A prevalência da obesidade tem aumentado em todo mundo, afetando também mulheres em idade reprodutiva. Estudos têm demonstrado que o acúmulo excessivo de tecido adiposo resulta em prejuízos à reprodução feminina. O mecanismo pelo qual a obesidade diminui a fertilidade não está totalmente estabelecido. Atualmente, são propostas a condição inflamatória e a indução de estresse oxidativo como potenciais mecanismos de ação para as patologias relacionadas à obesidade. Adicionalmente, a angiotensina II (Ang II) é mais um fator que tem sido relacionado com alterações associadas à obesidade, e os efeitos deste peptídeo incluem ações pró-inflamatórias e pró-oxidativas. O presente estudo analizou o efeito da obesidade na ovulação e no metabolismo oxidativo ovariano, e a participação da Ang II como um possível modulador da formação de espécies reativas de oxigênio em ovários de ratas obesas e seus efeitos na ovulação. Foram utilizadas ratas submetidas a uma dieta hipercalórica composta por alimentos palatáveis, conhecida como dieta de cafeteria, a partir do desmame até a idade adulta, por um período de 17 semanas. Os animais foram divididos em grupos: CTL (controle), CTL LOS (controle + losartan), CAF (cafeteria) e CAF LOS (cafeteria + losartan). Avaliamos o consumo de alimentos e líquidos, o peso corporal, o peso da gordura abdominal e retroperitonial, a concentração de insulina plasmática, o número de oócitos, as atividades das enzimas antioxidantes (superóxido dismutase e catalase), concentração de peróxido de hidrogênio (H2O2) e parâmetros de dano oxidativo (lipoperoxidação e oxidação de proteínas). As fêmeas obesas do grupo CAF apresentaram maior consumo de energia e reduzido consumo de água e ração padrão, hiperinsulinemia, aumento das gorduras abdominal e retroperitonial, e aumento de peso corporal. A obesidade não reduziu significativamente a ovulação, mas aumentou a atividade das enzimas antioxidantes e a concentração de H2O2 no ovário. A administração do losartan, em ratas alimentadas com a dieta de cafeteria, reduziu a ingestão energética total, a concentração plasmática de insulina e o ganho de gordura abdominal, mas não evitou o desenvolvimento da obesidade. O losartan inibiu a atividade da enzima antioxidante superóxido dismutase no ovário das ratas obesas do grupo CAF, porém não alterou a atividade da enzima antioxidante catalase. Os resultados deste estudo demonstram que a obesidade resulta em alterações no metabolismo e sugerem a participação da Ang II na formação de espécies reativas de oxigênio no ovário. / The prevalence of obesity has increased worldwide, also affecting women of reproductive age. Studies have shown that excessive accumulation of adipose tissue results in impaired female reproduction. The mechanism by which obesity reduces fertility is not fully established. Currently, proposals are the inflammatory condition and the induction of oxidative stress as a potential mechanism of action for diseases related to obesity. Additionally, angiotensin II (Ang II) is another factor that has been related to changes associated with obesity, and the effects of this peptide include pro-inflammatory and pro-oxidative actions. The present study considers the effect of obesity on ovulation and ovarian oxidative metabolism, and the participation of Ang II as a possible modulator of the formation of reactive oxygen species in ovaries of obese rats and their effects on ovulation. Female rats fed a diet consisting of high calorie foods palatable, known as cafeteria diet from weaning to adulthood, for a period of 17 weeks. The animals were divided into groups: Control (CTL) CTL LOS (control + losartan), CAF (cafeteria) and CAF LOS (losartan + cafeteria). We evaluate the consumption of food and fluids, body weight, abdominal and retroperitoneal fat weight, the plasma insulin concentration, the number of oocytes, the activities of antioxidant enzymes (superoxide dismutase and catalase), concentration of hydrogen peroxide (H2O2 ) and parameters of oxidative damage (lipid peroxidation and protein oxidation). The females of the CAF group had higher energy consumption and reduced consumption of water and standard chow, hyperinsulinemia, increased abdominal and retroperitoneal fat, and weight gain. Obesity not significantly reduced ovulation, but increased the activity of antioxidant enzymes and the concentration of H2O2 in the ovary. The administration of losartan in rats fed the cafeteria diet, reduced total energy intake, plasma insulin concentration and abdominal fat gain, but did not prevent the development of obesity. Losartan inhibited the activity of the antioxidant enzyme superoxide dismutase in the ovary of rats CAF group, but did not alter the activity of the catalase antioxidant enzyme. The results of this study demonstrate that the cafeteria diet results in changes in metabolism and suggests the involvement of Ang II in the formation of ROS in the ovary.

A hipótese do estudo é a de que a Angiotensina II (AngII) é capaz de desencadear processos inflamatórios iniciais que compõem parte dos mecanismos envolvidos na lesão vascular ou no seu progresso. Os objetivos foram avaliar a expressão de marcadores iniciais de inflamação em resposta à ação da AngII e por qual receptor (AT1 ou AT2) esta levaria à expressão destes marcadores inflamatórios. O estudo foi realizado em camundongos machos C57Bl/6J submetidos ao tratamento com doses subpressoras de AngII, bloqueadores dos receptores AT1 e AT2 e uma combinação destes. Os tempos de tratamento foram determinados através de uma curva de tempo-resposta feita com injeções de AngII. Após definição da curva temporal foram preparados 6 grupos de animais: controle, tratados AngII, Losartan, AngII+Losartan, PD123319 e AngII+PD123319. Foram feitas avaliações dos marcadores inflamatórios nos corações por imunohistoquímica para citocinas IL-1<font face=\"Symbol\">b e IL-6, TNF<font face=\"Symbol\">a, TGF-<font face=\"Symbol\">b e MCP-1, a molécula de adesão ICAM-1, e foram quantificados a IL-6 e o TNF-<font face=\"Symbol\">a séricos pela técnica ELISA. / The study hypothesis is that the angiotensin II (Ang II) is capable of triggering inflammatory processes that comprise the initial part of the mechanisms involved in vascular injury or in progress. The objectives were to evaluate the expression of early markers of inflammation in response to the action of Ang II and which receptor (AT1 and AT2) this would lead to the expression of these inflammatory markers. The study was conducted in male C57Bl/6J mice undergoing treatment with subpressor doses of AngII, blockers of AT1 and AT2 receptors and a combination thereof. Treatment times were determined using a time-response curve performed with injections of AngII. After definition of time curve were prepared six animal groups: control, treated Ang II, losartan, Ang II + losartan, PD123319 and Ang II + PD123319. Evaluations were made in the hearts of inflammatory markers by immunohistochemistry for IL-1<font face=\"Symbol\">b and IL-6, TNF<font face=\"Symbol\">a, TGF-<font face=\"Symbol\">b and MCP-1, the adhesion TNF-<font face=\"Symbol\">a serum by ELISA.

O uso de esteróide anabolizante é cada vez maior por pessoas que praticam exercícios como forma de lazer, sem se importarem com os possíveis efeitos colaterais, o que vem se tornando um importante problema de saúde pública. Dentre os seus principais efeitos colaterais, destacamos a hipertrofia cardíaca, que parece ser ainda mais pronunciada quando associado ao treinamento físico, sendo esta relacionada a maior atividade da enzima conversora de angiotensina cardíaca. Tendo em vista esse cenário, o presente trabalho visa verificar a participação do sistema renina angiotensina aldosterona sobre a hipertrofia cardíaca e síntese de colágeno induzida pelo esteróide anabolizante, associado ao treinamento físico por natação em ratos, por meio do bloqueio de receptores AT1 com Losartan e dos receptores de mineralocorticóides com Espironolactona. Resultados mostram que a administração de esteróide anabolizante aumenta a ativação do sistema renina angiotensina aldosterona cardíaco, o qual está diretamente relacionado aos seus efeitos colaterais, visto que o bloqueio dos receptores AT1 ou dos RM inibiu esses efeitos. Sendo mostrado pela primeira vez, os efeitos do esteróide anabolizante sobre o aumento na expressão do gene da aldosterona sintase e da enzima 11-HSD2, sugerindo os efeitos dos esteróides anabolizantes sobre o aumento da síntese e atividade da aldosterona cardíaca / The anabolic steroid use is growing by recreational exercise practitioners, without worried about the possible collateral effects, becoming an important problem of public health. Among its deleterious effects we detach the cardiac hypertrophy, that looks to be still bigger when the swimming training was associated, being is related to bigger activity of the cardiac angiotensin converter enzime. With that, the present work is going to verify the renin angiotensin aldosteron system participation about the cardiac hypertrophy and collagen synthesis prompted by the anabolic steroid and the association with the swimming training in rat by means of the AT1 receivers blockade with Losartan and of the mineralocorticoids receivers blockade with Espironolacton. Our results show that the anabolic steroid administration increased the cardiac rennin angiotensin aldosteron system activity, that is straightly related to its deleterious effects, seen that the AT1 receivers blockade or the mineracorticoids receivers blockade inhibited those effects. Being shown by the first time the anabolic steroids effects about the increase of the aldosterone sintase gene expression and of the 11-HSD2 enzyme, suggesting the anabolic steroids effects about the cardiac aldosterone synthesis and activity increase

A lesão por balão cateterismo é um procedimento comumente utilizado para o estudo dos mecanismos de restenose. O estresse mecânico produzido pela passagem do balão promove alterações tanto na artéria lesada quanto na artéria contra-lateral. Observou-se um aumento da densidade de neurônios que contêm neuropeptídeos como a Substância P (SP) e o Peptídeo Relacionado com o Gene da Calcitonina (CGRP) na artéria contra-lateral à lesão, o que evidencia a ocorrência de um processo neurocompensatório. Observou-se ainda um aumento da reatividade desta artéria à fenilefrina (Phe) e à angiotensina II (Ang II) após 4 e 15 dias da lesão, respectivamente. O objetivo do presente trabalho foi estudar as conseqüências dos tratamentos com celecoxibe (inibidor seletivo da enzima COX-2), -tocoferol (Vitamina E, antioxidante natural) e losartan (antagonista dos receptores AT1), sobre a reatividade à Phe, Cloreto de Potássio (KCl), Acetilcolina (ACh), Ang II de artérias ipsilaterais e contra-laterais em relação a artérias controles. Em animais tratados com celecoxibe (10 mg/Kg - 2 vezes ao dia) ou -tocoferol (400 mg/Kg/dia) por 7 dias. Os resultados mostram que os dois tratamentos normalizam os valores de efeito máximo (Emax) da Phe nas artérias contra-laterais com endotélio aos níveis de artérias controle. Em animais tratados com celecoxibe, a artéria ipsilateral não respondeu à Phe, enquanto no tratamento com -tocoferol mostrou valores de Emax reduzidos em relação a animais controle. Os valores de Emax da ACh em artérias de animais controle e tratados com celecoxibe ou -tocoferol, são idênticos. Entretanto, ambos os tratamentos promoveram redução na potência da ACh em artérias controle quando comparadas com as de animais não tratados. A potência da ACh na artéria contra-lateral foi semelhante ao controle em todos os tratamentos. O Emax da Ang II estava aumentado na artéria contra-lateral à lesão. O tratamento com losartan (15 mg/Kg/dia) por 18 dias promoveu redução neste parâmetro na artéria contra-lateral aos níveis do controle. A potência da Ang II em artérias contra-laterais de animais tratados com losartan é igual ao da artéria de animais controle. Nos animais controles tratados com losartan a potência desse peptídeo foi menor do que controle e contra-lateral sem tratamento e contra-lateral tratada. Na artéria contra-lateral o Emax do KCL estava diminuído em relação ao controle e o tratamento com losartan não modificou este parâmetro. O Emax da ACh em artérias controle e contra-laterais não foi alterado pelo tratamento com losartan, entretanto houve aumento da potência deste agonista em artérias controles e contra-laterais em relação a artérias de animais controles. Os resultados obtidos no presente estudo indicam que a produção de espécies reativas de oxigênio, prostanóides vasocontritores e Ang II levam a alterações na reatividade aos agonistas estudados na artéria contra-lateral à lesão por cateter balão. / The injury by balloon catheter is a procedure commonly used to study the mechanisms of restenosis. The mechanical stress produced by the passage of the balloon promotes changes both in the injured artery in the contralateral artery. There was an increased density of neurons containing neuropeptides such as substance P (SP) and the Gene Related Peptide of Calcitonin (CGRP) in the contralateral artery to the lesion, which shows the occurrence of a process neurocompensatory. There was also an increase in the artery reactivity to phenylephrine (Phe) and angiotensin II (Ang II) after 4 and 15 days of injury, respectively. There was also an increase in the artery reactivity to Phe and Ang II after 4 and 15 days of injury, respectively. The objective of this work was to study the consequences of treatment with celecoxib (selective inhibitor of COX-2), -tocopherol (vitamin E, natural antioxidant) and losartan (AT1 receptor antagonist) on the reactivity to Phe, chloride Potassium (KCl), acetylcholine (ACh), Ang II in arteries ipsilateral and contralateral side for control arteries. In animals treated with celecoxib (10 mg / kg - 2 times daily) or -tocopherol (400 mg / kg / day) for 7 days. The results show that both treatments normalize the values of maximum effect (Emax) of Phe in the contralateral arteries with endothelium to the levels of control arteries. In animals treated with celecoxib, the ipsilateral artery did not respond to Phe, whereas the treatment with -tocopherol showed reduced values of Emax for the control animals. The values of Emax of ACh in arteries from control animals and treated with celecoxib or -tocopherol, are identical. However, both treatments promoted reduction in the potency of ACh in control arteries when compared with untreated animals. The potency of ACh in the contralateral artery was similar to control in all treatments. The Emax of Ang II was increased in the contra-lateral artery to the lesion. Treatment with losartan (15 mg / kg / day) for 18 days promoted reduction in this parameter in the contra-lateral artery levels of control. The potency of Ang II in contralateral arteries of animals treated with losartan is equal to the artery of control animals. In control animals treated with losartan the potency of this peptide was lower than control and contra-lateral untreated and control-treated side. Contralateral artery in the Emax of KCL was decreased in the control and treatment with losartan did not modify this parameter. The Emax of ACh in control arteries and contralateral side was not changed by treatment with losartan, however increased the power of this agonist in control arteries and contralateral side on arteries of control animals. The results of this study indicate that the production of reactive oxygen species and vasoconstrictors prostanoids Ang II lead to changes in reactivity to agonists studied in the contra-lateral to the artery by balloon catheter injury.

O estresse crônico ou agudo pode alterar diversas funções relacionadas ao sistema cardiovascular, ocasionando doenças cardíacas. O sistema renina-angiotensina (SRA), importante participante do controle dessas funções, é profundamente afetado em resposta ao estresse. A angiotensina II (Ang II) é reconhecida como hormônio multifuncional que influencia diversos processos celulares importantes para a regulação da função vascular, incluindo regulação do tônus vascular, crescimento celular, dentre outros. Outro componente do SRA é a angiotensina 1-7 (Ang 1-7), suas ações vasculares envolvem aumento na produção de prostanóides vasodilatadores, óxido nítrico e fator hiperpolarizante derivado do endotélio. O objetivo do presente trabalho foi avaliar as conseqüências do estresse, agudo ou crônico, sobre as atividades vasomotoras da Ang II e da Ang 1-7, os mecanismos envolvidos na contração e relaxamento induzidos, respectivamente, por estes peptídeos e as modificações na expressão dos receptores AT1, AT2 e Mas, em carótida de ratos. O estresse crônico levou à diminuição do ganho de peso corpóreo dos animais, promoveu remodelamento das artérias carótidas, com significativo aumento da camada média acompanhada de redução da resposta de relaxamento da Ang 1-7, embora a expressão de seus receptores, do tipo Mas, estivesse aumentada. A maior expressão de receptores de Ang II, AT1 e AT2, desencadeada pelo estresse agudo não alterou a resposta contrátil deste peptídeo. Em carótidas de animais submetidos ao estresse crônico observa-se redução do Emax da Ang II e da Ang 1-7 após incubação com indometacina, sugerindo que prostanóides estão envolvidos na resposta vascular tanto da Ang II quanto da Ang 1-7 em situações de exposição prolongada ao estresse. A maior expressão de nitrotirosina em carótidas de animais expostos tanto ao estresse agudo quanto crônico, demonstra que o óxido nítrico e estresse oxidativo parecem estar relacionados às alterações vasomotoras, em resposta aos peptídeos Ang II e Ang 1-7. Foi evidenciado que o estresse agudo eleva significativamente os níveis plasmáticos de corticosterona e a produção de espécies reativas de oxigênio (EROs). Estes dados sugerem que os estresses agudo e crônico, por imobilização, alteram a expressão de receptores do SRA e a vasoatividade de carótidas em resposta à Ang II e Ang 1-7 em função de diferentes mecanismos celulares. / The chronic or acute stress can alter various functions of the cardiovascular system, causing heart disease. The renin-angiotensin system (RAS), a major participant in control of these functions, is profoundly affected in response to stress. Angiotensin II (Ang II) is recognized as a multifunctional hormone that influences many cellular processes important for the regulation of vascular function, including regulation of vascular tone, cell growth, among others. Another component of the RAS is angiotensin 1-7 (Ang 1-7), their actions involve an increase in vascular production of prostanoid vasodilators, nitric oxide and endothelium-derived hyperpolarizing factor. The aim of this study was to evaluate the consequences of chronic or acute stress on vasomotor activity of Ang II and Ang 1-7, the mechanisms involved in contraction and relaxation induced, respectively, by these peptides and the changes in the expression of AT1, AT2 and Mas in rat carotid artery. Chronic stress has led to decreased body weight gain of animals, promoted remodeling of carotid arteries with a significant increase in the medial layer accompanied by a reduction of the relaxation response to Ang 1-7, although the expression of their receptors (Mas) was increased. The highest expression of Ang II receptors, AT1 and AT2, triggered by acute stress did not alter the contractile response of this peptide. In carotid arteries of animals subjected to chronic stress is observed reduction of Emax of Ang II and Ang 1-7 after incubation with indomethacin, suggesting that prostanoids are involved in the vascular response of both Ang II and Ang 1-7 in exposed situations prolonged stress. The greater expression of nitrotyrosine in carotids from animals exposed to both acute or chronic stress, demonstrates that nitric oxide and oxidative stress appear to be related to vasomotor changes in response to peptides Ang II and Ang 1-7. It was shown that acute stress increases plasma levels of corticosterone and the production of reactive oxygen species (ROS). These data suggest that acute and chronic stress by immobilization, alter the expression of receptors of RAS and vasomotor activity in carotid artery in response to Ang II and Ang 1-7 by different cellular mechanisms.

O mecanismo mais importante para a homeostase do K+ é o controle da secreção de K+ no néfron distal. O objetivo deste trabalho foi avaliar em animais submetidos à depleção de K+ por sete dias, a expressão de AT1R da ATRAP e algumas vias de sinalização como as WNK1, KS-WNK1 e WNK4. Estes animais apresentaram menor ganho de peso corporal, hipertrofia renal, isostenúria, e redução da FE de Na+ e K+, com aumento de Ang II, sem alterar a aldosterona. Verificamos aumento da expressão de AT1R mais acentuado em lisado celular e o aumento de ATRAP foram iguais nas frações de lisado total, membranas total e apical. Não detectamos variação nos níveis de RNAm dessas proteínas. A depleção de K+ induziu a fosforilação de c-Src, ERK1/2 e p38, bem como aumento dos RNAm de WNK1 e WNK4, e redução do RNAm de KS-WNK1. Considerando nossos resultados, a depleção aumenta a ação da Ang II, provavelmente devido à hiperexpressão de AT1R, sem diminuir a expressão de ATRAP. A hiperexpressão de WNK1 e WNK4, associada à redução da KS-WNK1. / The most important mechanism for the K+ homeostasis on varying the content of this ion in the diet is the control of K+ secretion in the distal nephron. Since angiotensin II (Ang II) is an important modulator of K+ secretion, the aim of this study was to evaluate, in animals subjected to K+ depletion for seven days, the expression level of angiotensin type 1 receptor (AT1R) and the AT1R-associated protein (ATRAP). Moreover, it was intended to evaluate the possible activation of some signaling pathways triggered by Ang II via AT1R. We also looked for evaluate the expression of ion transporters and \'\'with no lysine kinases\'\' (WNKs) WNK1, KS-WNK1 and WNK4 in these animals, since some of the effects of angiotensin II in the distal tubular segments are mediated by these kinases. The animals subjected to K+ depletion have showed lower body weight gain, renal hypertrophy, marked polyuria, isosthenuria, and significant reduction in FE Na+ and K+, and increased plasmatic Ang II levels, without changing the aldosterone levels. We found that the expression of ATRAP and AT1R is increased in all cell fractions analyzed, with the highest rise in the AT1R in total cell lysate and ATRAP increase was not significant in the apical membrane. We did not detect changes in mRNA levels of these proteins, suggesting no changes in the transcription rate. The mRNA levels of Na+/H+ exchanger isoform 3 (NHE3) and Cl-/Formate (CFEX), abundant in proximal tubuleswere not altered as well. Regarding signaling pathways, K+ depletion induced c-Src, ERK1/2 and p38 phosphorylation, as well as a significant increase in WNK1 and WNK4 mRNA , and reduced KS- WNK1 mRNA. Considering our results, K+ depletion increases Ang II action in renal tissue, probably due to the overexpression of AT1R, and that effect is not associated to the decreased expression of ATRAP. However, the total cell lysate AT1R increasing, was greater than that of ATRAP. The overexpression of WNK1 and WNK4 associated with (to) the reduction of KS - WNK1 appears to be important for K+ secretion inhibition in K+-depleted animals. The inhibitory activity of WNK4 on ROMK channels depends on its dephosphorylation, which depends on the activation of c-Src. The activation of c-Src was evidenced by the increase in K+ -depleted animals phosphorylation.

O receptor para Angiotensina II tipo 1 (AT1R) é expresso tanto em membrana apical quanto basolateral dos túbulos proximais renais. Embora haja evidências de diferenças funcionais entre receptores apicais e basolaterais, como, por exemplo, a dependência do processo de internalização de receptores apicais, mas não de basolaterais, para a efetivação dos efeitos fisiológicos da Angiotensina II, os mecanismos envolvidos na determinação dessas diferenças não são conhecidos. Alguns trabalhos já evidenciaram a importância da porção c-terminal do receptor AT1 na sua internalização. Desta forma, com o intuito de identificar proteínas de membrana que possam interagir com tal região, foi feita a clonagem do fragmento de DNA correspondente a esta no vetor pGEX-6P-2. O produto da transcrição e tradução do gene foi uma proteína de fusão (GST-AT1aR) que possui em torno de 35kDa, a qual foi imobilizada em resina de glutationa sefarose e incubada com proteínas de membranas totais de córtex renal de ratos (GST pull-down assay). As amostras foram submetidas à Eletroforese Bidimensional, onde identificamos seis spots correspondentes a proteínas que interagem especificamente com a proteína de fusão, mas não com GST. Estes spots foram recortados e analisados por espectrometria de massa. Cinco diferentes proteínas foram identificadas como provavelmente associadas ao receptor AT1aR: ATP sintase subunidade beta, ATP sintase subunidade alfa mitocondrial, GRP78 (heat shock protein de 78kDa regulada por glicose), HSC70 (heat shock protein de 71kDa) e dipeptidil peptidase 4 (DPPIV). Experimentos subsequentes de GST pull-down e western blotting para as proteínas encontradas, confirmaram interação da cauda C-terminal do receptor com as proteínas ATP sintase subunidade beta, HSC70 (heat shock protein de 71kDa) e GRP78 (heat shock protein de 78kDa regulada por glicose). No entanto, nos estudos de co-imunoprecipitação foi possível confirmar apenas a interação com HSC70, um membro da família HPS70, uma heat shock protein. HSP são também chamadas de chaperonas por estarem envolvidas no dobramento correto de proteínas recém sintetizadas, no redobramento de proteína desnaturadas ou dobradas incorretamente e na degradação de proteínas com danos irreparáveis. No entanto, trabalhos recentes descrevem novos papéis para esta proteína, como a participação em processos de tráfego protéico entre compartimentos intracelulares, reciclagem de proteínas para a membrana plasmática e endocitose mediada por clatrina. Novos estudos serão necessários para se determinar a função fisiológica da interação de HSC70 com a cauda citoplasmática do receptor AT1 e ainda, se essa associação estaria envolvida nas diferenças funcionais observadas quando esse receptor é expresso em membrana apical ou basolateral / The angiotensin II receptor type 1 (AT1R) is expressed in both apical and basolateral membranes in the renal proximal tubules. Although there are evidences that they have functional differences, such as the dependence on internalization for apical, but not basolateral, receptors to trigger physiological effects of angiotensin II, the mechanisms of this peculiar behavior are not clear. The carboxy-terminal tail of the AT1 receptor was shown to be involved in its internalization. Thus, in order to identify possible AT1R c-terminal interacting proteins, we have inserted the cDNA coding the last 53 amino acids of the C-terminus into pGEX-6P-2 vector. The gene translation product was a fusion protein (GST-AT1aR) weighting approximately 35 kDa which was immobilized on Glutathione Sepharose resin and incubated with rat renal cortex total membrane proteins (GST pull-down assay). The samples were then subjected to two dimensional gel electrophoresis. We identified six protein spots that specifically interacted with GST-AT1aR. These spots were cut and analyzed by mass spectrometry. Five different proteins were identified as probably associated with AT1aR, ATP synthase beta subunit, ATP synthase alpha subunit, GRP78 (glucose regulated protein of 78kDa), HSC70 (Heat shock cognate 71kDa protein) and dipeptidyl peptidase 4 (DPPIV). The interaction with ATP synthase beta subunit, HSC70 and GRP78 was confirmed by GST pull-down and western blotting. However, immunoprecipitation of total protein of renal cortex followed by immunobloting only confirmed the interaction with HSC70. This protein is a member of the Heat Shock Proteins family HSP70 also called chaperones, because their involvement in correct folding of newly synthesized proteins, refolding of partially denatured or misfolded proteins, and in protein degradation of irreparably damaged proteins. Recent studies have described new roles for HSC70, such as the participation in protein trafficking between intracellular compartments, recycling of proteins to the plasma membrane and endocytosis mediated by clathrin. Further studies are necessary to determine the physiological role of this interaction and whether this association is involved in the functional differences observed regarding the activation of the receptor in apical or basolateral membranes

NHE3 reabsorve a maior parte de Na+ em túbulos proximais e é agudamente modulado por Ang II de forma bimodal. O objetivo deste trabalho foi avaliar os efeitos crônicos da Ang II sobre a atividade, expressão e atividade promotora de NHE3. A atividade de NHE3 foi avaliada na presença de veículo, inibidor de NHE1, 2 e 3 e H+ ATPase. Houve redução da recuperação do pHi na presença do inibidor de NHE3. Células foram expostas por 24h a Ang II de 10-7M a 10-12 M e houve aumento de atividade com Ang II 10-11 M. Houve aumento na expressão de NHE3 e no seu RNAm. Actinomicina D não mostrou diferença entre os tempos de ½ vida do RNAm. Transfecções transitórias de fragmentos do promotor de NHE3 de rato mostraram que a atividade do fragmento -65/+31 aumentou na presença de Ang II. Mutações em sítios para a ligação de Sp1/Egr-1 e AP2 mostraram que o sítio Sp1/Egr-1 é fundamental para esse efeito. As vias que envolvem o citocromo P450, PI3K, PKA e MAPK são ativadas, porém, as vias da PLC e JAK/STAT não. Losartan aboliu os efeitos observados. Conclui-se que a exposição crônica à baixa concentração de Ang II promoveu aumento na atividade, expressão, nível de RNAm e atividade promotora do gene NHE3 via AT1R. O sítio de ligação para os fatores de transcrição Sp1/Egr-1 está envolvido nessa resposta. / NHE3 is the major responsible for the sodium reabsorption in proximal tubules and it is Ang II acutely modulated in a bimodal fashion. The aim of this study was to evaluate the chronic effects of Ang II on NHE3 activity, transcription and expression. The NHE3 activity was evaluated in the presence of vehicle, NHE1, 2 and 3 and H+ ATPase inhibitors. Presence of NHE3 inhibitor reduced the rate of pHi recovery. Cells were treated with Ang II 10-7M to 10-12 M for 24h and Ang II 10-11 M increased the pHi recovery rate. NHE3 protein and mRNA were increased in Ang II presence. NHE3 mRNA ½ life in Actinomycin D incubated cells was not affected by Ang II treatment. Transient transfections of fragments of rat NHE3 promoter showed that the activity of -65/+31 was increased in Ang II presence. Mutation at Sp1/Egr-1 and AP2 sites in the -60/+31 fragment showed that Sp1/Egr-1 integrity is required. Cytochrome P450, PI3K, PKA and MAPK signaling pathways are related with this effect, while PLC and JAK/STAT are not. Losartan abolished the observed effects. In conclusion, chronic treatment with low concentration of Ang II resulted in increase of NHE3 activity, protein expression, mRNA levels and promoter activity of NHE3 gene through AT1R. Sp1/Egr-1 site seems to be involved in this effect.

Orientadores: Nicola Amanda Conran Zorzetto, Fernando Ferreira Costa / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-25T23:15:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Santos_AlissonFernandesdos_D.pdf: 3501020 bytes, checksum: 082754f565197f1a75d8da113de08ea3 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: A anemia falciforme (AF) é uma doença genética causada pela substituição de um ácido glutâmico por uma valina na posição 6 da cadeia globina 'beta'. A mutação de ponto origina a hemoglobina S (HbS), que sob condições de deoxigenação se polimeriza tornando os eritrócitos mais propensos à falcização. A fisiopatologia da AF resulta em processos recorrentes de vaso-oclusão e hemólise, causando numerosas complicações clínicas, incluindo a danificação dos rins e problemas cardiovasculares. A angiotensina II (Ang II), um peptídeo vasoconstritor derivado do sistema renina-angiotensina (SRA), controla a pressão arterial e o equilíbrio dos fluidos. A Ang II também participa na geração de espécies reativas de oxigênio, diminuindo a biodisponibilidade do óxido nítrico (NO), um gás vasodilatador, podendo contribuir para alterações no endotélio. A hidroxiureia (HU), agente quimioterápico importante no tratamento dos indivíduos portadores de AF, exerce seu efeito benéfico por meio do aumento de hemoglobina fetal (HbF), reduzindo a falcização dos eritrócitos, diminuindo o número de leucócitos, além de possuir a capacidade de gerar NO. O objetivo deste estudo foi verificar se a produção e expressão das proteínas do SRA estão alteradas na AF e os efeitos da terapia com HU nestes parâmetros. Para analisar a atividade do SRA na AF e um possível papel para a Ang II no processo inflamatório, foram quantificadas as concentrações plasmáticas de Ang II, enzima conversora de angiotensina (ACE), molécula de adesão vascular-1, molécula de adesão intercelular-1, endotelina-1 (ET-1), metabólitos de NO, guanosina monofosfato cíclico (GMPc), interleucina-6, interleucina-8, fator de necrose tumoral-'alfa' e inibidor do ativador do plasminogênio-1 nas amostras de sangue dos indivíduos portadores de AF e indivíduos sadios controles. A produção de Ang II e expressão de algumas proteínas do SRA também foram estudadas em um modelo animal de AF. Adicionalmente, camundongos com AF foram tratados com a HU (50 e 75 mg/kg/dia) por 4 semanas. Não foram encontradas diferenças significativas nos níveis plasmáticos de Ang II nos indivíduos portadores de AF e indivíduos controles, porém a Ang II mostrou correlação positiva com níveis plasmáticos de HbF e ET-1. Uma correlação negativa entre níveis da Ang II e GMPc também foi encontrada no plasma. As concentrações plasmáticas de ACE foram encontradas significantemente menores em indivíduos portadores de AF em comparação aos indivíduos controle. Em camundongos com AF, as concentrações plasmáticas de Ang II estão significativamente diminuídas quando comparadas aos camundongos controles. O tratamento de camundongos AF com HU (75 mg/kg/dia) aumentou significativamente os níveis de Ang II. Diferenças significativas nas expressões dos genes AT1R e ACE1 (que codificam o receptor de angiotensina II tipo 1 e a enzima ACE, respectivamente) foram detectadas em camundongos com AF sem tratamento de HU quando comparados aos camundongos controles, sendo que as expressões dos genes foram menores nos rins e maiores no fígado. Os dados obtidos no estudo sugerem que pode haver alterações no SRA em indivíduos portadores de AF, apesar de não encontrar associações entre alterações em Ang II com parâmetros inflamatórios. Futuros estudos poderiam indicar se alterações na expressão das proteínas do SRA contribuem para algumas manifestações da AF ou refletem danos teciduais nestes indivíduos / Abstract: Sickle cell disease (SCD) is caused by a point mutation that results in the substitution of glutamic acid for valine at the sixth position of the 'beta'-globin chain, leading to the production of hemoglobin S (HbS). HbS polymerizes under conditions of low oxygen concentration, causing the erythrocyte to adopt a sickled shape. The pathophysiology of SCD results in recurrent vaso-oclusion and hemolysis, causing clinicals complications, including kidney damage and cardiovascular problems. Angiotensin II (Ang II), a peptide and vasoconstrictor derived from the action of the renin-angiotensin system (RAS), controls blood pressure and fluid balance. Ang II also participates in the generation of reactive oxygen species, decreasing the bioavailability of the vasodilatory gas nitric oxide (NO), and potentially causing endothelial alterations. Hydroxyurea (HU), an important chemotherapeutic drug employed in the treatment of SCD, has numerous benefits that include augmentation of fetal hemoglobin, reduction of erythrocyte sickling and decreased leukocyte numbers; furthermore, HU also generates NO in vivo. The aim of this study was to investigate whether the production and expression of proteins of the RAS are altered in SCD and the effects of HU therapy on these parameters. To analyse alterations in Ang II and possible associations with inflamatory processes in sickle cell anemia (SCA), the following were quantified in the plasma of SCA patients on and off HU and in healthy control individuals; Ang II, angiotensin converting enzyme (ACE), vascular adhesion molecule-1, intercellular adhesion molecule-1 and endothelin-1 (ET-1), NO metabolites, cyclic guanylate monophosphate (cGMP), interleucin-6, interleucin-8, tumor necrosis factor-'alfa' and plasminogen activator inhibitor-1. The production of Ang II and the expressions of some RAS proteins were also studied in an animal model of SCD. In addition, SCD mice were treated, or not, with hydroxyurea (50 and 75 mg/kg/day) for 4 weeks. Plasma levels of Ang II of SCA patients did not differ from those of controls; however, Ang II demonstrated positive correlations with fetal hemoglobin and ET-1; and a negative correlation with plasma cGMP. Plasma levels of ACE were significantly lower in SCA individuals compared with control individuals. In SCD mice, plasma levels of Ang II were significantly decreased when compared to control mice. Treatment with HU (75 mg/kg/day) in the SCD mice increased levels of Ang II significantly. Significant differences in the gene expressions of AT1R and ACE1 (encoding the angiotensin II receptor type 1 and ACE) were detected in SCD mice not treated with HU, when compared to control mice, where these gene expressions were lower in the kidneys and higher in the liver. These results suggest that some alterations in the RAS may occur in SCD individuals. Although we found no association between plasma Ang II levels with inflammatory parameters in patients, further studies should indicate whether alterations in the RAS may contribute to some of the manifestations of SCD or reflect tissue damage in these individuals / Doutorado / Clinica Medica / Doutor em Clínica Médica

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / The objective of this study was to investigate the factors controling the expression of angiotensin II (AngII) receptors and to determine the physiological role of AngII in granulosa cells. The AGTR2 receptor was localized in granulosa (and theca) cells from follicles of different sizes. Bovine ovaries were collected at a local abattoir and small follicles (2-5mm) were isolated for harvesting granulosa cells. The cells were cultured in free medium serum in non-luteinizing conditions without FSH (control group) or with graded doses of FSH or IGF1. In other cultures, cells were cultured with or without IGF1 and bone morphogenetic protein-7 (BMP-7), and fibroblast growth factor-2 (FGF-2). Treatment with FSH, IGF1 and BMP-7 increased (P<0.05) estradiol secretion and AGTR2 mRNA expression relative to control cultures. In contrast, none of these treatments affected AGTR1 receptor expression. Addition of FGF-2 significantly decreased estradiol secretion but did not affect AGTR1 or AGTR2 expression. Cells were cultured with FSH plus graded doses of FGF-7 or FGF-10, and the effects of these factors on AGTR2 protein levels were measured by Western blot. AGTR2 protein levels decreased in the groups treated with FGF-7 (10 and 100ng/ml) and FGF-10 (all concentrations; P<0.05), and estradiol secretion was significantly inhibited by the highest dose of each FGF (P<0.05). Bovine follicles greater than 5 mm diameter were dissected and granulosa and theca cells were separated for RNA extraction, and follicle fluid assayed for estradiol (E2) and progesterone (P) content. Non-atretic follicles (P less than 100ng/ml) were classed as estrogenic (E2 greater than 100ng/ml) or non-estrogenic (E2 less than 40ng/ml). There were no differences in AGTR1 receptor expression in theca and granulosa cells between estrogenic and nonestrogenic follicles. Likewise, there were no changes in AGTR2 receptor expression in theca cells with follicle state. However, AGTR2 receptor mRNA levels were significantly higher in granulosa cells of estrogenic compared to non-estrogenic follicles (P<0.01), and AGTR2 receptor mRNA was correlated with E2 concentrations in follicular fluid. To determine the physiological consequences of AT activation in granulosa cells, cells from small (2-5mm) bovine follicles were cultured in serum-free medium with FSH ± AngII. The addition of AngII had no effect on estradiol or progesterone secretion, but significantly inhibited protease nexin-1 (PN-1) mRNA levels and protein secretion (P<0.05). PN-1 is an inhibitor of proteases involved in extracellular matrix remodeling and follicle rupture. Bovine granulosa cells from large (>10 mm) follicles were cultured for 6h, 12h and 24h with LH (100ng/ml) or AngII, with or without angiotensin receptor blocker (losartan for AGTR1 and PD123,319 for AGTR2). These cells expressed Ptgs2 under basal culture conditions, which was not upregulated by either LH or AngII alone. However, LH and AngII in combination significantly enhanced Ptgs2 (P<0.05) mRNA and protein accumulation. Similarly, expression of the proteolytic enzymes uPA and tPA, and their inhibitor, PN-1, were upregulated by the combination of LH and AngII but not by either factor alone. The addition of AGTR blockers inhibited the effect of AngII. In conclusion, AGTR2 receptor is present in granulosa bovine cells, and mRNA and protein are regulated by FSH, IGF-1, BMP-7, FGF-7 and FGF-10 in bovine granulosa cells in vitro, AGTR2 but not AGTR1 receptor mRNA levels are regulated during follicular growth in cattle, and that AngII regulates granulosa PN-1 secretion. These data suggest that AngII is a physiological co-factor necessary for the expression of genes in granulosa cells that are critical for ovulation. / O objetivo deste trabalho foi estabelecer o controle de expressão dos receptores de angiotencina II (AngII) e determinar a ação fisiológica da AngII em células da granulosa (CG) cultivadas in vitro. Os receptores de AngII tipo 1 (AGTR1) e tipo 2 (AGTR2) foram localizados em folículos de bovinos de diferentes tamanhos. Verificouse que as CG de bovinos provenientes de folículos entre 2- 5 mm e cultivadas com FSH, IGF-1, BMP-7 apresentaram aumento na expressão do receptor AGTR2 (P<0,05) em relação ao grupo controle (GC), bem como aumento da secreção de estradiol (E2; P<0,05). Em contraste, as CG tratadas com 10 ng/ml de FGF-2 ou 10 e 100 ng/ml de FGF-7 e FGF-10 apresentaram uma redução na secreção de E2 (P<0,05), porém somente os grupos FGF-7 e 10 nas doses 10 e 100 ng/ml reduziram (P<0,05) a expressão do receptor AGTR2. Para os dois experimentos, não houve diferença na expressão do receptor AGTR1 entre o GC e os grupos tratados. As CG e células da teca (CT) foram coletadas de ovários provenientes de abatedouro para extração de RNA e o fluido folicular para dosagem de E2 e progesterona P4. Esses folículos foram classificados como dominantes (FD; P4<100ng/ml e E2>100ng/ml) e atrésicos (FA; P4>40ng/ml). A expressão dos receptores AGTR1 e AGTR2 foi mensurada por RTPCR. Não houve diferença na expressão do receptor AGTR1 entre FD e FA. No entanto, o receptor AGTR2 apresentou um aumento (P<0,05) na expressão em CG de FD em relação a FA. A expressão do receptor AGTR1 se manteve constante em CG e CT de FD e FA. Para determinar os afeitos da AngII através da ativação de seus receptores CG foram cultivadas em meio livre de soro com FSH e/ou AngII. A AngII não apresentou efeito na secreção de E2 ou P4, mas inibiu (P<0.05) mRNA e proteína para a protease nexin-1 (PN-1). Considerando a redução de expressão da PN-1 envolvida no controle do remodelamento da matriz extracelular (RME), é possível especular um efeito de AngII sobre RME durante o desenvolvimento folicular. Em um terceiro experimento, as CG de folículos grandes (>10mm) foram cultivadas durante 6h, 12h e 24h na presença de Ang (10-5) com ou sem LH (100ng/ml). A combinação de AngII e LH aumentou significativamente (P<0,05) a expressão de mRNA e proteína para COX-2, ativador do plasminogênio tipo U e T, bem como para PN-1. Entretanto, AngII ou LH não aumentaram a expressão de COX-2. O aumento da expressão destes gene indica uma função de AngII no processo de ovulação através das CG. Em um segundo momento, verificou-se através de qual receptor a AngII atua para controlar a expressão desses genes. As CG foram cultivadas por 6h com LH e/ou AngII com ou sem inibidores específicos para o receptor AGTR1 (losartan) e AGTR2 (PD123,319). Os resultados demonstraram que a presença do inibidor de AGTR2 bloqueou o efeito da associação de LH e AngII em relação ao grupo controle (P<0.05), demonstrado que a ação da AngII é mediada pelo receptor AGTR2 em CG. Em conclusão, o receptor AGTR2 está presente nas células da granulosa de bovinos e o mRNA para o receptor AGTR2 é regulado durante o crescimento folicular. Além disso, a expressão do mRNA e a tradução da proteína para o AGTR2 são reguladas por FSH, IGF-1, BMP-7, FGF-7 e FGF-10 em CG de bovinos cultivadas in vitro. Os dados também sugerem que AngII regula a proteína PN-1 em CG e age como um co-fator fisiológico necessário para a ovulação.