Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Bioquímica / Made available in DSpace on 2013-06-25T22:55:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 311468.pdf: 1744978 bytes, checksum: 2c50dfef14dbdb20f41ec7b7942aeb0d (MD5) / A excitotoxicidade induzida pela excessiva ativação da neurotransmissão glutamatérgica está envolvida em várias neuropatologias. Neste sentido, moléculas que impeçam a liberação de glutamato ou a ativação excessiva dos seus receptores, podem ser úteis para prevenir a morte neuronal em algumas doenças. As lectinas são proteínas capazes de ligação reversível a carboidratos e glicoconjugados, e algumas têm sido utilizadas no estudo e purificação de receptores ionotrópicos glutamatérgicos. O presente estudo teve como objetivo avaliar a potencial atividade neuroprotetora de lectinas extraídas de plantas como a ConBr, BBL, VGL, CGL e FTL frente à excitotoxicidade glutamatérgica. Fatias de hipocampo foram isoladas a partir de camundongos machos adultos e incubadas durante 6 h em solução tampão salina/Krebs/DMEM, na presença de glutamato (10 mM) ou glutamato (10 mM) co-administrado com ConBr, BBL, VGL, CGL ou FTL (10 µg/mL). Além disso, a fosforilação de MAPKs (ERK1/2, p38MAPK e JNK1/2/3) e AKT foi avaliada por western blot na avaliação neuroprotetora de ConBr, VGL e CGL. Os resultados mostram que o glutamato foi capaz de reduzir a viabilidade hipocampal (~25%), diminuiu a fosforilação de AKT e aumentou a fosforilação de ERK1 e p38MAPK. Notavelmente, ConBr e VGL impediram a redução da viabilidade celular e reverteram a diminuição da fosforilação de AKT induzida pelo glutamato. Entretanto, somente VGL reverteu o aumento na fosforilação de p38MAPK e ERK1 induzido por glutamato. Na presença do inibidor de PI3K, LY294002 (10 µM), ConBr não foi capaz de reverter a queda na viabilidade induzida pelo glutamato, sugerindo que o efeito neuroprotetor de ConBr é dependente da via PI3K/AKT. O mecanismo envolvido na modulação das vias de sinalização intracelular não foi elucidado. No entanto, considerando os receptores NMDA como uma proteína glicosilada no domínio N-terminal extracelular, é possível sugerir um bloqueio dos receptores de NMDA por meio da interação das lectinas ConBr e VGL com as cadeias de oligossacarídios. / The excitotoxicity induced by excessive activation of the glutamatergic neurotransmission is involved in several neuropathologies. In this sense, molecules that prevent the release of glutamate or excessive activation of its receptors can be useful to prevent neuronal death in these diseases. Lectins are proteins capable of reversible binding to carbohydrates on glycoconjugates, and some have been used in the study and purification of ionotropic glutamate receptors. The present study aimed to evaluate the potential neuroprotective activity of lectins extracted from plants such as ConBr, BBL, VGL, CGL and FTL to prevent glutamate-induced excitotoxicity. Hippocampal slices were isolated from adult male mice and incubated for 6 h in Krebs/saline/DMEM buffer in the presence of glutamate (10 mM) or glutamate (10 mM) plus ConBr, BBL, VGL, CGL or FTL (10 ìg/mL). Moreover, the phosphorylation of MAPKs (ERK1/2, p38MAPK and JNK1/2/3) and AKT was evaluated by western blotting in the study concerning the neuroprotective mechanism displayed by ConBr, VGL and CGL. The results show that glutamate was able to reduce hippocampal slice viability (-25%), diminish the phosphorylation of AKT and increase the phosphorylation of p38MAPK and ERK1. No changes were observed in the phosphorylation of JNK1/2/3 and ERK2. VGL prevented the increment of p38MAPK and ERK1 phosphorylation. Notably, ConBr and VGL prevented the reduction of cell viability and the decrease of AKT phosphorylation induced by glutamate. Furthermore, in the presence of PI3K inhibitor, LY294002 (10 ìM), ConBr was unable to reverse the loss in cell viability induced by glutamate. It suggests that ConBr exerts its neuroprotective effect in a manner dependent of PI3K/AKT pathway. The mechanism involved in the modulation of signaling pathways was not addressed in our study. However, considering NMDA receptors as glycosylated protein in the extracellular N-terminal domain it is possible to suggest a blockage of NMDA receptors via ConBr or VGL lectin interaction with oligosaccharide chains.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Neurociências, Florianópolis, 2013. / Made available in DSpace on 2013-12-05T23:10:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 320906.pdf: 3852058 bytes, checksum: f76b24f3a609281787c0890e932c2090 (MD5) Previous issue date: 2013 / A creatina modula a bioenergética celular e apresenta efeito antiexcitotóxico, antioxidante e apresenta propriedades neuroprotetora e antidepressiva, no entanto, os mecanismos intracelulares responsáveis por esses efeitos ainda não estão bem estabelecidos. No primeiro captítulo desta tese foi analisado o efeito da administração de creatina (p.o.) em camundongos no teste de suspensão pela cauda (TSC), um teste preditivo de atividade antidepressiva. Além disso, foi avaliado o envolvimento dos sistemas de neurotransmissão dopaminérgico, serotonérgico, noradrenérgico, glutamatérgico, bem como as vias de sinalização intracelular mediadas por L-arginina/óxido nítrico (ON), proteína cinase A (PKA), proteína cinase C (PKC), cinase da cinase ativada por mitógenos (MEK)/cinase ativada por estímulos extracelulares (ERK) 1/2, cinase dependente de Ca2+/calmodulina (CaMK-2), fosfatidilinositol 3 cinase (PI3K)/proteína cinase B (AKT), glicogênio sintase cinase 3ß (GSK-3ß), proteína alvo da rapamicina em mamíferos (mTOR) e hemeoxigenase-1 (HO-1) implicadas no efeito antidepressivo da creatina no TSC. A administração de creatina (0,1-1000 mg/kg) reduziu o tempo de imobilidade em camundongos submetidos ao TSC, sem alterar a atividade locomotora. O efeito anti-imobilidade promovido pela administração de creatina no TSC foi bloqueado pelo pré-tratamento dos camundongos com ?-clorofenilalanina metil éster (PCPA; 100 mg/kg, i.p., por 4 dias consecutivos, inibidor da síntese de serotonina (5-HT)), a-metil-?-tirosina (AMPT; 100 mg/kg, i.p., inibidor da enzima tirosina hidroxilase), haloperidol (0,2 mg/kg, i.p., antagonista não seletivo de receptores dopaminérgicos), SCH23390 (0,05 mg/kg, s.c., antagonista de receptores dopaminérgicos D1), sulpirida (50 mg/kg, i.p., antagonista de receptores dopaminérgicos D2), prazosina (1 mg/kg, i.p., antagonista de receptores a1-adrenérgicos), N-metil-D-aspartato (NMDA) (0,1 pmol/sítio, i.c.v.), D-serina (30 µg/sítio, i.c.v., agonista do sítio da glicina do receptor NMDA), arcaína (1 mg/kg, i.p., antagonista do sítio das poliaminas dos receptores NMDA), L-arginina (750 mg/kg, i.p., precursor de ON), SNAP (25 µg/site, i.c.v, doador de ON), 7-nitroindazol (25 mg/kg, i.p., inibidor da enzima óxido nítrico sintase neuronal), H-89 (1 µg/sítio, i.c.v., inibidor de PKA), KN-62 (1 µg/sítio, i.c.v., inibidor de CaMK-2), queleritrina (1 µg/site, i.c.v., inibidor de PKC), U0126 (5 µg/sítio, i.c.v., inibidor de MEK1/2), PD09058 (5 µg/sítio, inibidor da MEK1/2), LY294002 (10 nmol/sítio, i.c.v., inibidor de PI3K), wortmanina (0,1 µg/sítio, inibidor de PI3K), rapamicina (0,2 nmol/sítio, i.c.v., inibidor de mTOR), protoporfirina de zinco (10 µg/sítio, i.c.v., inibidor da enzima heme oxigenase-1). Alémdisso, creatina (0,01 mg/kg, dose sub-efetiva) em combinação com doses sub-efetivas de SKF38393 (0,1 mg/kg, s.c., agonista de receptores dopaminérgicos D1), apomorfina (0,5 mg/kg, ip, agonista preferencial de receptores dopaminérgicos D2), fenilefrina (0,4 µg/sítio, i.c.v., agonista de receptores a1-adrenérgico), WAY100635 (0,1 mg/kg, s.c., antagonista seletivo de receptores 5-HT1A), 8-OH-DPAT (0,1 mg/kg, i.p., agonista de receptores 5-HT1A), fluoxetina (5 mg/kg, p.o., antidepressivo inibidor da recaptação de serotonina (ISRS)), paroxetina (0,1 mg/kg, p.o., ISRS), citalopram (0,1mg/kg, p.o., ISRS), sertralina (3 mg/kg, p.o., ISRS), amitriptilina (1 mg/kg, p.o., antidepressivo tricíclico), imipramina (0,1 mg/kg, p.o., antidepressivo tricíclico), reboxetina (2 mg/kg, p.o., antidepressivo inibidor seletivo da recaptação de noradrenalina, ISRN), bupropiona (1 mg/kg, p.o., antidepressivo inibidor da recaptação de dopamina e noradrenalina), MK-801 (0,01 mg/kg, p.o., antagonista de receptores de NMDA), cetamina (0,1 mg/kg, i.p., antagonista de receptores NMDA), AR-A014418 (0,01 µg/sítio, i.c.v., inibidor seletivo da enzima GSK-3ß), cloreto de lítio (10 mg/kg, p.o., inibidor não seletivo da enzima GSK-3ß), protoporfirina de cobalto (0,01 µg/sítio, i.c.v., indutor da expressão de HO-1) reduziu o tempo de imobilidade no TSC, em comparação com qualquer um dos fármacos administrados isoladamente. Este conjunto de resultados sugere que o efeito antidepressivo da creatina no TSC seja mediado por uma ativação de receptores dopaminérgicos D1 e D2, bem como dos receptores 5-HT1A e a1-adrenérgico, e uma inativação de receptores glutamatérgicos NMDA, além de envolver a ativação de PKA, PKC, MEK1/2, PI3K/AKT, mTOR, HO-1 e uma inibição de GSK-3ß. Tendo em vista que existe uma grande comorbidade entre a depressão e a doença de Parkinson (DP), e sabendo que antidepressivos de distintas classes protegem da morte celular induzida por toxinas dopaminérgicas, como a 6-OHDA, o segundo capítulo desta tese investigou o efeito neuroprotetor da creatina frente a morte celular induzida pela toxina dopaminérgica 6-OHDA. Esta diminuiu a viabilidade de células de neuroblastoma humano SH-SY5Y, bem como de fatias de estriado cerebral de ratos. A creatina apresentou um efeito protetor contra a toxicidade induzida por 6-OHDA (10?5000 µM) em células SH-SY5Y e este efeito foi revertido por diferentes inibidores de cinases: LY294002 (10 µM), KN-93 (1 µM, inibidor de CaMK-2), H-89 (2 µM), PD98059 (10 µM) e queleritrina (0,1 µM). Além disso, 6-OHDA reduziu a fosforilação de GSK-3ß (Ser9) em células SH-SY5Y e a incubação com creatina reverteu este efeito. Ainda, 6-OHDA (50-300 µM) reduziu a viabilidade celular em fatias de estriado de ratos e creatina ou fosfocreatina (2,5-10 mM) reverteueste efeito. Ainda, verificamos que 6-OHDA aumenta a produção de espécies reativas de oxigênio e induz uma diminuição na fosforilação de AKT (Ser473) e GSK-3ß (Ser9) em fatias de estriado de ratos, sendo que a creatina ou fosfocreatina (5 mM) reverteu este efeito. O inibidor da PI3K LY294002 (30 µM) reverteu o efeito da creatina e da fosfocreatina sobre a viabilidade celular e produção de espécies reativas de oxigênio em fatias de estriado expostas a 6-OHDA. Além disso, 6-OHDA diminuiu o imunoconteúdo de tirosina hidroxilase e creatina ou fosfocreatina reverteu este efeito. O efeito protetor de creatina ou fosfocreatina na modulação do imunoconteúdo de tirosina hidroxilase em fatias de estriado de ratos expostas a 6-OHDA parece ser dependente da ativação da via de sinalização intracelular PI3K/AKT, uma vez que LY294002 (30 µM) reverteu este efeito. Este segundo conjunto de resultados sugere que a creatina apresenta efeito neuroprotetor frente à morte celular induzida por 6-OHDA e este efeito parece ser devido a propriedades antioxidantes e ativação das vias de sinalização intracelular mediadas por PKA, PKC, MEK1/2, PI3K/AKT e uma inibição de GSK-3ß. Esta tese sugere que a creatina pode ser uma nova alternativa terapêutica para o tratamento da depressão e da DP. <br> / Abstract : Creatine modulates cellular bioenergetics and presents antiexcitotoxic, antioxidant, neuroprotective and antidepressant properties; however, the intracellular mechanisms responsible for these effects are not well established. In the first chapter of this thesis, the effect of creatine administration (p.o.) in the mouse tail suspension test (TST), a test predictive of antidepressant activity, was investigated. In addition, the possible involvement of neurotransmission systems (dopaminergic, serotonergic, noradrenergic and glutamatergic), and the intracellular signaling pathways mediated by L-arginine/nitric oxide (NO), protein kinase A (PKA), protein kinase C (PKC), mitogen-activated protein kinase kinase 1/2 (MEK 1/2)/ extracellular-signal-regulated kinase 1/2 (ERK 1/2), Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase-2 (CaMK-2), phosphatidylinositide 3-kinase (PI3K)/protein kinase B (AKT), glycogen synthase kinase-3ß (GSK-3ß), mammalian target of rapamycin (mTOR) and heme oxygenase-1 (HO-1) in the antidepressant-like effect of creatine in the TST was evaluated. The administration of creatine (0.1-1000 mg/kg) reduced the immobility time in mice submitted to the TST, without changing locomotor activity. The anti-immobility effect of creatine in the TST was blocked by pretreatment of mice with p-chlorophenylalanine methyl ester (PCPA; 100 mg/kg, i.p., for 4 consecutive days, inhibitor of serotonin (5-HT) synthesis), a-methyl-p-tyrosine (AMPT, 100 mg/kg, i.p., inhibitor of tyrosine hydroxylase), haloperidol (0.2 mg/kg, i.p., non-selective dopamine receptor antagonist), SCH23390 (0.05 mg/kg, s.c., dopamine D1 receptor antagonist), sulpiride (50 mg/kg, i.p., dopamine D2 receptor antagonist), prazosin (1 mg/kg, i.p., a1-adrenoceptor antagonist), NMDA (0.1 pmol/site, i.c.v.), D-serine (30 µg/site, i.c.v., agonist of the glycine site of the NMDA receptor), arcaine (1 mg/kg, i.p., antagonist of the polyamine site of the NMDA receptor), L- arginine (750 mg/kg, i.p., a precursor of nitric oxide, NO), SNAP (25 µg/site, i.c.v., NO donor), 7-nitroindazole (25 mg/kg, i.p., inhibitor of neuronal nitric oxide synthase), H-89 (1 µg/site, i.c.v., PKA inhibitor), KN-62 (1 µg/site, i.c.v., CaMK-2 inhibitor), chelerythrine (1 µg/site, i.c.v., PKC inhibitor), U0126 (5 µg/site, i.c.v., MEK1/2 inhibitor), PD09058 (5 µg/site, MEK1/2 inhibitor), LY294002 (10 nmol/site, i.c.v., PI3K inhibitor), wortmannin (0.1 µg/site, PI3K inhibitor), rapamycin (0.2 nmol/site, i.c.v., mTOR inhibitor), zinc protoporphyrin (10 µg/site, i.c.v., HO-1 inhibitor). Furthermore, creatine (0.01 mg/kg, sub-effective dose) in combination with sub-effective doses of SKF38393 (0.1 mg/kg s.c., dopamine D1 receptor agonist), apomorphine(0.5 mg/kg, i.p., preferential agonist of dopamine D2 receptor), phenylephrine (0.4 mg/site, i.c.v., a1-adrenoceptor agonist), WAY100635 (0.1 mg/kg, s.c., a selective 5-HT1A receptor antagonist) 8-OH-DPAT (0.1 mg/kg, i.p., a selective 5-HT1A receptor agonist), fluoxetine (5mg/kg, p.o., selective serotonin reuptake inhibitor (SSRI)), paroxetine (0.1 mg/kg, p.o., SSRI), citalopram (0.1 mg/kg, p.o., SSRI), sertraline (3 mg/kg, p.o., SSRI), amitriptyline (1 mg/kg p.o., tricyclic antidepressant), imipramine (0.1 mg/kg, p.o., tricyclic antidepressant), reboxetine (2 mg/kg, p.o., selective noradrenaline reuptake inhibitor), bupropion (1 mg/kg, p.o., dopamine and noradrenaline reuptake inhibitor), MK-801 (0.01 mg/kg, p.o., NMDA receptor antagonist) ketamine (0.1 mg/kg, i.p., NMDA receptor antagonist), AR-A014418 (0.01/site, i.c.v., GSK-3ß inhibitor), lithium chloride (10 mg/kg, p.o., non-selective GSK-3ß inhibitor), cobalt protoporphyrin (0.01 µg/site, i.c.v., inducer of HO-1 expression) decreased the immobility time in the TST as compared to either drug administered alone. This set of results suggest that the antidepressant-like effect of creatine in the TST is mediated by the activation of dopamine D1 and D2 receptors, 5-HT1A receptors, and a1-adrenoceptors as well as an inactivation of NMDA receptors. Moreover, this set of results also indicates that activation of PKA, PKC, MEK1/2, PI3K/AKT, mTOR, HO-1 and inhibition of GSK-3ß are involved in the antidepressant-like effect of creatine in the TST. Considering: i) the high depression and Parkinson's disease comorbidity; ii) antidepressants of different classes protect the cell death induced by dopaminergic toxins, such as 6-OHDA, the second chapter of this thesis also evaluated the neuroprotective effect of creatine against cell death induced by the dopaminergic toxin 6-OHDA. We demonstrated that 6-OHDA decreased the cell viability of human neuroblastoma cells SH-SY5Y, as well as rat striatal slices. Creatine protected against the toxicity induced by 6-OHDA (10-5000 mM) in SH-SY5Y cells and this effect was reversed by different kinase inhibitors: LY294002 (10 µM), KN-93 (1 µM, CaMK-2 inhibitor), H-89 (2 µM), PD98059 (10 µM) and chelerythrine (0.1 µM). Furthermore, 6-OHDA reduced phosphorylation of GSK-3ß (Ser9) in SH-SY5Y cells and creatine (10 µM) reversed this effect. Also, 6-OHDA (50-300 µM) reduced cell viability and increased the production of reactive oxygen species in rat striatal slices and creatine or phosphocreatine (2.5-10 mM) reversed this effect. We also find that 6-OHDA decreased the phosphorylation of AKT (Ser473) and GSK-3ß (Ser9) in rat striatal slices and creatine or phosphocreatine reversed this effect. The PI3K inhibitor LY294002 (30 mM) reversed the protective effect of creatine or phosphocreatine against cell viability and production of reactive oxygenspecies in striatal slices exposed to 6-OHDA. Furthermore, 6-OHDA decreased the tyrosine hydroxylase immunocontent and phosphocreatine or creatine reversed this effect. The effect of creatine or phosphocreatine on the modulation of tyrosine hydroxylase immunocontent in rat striatal slices exposed to 6-OHDA could be dependent on the activation of the intracellular signaling pathway mediated by PI3K/AKT, since LY294002 (30 mM) reversed this effect. This second set of data suggests that creatine has neuroprotective effect against cell death induced by 6-OHDA and this effect could be due to the antioxidant properties and activation of intracellular signaling pathways mediated by PKA, PKC, MEK1/2, PI3K/AKT and an inhibition of GSK-3ß. This thesis suggests that creatine may be a novel therapeutic alternative for the treatment of depression and Parkinson's disease.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-graduação em Bioquímica, Florianópolis, 2013 / Made available in DSpace on 2013-12-05T23:45:30Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013Bitstream added on 2014-09-24T20:22:44Z : No. of bitstreams: 1 318939.pdf: 1271951 bytes, checksum: ed5d9989c7ba6d32a2bd129ebd586437 (MD5) / Lectinas são proteínas que se ligam a carboidratos presentes em glicoconjugados podendo regular diversas funções celulares em eventos fisiológicos e patológicos. No sistema nervoso central, galectina-1 uma lectina com afinidade por ß-galactosídeos, pode mediar diversas funções neurais importantes e produzir neuroproteção. Lectinas isoladas de plantas tem sido aplicadas como ferramentas no estudo da função neural. VML é uma lectina isolada das sementes de Vatairea macrocarpa, que similar a galectina-1 possui afinidade por galactose. Contudo o efeito de VML sobre o SNC é desconhecido. O objetivo desse estudo foi verificar se VML é capaz de alterar a função neural, modulando parâmetros comportamentais, bem como a expressão de proteínas gliais e pró-inflamatórias em camundongos. VML administrada por via intracerebroventricular (i.c.v) aumentou o tempo de imobilidade de camundongos adultos no teste do nado forçado (TNF), 1 e 24 h após a administração da lectina. Este efeito foi dependente das interações entre a lectina com carboidratos e da estrutura tridimensional nativa de VML. VML aumentou o conteúdo de COX-2, GFAP e S100B no hipocampo dos animais 1 h após a administração da lectina. Contudo, essas alterações não foram encontradas 24 h após. Entretanto, neste período tardio foi observado um aumento na fosforilação de p38MAPK. A fosforilação de ERK1/2, JNK1/2/3, AKT e GSK-3ß no hipocampo não foram alteradas 1, 6 ou 24 h após a administração da lectina. Desta forma, pode-se verificar que VML é capaz de induzir um comportamento do tipo depressivo e aumentar a expressão de proteínas relacionadas à inflamação. Em conjunto, esses resultados indicam efeitos potencialmente tóxicos de VML no hipocampo de camundongos, aparentemente envolvendo respostas neuroinflamatórias. Esses achados comparados às ações neuroprotetoras descritas para galectina-1, sugerem um papel duplo de lectinas com afinidade por galactose na função neural <br> / Abstract: Lectins are carbohydrate-binding proteins that can recognize glycoconjugates, regulating many cell functions, and physiopathological events. In the central nervous system (CNS) galectin-1, a ß-galactosidebinding lectin, can mediate many neural functions and induce neuroprotection. Lectins isolated from plants have been applied as a tool to study neural function. VML is a galactose-binding lectin isolated from Vaitairea macrocarpa seeds that have ß-galactose-binding activity like galecin-1. However, VML effects on the CNS are largely unknown. The aim of this study was to verify that VML is able to alter the neural function, evaluating behavior parameters and glial and inflammatory proteins in adult mice hippocampus. VML administered by intracerebrovetricular route induces an increase in the immobility time in the Forced-Swimming-Test 1 and 24 h after injection of lectin and that effect was dependent on protein-carbohidrate interaction and native VML tridimensional structure. VML induces the enhancement of COX2, GFAP expression in mice hippocampus 1 h after i.c.v administration. However, 24 h after, no changes were found after VML i.c.v. administration. By the way, in the same time was observed an increase in p38MAPK phosphorylation. The ERK1/2, JNK1/2/3, AKT and GSK-3ß phosphorylation in hippocampus were no change after lectin administration. These results reported here demonstrated that the lectin from V. macrocarpa seeds was able to induce a depressive-like behavior and increase inflammatory proteins expression. VML may exert some neurotoxic effects in the mice hippocampus and appears to be involved with neuroinflammatory responses. These findings compared the neuroprotective actions described for galectin-1, suggest a dual role for ß-galactoside-binding lectins in neural function.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Neurociências, Florianópolis, 2016. / Made available in DSpace on 2016-09-20T04:56:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 340495.pdf: 1662080 bytes, checksum: 079d7095f84db1f40c79acbdd2f1074c (MD5) Previous issue date: 2016 / A guanosina, nucleosídeo derivado da purina guanina, exerce efeitos neuroprotetores e neurotróficos no Sistema Nervoso Central (SNC). Recentemente, um sistema de neurotransmissão purinérgica dos derivados da guanina, ou sistema guanosinérgico, foi proposto. Deste sistema de neurotransmissão, já são conhecidos transportadores de nucleosídeos e enzimas responsáveis pelo metabolismo intra e extracelular, porém os receptores de membrana seletivos para a guanosina ainda não foram claramente caracterizados. Alguns efeitos neuroprotetores da guanosina parecem depender da ativação dos receptores de adenosina A1R e A2AR. Nesta tese, foi avaliada (i) a interação da guanosina com oligômeros de receptores de adenosina A1RA2AR; e (ii) o efeito da guanosina em um modelo animal da doença de Alzheimer. No capítulo I, através da superexpressão heteróloga dos receptores A1 e A2A em células HEK293, demonstramos que a guanosina não altera a colocalização destes receptores na membrana celular e sua heteromerização, quando avaliada por BRET e complementação de fluorescência. A guanosina não tem efeito per se, mas inibe o aumento de Ca2+ intracelular induzido por agonista de A1R (CCPA) em células que expressam A1R. Em células que expressam A1R+A2AR guanosina previne a aumento de Ca2+ induzido por agonista de A1R ou de A2AR. Guanosina induz aumento de AMPc em células A2AR, mas inibe o aumento de AMPc na presença dos agonistas A2AR, adenosina e CGS21680. Experimentos de nanoBRET sugerem que a guanosina desloca a ligação do agonista A2AR (APEC) em células que expressam A2AR e oligômeros A1R+A2AR. O efeito neuroprotetor da guanosina, não é observado em um modelo de isquemia in vitro realizado em fatias hipocampais de camundongos knock-out para o A2AR. Os resultados sugerem que guanosina pode interferir com a sinalização celular ativada por A1R e A2AR, e na presença de agonistas A2AR, guanosina bloqueia a ativação deste receptor. Além disso, o efeito neuroprotetor da guanosina depende da expressão de A2AR. No capítulo II desta tese, o efeito neuroprotetor da guanosina foi avaliado em um modelo de toxicidade do peptídeo beta-amiloide (Aß1-40), um modelo animal da doença de Alzheimer. Guanosina administrada logo após a infusão i.c.v do Aß1-40 e durante 14 dias consecutivos reverteu o déficit cognitivo e o comportamento tipo-anedônico induzidos pelo Aß1- 40. Guanosina preveniu o aumento na captação de glutamato independente de Na+ induzido pelo Aß1-40. A análise dos níveis de purinas mostra que Aß1-40 aumentou os níveis de ADP e ATP no hipocampo dos animais, e que o tratamento com guanosina aumentou os níveis de GDP. Aß1-40 reduziu a expressão de GFAP na região CA1 do hipocampo dos camundongos e guanosina não alterou esse efeito. Não foi observada alteração nos níveis de sinaptofisina no hipocampo dos animais. Os resultados obtidos sugerem que guanosina previne alterações cognitivas e no transporte de glutamato induzidas pelo Aß1-40 em camundongos. Esta tese contribuiu para identificar os sítios extracelulares de interação da guanosina e adicionou evidências sobre o efeito neuroprotetor da guanosina.<br> / Abstract : Guanosine, the guanine-based nucleoside, exerts neurotrophic and neuroprotective effects in the Central Nervous System (CNS). A guaninebased purinergic system - or guanosinergic system ? has been recently proposed. In this neurotransmitter system some components are known, as nucleosides transporters and enzymes responsible for intra and extracellular metabolism. However, a selective extracellular site for guanosine interaction or guanosine receptor has not yet been clearly characterized. Some of guanosine neuroprotective effects seem to be dependent upon the activation of adenosine A1 or A2A receptors. In this study, we investigated (i) the possible guanosine interaction with A1RA2AR oligomers, and (ii) guanosine neuroprotective effect in an animal model of Alzheimer´s disease. Using A1R and A2AR heterologous expression in HEK193 cells, we showed that guanosine did not alter the colocalization of these receptors at the cellular membrane. Guanosine also did not modify A1R-A2AR heteromeric formation, evaluated with BRET and bimolecular fluorescence complementation (BiFC) techniques. Guanosine alone had no effect on intracellular Ca2+ signaling, but it inhibited the increase in Ca2+ induced by an A1R agonist (CCPA) in A1Rcells. In A1R+A2AR-expressing cells, guanosine prevents Ca2+ signaling evoked by A1R or A2AR agonists. Guanosine increased cAMP levels in A2AR cells, but it inhibited cAMP increase induced by adenosine or CGS21680 (A2AR agonists). NanoBRET experiments suggested that guanosine displaced the binding of an A2AR agonist (APEC), both in A2AR and A2AR+A1R cells. Guanosine neuroprotective effect in an in vitro model of ischemia was not observed in hippocampal slices of A2ARknockout mice. Data presented here suggest that guanosine can interfere on A1R and A2AR activated signaling pathways. However, in the presence of an A2AR agonist, guanosine blocks A2AR activation. Furthermore, the neuroprotective effect of guanosine is dependent on A2AR expression. In chapter II, we assessed guanosine neuroprotective effects against amyloid-beta peptide (Aß1-40) intracerebroventricular infusion, an animal model of Alzheimer´s disease. Guanosine treatment soon after Aß1-40 i.c.v infusion and once a day during the 14 consecutive days, inhibited the cognitive deficit and the anhedonic-like behavior induced by Aß1-40. Guanosine prevented the impairment in Na+-independent glutamate transport induced by Aß1-40. Purines levels analysis showed that Aß1-40 increased ATP and ADP at mice hippocampus, and guanosine increased GDP levels. Aß1-40 infusion decreased GFAP at CA1 hippocampal region, an effect not modified by guanosine. No changes in synaptophysin levels were observed. Presented data show that guanosine prevents cognitive alterations and the unbalance in glutamate transmission evoked by Aß1-40 in mice. Therefore, this thesis has contributed to identify extracellular sites to guanosine action and add information on the neuroprotective effects of guanosine.

A isquemia cerebral está entre as principais causas de mortalidade e morbidade em países industrializados e, apesar dos estudos constantes, ainda não existe um tratamento eficaz. Nesse estudo, investigamos o efeito neuroprotetor da boldina, um alcalóide presente nas folhas e casca de Peumus boldus Molina, sobre os danos causados pela isquemia cerebral. Para isso, foi utilizado um modelo in vitro de privação de oxigênio e glicose (POG) em culturas organotípicas de hipocampo de rato. Nossos resultados demonstraram que o tratamento com boldina nas concentrações de 120 µM e 250 µM diminuiu significativamente a morte celular induzida pela POG de 36% para 20 e 11%, respectivamente. A boldina não apresentou efeito tóxico em condições basais em nenhuma das concentrações testadas. O efeito neuroprotetor da boldina ocorreu apenas quando ela estava presente durante o período de POG, não havendo diferença quando ela foi utilizada somente durante o período de 24 horas de recuperação. O tratamento com boldina durante a POG foi capaz de induzir ativação microglial observada 24 horas após o tratamento através da marcação com isolectina B4. Ela também causou um aumento considerável na produção de espécies reativas, o que pode ser causa ou conseqüência da ativação da microglia. Não foram observadas diferenças na fosforilação das proteínas Akt e GSK-3ß 24 horas após o tratamento e, portanto, alterações nessas proteínas não parecem estar envolvidas com a neuroproteção causada pela boldina. Em conjunto, os resultados sugerem um efeito neuroprotetor promissor da boldina contra os danos causados pela POG, sendo que os mecanismos que desencadeiam esse efeito devem ser melhor elucidados. / Ischemic stroke is among the major causes of mortality and morbidity in industrialized countries and, in spite of several studies, no efficient treatment is available to the patients. In this work, we investigated the neuroprotective effect of boldine, an alkaloid present in leaves and bark of Peumus boldus Molina, against the damage caused by an in vitro lesion that mimics ischemic stroke. For these experiments, we used an in vitro model of oxygen and glucose deprivation (OGD) in rat organotypic hippocampal slice cultures. Our results showed that the treatment with boldine in the concentrations of 120 µM and 250 µM caused a significant reduction in cellular death after OGD from 36%, observed in OGDvehicle exposed cultures, to 20% and 11%, respectively. Boldine was not cytotoxic in basal conditions in any of the tested concentrations. The neuroprotective effect of boldine was observed when it was present during the period of OGD, showing no difference when it was used only during the recovery period of 24 hours. To elucidate a possible mechanism by which boldine exerts its neuroprotective effect we investigated the microglial activation, production of reactive species and the phosphorylation of Akt and GSK-3b proteins involved in PI3K cell signaling pathway. Our results showed that, when used during the OGD period, boldine 250 µM induced a marked microglial activation, as shown by isolectin B4 binding, increased reactive species production, as shown by DCF-DA oxidation and had no effect on Akt and GSK-3ß phosphorylation. Taken together, the results presented here suggest a promising neuroprotective effect of boldine against the damage caused by OGD, but the mechanism of action of this compound must be better elucidated.

A hiper estimulação do sistema glutamatérgico (excitotoxicidade), é um evento tóxico para o sistema nervoso central (SNC) e está envolvida em diversas doenças cerebrais agudas e crônicas. O glutamato, principal neurotransmissor excitatório do SNC, exerce suas funções através da ativação de seus receptores. A modulação da neurotransmissão glutamatérgica envolve a retirada do glutamato da fenda sináptica por transportadores específicos. Diversos estudos têm demonstrado que as purinas derivadas da guanina e a inosina apresentam efeitos neuroprotetores em modelos experimentais de doenças cerebrais relacionadas com a excitotoxicidade. Nesta tese, nós demonstramos que a captação de glutamato em fatias de várias estruturas cerebrais é diferente em ratas que apresentam comportamento tipo depressivo quando comparadas com ratas normais. Ou seja, nas ratas com comportamento tipo-depressivo houve um aumento inicial da captação de glutamato hipocampal e uma diminuição gradual após as 24 h que persiste até 21 dias. Nas ratas normais não houve alterações na captação de glutamato. O hipocampo foi a estrutura cerebral mais sensível ao comportamento de depressão. Alèm disso, evidenciamos o potencial neuroprotetor do GMP, da guanosina e da inosina em diferentes modelos experimentais de doenças cerebrais. A administração sistêmica de GMP induziu um comportamento ansiolítico em protocolos clássicos para avaliar drogas com potencial ansiolítico/ansiogênico em ratos. A administração oral crônica de GMP em camundongos aumentou a resistência do córtex cerebral a um insulto isquêmico ex vivo por privação de oxigênio e glicose. Esse efeito neuroprotetor foi correlacionado com modulações do sistema glutamatérgico. Ou seja, a administração de GMP foi capaz de diminuir o imunoconteúdo de algumas subunidades de receptores e de alguns subtipos de transportadores glutamatérgicos. Isto potencialmente pode estar relacionado ao efeito neuroprotetor ocasionado pela diminuição da sinalização e da fonte de glutamato, respectivamente, durante o insulo isquêmico. Além disso, verificamos que a administração intracerebroventricular de inosina exerceu efeito anticonvulsivante em camundongos frente a convulsões induzidas por ácido quinolínico, um potente agonista glutamatérgico. Este efeito foi independente dos receptores benzodiazepínicos. Avaliamos também o efeito do tratamento oral crônico com guanosina frente ao prejuízo cognitivo e dano hipocampal em ratos submetidos à hipoperfusão cerebral crônica. O tratamento com guanosina não foi capaz de prevenir o prejuízo cognitivo, porém nenhum animal tratado apresentou dano hipocampal. Por fim, investigamos o possível sítio de união da guanosina à membrana plasmática cerebral em ratos. Verificamos que as preparações enriquecidas em membrana plasmáticas, comumente utilizadas em protocolos de união, apresentam níveis significativos de guanosina endógena. Entretanto estes níveis elevados de guanosina endógena podem mascarar os níveis de união da guanosina. Por isso apresentamos uma metodologia capaz de diminuir os níveis de guanosina endógena, detectando assim um maior nível de união da guanosina nas preparações enriquecidas em membrana plasmática. Por fim, apresentamos alguns dados que mostram a necessidade de melhorar a purificação das preparações enriquecidas em membrana plasmática para evitar a contaminação com membrana mitocondrial. . De uma maneira geral, esta tese traz contribuições para um melhor entendimento das alterações do sistema glutamatérgico e o potencial neuroprotetor das purinas derivadas da guanina e da inosina em doenças cerebrais envolvendo excitotoxicidade glutamatérgica. / The neurotoxicity caused by overstimulation of glutamatergic system is implicated in several acute and chronic brain diseases. Glutamate mediate the excitatory synaptic transmition in the brain by acting on the ionotropic and metabotropic glutamate receptors The uptake mechanisms performed by specific transporter proteins have an important role in modulate the glutamatergic neurotransmission. Several studies have shown that the guanine based-purines and inosine exhibit neuroprotective effects in experimental models of brain disorders caused by excitotoxicity. In this thesis, we showed that the glutamate uptake by different brain structures of female rats with depression-like behavior is different from the normal female rats. For example, in female rats with depression-like behavior there was an initial increase in the hippocampal glutamate uptake followed by a gradual decrease after 24h that persist up to 21 days compared to animals without depressive-like behavior.The hippocampus was the most sensitive brain structure related to this behavior. We also reported the neuroprotective potential effect of GMP, guanosine, and inosine in different experimental models of brain diseases. We showed that systemic administration of GMP induced an anxiolytic-like behavior in classic behavior protocols developed to evaluate potential anxyolityc/anxiogenic drugs in rats. We also demonstrated that an oral chronically administration of GMP in mice increased the resistance of the brain cortex to an ex vivo ischemic insult, the oxygen and glucose deprivation. This neuroprotective effect was correlated with changes in the brain cortical glutamatergic system. The GMP administration decreased the immunocontent of some glutamate receptors subunits and some subtypes of glutamate transporters. Those effects may be related to the neuroprotective effect by decreasing the signaling pathway and the source of glutamate, respectively, during an ischemia insult. Moreover, we reported that an intracerebroventricular administration of inosine caused an anticonvulsive effect in mice against seizures induced by quinolinic acid, a potent glutamate agonist. This effect was independent of benzodiazepines receptors. We also investigated the effect of an oral chronically treatment with guanosine against the cognitive impairment and the hippocampal damage observed in animal model of chronic cerebral hypoperfusion. The guanosine treatment did not prevent the cognitive impairment, however none of the animals treated with guanosine presented hippocampal damage. Finally, we investigated the guanosine binding site at the rat brain plasma membrane. We reported that the plasma membrane enriched preparations, commonly used in binding protocols, shows significant levels of endogenous guanosine. However, the increased levels of endogenous guanosine could mask the guanosine binding. For this reason we proposed a new methodology to decrease the endogenous guanosine in the plasma membrane enrich preparations to be able to detect the increase level of guanosine binding. Moreover, we presented some data that corroborate with the need of a better purify plasma membrane enrich preparations to avoid the contamination with mitochondrial membranes. Therefore, the work developed during this thesis contributes to a better understanding of alterations in the glutamatergic system and the neuroprotective potential of the guanine based purines and inosine in brain disorders related to glutamatergic excitotoxicity.

O cérebro é altamente dependente de um fluxo sanguíneo contínuo para suprimento de oxigênio e glicose, e por esta razão, eventos isquêmicos resultam em grande degeneração celular. O resveratrol é um antioxidante natural encontrado nas uvas e no vinho tinto que possui efeitos antitumoral e antiinflamatório, bem como propriedades cardioprotetoras. Neste trabalho, nós avaliamos o efeito neuroprotetor do resveratrol em um modelo in vitro de isquemia cerebral. Além disso, nós investigamos se este efeito estava correlacionado com as vias de sinalização da fosfoinositol3-quinase (PI3-k) e da proteína quinase ativada por mitógenos (mitogen-activated protein kinase-MAPK), ambas envolvidas na regulação da proliferação e sobrevivência celular. Para isto, nós usamos cultura organotípica de hipocampo exposta à privação de oxigênio e glicose (POG) como modelo de isquemia cerebral. A morte celular foi quantificada pela medida da incorporação de iodeto de propídeo (IP), um marcador de células mortas. Nas culturas expostas à POG na presença do veículo, aproximadamente 46% do hipocampo foi marcado com IP, indicando uma alta porcentagem de morte celular. Quando as culturas foram tratadas com resveratrol 10, 25 e 50µM, a morte celular foi reduzida para 22, 20 e 13%, respectivamente. Para elucidar o mecanismo pelo qual o resveratrol exerce seu efeito neuroprotetor nós investigamos a via PI3-k usando o inibidor LY294002 (5µM) e a via MAPK usando o inibidor PD98059 (20µM). A neuroproteção mediada pelo resveratrol (50µM) foi prevenida pelo LY294002, mas não pelo PD98059. A análise por immunoblotting revelou que o resveratrol 50µM induziu a fosforilação/ativação da Akt, a fosforilação/inativação da glicogênio sintase quinase-3β (GSK-3β) 1, 6 e 24 h após a POG e a fosforilação/ativação da quinase regulada por sinais extracelulares (extracellular signal-regulated kinase-1 and -2-ERK1/2) 6 e 24 h após a POG. Juntos, o aumento da fosforilação da Akt e GSK-3β induzida pelo resveratrol após a POG e o efeito da inibição da PI3-k pelo LY294002 levando a diminuição da neuroproteção mediada pelo resveratrol, sugerem que a via PI3-k/Akt, associada à GSK-3β , estão envolvidas no mecanismo pelo qual o resveratrol protege as culturas organotípicas da morte celular.

A hiper estimulação do sistema glutamatérgico (excitotoxicidade), é um evento tóxico para o sistema nervoso central (SNC) e está envolvida em diversas doenças cerebrais agudas e crônicas. O glutamato, principal neurotransmissor excitatório do SNC, exerce suas funções através da ativação de seus receptores. A modulação da neurotransmissão glutamatérgica envolve a retirada do glutamato da fenda sináptica por transportadores específicos. Diversos estudos têm demonstrado que as purinas derivadas da guanina e a inosina apresentam efeitos neuroprotetores em modelos experimentais de doenças cerebrais relacionadas com a excitotoxicidade. Nesta tese, nós demonstramos que a captação de glutamato em fatias de várias estruturas cerebrais é diferente em ratas que apresentam comportamento tipo depressivo quando comparadas com ratas normais. Ou seja, nas ratas com comportamento tipo-depressivo houve um aumento inicial da captação de glutamato hipocampal e uma diminuição gradual após as 24 h que persiste até 21 dias. Nas ratas normais não houve alterações na captação de glutamato. O hipocampo foi a estrutura cerebral mais sensível ao comportamento de depressão. Alèm disso, evidenciamos o potencial neuroprotetor do GMP, da guanosina e da inosina em diferentes modelos experimentais de doenças cerebrais. A administração sistêmica de GMP induziu um comportamento ansiolítico em protocolos clássicos para avaliar drogas com potencial ansiolítico/ansiogênico em ratos. A administração oral crônica de GMP em camundongos aumentou a resistência do córtex cerebral a um insulto isquêmico ex vivo por privação de oxigênio e glicose. Esse efeito neuroprotetor foi correlacionado com modulações do sistema glutamatérgico. Ou seja, a administração de GMP foi capaz de diminuir o imunoconteúdo de algumas subunidades de receptores e de alguns subtipos de transportadores glutamatérgicos. Isto potencialmente pode estar relacionado ao efeito neuroprotetor ocasionado pela diminuição da sinalização e da fonte de glutamato, respectivamente, durante o insulo isquêmico. Além disso, verificamos que a administração intracerebroventricular de inosina exerceu efeito anticonvulsivante em camundongos frente a convulsões induzidas por ácido quinolínico, um potente agonista glutamatérgico. Este efeito foi independente dos receptores benzodiazepínicos. Avaliamos também o efeito do tratamento oral crônico com guanosina frente ao prejuízo cognitivo e dano hipocampal em ratos submetidos à hipoperfusão cerebral crônica. O tratamento com guanosina não foi capaz de prevenir o prejuízo cognitivo, porém nenhum animal tratado apresentou dano hipocampal. Por fim, investigamos o possível sítio de união da guanosina à membrana plasmática cerebral em ratos. Verificamos que as preparações enriquecidas em membrana plasmáticas, comumente utilizadas em protocolos de união, apresentam níveis significativos de guanosina endógena. Entretanto estes níveis elevados de guanosina endógena podem mascarar os níveis de união da guanosina. Por isso apresentamos uma metodologia capaz de diminuir os níveis de guanosina endógena, detectando assim um maior nível de união da guanosina nas preparações enriquecidas em membrana plasmática. Por fim, apresentamos alguns dados que mostram a necessidade de melhorar a purificação das preparações enriquecidas em membrana plasmática para evitar a contaminação com membrana mitocondrial. . De uma maneira geral, esta tese traz contribuições para um melhor entendimento das alterações do sistema glutamatérgico e o potencial neuroprotetor das purinas derivadas da guanina e da inosina em doenças cerebrais envolvendo excitotoxicidade glutamatérgica. / The neurotoxicity caused by overstimulation of glutamatergic system is implicated in several acute and chronic brain diseases. Glutamate mediate the excitatory synaptic transmition in the brain by acting on the ionotropic and metabotropic glutamate receptors The uptake mechanisms performed by specific transporter proteins have an important role in modulate the glutamatergic neurotransmission. Several studies have shown that the guanine based-purines and inosine exhibit neuroprotective effects in experimental models of brain disorders caused by excitotoxicity. In this thesis, we showed that the glutamate uptake by different brain structures of female rats with depression-like behavior is different from the normal female rats. For example, in female rats with depression-like behavior there was an initial increase in the hippocampal glutamate uptake followed by a gradual decrease after 24h that persist up to 21 days compared to animals without depressive-like behavior.The hippocampus was the most sensitive brain structure related to this behavior. We also reported the neuroprotective potential effect of GMP, guanosine, and inosine in different experimental models of brain diseases. We showed that systemic administration of GMP induced an anxiolytic-like behavior in classic behavior protocols developed to evaluate potential anxyolityc/anxiogenic drugs in rats. We also demonstrated that an oral chronically administration of GMP in mice increased the resistance of the brain cortex to an ex vivo ischemic insult, the oxygen and glucose deprivation. This neuroprotective effect was correlated with changes in the brain cortical glutamatergic system. The GMP administration decreased the immunocontent of some glutamate receptors subunits and some subtypes of glutamate transporters. Those effects may be related to the neuroprotective effect by decreasing the signaling pathway and the source of glutamate, respectively, during an ischemia insult. Moreover, we reported that an intracerebroventricular administration of inosine caused an anticonvulsive effect in mice against seizures induced by quinolinic acid, a potent glutamate agonist. This effect was independent of benzodiazepines receptors. We also investigated the effect of an oral chronically treatment with guanosine against the cognitive impairment and the hippocampal damage observed in animal model of chronic cerebral hypoperfusion. The guanosine treatment did not prevent the cognitive impairment, however none of the animals treated with guanosine presented hippocampal damage. Finally, we investigated the guanosine binding site at the rat brain plasma membrane. We reported that the plasma membrane enriched preparations, commonly used in binding protocols, shows significant levels of endogenous guanosine. However, the increased levels of endogenous guanosine could mask the guanosine binding. For this reason we proposed a new methodology to decrease the endogenous guanosine in the plasma membrane enrich preparations to be able to detect the increase level of guanosine binding. Moreover, we presented some data that corroborate with the need of a better purify plasma membrane enrich preparations to avoid the contamination with mitochondrial membranes. Therefore, the work developed during this thesis contributes to a better understanding of alterations in the glutamatergic system and the neuroprotective potential of the guanine based purines and inosine in brain disorders related to glutamatergic excitotoxicity.

O cérebro é altamente dependente de um fluxo sanguíneo contínuo para suprimento de oxigênio e glicose, e por esta razão, eventos isquêmicos resultam em grande degeneração celular. O resveratrol é um antioxidante natural encontrado nas uvas e no vinho tinto que possui efeitos antitumoral e antiinflamatório, bem como propriedades cardioprotetoras. Neste trabalho, nós avaliamos o efeito neuroprotetor do resveratrol em um modelo in vitro de isquemia cerebral. Além disso, nós investigamos se este efeito estava correlacionado com as vias de sinalização da fosfoinositol3-quinase (PI3-k) e da proteína quinase ativada por mitógenos (mitogen-activated protein kinase-MAPK), ambas envolvidas na regulação da proliferação e sobrevivência celular. Para isto, nós usamos cultura organotípica de hipocampo exposta à privação de oxigênio e glicose (POG) como modelo de isquemia cerebral. A morte celular foi quantificada pela medida da incorporação de iodeto de propídeo (IP), um marcador de células mortas. Nas culturas expostas à POG na presença do veículo, aproximadamente 46% do hipocampo foi marcado com IP, indicando uma alta porcentagem de morte celular. Quando as culturas foram tratadas com resveratrol 10, 25 e 50µM, a morte celular foi reduzida para 22, 20 e 13%, respectivamente. Para elucidar o mecanismo pelo qual o resveratrol exerce seu efeito neuroprotetor nós investigamos a via PI3-k usando o inibidor LY294002 (5µM) e a via MAPK usando o inibidor PD98059 (20µM). A neuroproteção mediada pelo resveratrol (50µM) foi prevenida pelo LY294002, mas não pelo PD98059. A análise por immunoblotting revelou que o resveratrol 50µM induziu a fosforilação/ativação da Akt, a fosforilação/inativação da glicogênio sintase quinase-3β (GSK-3β) 1, 6 e 24 h após a POG e a fosforilação/ativação da quinase regulada por sinais extracelulares (extracellular signal-regulated kinase-1 and -2-ERK1/2) 6 e 24 h após a POG. Juntos, o aumento da fosforilação da Akt e GSK-3β induzida pelo resveratrol após a POG e o efeito da inibição da PI3-k pelo LY294002 levando a diminuição da neuroproteção mediada pelo resveratrol, sugerem que a via PI3-k/Akt, associada à GSK-3β , estão envolvidas no mecanismo pelo qual o resveratrol protege as culturas organotípicas da morte celular.

A isquemia cerebral está entre as principais causas de mortalidade e morbidade em países industrializados e, apesar dos estudos constantes, ainda não existe um tratamento eficaz. Nesse estudo, investigamos o efeito neuroprotetor da boldina, um alcalóide presente nas folhas e casca de Peumus boldus Molina, sobre os danos causados pela isquemia cerebral. Para isso, foi utilizado um modelo in vitro de privação de oxigênio e glicose (POG) em culturas organotípicas de hipocampo de rato. Nossos resultados demonstraram que o tratamento com boldina nas concentrações de 120 µM e 250 µM diminuiu significativamente a morte celular induzida pela POG de 36% para 20 e 11%, respectivamente. A boldina não apresentou efeito tóxico em condições basais em nenhuma das concentrações testadas. O efeito neuroprotetor da boldina ocorreu apenas quando ela estava presente durante o período de POG, não havendo diferença quando ela foi utilizada somente durante o período de 24 horas de recuperação. O tratamento com boldina durante a POG foi capaz de induzir ativação microglial observada 24 horas após o tratamento através da marcação com isolectina B4. Ela também causou um aumento considerável na produção de espécies reativas, o que pode ser causa ou conseqüência da ativação da microglia. Não foram observadas diferenças na fosforilação das proteínas Akt e GSK-3ß 24 horas após o tratamento e, portanto, alterações nessas proteínas não parecem estar envolvidas com a neuroproteção causada pela boldina. Em conjunto, os resultados sugerem um efeito neuroprotetor promissor da boldina contra os danos causados pela POG, sendo que os mecanismos que desencadeiam esse efeito devem ser melhor elucidados. / Ischemic stroke is among the major causes of mortality and morbidity in industrialized countries and, in spite of several studies, no efficient treatment is available to the patients. In this work, we investigated the neuroprotective effect of boldine, an alkaloid present in leaves and bark of Peumus boldus Molina, against the damage caused by an in vitro lesion that mimics ischemic stroke. For these experiments, we used an in vitro model of oxygen and glucose deprivation (OGD) in rat organotypic hippocampal slice cultures. Our results showed that the treatment with boldine in the concentrations of 120 µM and 250 µM caused a significant reduction in cellular death after OGD from 36%, observed in OGDvehicle exposed cultures, to 20% and 11%, respectively. Boldine was not cytotoxic in basal conditions in any of the tested concentrations. The neuroprotective effect of boldine was observed when it was present during the period of OGD, showing no difference when it was used only during the recovery period of 24 hours. To elucidate a possible mechanism by which boldine exerts its neuroprotective effect we investigated the microglial activation, production of reactive species and the phosphorylation of Akt and GSK-3b proteins involved in PI3K cell signaling pathway. Our results showed that, when used during the OGD period, boldine 250 µM induced a marked microglial activation, as shown by isolectin B4 binding, increased reactive species production, as shown by DCF-DA oxidation and had no effect on Akt and GSK-3ß phosphorylation. Taken together, the results presented here suggest a promising neuroprotective effect of boldine against the damage caused by OGD, but the mechanism of action of this compound must be better elucidated.