affinity chromatography. Samples of soluble protein were analyzed regarding secondary structure, interaction with putative ligants and stability under different physico-chemical conditions. Crystallization trials were carried out under different conditions, one particular condition yielded crystal with a P6122space group, but the structure was not solved. Based on known ortholog structures, a structural model for Xac MalE was obtained allowing interaction with modeled threhalose and maltose. Structural models the transmembrane (LacF and LacG) and ATPase (UgpC) components were also obtained. The present results represent an important contribution to the knowledge of the physiology and transporter systems found in Xac.

Molibdênio é um elemento traço envolvido na fixação de nitrogênio, enxofre e carbono. Oligopeptídeos estão envolvidos na nutrição bacteriana e diversos outros processos de sinalização intercelular. O objetivo do presente estudo foi investigar o papel funcional das proteínas ligadoras dos sistemas de captação de molibdato (ModA) e oligopeptídeo (OppA) em Xanthomonas axonopodis pv. citri em condições in vitro e in vivo. O mutante ModA mostrou uma produção diminuída de goma xantana, alteração do biofilme e adesão prejudicada em condições in vitro. In vivo a interação do mutante modA mostrou alterações nas lesões causadas em folhas de grapefruit possivelmente resultado da baixa expressão do gene gumB. O mutante na proteína OppA apresentou células mais co-agregadas alterando a estrutura do biofilme e consequentemente diminuindo sua capacidade de adesão. In vivo, a linhagem mutante não alterou o fenótipo de patogenicidade, mas a sua capacidade de crescimento foi afetada no início da fase estacionária sugerindo que o sistema Opp desempenha um papel nutricional. / Molybdenum is a trace element involved in nitrogen fixation, sulfur and carbon. Oligopeptides are involved in bacterial nutrition and several other intercellular signaling processes. The aim of this study was to investigate the functional role of binding proteins of molybdate (ModA) and oligopeptide (OppA) uptake systems of Xanthomonas campestris pv. citri in in vitro and in vivo conditions. ModA mutant showed a decreased production of xanthan gum, altered biofilm and adhesion impaired in vitro conditions. In vivo ModA mutant interaction showed changes in injuries on leaves of grapefruit possibly due to low expression of the gumB gene. The OppA mutant showed more cells co-aggregated by changing the structure of the biofilm and consequently reducing their capacity to adhere. In vivo, the mutant strain did not modify the phenotype of pathogenicity, but its ability for growth was affected at the early stationary phase suggesting that the Opp system plays a nutritional role.

Os transportadores de membrana do tipo ATP Binding Cassette (ABC) e solute carriers (SLC) regulam a homeostase intracelular de fármacos, modificando a biodisponibilidade e possivelmente a eficácia terapêutica. A variabilidade na resposta a hipolipemiantes, como as vastatinas, tem sido associada a vários fatores genéticos e ambientais. Com a finalidade de avaliarmos os mecanismos de regulação da expressão dos transportadores pela atorvastatina, a expressão de RNAm de transportadores ABC (ABCB1, ABCG2 e ABCC2) e SLC (SLCO1B1, SLCO2B1 e SLC22A1) foi avaliada por RT-PCRq em células mononucleares do sangue periférico (CMSP) de 18 indivíduos normolipidêmicos (NL) e 22 pacientes hipercolesterolêmicos (HC) tratados com atorvastatina (10mg/dia/4 semanas). A possível associação entre o polimorfismo ABCB1 C3435T e a expressão de RNAm também foi avaliada. Os estudos in vitro foram realizados com as células das linhagens HepG2 e Caco-2. Foram avaliados os efeitos da atorvastatina na ativação de fatores de transcrição (NF-kappaB, NF-Y, c-jun, SP-1 e PXR) por ensaio de mobilidade eletroforética retardada em gel de poliacrilamida (EMSA) e na meia-vida do RNAm do gene ABCB1 por RT-PCRq, e a expressão e atividade funcional da proteína ABCB1 por Western blot, imunohistoquimica e citometria de fluxo. A proteina ABCB1 foi localizada por imunohistoquimica na membrana apical do canalículo biliar das celulas HepG2 e na membrana apical das Caco-2. O tratamento das células HepG2 com atorvastatina causou redução da expressão de RNAm do gene ABCB1 e aumento na expressão dos genes ABCG2 e ABCC2. Esses efeitos foram dose e tempo dependentes. O tratamento com atorvastatina das células Caco-2 não modificou a expressão dos transportadores de efluxo após 30 a 120 min. Nas células HepG2, as concentrações de 10 e 20 M de atorvastatina causaram diminuição da expressão de ABCB1 (0 &#181;M: 1,00 ± 0,06; 10 &#181;M: 0,69 ± 0,25, p< 0,05; 20 &#181;M: 0,69 ± 0,06, p< 0,05). A atividade da ABCB1, avaliada pelo efluxo de Rh123, mostrou-se estar reduzida em 41% nas células HepG2, após tratamento com atorvastatina 20 &#181;M. Embora a diminuição da expressão do ABCB1 não tenha sido decorrente de uma menor ativação transcricional, avaliada indiretamente por EMSA, estudos de mecanismos de regulação pós-transcricionais, revelaram que a atorvastatina diminui a estabilidade de RNAm do gene ABCB1. Esse resultado parece estar de acordo com o ocorrido nas CMSP, já que o tratamento com atorvastatina diminuiu a expressão de RNAm do gene ABCB1 nos indivíduos HC. Essa modulação, no entanto não está associada à presença do polimorfismo ABCB1 C3435T. Em relação aos transportadores de captação, a expressão do SLC22A1 nas células Caco-2 diminui após tratamento com atorvastatina por 30 min e não foi modificada nas células HepG2. Já o gene SLCO2B1 encontrou-se muito aumentado após 24 h de tratamento nas células HepG2. Estudos in vivo nas CMSP, mostrou que a expressão de mRNA basal dos transportadores nos HC foi 10 vezes maior que nos NL e diminuiu após tratamento com atorvastatina nos HC. Com os resultados obtidos podemos sugerir que diferenças no efeito da atorvastatina nos tipos celulares podem ser em decorrência da expressão tecido-específica de fatores de transcrição. No modelo de hepatócito, HepG2, a atorvastatina é um inibidor do transporte mediado pela ABCB1 e é capaz de diminuir a síntese e a função da ABCB1, via aumento da degradação de RNAm do gene ABCB1. Em conseqüência ocorre uma redução do efluxo pelo sistema biliar, causando aumento da concentração intracelular. Ainda, podemos concluir que em CMSP o colesterol pode ser o responsável pela modulação dos genes dos transportadores de membrana e que isso pode implicar em diferenças na eficácia da atorvastatina. / Specific membrane transporters have a significant impact on drug absorption and disposition. Most of them belong to two super-families, ABC (ATP-binding cassette) and SLC (solute-linked carrier). Statins are important therapeutic agents in the management of hypercholesterolemia, and considerable inter-individual variation exists in response to its therapy. The effects of atorvastatin expression of efflux (ABCG2 and ABCC2) and uptake (SLCO1B1, SLCO2B1 and SLC22A1) drug transporters were investigated by qPCR in Caco-2 and HepG2 cell lines and in peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) of eighteen normolipidemic (NL) and twenty two hypercholesterolemic (HC) individuals treated with atorvastatin (10mg/day/4 weeks). The possible involvement of ABCB1 C3435T polymorphism in ABCB1 mRNA expression was also evaluated. In vitro studies with the cell lines HepG2 and Caco-2 were also performed. The effect of atorvastatin on the activation of the promoter of ABCB1 by transcription factors (NF-kappaB, NF-Y, c-jun, SP-1, and PXR) was evaluated by electrophoretic mobility shift assay (EMSA), and ABCB1 mRNA half-life were measured by PCRq. The expression and functional activity of ABCB1 were investigated by Western blot, imunohistochemistry and flow cytometry. Immunohystochemical analysis revealed that ABCB1 is located at the apical membrane of the bile canaliculi in HepG2, and in apical membrane of Caco-2 cells. Atorvastatin treatment of HepG2 cells caused a decreased in ABCB1 and an increase in ABCC2 and ABCG2 transcript levels. These effects were time and dose-dependent. Treatment of Caco-2 cells did not present any differences in efflux transporters mRNA levels. Treatment of HepG2 cells with 10 and 20 M atorvastatin caused a reduction on ABCB1 expression (0 &#181;M: 1,00 ± 0,06; 10 &#181;M: 0,69 ± 0,25, p< 0,05; 20 &#181;M: 0,69 ± 0,06, p< 0,05), and a 41% decrease in ABCB1-mediated efflux of Rhodamine123 (p < 0.01). Although reduced ABCB1 mRNA expression was not due to any repressor protein suppressing ABCB1 promoter activation, mRNA stability studies revealed that mRNA stability of ABCB1 was markedly decreased by atorvastatin treatment (2h versus 7h for control). In agrrement with these results, in PBMCs of HC individuals, atorvastatin treatment also reduced ABCB1 mRNA expression. However, the down-regulation was not associated with the presence of 3435T allele. For the uptake transporters, atorvastatin decreased SLC22A1 transcript levels after 30min-treatment and it was not regulated in HepG2. On the other hand, SLCO2B1 was up-regulated after 24h-treatment of HepG2 cells. In vivo studies with PBMCs revealed that during hypercholesterolemia all the drug transporters analyzed were increased almost 10-fold (p< 0.05), and after atorvastatin therapy the efflux and uptake transporters transcript levels were all down-regulated. These findings suggest that atorvastatin exhibits differential effects on mRNA expression of drug transporters depending on the cell type, which may be related to tissue-specific expression of transcription factors. Atorvastatin leads to decreased ABCB1 function and synthesis in HepG2 cells by increasing degradation of ABCB1 mRNA. Therefore, inhibition of ABCB1 may reduce atorvastatin elimination via bile, increasing its cellular concentrations. We also may suggest that in PBMCs cholesterol modulates mRNA expression of drug transporters, and this may contribute to the variability of response to atorvastatin.

L’Adrénoleucodystrophie liée à l’X est une maladie neurodégénérative rare due à des mutations dans le gène ABCD1. Ce gène code un demi-transporteur ABC peroxysomal, impliqué dans l’importation d’acides gras à très longue chaîne. Deux autres demi-transporteurs sont localisés dans la membrane peroxysomale : ABCD2 et ABCD3. La surexpression d’ABCD2 permet de compenser la déficience en ABCD1, ouvrant ainsi des perspectives thérapeutiques. Dans cette optique, l’objectif principal de ma thèse était d’étudier la fonction et la structure d’ABCD2, et plus largement des transporteurs ABC peroxysomaux.Les demi-transporteurs doivent au minimum se dimériser pour constituer un transporteur fonctionnel. Leur dimérisation alternative pourrait moduler leur spécificité de substrat. Afin de tester cette hypothèse, nous avons réalisé des constructions plasmidiques codant différents dimères chimériques, dont la fonctionnalité a été vérifiée par transfection transitoire dans deux modèles cellulaires (fibroblastes humains et levures). D’après nos résultats, ABCD1 et ABCD2 seraient fonctionnels quel que soit leur agencement dimérique. De plus, comme d’autres transporteurs ABC, les transporteurs ABC peroxysomaux pourraient s’oligomériser. En utilisant différentes techniques biochimiques (co-immunoprécipitation, sédimentation sur gradient de sucrose et électrophorèse en conditions natives), sur un modèle cellulaire surexprimant ABCD2-EGFP, nous démontrons qu’ABCD2-EGFP interagit avec ABCD1 et ABCD3, et que les transporteurs ABC peroxysomaux sont capables de s’oligomériser. Il reste désormais à déterminer les facteurs qui contrôlent cette oligomérisation et comprendre la valeur fonctionnelle de ces interactions. / X-linked Adrenoleukodystrophy (X-ALD) is a rare neurodegenerative disease caused by deficiency of the peroxisomal half-transporter ABCD1, implicated in very long chain fatty acids import. Two additional half-transporters are located in the peroxisomal membrane: ABCD2 and ABCD3. Over-expression of ABCD2 is known to compensate for ABCD1 deficiency, making ABCD2 a therapeutic target for X-ALD treatment. In this context, the main objective of my thesis was to investigate the function and the structure of ABCD2, and more broadly, of peroxisomal ABC transporters.Half-transporters must at least dimerize to form a functional transporter. Alternative dimerization could modulate substrate specificity. In order to test this hypothesis, we engineered plasmidic constructs encoding chimeric ABCD dimers, whose functionality has been evaluated by transient transfection in two cell models (human fibroblasts and yeasts). Our results show that, ABCD1 and ABCD2 are functional whatever their dimeric organization. Besides, like other ABC transporters, peroxisomal ABC transporters could oligomerize. By using a multi-technical approach (co-immunoprecipitation, velocity sucrose gradient and native polyacrylamide gel electrophoresis experiments) on stably transfected hepatoma cells expressing ABCD2-EGFP, we demonstrate that ABCD2-EGFP interacts with ABCD1 and ABCD3, and that peroxisomal ABC transporters oligomerize. The perspectives will consist in determining which factors control the oligomerization process and understanding the functional value of these interactions.