Anopheles melas is a brackish water mosquito found along the coast of West-Africa where it can be the dominant malaria vector locally. In order to facilitate genetic studies of this species and to examine the usefulness of microsatellite markers when used in a sibling species, 45 microsatellite loci originally developed for Anopheles gambiae were sequenced in An. melas. These loci were evaluated on their suitability as polymorphic markers based on repeat structure, length, and polymorphism in wild An. melas populations. Of the 45 loci, 18 were not considered promising markers in An. melas. A total of 48 out of 90 An. gambiae primers contained at least one mismatch with the An. melas annealing site. An. melas-specific primers were designed for 27 loci, and their variability was examined in two wild populations from Equatorial Guinea. Based on a low level of polymorphism, Hardy-Weinberg disequilibrium, or poor amplification, a further 12 loci were excluded. The remaining fifteen loci were screened in four additional wild populations from a wider geographic region including Equatorial Guinea, Cameroon, The Gambia, and Guinea Bissau. These loci showed an average heterozygosity ranging from 0.18 to 0.79, with 2.5 to 15 average alleles per locus, yielding 13 highly polymorphic markers and two loci with more limited variability in a wide geographic region. To examine the effects of cross species amplification, five of the original An. gambiae markers were also amplified in the An. melas populations. Null alleles were found for one of these An. gambiae markers. We discuss the pitfalls of using microsatellite loci even in a very closely related species, and conclude that in addition to the well-known problem of null alleles associated with this practice, many loci may prove to be of very limited use as polymorphic markers even when used in a sibling species. Fifteen An. melas-specific markers were subsequently amplified and analyzed in 11 wild An. melas populations from throughout the range of this species, including Bioko Island, Equatorial Guinea. We analyzed pair-wise population differentiation between all populations, and found that all but two comparisons were significant (p-val.<0.05), and populations clustered into three distinct groups representing Bioko Island, Central Africa, and West Africa populations. A Bayesian clustering analysis found little, if any, evidence for migration from mainland to Bioko Island populations, although there was evidence of migration from Bioko Island to the West population cluster, and from the Central to the West population cluster. Simulations of historical gene followed these same patterns and further support our predictions of unidirectional gene flow. Comparison of 1161 nucleotides amplified and sequenced from the ND4 and ND5 regions of the mtDNA showed that differentiation between An. melas population clusters is on par with levels of differentiation between member species of the An. gambiae complex, with low support for internal nodes in a maximum likelihood tree, which suggests that observed An. melas clusters are not monophyletic. From this we hypothesize that Bioko Island An. melas populations are derived from Tiko, Cameroon, and that these populations became isolated from one another when sea levels rose after the last glaciation period (?10,000-11,000 years ago), cutting off Bioko Island populations from the mainland and significantly reducing migration. Our conclusions have implications for vector control within the region, as Bioko Island is the subject of an intensive malaria control campaign, and the lack of migration from mainland West Africa to Bioko Island make it unlikely that eradicated populations of this malaria vector will be repopulated by mainland immigrants.

Diss. (sammanfattning) Alnarp : Sveriges lantbruksuniv., 2007. / Härtill 4 uppsatser.

Thesis (M.Sc. (Molecular Genetics and Genetic Engineering))--Mahidol University, 2000.

Orientador: Rosangela Zacarias Machado / Banca: Marcos Rogério André / Banca: Rosely dos Santos Malafronte / Banca: Ana Patrícia Yatsuda Natsui / Banca: Tiago Wilson Patriarca Mineo / Resumo: A malária é a endemia de maior impacto na Saúde Pública de países tropicais, devido à alta morbidade e mortalidade. Considerando a malária como uma zoonose, nos quais primatas podem funcionar como reservatórios de espécies de Plasmodium que podem infectar seres humanos nos levam a realizar estudos de malária em primatas com inquestionável relevância. Sabendo-se que geralmente a distribuição da malária humana e de primatas segue a mesma distribuição dos anofelinos, mosquitos vetores, neste trabalho investigaram-se a presença de Plasmodium spp. em primatas neotropicais e em anofelinos na Ilha de São Luís, Estado do Maranhão, Brasil. Colheram-se amostras de sangue de primatas neotropicais do CETAS-São Luís (n=141) e de vida livre (n=20) da Reserva Particular Sítio Aguahy, município de São José de Ribamar. Mosquitos anofelinos foram capturados nesta mesma reserva (n=380) e no Sítio Mangalho (n=36), localizado na Área de Proteção Ambiental do Maracanã, município de São Luís, totalizando em 54 ―pools‖. As amostras de sangue de primatas foram submetidas a testes morfológicos, sorológicos (RIFI e ELISA-teste) e moleculares (qPCR e PCR convencional) para identificação de Plasmodium. Os ―pools‖ de mosquitos foram ensaiados por testes moleculares para identificação de Plasmodium. Cinco primatas tiveram lâminas positivas (3,10%) com observação de formas trofozoíticas. Na RIFI quatro amostras de soro de primatas sororreagiram frente ao antígeno de P. malariae. Amplificaram para Plasmodium sp. na qPCR 34,16% (55/161) das amostras de primatas. Na PCR convencional 30,43% (49/161) foram positivas, sendo 47 (47/49) para P. brasilianum/P. malariae e 2 (2/49) para P. simium/P. vivax. Foram sequenciadas quatro amostras de DNA de primatas, que apresentaram identidade com P. malariae (n=2),com Plasmodium ZOOBH (n=1) e com P. falciparum (n=1). Três ―pools‖ de anofelinos foram positivos para Plasmodium na... / Abstract: Malaria is a disease of greater impact on Public Health in tropical countries because of the high morbidity and mortality. Considering malaria as a zoonosis in which primates can act as reservoirs of species of Plasmodium that can infect humans lead us to conduct malaria studies in primates with unquestionable relevance. It is generally know that the distribution of human and primate malaria following the same distribution of Anopheles mosquitoes vectors, in this study we investigated the presence of Plasmodium spp. in neotropical primates and Anopheles in São Luís Island, Maranhão State, Brazil. Samples were blood neotropical primates CETAS-São Luís (n = 141) and wild life (n = 20) Private Reserve Sítio Aguahy, São José de Ribamar. Anopheles mosquitoes were captured in the same reserve (n = 380) and Mangalho site (n = 36), located in the Environmental Protection Area of the Maracanã, São Luís, totaling 54 pools. The primate blood samples were subjected to morphological, serological (IFA and ELISA-test) and molecular (qPCR and conventional PCR) to identify Plasmodium. The "pools" of mosquitoes were assayed by testing for molecular identification of Plasmodium. Five primates had positive slides (3.10%) with observation trofozoíticas forms. In IFA four primate serum samples sororreagiram against the antigen of P. malariae. Amplified Plasmodium sp. qPCR at 34.16% (55/161) of samples of primates. In conventional PCR 30.43% (49/161) were positive, 47 (47/49) for P. brasilianum/P. malariae and 2 (2/49) to P.simium/P. vivax. Were sequenced DNA samples from four primates which showed identity with P. malariae (n = 2), Plasmodium ZOOBH (n = 1) and P. falciparum (n = 1). Three pools of Anopheles were positive for Plasmodium in qPCR (3/54) and conventional PCR. The sequencing samples showed identity to P. falciparum (n = 1), P. vivax (n = 1) and Plasmodium ZOOBH (EF090276). Due to the continued and increasing encroachment to forests by ... / Doutor

Made available in DSpace on 2011-05-04T12:42:03Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009 / Até hoje não existem mecanismos eficientes de controle da malaria, uma das doenças infecciosas mais importantes do mundo. Nas últimas décadas, a transformação genética dos mosquitos transmissores tem sido proposta como uma alternativa para o controle de esta doença. Para isso, além do desenvolvimento de técnicas para a introdução de DNA em células germinais dos mosquitos e da identificação de genes capazes de bloquear ou reduzir a transmissão de parasitas aos humanos, é necessário o desenvolvimento de métodos eficientes para a introdução e fixação de genes refratários à malaria nas populações naturais de mosquitos. O uso de elementos de transposição tem sido sugerido para tais fins pelas características biológicas de invasão e propagação em genomas eucariotas que presentão estes elementos. Na presente tese, analisaram-se os elementos de transposição presentes no genoma do mosquito Anopheles gambiae, um dos principais vetores da malaria no mundo. Os resultados apresentados se encontram divididos em três partes, primeiramente a descrição de AnoTExcel, uma base de dados com informação detalhada dos elementos de transposição presentes neste genoma. Por outra, a partir desta base, foram identificados e caracterizados elementos novos, não detectados previamente em nenhum genoma. Por último, foram analisados elementos representativos pertencentes às diferentes classes de elementos de transposição desde uma perspectiva evolutiva e foi proposta uma análise de redes (Network analysis) para inferir as inter-relações entre elementos de transposição pertencentes à mesma família. / Up today, there are no efficient mechanisms for the control of Malaria, one of the most important diseases in the world. In the last decades, the genetic transformation of the malaria vectors have been proposed as an alternative. For achieving so, besides the development of techniques for the introduction of foreign DNA into the mosquitoes germinal cells and the identification of genes able to block or reduced the parasites transmission to human, the development of efficient methods for the introduction and fixation of the refractory genes into the mosquitoes natural populations is needed. In this regard, the use of transposable elements has been suggested as a driver system due to their biological characteristics of eukaryotic genomes invasion and propagations. In this thesis the analysis of the transposable elements in the genome of Anopheles gambiae, one of the most important vectors of malaria, has been proposed. The results are divided in three parts, first of all a description of AnoTExcel, a database with detailed information of the transposable elements present in the mosquito genome. The characterization of Novel elements that have not been described before is also described. Last, an evolutionary analysis of representative elements from different classes and families of elements has been performed. Finally, we have also proposed a network analysis for inferring the relationships between elements within the same family.

Made available in DSpace on 2015-11-04T13:39:07Z (GMT). No. of bitstreams: 2 geovane_lopes_ioc_mest_2014.pdf: 4146940 bytes, checksum: 332c9cbd56d1a1690235d637c48eaeef (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2015-10-29 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / O objetivo geral do presente trabalho foi caracterizar e identificar peptidases ativas presentes nos intestinos de machos e fêmeas de Anopheles aquasalis bem como identificar as proteínas expressas no intestino e gônadas de fêmeas dessa espécie. Para a caracterização proteolítica foram usadas distintas abordagens bioquímicas que permitiram reunir um grupo importante de informações sobre a expressão de enzimas proteolíticas nesta espécie de mosquito. Usando o substrato fluorogênico Z-Phe-Arg-AMC em solução e a técnica de enzimografia por SDS-PAGE co-polimerizado com gelatina foi possível observar um perfil proteolítico composto por serina peptidases do tipo tripsina no intestino de machos e fêmeas de An. aquasalis. Estas enzimas apresentam maior atividade proteolítica na faixa de pH alcalino e ampla estabilidade térmica, sendo ativas entre 25 °C \2013 80 °C, com maior atividade entre 37 °C \2013 50 °C. Diferenças qualitativas e quantitativas na expressão das peptidases também foram detectadas. Foi observado que o perfil proteolítico difere entre macho e fêmea, sugerindo com isso que a expressão de algumas dessas enzimas é sexo-específica Para análise proteômica do intestino e gônadas de fêmeas alimentadas com açúcar usou-se uma abordagem \201Cbottom-up\201D acoplada à análise bioinformática de dados para identificação das proteínas expressas. A análise do intestino foi feita através de um procedimento de digestão em solução sem pré-fracionamento das proteínas, ao passo que a análise das gônadas foi feita usando um protocolo de digestão em gel após fracionamento das proteínas por SDS-PAGE. Usando estas estratégias, um total de 137 e 995 proteínas foram identificadas no intestino e gônadas, respectivamente. As proteínas foram identificadas usando os programas ProLuCID e/ou PEAKS, e uma base de dados \201Ccustomizada\201D incluindo todas as sequencias de Culicídeos depositadas na base de dados UniProt (81,000 sequencias, em outubro de 2013). As identificações foram posteriormente analisadas com relação ao enriquecimento de termos de ontologia gênica e foram classificadas de acordo com seu processo biológico e função molecular, usando o módulo GeneOntology da plataforma PatternLab. A caracterização proteômica revelou para o intestino (i) a presença de várias serina peptidases do tipo tripsina, corroborando a expressão e atividade das enzimas observadas na enzimografia; (ii) a expressão de vários genes codificantes para quimiotripsina, embora a sua atividade não tenha sido detectada pela enzimografia; e para as gônadas (iii) proteínas associadas à vitelogênese; e (iv) a expressão massiva de proteínas implicadas na preparação do tecido para reprodução Finalmente, até o presente, esta é a primeira caracterização abrangente da atividade proteolítica de machos e fêmeas de An. aquasalis bem como a primeira caracterização proteômica do intestino e gônadas de fêmeas desta espécie alimentadas com açúcar. Os resultados obtidos neste trabalho além de fornecerem informações sobre a localização tecidual de proteínas no mosquito e abrirem diversas vias de estudo da biologia e fisiologia deste vetor, contribuem também para a anotação funcional do genoma desta espécie, visto tratar-se de uma espécie com genoma ainda não concluído / The aim of this study was to characterize and identify active peptidases from the midgut of males and females of Anopheles aquasalis and to identify protein expressed in the midgut and gonads of females of this species. The different bioche mical approaches used for the proteolytic characterization allowed gather ing a group of important information about the expression of proteolytic enzymes in this mosquito species. Using the fluorogenic substrate Z - Phe - Arg - AMC for in - solution enzymatic assays and by zymographic analyses (SDS - PAGE co - polymerized with gelatin) it was possible to observe a proteolytic profile composed of trypsin - like serine peptidases in the midgut of male and female A n . aquasalis . These pepti dases exhibit high proteolytic activity at a w ide range of alkaline pH and thermal stability, being active between 25° C - 80 ° C, with more activity between 37° C - 50° C. Qualitative and quantitative differences in the expression of peptidases were also detected. It was observed that proteolytic profile differs between males and females, thereby suggesting that the expression of some of these enzymes is sex - specific. For proteomic analysis of the midgut and gonads of females fed on sugar it was used a "bo ttom - up" proteomic approach coupled with bioinformatic s data analysis to identify tissue - specific expressed protein s . The midgut analysis was taken through an in - solution digestion procedure without pre - fractionation of the proteins, while the analysis of gonads was made using an in - gel digestion protocol after fractionation of proteins by SDS - PAGE. Using these strategies, a total of 137 and 995 proteins were identified in the midgut and gonads, respectively. Proteins were identified using the ProLuCID and/ or PEAKS software , and a customized database including all Culicidae protein sequences deposited at the UniProt database (81,000 sequences, in October 2013). Protein identifications were further analyzed for the enrichment of gene ontology terms and were c lassified according to their biological process and molecular function using the GeneOntology module of the PatternLab platform. The proteomic characterization of midgut revealed (i) the presence of various t rypsin - like serine peptidases , confirming the ex pression and activity of these enzymes observed by zymography, (ii) the expression of several chymotrypsin coding genes, although its activity was not detected by zymography . Proteomics of gonads from female fed with sugar revealed (iii) the expression of proteins associated with vitellogenesis and (iv) the massive expression of proteins involved in tissue preparation for reproduction process. F inally, to the present , t his is the first characterization of the proteolytic activity of males and females midgut s of An. aquasalis well as the first proteomic characterization of the midgut and gonads of A n . aquasalis females fed with sugar. The results obtained in this work in addition to providing information about the cellular localization of proteins in the mosq uito , open several avenues of study of the biology and physiology of this vector, and also contribute to the functional annotation of the genome of this species with genome not yet completed

Submitted by Anderson Silva (avargas@icict.fiocruz.br) on 2016-02-19T15:51:39Z No. of bitstreams: 1 dissertacao_mestrado_mariana_marinho_e_silva.pdf: 20546294 bytes, checksum: 7d6bff68d1a4d2ce6ef7b31d5db46bc9 (MD5) / Approved for entry into archive by Anderson Silva (avargas@icict.fiocruz.br) on 2016-02-19T18:22:14Z (GMT) No. of bitstreams: 1 dissertacao_mestrado_mariana_marinho_e_silva.pdf: 20546294 bytes, checksum: 7d6bff68d1a4d2ce6ef7b31d5db46bc9 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-02-19T18:22:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao_mestrado_mariana_marinho_e_silva.pdf: 20546294 bytes, checksum: 7d6bff68d1a4d2ce6ef7b31d5db46bc9 (MD5) / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / O número de casos de malária autóctone e importada tem aumentado na Região Extra - Amazônica. O fluxo de indivíduos infectados para regiões não endêmicas com p resença de vetores e demais condições necessárias à transmissão pode provocar surtos. O Mato Grosso do Sul, especialmente o Pantanal, está próximo a áreas malarígenas do Brasil e países vizinhos e por ele transitam milhares de pessoas, particularmente turi stas brasileiros e advindos de várias partes do mundo. Assim, é importante a determinação das espécies de Anopheles que podem atuar como vetor e o estudo da ecologia desses mosquitos, para permitir avaliar o risco de reintrodução da malária, o melhor enten dimento da epidemiologia da doença e o controle vetorial eficaz. A localidade Salobra, Pantanal do Município de Miranda, MS, outrora malarígena, é bastante peculiar, devido à sazonalidade das chuvas e rios com distintas características fisico - químicas, que transbordam alagando vasta planície durante parte do ano. Tal peculiaridade pode ter favorecido a especiação e aparecimento de complexos de espécies crípticas. Neste trabalho, realizamos capturas bimestrais de anofelinos em Salobra, de setembro - 2010 a jul ho - 2011. Em cada mês, foram realizadas coletas durante cinco dias, de 17 - 20h, nas paredes de uma casa, em atrativo humano no peridomicílio e em armadilha Shannon com cavalo no extradomicílio, além de três capturas de 18h no extradomicílio. Foi realizado le vantamento de dados epidemiológicos secundários acerca dos casos autóctones de malária ocorridos no MS nos últimos anos. No total, foram capturados 24.894 anofelinos, cuja maior frequência se deu na transição entre a estação chuvosa e seca. As identificaçõ es morfológica e molecular revelaram a presença de 13 espécies ou complexos em Salobra: An. albitarsis s.l. , An. darlingi , An. deaneorum , An. galvaoi , An. halophylus , An. mattogrossensis , An. oswaldoi s.l. , An. rondoni, An. triannulatus s.s. , An. triannula tus C , An. arthuri , An. konderi e An. oryzalimnetes , sendo as três últimas registradas pela primeira vez no MS. A espécie mais frequente no total das capturas foi An. darlingi ( 63,1%), principal vetor de malária no Brasil, seguida de An. triannulatus s.l. (19,7%). Todas as espécies apresentaram comportamento predominantemente exofágico e também foram abundantemente capturadas em atrativo animal, embora também tenham sido capturadas picando o homem no peridomicílio e coletadas repousando nas paredes internas da casa. O pico de maior frequência de anofelinos se dá no crepúsculo matutino e momentos peri - crepusculares do amanhecer, embora picos no crepúsculo vespertino e, principalmente, nas horas altas da noite também tenham sido observados, especialmente para An. darlingi. O levantamento epidemiológico revelou que, anualmente, ocorrem casos de malária autóctone e importada no MS, alguns diagnosticados no Pantanal. Mais de 66% dos casos eram de homens, com idade entre 18 e 52 anos, cujas atividades profissionais , como garimpo, extrativismo vegetal e agropecuária, aumentam a exposição à picada de anofelinos no extradomicílio durante o amanhecer e anoitecer, como se viu ocorrer em Salobra. Conclui - se que Salobra e o Pantanal de Miranda são consideravelmente recepti vos e vulneráveis à transmissão de malária. Portanto, a vigilância deve ser intensificada nesta área, de modo a se evitar surtos e o restabelecimento da endemicidade da malária. / The number of cases of imported and autochthonous malaria has increased in recent years in the Extra - Amazonian Region. The migration of malaria - infected individuals to non - endemic regions with presence of vectors and other conditions necessary for the malaria transmission can c ause outbreaks. Mato Grosso do Sul Stat e (MS), especially the Pantanal Region, is close to malarious areas in Brazil and in bordering countries, and thousands of people, particularly Brazilians and tourists coming from various parts of the world, transit trough Pantanal. It is, therefore, impor tant to determine the Anopheles species that can act as vectors and to study the ecolog y of these mosquitoes, in order to allow risk assessment of reintroduction of ma laria, better understanding of disease epidemiology, and effective vector control. The lo cation of Salobra, in the Pantanal of Miranda Municipality, MS, a malarious area in the past, is quite peculiar, due to seasonal rainfall s and rivers with different physico - chemical characteristics, which overflow flooding a vast plain during a time of yea r. This peculiarity may have favored speciation and appearance of complexes of cryptic species. We carried out bimonthly collections of Anopheles mosquitoes in Salobra, from 2010 - September to 2011 - July. Each month, collections were conducted for five days, from 17 - 20 h, in the walls of a domicile, in human bait in the peridomicile and in Shannon trap with animal bait in extradomicile. Three 18 - hour collections in extradomicile were performed . An epidemiological survey, based on secondary data, about autochth onous malaria cases occurred in MS in recent years was conducted. In total, 24,894 anophelines were collected, which occurred more frequently in the transition between the rainy and dry seasons. Morphological and molecular identification revealed the prese nce of 13 species in Salobra: An. albitarsis s.l. , An. darlingi , An. deaneorum , An. galvaoi , An. halophylus , An. mattogrossensis , An. oswaldoi s.l. , An. rondoni , An. triannulatus s.s. , An. triannulatus C , An. a rthuri , An. konderi and An. oryzalimnetes , the last three being registered for the first time in MS . The most frequent species in total of collections were An. darlingi (63.1%), main vector of malaria in Brazil, and An. triannulatus s.l. (19.7%). All species presented predominantly exophagic behavior and were abundantly caught on horse . However, they were also caught biting huma n in the peridomicile and on the inner walls of the house. T he highest peak frequency of all anophelines occurs in the morning and around peri - crepuscular hours, although peaks at dusk, and especially at dawn, are also observed, especially regarding An. darlingi . The epidemiological survey showed that autochthonous and imported malaria cases occur annually in MS, and some occur in Pantanal. More than 66% of cases were male indivi duals, aged 18 - 52 years, whose occupation s such as mining, agriculture and wood extraction, increase exposure to the bite of anopheline s in the extradomicile, during dawn and dusk, as it has been observed in Salobra. We conclude that Salobra and the Mirand a Pantanal are pretty receptive and vulnerable to malaria transmission. Therefore, surveillance should be intensified in this area, in order to prevent the occurrence of outbreaks and the reestablishment of endemic malaria.

Made available in DSpace on 2016-03-08T14:03:47Z (GMT). No. of bitstreams: 2 luana_ferreira_ioc_dout_2014.pdf: 11732289 bytes, checksum: 1ef56f743ff0c803375a1307f2379adc (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2016-01-13 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Diversos parasitas, agentes etiológicos de uma série de agravos, são transmitidos por mosquitos vetores em todo o mundo. A despeito de sua importância médica, ainda existem muitas lacunas no conhecimento da embriogênese desses insetos. Ovos de espécies do gênero Aedes resistem à dessecação, e são capazes de sobreviver vários meses no seco em estado de quiescência ao final da embriogênese. Entretanto, ovos de espécies de outros gêneros, como Anopheles e Culex, não possuem capacidade de resistir a longos períodos de exposição ao seco, apesar de adquirirem algum grau de impermeabilidade. Nos mosquitos Aedes aegypti e Anopheles gambiae tem sido mostrado que, durante a embriogênese, a síntese da cutícula serosa (CS), que contém quitina, coincide com a aquisição da resistência dos ovos à dessecação (ROD). O objetivo deste trabalho foi investigar, comparativamente, a embriogênese de diferentes mosquitos vetores, para elucidar semelhanças e diferenças na ROD. A maior parte do trabalho foi realizada com as espécies Ae. aegypti, An. aquasalis e Cx. quinquefasciatus. Verificamos que para An. aquasalis e Cx. quinquefasciatus a formação da CS também é simultânea à aquisição de ROD e contém quitina. O tempo requerido para a finalização da embriogênese de Ae. aegypti, An. aquasalis e Cx. quinquefasciatus é, respectivamente, 77,4, 51,3, e 34,2 horas após a postura A formação da CS ocorre em estágio embrionário equivalente para Ae. aegypti e An. aquasalis e um pouco mais tardio para Cx. quinquefasciatus. Ao final da embriogênese diferentes níveis de ROD foram detectados: alto para Ae. aegypti, médio para An. aquasalis e baixo para Cx. quinquefasciatus. Com o objetivo de entender essas diferenças, avaliamos, comparativamente, alguns aspectos físicos dos ovos: comprimento, largura, área, volume, peso e a superfície da casca. Apesar de diferenças interessantes e significativas terem sido observadas, não foi possível estabelecer correlação direta entre ROD e tais aspectos, quando avaliados individualmente. Quantificação do polissacarídeo quitina revelou tendência de maior conteúdo em cascas de ovos de espécies mais resistentes ao seco. Além disso, diferenças significativas foram encontradas no grau de melanização dos ovos das diferentes espécies, sugerindo que ovos mais melanizados são mais resistentes ao seco. Essa hipótese foi testada utilizando o mutante GORO da espécie An. quadrimaculatus. Nesta linhagem a melanização não ocorre corretamente, e as cascas de seus ovos têm aparência dourada. Em contraste, seu equivalente selvagem (WT) possui ovos de casca escura Ovos GORO possuem ROD deficiente: quando expostos ao seco por 10 horas após a formação da CS, apenas 12,3% são viáveis, em contraste com 66,5% de ovos WT. Nossos resultados confirmam de forma direta que, além da quitina da CS, a melanização da casca dos ovos é importante para a impermeabilização dos ovos de insetos / Several parasites, etiologic agents of a number of diseases, are transmitted by mosquito vectors worldwide. Despite their medical importance, many gaps in our knowledge about the embryogenesis of these insects still remain. Eggs from the Aedes genus resist to desiccation, and are able to survive several months in dry conditions in a quiescent status at the end of embryogenesis. In contrast, eggs belonging to other genera, like Anopheles and Culex, do not withstand long periods of exposure in dry conditions, although they acquire some degree of impermeability. It has already been demonstrated that, in the course of Aedes aegypti and Anopheles gambiae embryogenesis, the synthesis of the serosal cuticle (SC), which contains chitin, coincides with the acquisition of egg resistance to desiccation (ERD). The aim of the present work was to investigate, under a comparative basis, the embryogenesis of different mosquito vectors, in order to elucidate ERD similarities and differences. Most of the work was performed with Ae. aegypti, Anopheles aquasalis and Culex quinquefasciatus. We found that, for An. aquasalis and Cx. quinquefasciatus, ERD acquisition is also simultaneous to the development of SC, a layer containing chitin. Time required for embryogenesis completion is 77.4, 51.3, and 34.2 hours after egglaying for respectively Ae. aegypti, An. aquasalis and Cx. quinquefasciatus. The formation of SC occurs in an equivalent embryonic stage for Ae. aegypti and An. aquasalis, but a little later for Cx. quinquefasciatus. At the end of embryogenesis different ERD levels were detected: high for Ae. aegypti, medium for An. aquasalis and low for Cx. quinquefasciatus. In order to understand these differences, we comparatively evaluated some physical aspects of the eggs: length, width, area, volume, weight and eggshell surface appearance. Although interesting and significant differences have been observed, it was not possible to establish any direct correlation between ERD and these physical aspects, when individually considered. Quantification of chitin revealed tendency of higher amount of this polysaccharide in the eggshells of species more resistant to desiccation. Furthermore, significant differences were found in the degree of melanization of eggs from the different species, suggesting that more melanized eggs are also more resistant to dry conditions. This hypothesis was tested using the An. quadrimaculatus GORO mutant. In this strain, melanization does not occur properly, and the eggs have a golden appearance. Eggshells from the wild type (WT) strain, in contrast, are dark. GORO eggs exhibit a defective ERD: when exposed to dry conditions during 10 hours after the SC formation only 12.3% are viable, in contrast with 66.5% of WT eggs. Our results confirm, directly, that beyond the chitin present in the SC, the eggshell melanization is an important factor towards insect eggs impermeability

Made available in DSpace on 2015-10-06T13:03:03Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-06-22. Added 1 bitstream(s) on 2015-10-06T13:19:02Z : No. of bitstreams: 1 000848356.pdf: 1331001 bytes, checksum: d6e3659c184a0dc66b218b791f493b49 (MD5) / A malária é a endemia de maior impacto na Saúde Pública de países tropicais, devido à alta morbidade e mortalidade. Considerando a malária como uma zoonose, nos quais primatas podem funcionar como reservatórios de espécies de Plasmodium que podem infectar seres humanos nos levam a realizar estudos de malária em primatas com inquestionável relevância. Sabendo-se que geralmente a distribuição da malária humana e de primatas segue a mesma distribuição dos anofelinos, mosquitos vetores, neste trabalho investigaram-se a presença de Plasmodium spp. em primatas neotropicais e em anofelinos na Ilha de São Luís, Estado do Maranhão, Brasil. Colheram-se amostras de sangue de primatas neotropicais do CETAS-São Luís (n=141) e de vida livre (n=20) da Reserva Particular Sítio Aguahy, município de São José de Ribamar. Mosquitos anofelinos foram capturados nesta mesma reserva (n=380) e no Sítio Mangalho (n=36), localizado na Área de Proteção Ambiental do Maracanã, município de São Luís, totalizando em 54 ―pools‖. As amostras de sangue de primatas foram submetidas a testes morfológicos, sorológicos (RIFI e ELISA-teste) e moleculares (qPCR e PCR convencional) para identificação de Plasmodium. Os ―pools‖ de mosquitos foram ensaiados por testes moleculares para identificação de Plasmodium. Cinco primatas tiveram lâminas positivas (3,10%) com observação de formas trofozoíticas. Na RIFI quatro amostras de soro de primatas sororreagiram frente ao antígeno de P. malariae. Amplificaram para Plasmodium sp. na qPCR 34,16% (55/161) das amostras de primatas. Na PCR convencional 30,43% (49/161) foram positivas, sendo 47 (47/49) para P. brasilianum/P. malariae e 2 (2/49) para P. simium/P. vivax. Foram sequenciadas quatro amostras de DNA de primatas, que apresentaram identidade com P. malariae (n=2),com Plasmodium ZOOBH (n=1) e com P. falciparum (n=1). Três ―pools‖ de anofelinos foram positivos para Plasmodium na... / Malaria is a disease of greater impact on Public Health in tropical countries because of the high morbidity and mortality. Considering malaria as a zoonosis in which primates can act as reservoirs of species of Plasmodium that can infect humans lead us to conduct malaria studies in primates with unquestionable relevance. It is generally know that the distribution of human and primate malaria following the same distribution of Anopheles mosquitoes vectors, in this study we investigated the presence of Plasmodium spp. in neotropical primates and Anopheles in São Luís Island, Maranhão State, Brazil. Samples were blood neotropical primates CETAS-São Luís (n = 141) and wild life (n = 20) Private Reserve Sítio Aguahy, São José de Ribamar. Anopheles mosquitoes were captured in the same reserve (n = 380) and Mangalho site (n = 36), located in the Environmental Protection Area of the Maracanã, São Luís, totaling 54 pools. The primate blood samples were subjected to morphological, serological (IFA and ELISA-test) and molecular (qPCR and conventional PCR) to identify Plasmodium. The pools of mosquitoes were assayed by testing for molecular identification of Plasmodium. Five primates had positive slides (3.10%) with observation trofozoíticas forms. In IFA four primate serum samples sororreagiram against the antigen of P. malariae. Amplified Plasmodium sp. qPCR at 34.16% (55/161) of samples of primates. In conventional PCR 30.43% (49/161) were positive, 47 (47/49) for P. brasilianum/P. malariae and 2 (2/49) to P.simium/P. vivax. Were sequenced DNA samples from four primates which showed identity with P. malariae (n = 2), Plasmodium ZOOBH (n = 1) and P. falciparum (n = 1). Three pools of Anopheles were positive for Plasmodium in qPCR (3/54) and conventional PCR. The sequencing samples showed identity to P. falciparum (n = 1), P. vivax (n = 1) and Plasmodium ZOOBH (EF090276). Due to the continued and increasing encroachment to forests by ...

Made available in DSpace on 2016-09-27T13:40:05Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-08-31. Added 1 bitstream(s) on 2016-09-27T13:45:16Z : No. of bitstreams: 1 000868765.pdf: 2521331 bytes, checksum: 991fffa9898ac1fb4f910430954d436c (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Bolsa Estágio de Pesquisa no Exterior (BEPE) / A invasão da glândula salivar pela forma de esporozoítos do gênero Plasmodium é um passo crucial para o ciclo de vida nos mosquitos do gênero Anopheles, e um passo obrigatório para que a transmissão da malária ocorra. A TRAP domínio-A, uma proteína de esporozoítos que é secretada na face anterior do parasita quando em contato com a glândula salivar, interage com a saglin, proteína majoritária da glândula. Esta interação é fundamental para que ocorra a invasão. Este processo ocorre em Anopheles gambiae infectado com Plasmodium0berghei ou Plasmodium0 falciparum. No Brasil, o Anopheles darlingi é o principal veto do parasita da malária. Aproximadamente 80% dos!casos de malária são!causados por Plasmodium vivax, anualmente e aproximadamente 20% por Plasmodium falciparum. Em um estudo prévio de nosso grupo, foi observado! 80% de infecção por P. 0falciparum nos An. darlingi coletados em Rondônia, Porto Velho. Isto pode ser provavelmente porque o An. darlingi pode se infectar facilmente com P. falciparum, mas não o transmite de uma maneira eficiente. Comparamos a sequência da saglin de An. gambiae com sequências!de An. darlingi, e SG1 e SG1B foram as sequências mais relacionadas, com 27% de similaridade. Sequenciamos isolados de P alciparum!brasileiros, e!aminoácidos chave no!processo de invasão da glândula se apresentaram conservados. Caracterizamos, pela primeira vez, a região da saglin de An. gambiae, responsável pela interação com o domínio-A da TRAP, e observamos que esta sequência nao encontra homologia com sequências de An. darlingi. Anofelinos!da espécie An.gambiae e An. darlingi, divergiram há aproximadamente 79 milhões de anos, e o processo de especiação provocou o surgimento de algumas barreiras para o desenvolvimento de espécies de Plasmodium, que habitam regiões geográficas distintas. Parasitas da espécie P. falciparum chegaram no Brasil a aproximadamente 500 anos junto... / Salivary!gland!invasion!by!sporozoites!of!Plasmodium!genus!is!a!crucial!step! to! life! cycle! in! mosquitoes! of! Anopheles! genus, and! an! obligate! step! to! malaria! transmission! occurs.! TRAP! A! domain,! a! sporozoite! protein! that! is! secreted! on! anterior! tip! of! parasite! upon! contact! with! salivary! glands,! interacts! with! saglin,! a! major!gland!protein.!This!interaction!is!fundamental!to!gland!invasion.!This!process! occurs! in! Anopheles0 gambiae! infected! with! Plasmodium0 berghei! or! Plasmodium0 falciparum.!In!Brazil,!Anopheles0darlingi!is!the!main!vector!of!malaria!parasite.!Near! 80%! of!malaria! cases! are! due! Plasmodium0vivax,! annually,! and! about! 20%! due! to! Plasmodium0falciparum.! In! previous! studies! of! our! lab,! it!was! observed! 80%! of! P.! falciparum! infection! in! An.0 darlingi! collected! in! Rondonia,! Porto! Velho.! This! probably!happens!because!An.0darlingi!can!be!easily!infected!with!P.0falciparum,!but! can!not!efficiently!transmit!them.!We!compare!An.0gambiae!saglin!sequence!with0An.0 darlingi0sequences,!and!SG1!and!SG1B!were!the!most!related!sequences,!with!27%! of!similarity.!Brazilian!P.0falciparum!isolated!were!sequenced,!and!key!amino!acids! related!to!salivary!gland!invasion,!are!preserved.!We!characterize!for!the!first!time,! An.0gambiae! saglin! region! responsible! to! interact!with! A!domain!of!TRAP,! and!we! observed!that!these!sequences!have!no!homology!with!An.0darling!ones.!An.gambiae... / FAPESP: 2011/09400-6 / Bolsa Estágio de Pesquisa no Exterior (BEPE): 2012/16103-0