A vasodilatação promovida pela triiodotironina (T3) ocorre por sua ação direta sobre o relaxamento das células musculares lisas vasculares (CMLV), porém os mecanismos envolvidos são desconhecidos. Neste estudo mostramos que o T3 rapidamente relaxa as CMLV através da geração de óxido nítrico (NO), via óxido nítrico sintase neuronal e induzível (nNOS e iNOS), efeitos mediados pela sinalização PI3K/Akt. Ensaios funcionais em aortas sem endotélio, incubados com T3, mostraram menor resposta contrátil a Fenilefrina (FE), efeito este revertido pelo L-NAME, inibidor da NOS. Aortas de ratos hipertiroideos apresentaram aumento do receptor de Angiotensina II (AngII) do tipo 2 (AT2), acompanhado de diminuição de proteínas contráteis. In vitro o T3 diminui estas proteínas contráteis via AT2. Aortas sem endotélio dos ratos hipertiroideos apresentaram menor reatividade a AngII e maior relaxamento ao nitroprussiato de sódio (NPS), efeitos estes mediados via AT2. Por fim, observamos que o T3 é capaz de induzir produção de NO nas CMLV via PI3K/Akt, a qual é ativada pelo AT2 / 3,3\',5-triiodo-l-thyronine (T3) has been shown to induce vasodilation by its direct effect on vascular smooth muscle cells (VSMC). However, the mechanism by which T3 causes VSMC relaxation is still unknown. Here, we have shown that T3 causes rapid relaxation of VSMC via increased NO production from inducible and neuronal nitric oxide synthase (NOS). We further showed that these effects were mediated by PI3K/Akt signaling pathway. Vascular reactivity studies showed that endothelium-denuded aortas treated with T3 had a decreased response to phenylephrine which was reserved by L-NAME, NOS inhibitors. Aortas from hyperthyroid rats showed an upregulation of AT2 accompanied by decreased of contractile proteins. In vitro we observed that T3 decreases contractile proteins via AT2. Furthermore, endothelium-denuded aortas from hyperthyroid rats showed a decreased response to angiotensinII and augmented relaxation to sodium nitroprusside (SNP) via AT2 participation. Our data also suggests that PI3K/Akt signaling pathway is involved in T3-induced NO production in VSMC via AT2.

A isoforma 3 do trocador Na+ /H+ (NHE3), presente em membrana apical, é a proteína de transporte que medeia a maior parte da reabsorção de NaCl e NaHCO3- em túbulo proximal renal. A fosforilação direta do NHE3 por PKA na serina 552 é um dos mecanismos pelos quais a sua atividade pode ser inibida. A ligação da angiotensina II (Ang II) ao receptor AT1 (AT1R) em túbulo proximal estimula a atividade do NHE3 por diferentes vias de sinalização. Entretanto, não foram ainda bem estabelecidos os efeitos da ativação da via AT1R/Gi, com consequente diminuição nos níveis de cAMP, na regulação do NHE3. A Ang II pode ainda estimular a atividade do NHE3 por promover a sua translocação da base para o corpo das microvilosidades, entretanto, o papel da proteína motora miosina IIA nesta translocação em resposta à Ang II ainda não foi estabelecido. Sendo assim esta tese teve como objetivos: (1) testar a hipótese de que a Ang II diminui os níveis de fosforilação do NHE3 mediados pelo cAMP/PKA na serina 552 aumentando a sua atividade por reduzir os níveis de cAMP e (2) testar a hipótese de que a miosina IIA participa da redistribuição do NHE3 da base para o corpo das microvilosidades em túbulo proximal renal em condições de estímulo da reabsorção de sódio, como ocorre em resposta à Ang II. Visando avaliar os efeitos da ativação da via AT1R/Gi na regulação do NHE3, verificamos, por meio da técnica de recuperação do pH dependente de Na+, que, em condições basais, a Ang II estimulou a atividade do NHE3, mas não alterou a atividade da PKA e nem afetou os níveis de fosforilação do NHE3 na serina 552 em uma linhagem de células de túbulo proximal (OKP). Entretanto, na presença da forskolin (FSK), agente que eleva os níveis intracelulares de cAMP, a Ang II foi capaz de contrapor-se ao efeito inibitório da FSK sobre o NHE3 por promover redução na concentração de cAMP, diminuição da atividade da PKA e, consequentemente, diminuição nos níveis de fosforilação da serina 552. Todos os efeitos da Ang II foram bloqueados quando um pré-tratamento com Losartan, antagonista do receptor AT1, foi feito nas células OKP, destacando a contribuição da via AT1R/proteína Gi no aumento da atividade do NHE3 pela Ang II. Observamos que a inibição da proteína Gi com PTX (toxina pertussis) diminuiu a atividade do NHE3 em células OKP e que a PTX diminuiu a atividade do NHE3 assim como preveniu o efeito estimulatório da Ang II sobre a atividade do NHE3 em túbulo proximal de ratos Wistar. Adicionalmente, com a intenção de avaliar os efeitos da miosina IIA na redistribuição do NHE3, constatamos que a blebistatina, inibidor da miosina IIA, preveniu completamente o aumento de atividade do NHE3 mediado pela Ang II em ratos Wistar e que o uso da blebistatina foi capaz de prevenir o aumento do NHE3 na superfície de células OKP tratadas com Ang II. Em conjunto, nossos resultados sugerem que a Ang II contrapõe-se aos efeitos do cAMP/PKA sobre a fosforilação e a atividade do NHE3 pela ativação da via AT1R/Gi e que a miosina IIA desempenha um papel na mediação da regulação da atividade do NHE3 em túbulo proximal renal de ratos em resposta à Ang II. Sugerem ainda que a desfosforilação do NHE3 na serina 552 pode representar um evento chave na regulação do manuseio de sal tubular proximal pela Ang II na presença de hormônios natriuréticos que promovem o aumento dos níveis de cAMP e da fosforilação do transportador e que a miosina IIA está envolvida na regulação do tráfego do NHE3 em túbulo proximal renal / The Na+/H+ exchanger isoform 3 (NHE3), expressed on the apical membrane, is responsible for most NaCl and NaHCO3 - reabsorption in the renal proximal tubule. Direct phosphorylation of NHE3 by PKA at serine 552 is one of the mechanisms by which its activity is inhibited. Binding of angiotensin II (Ang II) to the AT1 receptor (AT1R) in the proximal tubule stimulates NHE3 activity through multiple signaling pathways. However, the effects of AT1R/Gi activation and subsequent decrease in cAMP accumulation on NHE3 regulation are not well established. Ang II can also stimulate NHE3 activity by promoting its translocations from the base to the body of the microvilli, however, the role of the myosin IIA motor protein in this translocation in response to Ang II is not yet established. Therefore, the aims of this thesis are: (1) to test the hypothesis that Ang II decreases the cAMP/PKA-mediated NHE3 phosphorylation levels at serine 552 increasing its activity by reducing cAMP levels and (2) to test the hypothesis that myosin IIA participates in the NHE3 redistribution from the base to the body of the microvilli in the renal proximal tubule under conditions in which sodium reabsorption is stimulated, such as in response to Ang II. In order to evaluate the effects of AT1R/Gi pathway activation on NHE3 regulation, by means the intracellular pH recovery technique, we verified that under basal conditions, Ang II stimulated NHE3 activity but did not affect PKA-mediated NHE3 phosphorylation at serine 552 in opossum kidney (OKP) cells. However, in the presence of the cAMP-elevating agent forskolin (FSK), Ang II counteracted FSK-induced NHE3 inhibition, reduced intracellular cAMP concentrations, lowered PKA activity, and prevented the FSK-mediated increase in NHE3 serine 552 phosphorylation. All effects of Ang II were blocked by pretreating OKP cells with the AT1R antagonist Losartan, highlighting the contribution of the AT1R/Gi pathway in Ang II-mediated NHE3 upregulation under cAMP-elevating conditions. We also verified that Gi protein inhibition by pertussis toxin treatment decreased NHE3 activity both in vitro and in vivo and, more importantly, prevented the stimulatory effect of Ang II on NHE3 activity in Wistar rat proximal tubules. Additionally, we assessed the effects of myosin IIA on NHE3 redistribution, and found that blebbistatin, a myosin IIA inhibitor, completely prevented the increase of Ang II-mediated NHE3 activity in Wistar rats and that blebbistatin was able to prevent the increase of NHE3 on the Ang II-treated OKP cells surface. Collectively, our results suggest that Ang II counteracts the effects of cAMP/PKA on NHE3 phosphorylation and inhibition by activating the AT1R/Gi pathway and that myosin IIA plays a role in mediating the NHE3 activity regulation in the rat renal proximal tubule in response to Ang II. Furthermore, these findings support the notion that NHE3 dephosphorylation at serine 552 may represent a key event in the regulation of renal proximal tubule sodium handling by Ang II in the presence of natriuretic hormones that promote cAMP accumulation and transporter phosphorylation, and that myosin IIA is involved in NHE3 trafficking regulation in the renal proximal tubule

Estudamos se a sobrecarga salina leva ao aumento de neoíntima em vasos submetidos à lesão e avaliamos a participação do sistema renina-angiotensina neste processo. Usamos camundongos C57Bl6 machos tratados por 2 ou 12 semanas com NaCl 1% para beber ou água (grupos cont, sal2 e sal12), submetidos à lesão vascular. O grupo sal12 aumentou a lesão vascular e alterou a relação de fibras colágenas, com exacerbação de deposição colágena na lesão vascular, e a relação entre as angiotensinas II e (1-7) vasculares, com aumento de Ang (1-7) e sem redução de ang II após a lesão. Os resultados obtidos permitem concluir que a sobrecarga salina aumenta a neoíntima nas artérias com lesão e altera a relação entre angiotensinas II e (1-7) de forma possivelmente propiciar o aumento de relação íntima/média observado. / We studied if salt overload leads to an increase in neointima in injured arteries, and evaluate the involvement of the renin-angiotensin in this process. Were used C57Bl6 male mice treated for 2 or 12 weeks with 1% NaCl to drink or water (cont, sal2 sal12 groups) submitted to vascular injury. The group sal12 increased vascular injury and altered the relationship of collagen fibers, with exacerbation of collagen deposition in the vascular injury, and the relationship between vascular angiotensin II and (1-7), with an increase of Ang (1-7) and no reduction of Ang II after injury. The results indicate that salt overload increases neointima in injured arteries, and modifies the relationship between angiotensin II and (1-7), possibly providing the increase in intima/media ratio observed.

A doença cardiovascular (DCV) é a principal causa de mortalidade nos pacientes com doença renal crônica (DRC) e a hipertrofia de ventrículo esquerdo (HVE), a alteração mais freqüente. A remodelação cardíaca (RC) patológica ocorre em resposta a agressões como sobrecarga de volume ou de pressão e é influenciada por ativação neurohormonal, fatores locais, inflamação, isquemia, necrose e apoptose celular. Os miócitos são as principais células envolvidas na RC. Avaliamos o papel da hiperfosfatemia e do paratormônio (PTH) em animais urêmicos. Trinta e dois ratos Wistar machos foram submetidos à paratireoidectomia (PTX) e nefrectomia (Nx), com reposição contínua de PTH em concentração fisiológica (PTHf= 0,022 ug/100g/h) ou elevada (PTHe=0,11 ug/100g/h). Os animais sham (N=16) foram operados e recebiam infusão de veículo. Apenas o conteúdo de fósforo nas dietas era diferente, ou seja: pobre=0,2% (pP) ou rica em fósforo=1,2% (rP). Dividimos os animais em 6 grupos: Sham: Sham-pP (G1), Sham-rP (G2); PTX+Nx: PTHf-pP (G3), PTHf-rP (G4), PTHe-pP (G5), PTHe-rP (G6). Semanalmente determinamos o peso e a pressão arterial caudal. Creatinina, fósforo, cálcio PTH e hematócrito foram analisados. Após 8 semanas os animais foram sacrificados. A hipertrofia e fibrose miocárdicas foram analisadas com o sistema digital Leica. O peso do coração corrigido por 100g peso corporal foi maior nos grupos G5 e G6 e apresentou uma correlação positiva com hipertrofia e fibrose miocárdica. A hipertrofia e fibrose foram menores no G3, quando comparado aos grupos Nx. A hipertrofia miocárdica foi maior no G6, evidenciando o papel do P neste processo. A fibrose mocárdica ocorreu principalmente em subendocárdio e foi mais intensa no G6. Analisamos a expressão do fator transformador de crescimento (TGF-beta) e angiotensina II que foram mais intensas nos grupos G5 e G6. As lesões das artérias coronarianas foram avaliadas de forma semi-quantitativa e os animais G5 e G6 mostraram calcificações de camada média. A expressão da alfa-actina se correlacionou negativamente com as lesões coronarianas. Nossos resultados demonstraram a importância do fósforo e PTH na fisiopatologia da DCV, sendo necessário um melhor controle destes elementos para prevenção de mortalidade nos pacientes com DRC. / Cardiovascular disease (CVD) is the leading cause of mortality in patients with chronic kidney disease (CKD), and left ventricular hypertrophy (LVH) is the most common alteration. Pathologic cardiac remodeling (CR) occurs in response to injuries such as volume or pressure overload, and it is influenced by neurohormonal activation, local factors, inflammation, ischemia, necrosis and cellular apoptosis. Myocytes are the principal cells involved in CR. We evaluated the role of hyperphosphatemia and parathyroid hormone (PTH) in uremic animals. Thirty-two male Wistar rats were submitted to parathyroidectomy (PTX) and nephrectomy (Nx), with PTH continuous replacement in physiologic concentration (PTHf=0.022ug/100g/h) or elevated (PTHe=0.11ug/100g/h). The sham animals (N=16) were operated and received vehicle infusion. Only the phosphorus content in diets was different, that is: poor = 0.2% (pP) or rich in phosphorus = 1.2% (rP). We divided the animals into 6 groups: Sham: Sham-pP (G1), Sham-rP (G2); PTX+Nx: PTHf-pP (G3), PTHf-rP (G4), PTHe-pP (G5), PTHe-rP (G6). We determined the weight and caudal blood pressure weekly. Creatinine, phosphorus, PTH calcium and hematocrit were analyzed. After 8 weeks, the animals were sacrificed. Myocardial hypertrophy and fibrosis were analyzed using Leica digital system. The weight of the heart corrected for 100g body weight was greater in groups G5 and G6 and presented a positive correlation with myocardial hypertrophy and fibrosis. Hypertrophy and fibrosis were lower in G3, when compared to Nx groups. Myocardial hypertrophy was higher in G6, determining the role of P in this process. Myocardial fibrosis occurred mainly in subendocardium and was more intense in G6. We analyzed the expression of transforming growth factor (TGF-alfa) and angiotensin II, which were more intense in groups G5 and G6. Coronary artery lesions were evaluated semiquantitatively and G5 and G6 animals showed middle layer calcifications. Expression of alfa-actin correlated negatively with coronary lesions. Our results demonstrated the importance of phosphorus and PTH in the pathophysiology of CVD; therefore, a better control of these elements is required in order to prevent mortality in patients with CKD.

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:22:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DissRBD.pdf: 921826 bytes, checksum: 40bd9588528375b232a2fdf78d110ff9 (MD5) Previous issue date: 2006-08-24 / The hypothesis of a synergy between two hormones responsible for sodium conservation, aldosterone and angiotensin II (ANG II), explains the expression of a characteristic of sodium appetite, hypertonic NaCl intake, in a hypovolemic animal. Hypertonic NaCl intake can be induced in normovolemic rats that received a combined treatment of mineralocorticoid and ANG II at individual doses not sufficient to induce sodium intake (paradigmatic synergy test). Considering the motivation to specific sodium intake another characteristic of sodium appetite, the objective of the present dissertation was to find out a role for the interaction between mineralocorticoid and ANG II on the specificity of sodium appetite. Sprague-Dawley Holtzman rats (≅ 300 g b.w.) were housed with access to water and one or more palatable (0.01 M KCl, 0.05 mM CaCl2, 0.15 M NaHCO3, 0.15 M NaCl) or hypertonic (0.50 M NaCl) mineral solutions for ingestion. In two-bottle tests, a bottle contained water and another bottle contained either 0.01 M KCl, 0.15 M NaHCO3, 0.15 M NaCl or 0.50 M NaCl. In five-bottle tests, a bottle contained water and each one of the remaining four bottles contained either 0.01 M KCl, 0.05 mM CaCl2, 0.15 M NaHCO3 or 0.15 M NaCl, respectively. In sodium depletion tests, intact rats received each a 10 mg sc. injection of furosemide or vehicle followed by 24 h access to sodium deficient food and water. Then, food was removed and mineral solutions and water were offered for recording their intake (sodium appetite test). In the paradigmatic synergy test, the animals received daily single sc injection of 2.5 mg of deoxycorticosterone acetate (DOCA) or sunflower oil (vehicle) for three days and a left lateral cerebroventricular injection of 50 ng of ANG II four hours after the last DOCA or oil injection. Fluid intake record began immediately after ANG II injection and food removal. The daily intake record showed no preference for any solution or water when animals had access to five bottles. Sodium depletion induced a preferential sodium intake, with higher NaCl than NaHCO3 intake, in either two- or five-bottle sodium appetite tests. DOCA alone enhanced the daily 0.15 M NaCl and NaHCO3 intake, but did not alter KCl or 0.50 M NaCl intake in two-bottle tests. In the paradigmatic tests with normovolemic animals, ANG II combined to oil induced the ingestion of all three palatable mineral solutions (KCl, NaHCO3, NaCl) and water, in two-bottle tests, and preference for NaHCO3 in five-bottle tests. DOCA pretreatment enhanced only sodium solution intake, particularly NaCl intake, induced by ANG II in two-bottle tests (0.15 M NaCl: DOCA/ANG II = 24.5 ± 6.7 ml/120 min. vs. OIL/ANG II = 9.2 ± 1.8 ml/120 min.; 0.15 M NaHCO3: DOCA/ANG II = 17.0 ± 1.8 ml/120 min. vs. OIL/ANG II = 14.6 ± 2.1 ml/120 min.; 0.01 M KCl: DOCA/ANG II = 9.8 ± 1.9 ml/120 min. vs. 11.9 ± 1.2 ml/120 min.), and enhanced by 80 % the total sodium solution intake in the beginning of the five-bottle test. The combined effect of DOCA with ANG II on the induction of 0.50 M NaCl intake in a two-bottle test was replicated in our animals. The results from the paradigmatic synergy test are coherent with results from sodium appetite tests, suggesting that the mineralocorticoid may turn the effect of ANG II on mineral intake more selective to sodium intake. Thus, the combined ANG II and mineralocorticoid action could contribute to the expression of two characteristics of sodium appetite, not only the acceptance of hypertonic sodium solutions, but also the selective sodium intake. / A hipótese do sinergismo entre dois hormônios responsáveis pela conservação de sódio, a aldosterona e a ANG II, explica uma característica do apetite ao sódio, a ingestão de NaCl hipertônico em um animal hipovolêmico. Ingestão de NaCl hipertônico pode ser induzida em ratos normovolêmicos que receberam um tratamento combinado de mineralocorticóide e ANG II, em doses individuais insuficientes para induzir a ingestão de sódio (teste paradigmático do sinergismo). Sendo a motivação para uma ingestão específica de sódio uma outra característica do apetite ao sódio, o objetivo desta dissertação foi o de procurar um papel para a interação entre mineralocorticóide e ANG II na especificidade do apetite ao sódio. Foram utilizados ratos Sprague-Dawley Holtzman (≅ 300 g p.c.) ambientados com livre acesso a bebedouros com água e uma ou mais soluções minerais palatáveis (KCl 0,01 M, CaCl2 0,05 mM, NaHCO3 0,15 M, NaCl 0,15 M) ou hipertônica (NaCl 0,50 M). Em testes de dois bebedouros, um dos bebedouros continha água e o outro, solução de KCl 0,01 M, NaHCO3 0,15 M, NaCl 0,15 M ou NaCl 0,50 M. Em testes de cinco bebedouros, um dos bebedouros continha água e cada um dos demais uma solução de KCl 0,01 M, CaCl2 0,05 mM, NaHCO3 0,15 M ou NaCl 0,15 M. Testes com dois ou cinco bebedouros foram empregados em animais depletados de sódio e no teste paradigmático do sinergismo. Nos testes de depleção de sódio, os animais receberam injeção sc de 10 mg de furosemida ou veículo, seguida de acesso a uma dieta hipossódica e água por vinte e quatro horas. Em seguida, o alimento foi removido e foram oferecidas soluções minerais para registro da ingestão das mesmas e de água (teste do apetite ao sódio). No teste paradigmático do sinergismo, os animais receberam injeção sc de 2,5 mg de acetato de desoxicorticosterona (DOCA) ou óleo de girassol (veículo) uma vez ao dia, durante três dias, e uma injeção de 50 ng de ANG II (ou salina) no ventrículo lateral esquerdo, quatro horas após a última injeção de DOCA ou óleo. Passou-se a registrar a ingestão de líquidos imediatamente após a injeção de ANG II e remoção da ração. O registro da ingestão diária mostrou que não houve preferência por nenhuma solução ou água durante o período de ambientação com cinco bebedouros. A depleção de sódio induziu ingestão preferencial de sódio no teste do apetite ao sódio, sendo a ingestão de NaCl 0,15 M maior do que a de NaHCO3 tanto nos testes de dois como de cinco bebedouros. O tratamento com apenas DOCA aumentou a ingestão diária de NaCl 0,15 M e de NaHCO3 sem alterar a ingestão diária de KCl e de NaCl 0,50 M, em testes de dois bebedouros. No teste paradigmático com ratos normovolêmicos, a ANG II combinada ao óleo promoveu ingestão das três soluções minerais palatáveis (KCl, NaHCO3, NaCl) e de água em testes de dupla escolha, e preferência ao NaHCO3 no teste com cinco bebedouros. O pré-tratamento com DOCA potenciou o efeito da ANG II apenas sobre a ingestão das soluções sódicas, mais evidente para NaCl, no teste com dois bebedouros (NaCl 0,15 M: DOCA/ANG II = 24,5 ± 6,7 ml/120 min. vs. ÓLEO/ANG II = 9,2 ± 1,8 ml/120 min.; NaHCO3 0,15 M: DOCA/ANG II = 17,0 ± 1,8 ml/120 min. vs. ÓLEO/ANG II = 14,6 ± 2,1 ml/120 min.; KCl 0,01 M: DOCA/ANG II = 9,8 ± 1,9 ml/120 min. vs. 11,9 ± 1,2 ml/120 min.), além de aumentar em 80 % a ingestão total de soluções sódicas no início do teste com cinco bebedouros. O efeito da indução de ingestão de NaCl 0,50 M pela combinação de DOCA com ANG II em testes de dois bebedouros foi replicado nos nossos animais. Os resultados do teste paradigmático do sinergismo são coerentes com os testes do apetite ao sódio, sugerindo que o mineralocorticóide possa tornar mais seletivo o efeito da ANG II sobre a ingestão mineral. Assim, uma interação entre ANG II e mineralocorticóide poderia contribuir para a expressão de duas características do apetite ao sódio, não apenas a aceitação de soluções hipertônicas de NaCl, mas também a ingestão seletiva de sódio.

A vasodilatação promovida pela triiodotironina (T3) ocorre por sua ação direta sobre o relaxamento das células musculares lisas vasculares (CMLV), porém os mecanismos envolvidos são desconhecidos. Neste estudo mostramos que o T3 rapidamente relaxa as CMLV através da geração de óxido nítrico (NO), via óxido nítrico sintase neuronal e induzível (nNOS e iNOS), efeitos mediados pela sinalização PI3K/Akt. Ensaios funcionais em aortas sem endotélio, incubados com T3, mostraram menor resposta contrátil a Fenilefrina (FE), efeito este revertido pelo L-NAME, inibidor da NOS. Aortas de ratos hipertiroideos apresentaram aumento do receptor de Angiotensina II (AngII) do tipo 2 (AT2), acompanhado de diminuição de proteínas contráteis. In vitro o T3 diminui estas proteínas contráteis via AT2. Aortas sem endotélio dos ratos hipertiroideos apresentaram menor reatividade a AngII e maior relaxamento ao nitroprussiato de sódio (NPS), efeitos estes mediados via AT2. Por fim, observamos que o T3 é capaz de induzir produção de NO nas CMLV via PI3K/Akt, a qual é ativada pelo AT2 / 3,3\',5-triiodo-l-thyronine (T3) has been shown to induce vasodilation by its direct effect on vascular smooth muscle cells (VSMC). However, the mechanism by which T3 causes VSMC relaxation is still unknown. Here, we have shown that T3 causes rapid relaxation of VSMC via increased NO production from inducible and neuronal nitric oxide synthase (NOS). We further showed that these effects were mediated by PI3K/Akt signaling pathway. Vascular reactivity studies showed that endothelium-denuded aortas treated with T3 had a decreased response to phenylephrine which was reserved by L-NAME, NOS inhibitors. Aortas from hyperthyroid rats showed an upregulation of AT2 accompanied by decreased of contractile proteins. In vitro we observed that T3 decreases contractile proteins via AT2. Furthermore, endothelium-denuded aortas from hyperthyroid rats showed a decreased response to angiotensinII and augmented relaxation to sodium nitroprusside (SNP) via AT2 participation. Our data also suggests that PI3K/Akt signaling pathway is involved in T3-induced NO production in VSMC via AT2.

Estudamos se a sobrecarga salina leva ao aumento de neoíntima em vasos submetidos à lesão e avaliamos a participação do sistema renina-angiotensina neste processo. Usamos camundongos C57Bl6 machos tratados por 2 ou 12 semanas com NaCl 1% para beber ou água (grupos cont, sal2 e sal12), submetidos à lesão vascular. O grupo sal12 aumentou a lesão vascular e alterou a relação de fibras colágenas, com exacerbação de deposição colágena na lesão vascular, e a relação entre as angiotensinas II e (1-7) vasculares, com aumento de Ang (1-7) e sem redução de ang II após a lesão. Os resultados obtidos permitem concluir que a sobrecarga salina aumenta a neoíntima nas artérias com lesão e altera a relação entre angiotensinas II e (1-7) de forma possivelmente propiciar o aumento de relação íntima/média observado. / We studied if salt overload leads to an increase in neointima in injured arteries, and evaluate the involvement of the renin-angiotensin in this process. Were used C57Bl6 male mice treated for 2 or 12 weeks with 1% NaCl to drink or water (cont, sal2 sal12 groups) submitted to vascular injury. The group sal12 increased vascular injury and altered the relationship of collagen fibers, with exacerbation of collagen deposition in the vascular injury, and the relationship between vascular angiotensin II and (1-7), with an increase of Ang (1-7) and no reduction of Ang II after injury. The results indicate that salt overload increases neointima in injured arteries, and modifies the relationship between angiotensin II and (1-7), possibly providing the increase in intima/media ratio observed.

A doença cardiovascular (DCV) é a principal causa de mortalidade nos pacientes com doença renal crônica (DRC) e a hipertrofia de ventrículo esquerdo (HVE), a alteração mais freqüente. A remodelação cardíaca (RC) patológica ocorre em resposta a agressões como sobrecarga de volume ou de pressão e é influenciada por ativação neurohormonal, fatores locais, inflamação, isquemia, necrose e apoptose celular. Os miócitos são as principais células envolvidas na RC. Avaliamos o papel da hiperfosfatemia e do paratormônio (PTH) em animais urêmicos. Trinta e dois ratos Wistar machos foram submetidos à paratireoidectomia (PTX) e nefrectomia (Nx), com reposição contínua de PTH em concentração fisiológica (PTHf= 0,022 ug/100g/h) ou elevada (PTHe=0,11 ug/100g/h). Os animais sham (N=16) foram operados e recebiam infusão de veículo. Apenas o conteúdo de fósforo nas dietas era diferente, ou seja: pobre=0,2% (pP) ou rica em fósforo=1,2% (rP). Dividimos os animais em 6 grupos: Sham: Sham-pP (G1), Sham-rP (G2); PTX+Nx: PTHf-pP (G3), PTHf-rP (G4), PTHe-pP (G5), PTHe-rP (G6). Semanalmente determinamos o peso e a pressão arterial caudal. Creatinina, fósforo, cálcio PTH e hematócrito foram analisados. Após 8 semanas os animais foram sacrificados. A hipertrofia e fibrose miocárdicas foram analisadas com o sistema digital Leica. O peso do coração corrigido por 100g peso corporal foi maior nos grupos G5 e G6 e apresentou uma correlação positiva com hipertrofia e fibrose miocárdica. A hipertrofia e fibrose foram menores no G3, quando comparado aos grupos Nx. A hipertrofia miocárdica foi maior no G6, evidenciando o papel do P neste processo. A fibrose mocárdica ocorreu principalmente em subendocárdio e foi mais intensa no G6. Analisamos a expressão do fator transformador de crescimento (TGF-beta) e angiotensina II que foram mais intensas nos grupos G5 e G6. As lesões das artérias coronarianas foram avaliadas de forma semi-quantitativa e os animais G5 e G6 mostraram calcificações de camada média. A expressão da alfa-actina se correlacionou negativamente com as lesões coronarianas. Nossos resultados demonstraram a importância do fósforo e PTH na fisiopatologia da DCV, sendo necessário um melhor controle destes elementos para prevenção de mortalidade nos pacientes com DRC. / Cardiovascular disease (CVD) is the leading cause of mortality in patients with chronic kidney disease (CKD), and left ventricular hypertrophy (LVH) is the most common alteration. Pathologic cardiac remodeling (CR) occurs in response to injuries such as volume or pressure overload, and it is influenced by neurohormonal activation, local factors, inflammation, ischemia, necrosis and cellular apoptosis. Myocytes are the principal cells involved in CR. We evaluated the role of hyperphosphatemia and parathyroid hormone (PTH) in uremic animals. Thirty-two male Wistar rats were submitted to parathyroidectomy (PTX) and nephrectomy (Nx), with PTH continuous replacement in physiologic concentration (PTHf=0.022ug/100g/h) or elevated (PTHe=0.11ug/100g/h). The sham animals (N=16) were operated and received vehicle infusion. Only the phosphorus content in diets was different, that is: poor = 0.2% (pP) or rich in phosphorus = 1.2% (rP). We divided the animals into 6 groups: Sham: Sham-pP (G1), Sham-rP (G2); PTX+Nx: PTHf-pP (G3), PTHf-rP (G4), PTHe-pP (G5), PTHe-rP (G6). We determined the weight and caudal blood pressure weekly. Creatinine, phosphorus, PTH calcium and hematocrit were analyzed. After 8 weeks, the animals were sacrificed. Myocardial hypertrophy and fibrosis were analyzed using Leica digital system. The weight of the heart corrected for 100g body weight was greater in groups G5 and G6 and presented a positive correlation with myocardial hypertrophy and fibrosis. Hypertrophy and fibrosis were lower in G3, when compared to Nx groups. Myocardial hypertrophy was higher in G6, determining the role of P in this process. Myocardial fibrosis occurred mainly in subendocardium and was more intense in G6. We analyzed the expression of transforming growth factor (TGF-alfa) and angiotensin II, which were more intense in groups G5 and G6. Coronary artery lesions were evaluated semiquantitatively and G5 and G6 animals showed middle layer calcifications. Expression of alfa-actin correlated negatively with coronary lesions. Our results demonstrated the importance of phosphorus and PTH in the pathophysiology of CVD; therefore, a better control of these elements is required in order to prevent mortality in patients with CKD.

A isoforma 3 do trocador Na+ /H+ (NHE3), presente em membrana apical, é a proteína de transporte que medeia a maior parte da reabsorção de NaCl e NaHCO3- em túbulo proximal renal. A fosforilação direta do NHE3 por PKA na serina 552 é um dos mecanismos pelos quais a sua atividade pode ser inibida. A ligação da angiotensina II (Ang II) ao receptor AT1 (AT1R) em túbulo proximal estimula a atividade do NHE3 por diferentes vias de sinalização. Entretanto, não foram ainda bem estabelecidos os efeitos da ativação da via AT1R/Gi, com consequente diminuição nos níveis de cAMP, na regulação do NHE3. A Ang II pode ainda estimular a atividade do NHE3 por promover a sua translocação da base para o corpo das microvilosidades, entretanto, o papel da proteína motora miosina IIA nesta translocação em resposta à Ang II ainda não foi estabelecido. Sendo assim esta tese teve como objetivos: (1) testar a hipótese de que a Ang II diminui os níveis de fosforilação do NHE3 mediados pelo cAMP/PKA na serina 552 aumentando a sua atividade por reduzir os níveis de cAMP e (2) testar a hipótese de que a miosina IIA participa da redistribuição do NHE3 da base para o corpo das microvilosidades em túbulo proximal renal em condições de estímulo da reabsorção de sódio, como ocorre em resposta à Ang II. Visando avaliar os efeitos da ativação da via AT1R/Gi na regulação do NHE3, verificamos, por meio da técnica de recuperação do pH dependente de Na+, que, em condições basais, a Ang II estimulou a atividade do NHE3, mas não alterou a atividade da PKA e nem afetou os níveis de fosforilação do NHE3 na serina 552 em uma linhagem de células de túbulo proximal (OKP). Entretanto, na presença da forskolin (FSK), agente que eleva os níveis intracelulares de cAMP, a Ang II foi capaz de contrapor-se ao efeito inibitório da FSK sobre o NHE3 por promover redução na concentração de cAMP, diminuição da atividade da PKA e, consequentemente, diminuição nos níveis de fosforilação da serina 552. Todos os efeitos da Ang II foram bloqueados quando um pré-tratamento com Losartan, antagonista do receptor AT1, foi feito nas células OKP, destacando a contribuição da via AT1R/proteína Gi no aumento da atividade do NHE3 pela Ang II. Observamos que a inibição da proteína Gi com PTX (toxina pertussis) diminuiu a atividade do NHE3 em células OKP e que a PTX diminuiu a atividade do NHE3 assim como preveniu o efeito estimulatório da Ang II sobre a atividade do NHE3 em túbulo proximal de ratos Wistar. Adicionalmente, com a intenção de avaliar os efeitos da miosina IIA na redistribuição do NHE3, constatamos que a blebistatina, inibidor da miosina IIA, preveniu completamente o aumento de atividade do NHE3 mediado pela Ang II em ratos Wistar e que o uso da blebistatina foi capaz de prevenir o aumento do NHE3 na superfície de células OKP tratadas com Ang II. Em conjunto, nossos resultados sugerem que a Ang II contrapõe-se aos efeitos do cAMP/PKA sobre a fosforilação e a atividade do NHE3 pela ativação da via AT1R/Gi e que a miosina IIA desempenha um papel na mediação da regulação da atividade do NHE3 em túbulo proximal renal de ratos em resposta à Ang II. Sugerem ainda que a desfosforilação do NHE3 na serina 552 pode representar um evento chave na regulação do manuseio de sal tubular proximal pela Ang II na presença de hormônios natriuréticos que promovem o aumento dos níveis de cAMP e da fosforilação do transportador e que a miosina IIA está envolvida na regulação do tráfego do NHE3 em túbulo proximal renal / The Na+/H+ exchanger isoform 3 (NHE3), expressed on the apical membrane, is responsible for most NaCl and NaHCO3 - reabsorption in the renal proximal tubule. Direct phosphorylation of NHE3 by PKA at serine 552 is one of the mechanisms by which its activity is inhibited. Binding of angiotensin II (Ang II) to the AT1 receptor (AT1R) in the proximal tubule stimulates NHE3 activity through multiple signaling pathways. However, the effects of AT1R/Gi activation and subsequent decrease in cAMP accumulation on NHE3 regulation are not well established. Ang II can also stimulate NHE3 activity by promoting its translocations from the base to the body of the microvilli, however, the role of the myosin IIA motor protein in this translocation in response to Ang II is not yet established. Therefore, the aims of this thesis are: (1) to test the hypothesis that Ang II decreases the cAMP/PKA-mediated NHE3 phosphorylation levels at serine 552 increasing its activity by reducing cAMP levels and (2) to test the hypothesis that myosin IIA participates in the NHE3 redistribution from the base to the body of the microvilli in the renal proximal tubule under conditions in which sodium reabsorption is stimulated, such as in response to Ang II. In order to evaluate the effects of AT1R/Gi pathway activation on NHE3 regulation, by means the intracellular pH recovery technique, we verified that under basal conditions, Ang II stimulated NHE3 activity but did not affect PKA-mediated NHE3 phosphorylation at serine 552 in opossum kidney (OKP) cells. However, in the presence of the cAMP-elevating agent forskolin (FSK), Ang II counteracted FSK-induced NHE3 inhibition, reduced intracellular cAMP concentrations, lowered PKA activity, and prevented the FSK-mediated increase in NHE3 serine 552 phosphorylation. All effects of Ang II were blocked by pretreating OKP cells with the AT1R antagonist Losartan, highlighting the contribution of the AT1R/Gi pathway in Ang II-mediated NHE3 upregulation under cAMP-elevating conditions. We also verified that Gi protein inhibition by pertussis toxin treatment decreased NHE3 activity both in vitro and in vivo and, more importantly, prevented the stimulatory effect of Ang II on NHE3 activity in Wistar rat proximal tubules. Additionally, we assessed the effects of myosin IIA on NHE3 redistribution, and found that blebbistatin, a myosin IIA inhibitor, completely prevented the increase of Ang II-mediated NHE3 activity in Wistar rats and that blebbistatin was able to prevent the increase of NHE3 on the Ang II-treated OKP cells surface. Collectively, our results suggest that Ang II counteracts the effects of cAMP/PKA on NHE3 phosphorylation and inhibition by activating the AT1R/Gi pathway and that myosin IIA plays a role in mediating the NHE3 activity regulation in the rat renal proximal tubule in response to Ang II. Furthermore, these findings support the notion that NHE3 dephosphorylation at serine 552 may represent a key event in the regulation of renal proximal tubule sodium handling by Ang II in the presence of natriuretic hormones that promote cAMP accumulation and transporter phosphorylation, and that myosin IIA is involved in NHE3 trafficking regulation in the renal proximal tubule

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