Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / This study investigated the effect of administration of cadmium (Cd), Rutin (Rut), or both, on lipid peroxidation in different brain structures, memory, anxiety and activity of the enzyme acetylcholinesterase (AChE) (ex vivo, in vitro and kinetic). The rats received Cd (2 mg / kg) and Rut (40 and 80 mg / kg) by gavage for 21 administrations on alternate days. To the ex vivo study, the animals were divided into six groups (n = 10): saline/saline, saline/Rut40, saline/Rut80, Cd/saline, Cd/Rut40 and Cd/Rut80. The trials of AChE in vitro were performed at concentrations of 1, 5, 10, 25 and 50 mM of Rut in rat brain homogenate controls. The same concentrations were used for kinetic analysis of Electroforus electricus (E.e.AChE). Cd increased lipid peroxidation in all structures analyzed except in the striatum. Rut reversed this effect only in the hypothalamus and hippocampus. Cd caused a decrease in test step-down latency and administration of Rut (40 and 80 mg/kg) reversed this effect of Cd. Cd increased the number and the percent of entries in enclosed arms of plus-maze, suggesting an anxiogenic effect of Cd. Rut (40 and 80 mg/kg) reversed the anxiogenic effect of Cd. Rats that were exposed to Cd and/or treated with Rut showed no altered sensitivity to shock, nor the locomotor activity. The ex vivo activity of the enzyme AChE increased in the cortex and hypothalamus of rats that received only Cd. Rut reversed this increase in both doses. In vitro activity of the enzyme AChE was inhibited at all concentrations of synaptosome cortex, cerebellum, striatum, hippocampus and hypothalamus. The kinetic analysis of the interaction between the Rut and E.e.AChE showed a competitive inhibition. The findings show that treatment with Rut decreased oxidative damage to the membrane, prevented the increase in AChE activity, reversed the memory deficit and anxiety caused by Cd. Moreover, characterized Rut as an inhibitor of AChE, showing that this flavonoid may modulate cholinergic neurotransmission and, consequently, improve cognition. / O presente estudo investigou o efeito da administração de Cádmio (Cd), de Rutina (Rut) ou de ambos, na peroxidação lipídica em diferentes estruturas encefálicas, na memória e ansiedade e na atividade da acetilcolinesterase (AChE) (ex vivo, in vitro e cinética) em ratos. Os animais receberam Cd (2 mg / kg) e Rut (40 e 80 mg / kg) por gavagem diariamente por 21 administrações em dias alternados. Os ratos do estudo ex vivo, foram divididos em seis grupos (n = 10): salina/salina, salina/Rut40, salina/Rut80, Cd/salina, Cd/Rut40 e Cd/Rut 80. Os ensaios da AChE in vitro foram realizados nas concentrações de 1, 5, 10, 25 e 50 μM de Rut em homogeneizado de encéfalo de ratos controles. As mesmas concentrações foram utilizadas para a análise cinética de Electroforus electricus (E.e. AChE). O metal aumentou a peroxidação lipídica em todas as estruturas analisadas exceto no estriado. A Rut reverteu esse efeito somente no hipotálamo e hipocampo. Houve uma piora da memória no grupo que recebeu somente Cd, porém a Rut reverteu essa diminuição de memória tanto nas doses de 40 quanto na de 80 mg/kg. O Cd teve efeito ansiogênico e a Rut reverteu esse comportamento em ambas as doses. A sensibilidade ao choque e a atividade locomotora não foram alteradas nos ratos que foram expostos ao Cd e/ou tratados com Rut. A atividade ex vivo da enzima AChE aumentou no córtex e no hipotálamo dos ratos que receberam somente cádmio. A Rut reverteu esse aumento em ambas as doses. A atividade in vitro da enzima AChE foi inibida em todas as concentrações em sinaptossoma de córtex, no cerebelo, no estriado, no hipocampo e hipotálamo. A análise cinética da interação entre Rut e E.e.AChE caracterizou uma inibição competitiva. Os achados do presente estudo demonstram que o tratamento com Rut diminuiu os danos oxidativos à membrana, impediu o aumento da atividade da AChE, reverteu o déficit de memória e a ansiedade causados pelo Cd. Além disso, caracterizou o composto como um inibidor da AChE , demonstrando que este flavonóide pode modular a neurotransmissão colinérgica e, conseqüentemente, melhorar a cognição.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / In recent years there has been an increase in researches for new enzyme inhibitors on medicinal plants used in the treatment of disorders such as schizophrenia, anxiety, amnesia, different stages of depression and bipolar affective disorder. The study of enzymatic inhibitors of prolyl oligopepetidase (POP) and acetylcholinesterase (AChE) are directly related to the treatment of central nervous sistem diseases. In a research with the species Hypericum brasiliense, native from Brazil, it was isolated as main secondary metabolite the chlorogenic acid, a compound able to inhibit POP and AChE. From this observation, three series of chlorogenic, caffeic and cinnamic acids derivatives were obtained through simple derivatization reactions and coupling with the amino acid proline. The derivatives were obtained by usual acetylation, methylation and esterification reactions with satisfactory yields of 50-90%. The couplings with the proline methyl ester were performed using either O-(7- azabenzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HATU)/ diisopropylethylamine (DIEA) in dimethylformamide or isobutyl chloroformate/ Nmethylmorpholine in tetrahydrofuran. The derivatives were tested against the enzymes POP, AChE and dipeptidyl oligopeptidase (DPP IV). Also, a study was conducted to determine the antibacterial and antifungal activities of all derivatives. The capacity of the tested compounds to inhibit DPP IV and AChE was not exceptional. In contrast, the derivatives methyl ester and 1,7-acetonide obtained from chlorogenic acid, and caffeic acid and its methyl ester derivative showed selectivity and satisfactory performance as POP inhibitors, with IC50 values of 3 to 14 μM. All compounds showed moderate antimicrobial activity. / Nos últimos anos observa-se uma intensificação nas pesquisas por novos inibidores enzimáticos produzidos por plantas medicinais usadas no tratamento de transtornos mentais, tais como esquizofrenia, ansiedade, amnésia, diferentes estágios de depressão e o transtorno afetivo bipolar. O estudo de inibidores das enzimas prolil oligopepetidase (POP) e acetilcolinesterase (AChE), estão diretamente relacionados ao tratamento de tais enfermidades do sistema nervoso central (SNC). Em um trabalho com a planta medicinal Hypericum brasiliense, nativa do Brasil, foi isolado como um dos principais metabólitos secundários o ácido clorogênico, que demonstrou ter capacidade de inibir a POP e a AChE. A partir desta observação, foram obtidas três séries de derivados do ácido clorogênico, do ácido cafeico e do ácido cinâmico através de técnicas simples de derivatização e acoplamento com a prolina metil éster. Os derivados foram obtidos através de técnicas usuais de acetilação, metilação e esterificação, com rendimentos satisfatórios de 50-90 %. Já os acoplamentos com a prolina metil éster foram realizados com hexafluorofosfato de O-(7-azabenzotriazol-1-il)-N,N,N',N'- tetrametiluronio (HATU)/ diisopropiletilamina (DIEA) em dimetilformamida ou cloroformato de isobutila/ N-metilmorfolina em tetraidrofurano. Estes compostos foram avaliados quanto à capacidade inibitória das enzimas POP e AChE, bem como foram testados frente a enzima dipeptidil peptidade IV (DPP IV). Também foi realizado um estudo da atividade antimicrobiana dos derivados obtidos. Os resultados obtidos indicaram que, frente à DPP IV e AChE, os compostos avaliados não demonstraram significativa capacidade inibitória. Entretanto, o derivado metil éster e 1,7-acetonídeo obtidos a partir do ácido clorogênico, o cafeoato de metila e o próprio ácido cafeico mostraram capacidade inibitória seletiva para a POP, com valores de IC50 entre 3 e 14 μM. Com relação à atividade antimicrobiana, os derivados apresentaram moderada ação bactericida, destacando-se os compostos derivados do ácido cinâmico por serem fungicidas.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / The phytochemical investigation of methanol crude extract of the stem bark of the species Helietta apiculata Benth and Zanthoxylum fagara (L.) Sarg., Rutaceae, provided the isolation of thirty-one compounds. The species H. apiculata were isolated eight furoquinolínicos alkaloids (8, 9, 10, 11, 12, 13, 15 and 24) and one quinolinone (22), six coumarins (51, 52, 53, 58, 115 and 116), 116 first identified in the literature, three cinnamates (121, 122 and 123), two lignans (98 and 123), a limonoid (92), a long-chain acid (126), a steroid (80) and a mixture terpenes (T39). Two benzophenantridine alkaloids (33 and 34), five amides (69, 70, 117, 118 and 119), and a lignan (124) have been identified in species Z. fagara, along with the steroid 80. The cinnamate 120, 123 and the lignan 119 were first identified as a natural product. The cinnamate 122 and coumarin 115 are first described in H. apiculata species, while the amide 115 is first described in the genus Zanthoxylum, and 119 for the first time in the species Z. fagara. Lignans 98, 123 and 124 are identified in the Rutaceae family first time. The limonoid 92 was subjected to structural modifications through aminolysis reactions with various amines, providing fifteen derivatives, which when subjected to evaluation of the antimicrobial potential demonstrated greater power to inhibition of microorganisms that limonoid. Other derivatives obtained during this study was the acetylation and oxidation products of tembamida (69) amide and methylating the flindersiamina (15) alkaloid. Extracts, fractions and products were subjected to analysis of antimicrobial potential and inhibition of AChE enzyme. The alkaloids showed inhibition potential only for gram-positive bacteria, whereas coumarins were compounds which had the largest range of antimicrobial activities front fungi, Gram-negative and Gram-positive. Inhibition of acetylcholinesterase enzyme was significant only for fractions: ether basic H. apiculata, basic butanol, final aqueous and aqueous extract from the leaves Z. fagara with inhibition values ranging from 58,24% to 74,34% while for isolates the results were not significant. / A investigação fitoquímica do extrato bruto metanólico das cascas do caule das espécies Helietta apiculata Benth e Zanthoxylum fagara (L.) Sarg., Rutaceae, levaram ao isolamento de trinta e um compostos. Da espécie H. apiculata foram identificados oito alcaloides furoquinolínicos (8, 9, 10, 11, 12, 13, 15 e 24), um quinolinona (22), seis cumarinas (51, 52, 53, 58, 115 e 116) sendo a 116 identificada pela primeira vez na literatura, três cinamatos (121, 122 e 123), duas lignanas (98 e 123), um limonoide (92), um ácido de cadeia longa (126), um esteroide (80) e uma mistura de terpenos (T39). Dois alcaloides benzofenantridínicos (33 e 34), cinco amidas (69, 70, 117, 118 e 119) e uma lignana (124) foram identificados na espécie Z. fagara, juntamente com o esteroide 80. O cinamato 120, a lignana 123 e a amida 119 foram identificados pela primeira vez como produto natural. O cinamato 122 e a cumarina 115 são descritos pela primeira vez na espécie H. apiculata, enquanto a amida 115 é descrita pela primeira vez no gênero Zanthoxylum, e 119 pela primeira vez na espécie Z. fagara. As lignanas 98, 123 e 124 são identificadas na família Rutaceae pela primeira vez. O limonoide 92 foi submetido a modificações estruturais através de reações de aminólise com diferentes aminas, proporcionando quinze derivados, que quando submetidos à avaliação do potencial antimicrobiano demonstraram maior poder de inibição dos microrganismos que o limonoide. Outros derivados obtidos durante este trabalho foram os produtos da acetilação e a oxidação da amida tembamida (69), e a metilação do alcaloide flindersiamina (15). Os extratos, frações e produtos obtidos foram submetidos a analise do potencial antimicrobiano e de inibição da enzima AChE. Os alcaloides apresentaram potencial de inibição apenas para bactérias gram-positivas, enquanto as cumarinas foram os compostos que apresentaram o maior leque de atividades antimicrobianas frente a fungos, bactérias gram-negativas e gram-positivas. A inibição da enzima Acetilcolinesterase foi relevante apenas para as frações: etérea básica de H. apiculata, butanólica básica, aquoso final e extrato aquoso a partir das folhas de Z. fagara com valores de inibição entre 58,24% a 74,34% enquanto para os produtos isolados os resultados não foram significativos.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Acute lymphoblastic leukemia (ALL) is the most common cancer found in the pediatric population and is characterized by uncontrolled proliferation and maturation arrest of lymphoid progenitor cells (lymphoblasts) in the bone marrow. In ALL occurs an increase in the production of reactive species and studies show the involvement of oxidative stress in ALL pathogenesis. Moreover acetylcholinesterase (AChE) present in blood and plasma and also in lymphocytes is well established as having non-cholinergic functions including development of cancer and its contribution to the regulation of immune function. Considering such statements, it was investigated the oxidative profile and ACHE activity in ALL patients. Eighty two ALL patients and 50 healthy subjects participated in this study. Patients were divided into 4 groups: newly diagnosed (ND) remission induction (RI), remission maintenance (RM) and out-of-treatment (OT). For evaluation of the oxidative profile, we determined the catalase (CAT) and superoxide dismutase (SOD) activities in blood, thiols non protein (NPSH) in plasma and erythrocytes, as well as, vitamin E, TBARS and protein carbonyl content from serum samples. Damage markers in lipids and proteins, represented by MDA levels and protein carbonylation content respectively, showed increased levels in patients when compared with the control group. In relation to enzymatic defense, represented by the enzymes SOD and CAT, it was observed a decrease in the activities in ALL patients in groups RD, RI and RM, coming back to the normal in OT group. Non enzymatic defense (NPSH in plasma and vitamin E) analyzed also revealed decrease in ALL patients in relation to the controls. No significant difference in NPSH levels was observed between RD group and control group. In relation to AChE activity, in both total blood and lymphocytes, was observed an increase in the RD group in relation to the other groups. On the other hand, in RI and RM the enzyme activity was diminished in relation to control group. No significant difference was observed in AChE activity between FT group and the control group. The results suggest that in ALL an excessive accumulation of reactive species contributes to an antioxidant depletion and dysfunction. The results had also disclosed that the AChE activity is modified in ALL, what can suggest the involvement of this enzyme in the modulation of immune function and in cancer development. The ALL results in a systemic disorder that induces changes, which can be detected by mesuring the peripheral markers of oxidative stress and AChE activity in whole blood and lymphocytes. / A leucemia linfoblástica aguda (LLA) é o câncer mais comum na infância e é caracterizado por uma proliferação descontrolada de células linfóides imaturas (linfoblastos) na medula óssea. Na LLA há uma produção elevada de espécies reativas e estudos relatam que o estresse oxidativo está envolvido na patogenia desta doença. Além disso, a enzima acetilcolinesterase (AChE) presente no sangue e no plasma, inclusive nos linfócitos, desempenha funções não colinérgicas e parece estar envolvida na regulação da função imune e no desenvolvimento do câncer. Levando em consideração tais afirmativas, este trabalho investigou o perfil oxidativo e a atividade da enzima AChE em pacientes com LLA. Participaram do estudo 82 pacientes com LLA e 50 indivíduos controles. Os pacientes foram divididos em 4 grupos: recém diagnosticado (RD), indução da remissão (IR), manutenção da remissão (MR) e fora de tratamento (FT). Para avaliação do perfil oxidativo, determinou-se a atividade da catalase (CAT) e da superóxido dismutase (SOD) em sangue total, os níveis de tióis não protéicos (NPSH) em plasma e eritrócitos, bem como, a concentração de vitamina E, substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) e o conteúdo de proteína carbonil em amostras de soro da população estudada. Os marcadores de danos oxidativos em lipídeos e proteínas, representados pelos níveis de MDA e conteúdo de proteína carbonil mostraram-se elevados nos pacientes quando comparados ao grupo controle. Em relação aos antioxidantes enzimáticos, representados pelas enzimas SOD e CAT, observou-se uma diminuição nas atividades das mesmas nos pacientes com LLA nos grupos RD, IR E MR voltando ao normal no grupo FT. Os antioxidantes não enzimáticos analisados (NPSH em plasma e vitamina E) também se mostraram diminuídos nos pacientes em relação aos controles. Nenhuma diferença nos níveis de NPSH em eritrócitos foi encontrada entre o grupo RD e o grupo controle. Em relação à atividade da AChE, observou-se um aumento nos pacientes do grupo RD em relação aos demais grupos tanto em sangue total quanto em linfócitos. Já, nos grupos IR e MR a atividade da enzima encontrou-se diminuída em relação ao grupo controle. Não houve diferença significativa na atividade da AChE entre o grupo FT e o grupo controle. Os resultados sugerem que na LLA, ocorre acumulação excessiva de espécies reativas levando a depleção ou disfunção das defesas antioxidantes tanto enzimáticas quanto não enzimáticas. Os resultados também revelaram que a atividade da AChE está modificada na LLA, o que pode sugerir o envolvimento desta enzima na modulação da função imune e no desenvolvimento do câncer. Conclui-se então que na LLA ocorrem mudanças sistêmicas, as quais podem ser detectadas pela medida de marcadores periféricos do estresse oxidativo e pela atividade da AChE em linfócitos e sangue total.

Made available in DSpace on 2014-12-17T14:02:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 PaulaIM.pdf: 2175384 bytes, checksum: 7697a3aa18d03cba26e4a0d38dbd3b26 (MD5) Previous issue date: 2009-10-05 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Cient?fico e Tecnol?gico / Methomyl (Lannate?) is an insecticide from the carbamate group, frequently used in pest control in various types of crops. This compound works inhibiting the activity of the enzyme acetylcholinesterase. The use of physicochemical and ecotoxicological analysis is the most efficient strategy for the correct characterization and control of residues of metomil. The main objectives of this study were to evaluate the acute toxicity of methomyl in 96 hours of exposure and, through a sublethal assay of 5 hours, to assess its effect on the activity of acetylcholinesterase present in brain and squeletic dorsal muscle of the Danio rerio fish. The results showed that the LC50-96 found to D. rerio was 3.4 mg/L and it was found through the average of four definitive tests. In vitro assays were used to test the inhibitory action of methomyl directly over soluble AChE, extracted from the squeletic dorsal muscle, with maximum inhibition of 68.57% to the insecticide concentrations of 0.2 mg/L. In sublethal tests with D. rerio, inhibitory effect of methomyl was found over the soluble form of AChE in the squeletic dorsal muscle, both in one and five hours of fish exposure to the insecticide. In both period, the average values of inhibition were around 61%. In the same condition, no significant inhibitory effect of methomyl soluble and membrane AChE of the D. rerio was observed in the 0.42, 0.85, 1.70 and 2.50 mg/L concentrations and in both times of fish exposure / O Metomil (Lannate?) ? um inseticida do grupo dos carbamatos utilizado no combate a pragas em diversos tipos de lavouras, sua forma de a??o ? atrav?s da inibi??o da enzima acetilcolinesterase. Para uma caracteriza??o adequada e controle de seus despejos, a estrat?gia mais eficiente ? o uso integrado de an?lises qu?micas, f?sicas e ecotoxicol?gicas. O presente trabalho teve por objetivo avaliar a toxicidade aguda em 96h do metomil, e atrav?s de um ensaio subletal de cinco (5) horas, estimar o seu efeito sobre a atividade da acetilcolinesterase no c?rebro e m?sculo esquel?tico dorsal da esp?cie Danio rerio. Os resultados demonstraram que no Danio rerio o valor da CL-50-96h encontrada foi de 3,40 mg/L, obtida atrav?s da m?dia de quatro testes realizados. Nos ensaios in vitro foi atestada a a??o inibit?ria da metomil diretamente sobre a AChE sol?vel extra?da do m?sculo esquel?tico dorsal do D. rerio com uma inibi??o m?xima de 68,57 % para a concentra??o de 0,2 mg/L do inseticida. Nos testes subletais com D. rerio foi constatado o efeito inibit?rio do metomil sobre a forma sol?vel da AChE de m?sculo esquel?tico dorsal, tanto em uma como em cinco horas de exposi??o do peixe ao inseticida. Em ambos os hor?rios os valores m?dios de inibi??o foram em torno de 61%. Nas mesmas condi??es n?o foi observada inibi??o significativa da atividade da AChE de membrana do m?sculos. N?o foi observado efeito inibit?rio do metomil sobre as AChE sol?vel e de membrana de c?rebro de D. rerio, nas concentra??es 0,42, 0,85, 1,70, 2,50 mg/L e em ambos os hor?rios de exposi??o dos peixes

Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / A hipertensÃo, uma das doenÃas mais comuns em todo o mundo, Ã uma doenÃa crÃnica onde a pressÃo sanguÃnea elevada pode afetar a saÃde. A enzima conversora de angiotensina I (ECA) pode aumentar a pressÃo arterial atravÃs da conversÃo da angiotensina I no potente vasoconstritor angiotensina II. Sendo assim, a inibiÃÃo da atividade da ECA Ã considerada uma abordagem terapÃutica Ãtil para combater a hipertensÃo. Alpinia zerumbet, uma planta aromÃtica abundante no nordeste do Brasil, Ã comumente utilizada na medicina popular devido suas propiedades diurÃticas e hipotensivas. AlÃm disso, vÃrios estudos relatam atividade antihipertensiva para esta espÃcie. Dessa forma, Alpinia zerumbet pode ser uma importante fonte de inibidores de ECA. Sabendo disso, resolveu-se investigar os extratos dos rizomas desta espÃcie na busca de compostos inibidores de ECA. A prospecÃÃo quÃmica do extrato hexÃnico do rizoma permitiu o isolamento de cinco substÃncias: Um estilbeno denominado (E)-3,5-dimetoxiestilbeno, inÃdito na espÃcie em estudo; um diterpeno de esqueleto labdano denominado (E)-15,16-bis-norlabda-8,11-dieno-13-ona; uma chalcona denominada 2â,4â-dihidroxi-6â-metoxi-3â-(3ââ-metil-6ââ-metil-etil-2ââ-ciclohexenil)chalcona; um esterÃide denominado β-sitosterol, comumente encontrado em plantas; e um hidrocarboneto aromÃtico da classe kavapirona denominado 5,6-dehidrokawain. Na determinaÃÃo estrutural dos compostos isolados, foram empregadas tÃcnicas espectromÃtricas de anÃlise unidimensionais [ressonÃncia magnÃtica nuclear (RMN) de 1H e 13C, e tÃcnicas bidimensionais (1H-1H-COSY, HSQC, HMBC, NOESY). TambÃm foram realizados os testes de inibiÃÃo da enzima conversora de angiotensina, antioxidante, de inibiÃÃo da enzima acetilcolinestarase e larvicida dos extratos hexÃnicos e etanÃlicos dos rizomas de Alpinia zerumbet. Os dois extratos apresentaram potencial de inibiÃÃo da enzima conversora de angiotensina e antioxidante. Somente o extrato hexÃnico apresentou atividade larvicida, com CL50 823,1 ppm. Nenhum dos extratos em estudo apresentou potencial de inibiÃÃo da enzima acetilcolinesterase. / Hypertension is one of the most common diseases in the world, is a chronic disease in which high blood pressure can affect health. The angiotensin I converting enzyme (ACE) can increase blood pressure through the conversion of angiotensin I to the potent vasoconstrictor, angiotensin II. Thus, inhibition of ACE activity is considered a useful therapeutic approach to combat hypertension. Alpinia zerumbet, a herb abundant in northeastern Brazil, is commonly used in folk medicine due to its diuretic and hypotensive properties. Moreover, several studies reported for this species antihypertensive activity. Thus, Alpinia zerumbet can be an important source of ACE inhibitors. Knowing this, we decided to investigate the extracts of the rhizomes of this species in the search for compounds ACE inhibitors. Prospecting chemical hexane extract of the rhizome allowed the isolation of five substances: A stilbene, named (E) -3,5-dimethoxystilbene, unprecedented in the species in this study, a labdane diterpene skeleton called (E) -15.16-bisnorlabda- 8,11-diene-13-one; one chalcone called 2â,4â-dihydroxy-6â-methoxy-3â-(3ââ-methyl-6ââ- methyl - ethyl -2ââ-cyclohexenyl) chalcone; a steroid called β-sitosterol, commonly found in plants, and an aromatic hydrocarbon class kavapirone, called 5,6- dehidrokawain. In the structural determination of individual compounds, spectrometric techniques were employed dimensional analysis [nuclear magnetic resonance (NMR) 1H and 13C and two dimensional techniques (1H-1H COSY, HSQC, HMBC, NOESY). Inhibition angiotensin converting enzyme, antioxidant potential, inhibition of acetilcolinestarase and larvicidal tests of ethanol and hexane extracts of the rhizomes of Alpinia zerumbet were tested. The two extracts showed potential for inhibition of angiotensin converting enzyme and antioxidant potential. Only the hexane extract showed larvicidal activity with LC50 823.1 ppm. None of the extracts studied showed potential inhibition of the enzyme acetylcholinesterase.

Aquatic environments are ecosystems that most affected impacts caused by anthropogenic action, since it is the final compartments of various products produced by human activity. This study evaluated the fish specie Serrasalmus brandtii (pirambeba), collected at two sites in the Itaparica reservoir (Brazil) during March/12 to January/2013 through biochemical and genotoxic biomarkers. Around the reservoir resettlement areas exist with agricultural practices using agrochemicals. Thus, the study aimed to use S. brandtii as specie sentinel for this region of the Sao Francisco river. There was no significant difference in the physicochemical parameters measured such as temperature and dissolved oxygen over the sample period. Among the morphological parameters, the masses of the specimens varied between sampling period. Acetylcholinesterase (AChE) and butyrylcholinesterase (BChE) activities were quantify on the brain and muscle specimens collected from the two sites. Brain AChE from pirambeba collected at site 1 showed a significant decay in specific activity over the study period, however protein content did not show the same profile. Brain BChE specific activity had significant variation during the sampling period. On the contrary, pirambeba collected at site 2 showed no significant difference in the brain AChE specific activity and protein content. Brain BChE of these specimens showed significant variation on the specific activity values. On muscle tissue, pirambeba collected at site 1 showed significant variation in the values of AChE specific activity as well as on the protein content during the sample period. BChE specific activity on the muscle also had significant variation. Pirambeba collected at site 2 showed significant variation on muscle AChE specific activity and protein content values over the analyzed period. For muscle BChE activity,values, the results showed pattern similar to the one observed on site 1. Genotoxicity assays were performed on pirambeba erythrocyte cells collected at two sites. The results showed frequency of micronuclei (MN) and significant variation between the mean frequencies of MN over the study period was observed. Nuclear abnormalities (NA) were also analyzed and the results indicated that pirambeba the site 1 had higher nuclear abnormalities frequencies than the pirambeba from site 2. The Comet assay indicated that majority of erythrocyte nuclei analyzed from both sites shown class 1damage indicating slight DNA damage. In vitro studies were also performed for the characterization of brain AChE from pirambeba and kinetic assays showed values of 0.324 ± 0.04 mmol /L and 0.709 ± 0.014 mmol / min-1.mg protein for the apparent kinetic constants Kmapp and Vmáxapp respectively. Brain AChE inhibitory assays showed that muscle AChE (0.362±0.2 μM) was more sensitive to carbamate eserine that brain AChE (0.887 ± 0.1 μM) AChE and when compared brain AChE between eserine (0.887 ± 0,1μM) and glyphosate (2,276 ± 0,02μM), there was a greater sensitivity for brain AChE with eserine. We conclude that among the biomarkers genotoxic tested, the results showed that the MN test was considered the most sensitive; S. brandtii specie can be a specie sentinel for the submedium San Francisco region, since was present in all samples of the river, even during the most severe period of drought and low water level, but also by having a direct relationship with the AChE activity and forming MN. / Ambientes aquáticos são ecossistemas que mais sofrem impactos causados pela ação antropogênica, uma vez que constitui compartimentos finais de vários produtos gerados pela atividade humana. O presente trabalho avaliou a espécie de peixe Serrasalmus brandtii (pirambeba), coletada em dois sítios no reservatório Itaparica (Brasil) durante o período de março/12 a janeiro de 2013 através de biomarcadores bioquímicos e genotóxicos. No entorno do reservatório existem reassentamentos com práticas agrícolas empregando agroquímicos. Desta forma, o trabalho visou a utilização de S. brandtii como sentinela no rio Sao Francisco. Não houve diferença marcante nos parâmetros físico-químicos temperatura e oxigênio dissolvido mensurados ao longo do período amostral. Entre os parâmetros morfológicos, as massas dos espécimes variaram entre os meses de amostragem. Foi realizada quantificação de atividade acetilcolinesterase (AChE) e butirilcolinesterase (BChE) cerebral e muscular de espécimes coletados nos dois sítios. AChE cerebral de pirambeba coletada no sítio 1 apresentou decaimento significativo na atividade específica ao longo do período estudado, no entanto o conteúdo protéico não mostrou o mesmo perfil. A atividade específica BChE cerebral mostrou variação significativa durante o período de amostragem. Todavia, pirambeba coletada no sítio 2 não mostrou diferença significativa na atividade específica de AChE cerebral e conteúdo protéico. BChE cerebral nesses espécimes apresentou variação significativa nos valores de atividade específica. No tecido muscular, pirambeba coletada no sítio 1 apresentou variação significativa nos valores de atividade específica AChE, bem como conteúdo protéico durante período amostrado. A atividade específica de BChE muscular também teve variação significativa. Espécimes coletadas no sítio 2 apresentaram variação significativa na atividade específica da AChE muscular e no conteúdo protéico ao longo do período estudado. Para valores de atividade de BChE muscular, os resultados apresentaram um padrão semelhante ao observado no sítio 1. Os ensaios genotóxicos foram realizados em eritrócitos de pirambeba coletadas nos dois sítios. Os resultados mostraram frequência de micronúcleos (MN) e variação significativa entre as freqüências de MN foi observada ao longo do período estudado. Anormalidades nucleares (AN) também foram analisadas e resultados indicaram que espécimes do sítio 1 tiveram maiores freqüências de AN do que espécimes do sítio 2. O ensaio Cometa indicou que a maioria dos núcleos de eritrócitos analisados nos dois sítios apresentou dano na classe1, indicando danos leves no DNA das células. Estudos in vitro foram também realizados para caracterização de AChE cerebral de pirambeba e ensaios cinéticos mostraram valores de 0,324±0,04 mmol/L e 0,709±0,014 mmol/min-1.mg de proteína para constantes cinéticas aparentes Kmapp e Vmáxapp, respectivamente. Ensaios inibitórios de AChE mostraram que AChE muscular (0,362±0,2) foi mais sensível ao carbamato de eserina que a AChE cerebral (0,887±0,1) e quando comparados AChE cerebral entre a eserina (0.887±0,1μM) e o glifosato (2,276±0,02μM), verificou-se uma maior sensibilidade para a AChE cerebral com eserina. Concluímos que dentre os biomarcadores genotóxicos testados, os resultados mostraram que teste de MN foi considerado o mais sensível; a espécie S. brandtii pode ser a espécie sentinela para a região do submédio São Francisco, visto que esteve presente no rio em todas as coletas, mesmo durante o período mais rigoroso de estiagem e baixo nível da água, como também por apresentar relação direta com a atividade de AChE e a formação de MN.

Made available in DSpace on 2016-08-19T12:56:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao_FernandaGabrielleSoaresSilva.pdf: 1148440 bytes, checksum: 5fda93ea5a22fe5304a59aa6f8b2f3b0 (MD5) Previous issue date: 2016-06-06 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The quality control of soil and groundwater has become an increasing need because human activities have led to contamination of ecosystems and affected human health. Agriculture, for instance, has left ecosystems waste organophosphate insecticides (OFs), highly toxic. In order to make an analysis of the impacts of these compounds in agricultural areas, it is required to have reference values taken in undisturbed areas, presenting the same type of soil and groundwater. In this regard, the ideal is that these compounds are not present in these ecosystems. In this paper, an electrochemical biosensor based on the acetylcholinesterase enzyme, immobilized by crosslinking with glutaraldehyde in the presence of estuarine macroalgae, was used to analyze levels of OFs pesticides in soil and groundwater samples collected in areas without human interference, throughout the state of Maranhão, Brazil. Biosensors applied presented, after optimization, sensitivity with detection limit between 0,054 and 1,44 μg/L, reproducibility with variation coefficient, CVs, internal measure between 8.3 and 9% and stability, showing minor variation in responses after being stored for 3 months), which made them suitable to be used in the organophosphates monitoring in the environmental matrices. Were also analyzed some physico-chemical parameters of quality of waters and soils, it has been verified that these are within the standards of the Brazilian legislation. The monitoring of the presence of levels, using the biosensor described herein, enabled to discard contamination hypothesis by these pollutants, nevertheless it is known that such compounds can have high mobility in environmental compartments. / O controle da qualidade de solos e águas subterrâneas tem-se tornado uma necessidade cada vez maior, pois as atividades humanas têm levado à contaminação de ecossistemas e afetado a saúde humana. A agricultura, por exemplo, tem deixado nos ecossistemas resíduos de inseticidas organofosforados (OFs), altamente tóxicos. Para se fazer uma análise dos impactos provocados por esses compostos em áreas agrícolas, é necessário que se tenha valores de referência de qualidade tomados em áreas não antropizadas, que apresentem mesma tipologia de solos e águas subterrâneas. Nesse particular, o ideal é que estes compostos não estejam presentes nesses ecossistemas. No presente trabalho, um biossensor eletroquímico à base da enzima acetilcolinesterase, imobilizada por ligação cruzada com glutaraldeído em presença de uma macroalga estuarina, foi utilizado para analisar pesticidas OFs em amostras de solo e de águas subterrâneas coletadas em áreas sem interferência humana, em todo o Estado do Maranhão, Brasil. Os biossensores empregados apresentaram, após otimização, sensibilidade com limite de detecção entre 0,054 e 1,44 μg/L, reprodutibilidade com coeficientes de variação, CVs, intramedidas entre 8,3 e 9% e estabilidade, apresentando mínimas variações nas respostas após armazenados por 3 meses, o que os tornou adequados para serem utilizados no monitoramento de organofosforados nas matrizes ambientais. Também foram analisados alguns parâmetros físico-químicos de qualidade de águas e solos, tendo sido verificado que estes encontram-se dentro dos padrões da legislação brasileira. A monitoração da presença de OFs, empregando o biossensor aqui descrito, possibilitou descartar a hipótese de contaminação por esses poluentes, não obstante se saiba que tais compostos podem ter elevada mobilidade nos compartimentos ambientais.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Cigarette smoke is a serious health problem and the most important cause of avoidable death in the world. It has a complex mixture with more than 4700 constituents, including nicotine and reactive oxygen species (ROS). The most common cause of its toxicity is the atherosclerosis and lipid peroxidation being nicotine an immunosuppressant compound. Among the major cellular changes promoted by nicotine is the disorder in the aggregation of platelets, which participate in the regulation of thromboembolic processes releasing nucleotides such as adenosine diphosphate (ADP). Once exerted the signaling events the nucleotides are degraded by the action of the enzymes NTPDase, 5´- nucleotidase and adenosine deaminase (ADA). This purinergic cascade of enzymatic hydrolysis is also present in lymphocytes and supplies a great amount of signaling modulating the immune system. Another important signaling molecule is acetylcholine (ACh) which is quicklys hydrolyzed by acetylcholinesterase (AChE) and is associated with the cognition process. The first hypothesis to be tested in this study was to investigate the activity of ectonucleotidases in platelets and the ADA from plasma of rats exposed to cigarette smoke during four weeks. The results in platelets demonstrated an increase for adenosine triphosphate (ATP), ADP, adenosine monophosphate (AMP) hydrolysis and adenosine deamination. These results suggest a compensatory organic response to regulate the evels of adenosine, a powerful inhibitor of platelet aggregation and important modulator of vascular tone. The second hypothesis was studied in vivo and in vitro the hydrolysis of nucleotides and nucleosides in lymphocytes of rats submitted to nicotine exposure per se. The in vivo results of lymphocytes demonstrated a decrease in the hydrolysis of ATP, ADP and adenosine in the concentrations of 0.25 and 1.0 mg/kg of nicotine. The expression of NTPDase protein and the counting of lymphocytes in rats were also diminished after nicotine exposure. The quantification of nucleotides and nucleoside in serum of rats treated with nicotine in the dose of 0.25 mg/kg showed an increase in the ATP (39%), ADP (39%) and adenosine (303%) levels. For the in vitro study the ATP-ADP-adenosine hydrolysis were diminished by nicotine in the nicotine concentrations tested (1 mM, 5 mM, 10 mM and 50 mM). These results suggest that alterations in the activity and expression of these enzymes in lymphocytes can contribute for the understanding of the mechanisms involving the suppression of the immune system caused by nicotine. Finally, the third hypothesis was to investigate the activity of AChE and the level of lipid peroxidation in striatum, cerebral cortex, hippocampus, and cerebellum of rats exposed to cigarette smoke and treated with vitamin E (50 mg/kg/day) during four weeks. The results had demonstrated an increase in the activity of AChE and in the levels of lipid peroxidation in the striatum, cerebral cortex and cerebellum, suggesting that this type of exposition can affect the functionality of the cholinergic system and increase the oxidative damage in the central nervous system (SNC). In addition, vitamin E was capable to reverse these increases, suggesting the use of this antioxidant compound in this type of exposition. Moreover, this study also suggests that cigarette smoke and nicotine modulate the purinergic system of platelets and lymphocytes, which may lead the propensity of thromboembolic and immunosuppressant illnesses, with mobilization of the phisiological defenses for a compensatory response. / A fumaça de cigarro é um grave problema de saúde e a mais importante causa de morte evitável no mundo. Possui uma complexa mistura com mais de 4000 constituintes, incluindo a nicotina e compostos que geram espécies reativas de oxigênio (EROs) no organismo. A causa mais comum de sua toxicidade é a aterosclerose e a peroxidação lipídica sendo a nicotina um composto imunossupressor. Entre as alterações celulares causadas pela nicotina, destacam-se os distúrbios na agregação de plaquetas e estas participam da regulação nos processos tromboembólicos, pela liberação de nucleotídeos tais como a adenosina difosfato (ADP). Uma vez exercido os eventos de sinalização os nucleotídeos são degradados pela ação das enzimas NTPDases, 5´-nucleotidase e adenosina desaminase (ADA). Esta cascata enzimática de hidrólise das purinas também está presente nos linfócitos e fornece um grande leque de sinalizações modulando a resposta imune. Outra molécula importante de sinalização é a acetilcolina (ACh) que é rapidamente hidrolisada pela acetilcolinesterase (AChE) e está associada ao processo de cognição. A primeira hipótese a ser testada neste estudo foi investigar a atividade das ectonucleotidases em plaquetas e a ADA no plasma de ratos expostos à fumaça de cigarro por quatro semanas. Os resultados em plaquetas demonstraram um aumento para a hidrólise de adenosina trifosfato (ATP), ADP, adenosina monofosfato (AMP) e adenosina. Esses resultados sugerem uma resposta orgânica compensatória com objetivo de manter os níveis de adenosina, um potente inibidor da agregação plaquetária e importante modulador do tônus vascular. A segunda hipótese foi realizar estudos in vivo e in vitro da hidrólise de nucleotídeos e nucleosídeos em linfócitos de ratos submetidos a exposição à nicotina per se. Os resultados in vivo de linfócitos demonstraram um decréscimo da hidrólise de ATP, ADP e adenosina nas concentrações de nicotina de 0,25 e 1,0 mg/kg. A expressão da proteína NTPDase e a contagem de linfócitos em ratos também foram diminuídas pela nicotina. A determinação dos níveis de nucleotídeos e nucleosídeos no soro de ratos tratados com nicotina na dose de 0,25 mg/kg aumentou para o ATP (39%), o ADP (39%) e a adenosina (303%). Para o estudo in vitro a hidrólise de ATP-ADP-adenosina foi diminuída pelas concentraçoes de nicotina (1 mM, 5 mM, 10 mM e 50 mM). Estes resultados sugerem que alterações na atividade e expressão destas enzimas nos linfócitos pode contribuir para a compreensão dos mecanismos envolvendo a supressão da resposta imune causada pela nicotina. Por fim, a terceira hipótese, foi investigar a atividade da AChE e o nível de peroxidação lipídica no estriado (ES), no córtex cerebral (CC), no hipocampo (HC) e no cerebelo (CE) de ratos expostos à fumaça de cigarro e tratados com vitamina E (50 mg/kg/dia) por quatro semanas. Os resultados demonstraram um aumento na atividade da AChE e no nível de peroxidação lipídica no ES, no CC e no CE, sugerindo que este tipo de exposição pode afetar a funcionalidade do sistema colinérgico e aumentar os danos oxidativos no sistema nervoso central (SNC). Em adição, a Vitamina E foi capaz de reverter estes efeitos, o que sugere uma boa escolha de terapia com este antioxidante neste tipo de exposição. Alem disso, este estudo também pode sugerir que a fumaça de cigarro e a nicotina modulam o sistema purinérgico de plaquetas e linfócitos, o que pode levar a propensão de doenças tromboembólicas e imunossupressoras, com a mobilização das defesas do organismo para uma resposta compensatória.

Orientador: Ana Maria Lima de Azeredo-Espin / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-14T11:05:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Silva_NormaMachadoda_D.pdf: 6129934 bytes, checksum: 5d8a07895afd2e470c9fd5caf8ac9fb8 (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: Cochliomyia hominivorax é considerada uma importante praga por causar perdas econômicas para a pecuária na região Neotropical. Este ectoparasita tem sido controlado principalmente por inseticidas, entretanto, este método normalmente resulta na seleção de indivíduos resistentes. Nesta tese foram investigados mecanismos associados com resistência a inseticidas organofosforados e piretróides. Os resultados apresentados nesta tese estão divididos em dois artigos. No artigo 1 foram investigados dois mecanismos de resistência a piretróides, um conhecido como kdr (knockdown resistance), associado à mutações no canal de sódio, e a mutação W251S no gene da carboxilesterase E3, a qual têm sido associada à hidrólise de piretróides. Foram investigadas populações da atual distribuição geográfica de C. hominivorax através de PCR-RFLP. Para a mutação kdr (L1014F) nenhum indivíduo mutante foi encontrado. Entretanto, a mutação W251S foi encontrada em todas as populações, com as mais altas freqüências nas amostras da Venezuela (100%) e Colômbia (93.75%). Em algumas populações amostradas, apesar da freqüência do alelo mutante ter sido relativamente baixa, o número de indivíduos portadores de pelo menos um alelo mutante foi alto. No bioensaio com cipermetrina (piretróide tipo II), utilizando amostras de Estiva (MG), os resultados analisados através do teste exato de Fisher indicaram que para a mais baixa concentração (p=0.0003) e para uma concentração intermediária (p= 0.024), a presença da mutação W251S está correlacionada com as chances de sobrevivência. Entretanto, na mais alta concentração (p= 0.221) a presença desta mutação não foi correlacionada com a sobrevivência, o que possivelmente indica dificuldade em hidrolisar este tipo de piretróide em concentrações maiores. No Artigo 2, as mutações G137D no gene da carboxilesterase E3, e as mutações I298V, G401A e F466Y no gene da acetilcolinesterase, associadas com resistência a organofosforados, foram investigadas nas mesmas populações do artigo 1, através de PCR-RFLP e sequenciamento direto de PCR. A região codificante completa da acetilcolinesterase também foi caracterizada e proposto um modelo para a estrutura tridimensional desta proteína com base na estrutura da acetilcolinesterase de Drosophila melanogaster. Possíveis alterações na proteína causadas pelas mutações associadas com resistência a organofosforados foram discutidas. No gene da acetilcolinesterase somente 2 de 135 indivíduos analisados apresentaram uma das mutações investigadas, a F466Y, o que pode estar associado ao alto custo no valor adaptativo do indivíduo, causado por algumas mutações neste gene ou inexistência dos demais alelos mutantes nestas populações. Entretanto, para a mutação G137D no gene da E3 foi encontrado um alto número de indivíduos portadores de pelo menos um alelo mutante na maioria das populações brasileiras e no Uruguai. Em Cuba, Venezuela e Colômbia nenhum indivíduo mutante para G137D foi encontrado, o que pode estar relacionado com os inseticidas usados no controle de C. hominivorax nestas regiões ou com a inexistência do alelo mutante nestas localidades. Os resultados de ambos os trabalhos indicam que mutações no gene da carboxilesterase E3 são um dos principais mecanismos de resistência selecionados nesta espécie, dentre os investigados até o momento. Este estudo representa um importante avanço no entendimento da base molecular da resistência a inseticidas em um importante ectoparasita. / Abstract: Cochliomyia hominivorax is an important ectoparasite, causing considerable economic losses to livestock sector in Neotropical region. This ectoparasite has been controlled mainly by applying insecticides, however, this method usually results in the selection of resistant individuals. In this thesis, mechanisms associated with organophosphate and pyrethroid insecticide resistance were investigated. The results presented in this thesis are divided in two articles. In the Article 1 two mechanisms associated with pyrethroid resistance were investigated, the kdr (knockdown resistance), a generic term for mutations in the sodium channel, and a mutation in the residue 251 of the carboxylesterase E3 gene, which have been associated with pyrethroid hydrolysis. Populations of actual geographical distribution of C. hominivorax were investigated through PCR-RFLP. For the kdr mutation, no mutant individuals were found. However, the W251S mutation was found in all populations investigated, with the highest frequencies in the samples from Colombia (100%) and Venezuela (93.75%). In some populations, despite relatively low mutant allele frequency, the number of individuals having at least one mutant allele was high. A bioassay with cypermethrin (pirethroid type II) was also performed, using samples from Estiva (MG). The results of the Fisher's exact test for the lowest concentration (p=0.0003, a= 0.05) and for an intermediate concentration (p= 0.024, a= 0.05) indicated that the presence of W251S mutation are correlated with the survival. However, at the highest concentration, Fisher's exact test (p= 0.221, a= 0.05) indicated that the presence of this mutation was not correlated with survival. These results indicate that the W251S mutation in C. hominivorax probably presents difficulties in hydrolyzing of this kind of pyrethroid, in high concentrations. In the Article 2, the G137D mutation, in the carboxylesterase E3 gene, and the I298V, G401A and F466Y mutations in the acetylcholinesterase gene, associated with organophosphate resistance, were investigated. The same populations of article 1 were analyzed using PCR-RFLP and PCR direct sequencing. The complete coding region of acetylcholineserase also was characterized and a putative model for the three-dimensional structure of this protein was proposed, based on solved structure of Drosophila melanogaster. Possible alterations in the protein, caused by mutations associated with organophosphate resistance, were discussed. For the acetylcholinesterase gene, only 2 of 135 individuals analyzed presented one of the mutations investigated, the F466Y. This fact may be related with the fitness cost of some mutations in this gene, or the inexistence of mutant alleles in these populations. For the G137D mutation, a high number of individuals having at least one mutant allele were found in most of the Brazilian populations and in Uruguay. In Cuba, Venezuela and Colombia no G137D mutant was found, a finding that may be related to the insecticides used for C. hominivorax control in these regions. The results of these two works indicate that mutations in the carboxylesterase E3 gene are one of the main insecticide resistance mechanisms selected in this species, so far investigated. This study represents a significant advance in the understanding of the molecular basis of insecticide resistance in an important livestock ectoparasite. / Doutorado / Genetica Animal e Evolução / Doutor em Genetica e Biologia Molecular