Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2016-05-17T11:50:55Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1288058 bytes, checksum: 45b5a45c90b8a794c2f6a5666113f13e (MD5) / Made available in DSpace on 2016-05-17T11:50:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1288058 bytes, checksum: 45b5a45c90b8a794c2f6a5666113f13e (MD5) Previous issue date: 2008-08-29 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / O Herpesvirus equino 1 (EHV-1), um importante patógeno de cavalos, foi escolhido como vírus alvo, pois representa uma família altamente patogênica e apesar de já haver vacinas contra ele, elas são pouco eficientes. Assim, um novo tratamento que evite perdas financeiras irreparáveis em criações de cavalos é bastante relevante. Por outro lado, os produtos naturais são alvos das mais diversas pesquisas para formulação de novos medicamentos, dentre eles os antivirais por possuírem um elevado potencial terapêutico. Neste trabalho, realizamos ensaios biológicos em cultivo celular com células Vero para determinar o efeito citotóxico e os potenciais antivirais de 8 compostos (quatro substâncias puras, um extrato de microrganismo e três extratos vegetais de uma mesma espécie). As citotoxicidades foram determinadas por microscopia óptica e confirmadas usando uma variação do método colorimétrico baseado na redução do sal MTT. Com o objetivo de investigar in vitro o potencial antiviral de cada tratamento sobre o EHV-1, foi feita a avaliação da redução de título viral por visualização do efeito citopático seguida de titulação viral em três ensaios antivirais, o de “Inativação Direta”, o “End Point” e o “Timing of Addition”. O primeiro teve como objetivo determinar se os tratamentos possuem ação sobre as partículas virais desestabilizando-as ou se ligando a elas de forma irreversível. O segundo tem como objetivo determinar se as substâncias puras ou presentes nos extratos se ligam aos receptores celulares ou a outras estruturas moleculares causando modificações celulares duradouras. O terceiro foi realizado com o objetivo de determinar a ação dos compostos sobre quatro etapas do ciclo infectivo viral, avaliando se apresentam ação antiviral em fases específicas da infecção. Os resultados dos testes demonstraram que as concentrações máximas não tóxicas obtidas foram respectivamente, 70, 100, 120, 110 e 70 μg/mL para a quercetina, morina, rutina, ácido trans-cinâmico e monascus; 40, 40 e 90 μg/mL para os extratos E1, E2, E3, respectivamente e 3,0% (v/v) para o DMSO. Nas concentrações testadas, o DMSO não causou variação significativa no título viral em nenhum dos testes, sendo, portanto, um composto inerte. A rutina não demonstrou ação antiviral significativa em nenhum dos testes. Os extratos apresentaram maior potencial antiviral contra o EHV-1 in vitro, seguidos das substâncias quercetina e morina. Nos resultados do teste de inativação direta, foi observada a ação dos três extratos, da quercetina e da morina. O E3 foi o único a apresentar ação no teste “End Point”. No “Timing of Addition”, todos os compostos apresentaram ação antiviral em pelo menos uma etapa de infecção, com exceção da rutina. A morina e o monascus sobre a adsorção, o ácido trans- cinâmico sobre os receptores celulares e na adsorção, a quercetina e o E2 nas fases de adsorção e penetração viral, e o E1 e o E3 em todas as fases. O processo de adsorção foi o mais afetado pelos compostos, sugerindo ação principalmente sobre as partículas virais e receptores celulares, impedindo momentos iniciais da infecção. Possivelmente, há nos extratos um efeito sinérgico decorrente da ação de mais de um composto. Com os resultados encontrados neste trabalho, concluímos que estes compostos poderão ser de grande importância nas medicinas veterinária e humana para prevenção e tratamento de infecções virais e para formulação de novos medicamentos. / The Equine herpesvírus 1 (EHV-1), a important pathogen of horses, was chosen as target virus because it represents a highly pathogenic family and although we already have vaccines against it, they are inefficient. Thus, a new treatment that avoid irreparable financial loses in creations of horses is quite relevant. On other hand, due to their high therapeutic potential, the natural products are targets of various researches for formulation of new medicines. In this work, we made biological assays in Vero’s cell culture to determine the cytotoxic effect and antiviral potential of 8 compounds (four pure substances, one microorganism extract and three plant extracts from the same specie). The cytotoxicidates were determined by optical microscopy and confirmed by using a variation of colorimetric method based on MTT salt reducing. In order to investigate in vitro the antiviral potential from each treatment on the EHV-1, we did the viral title reduction evaluation by viewing the cytopathic effect followed by viruses titration in three antiviral assays, "Direct Inactivation", "End Point" and "Timing of Addition". The first aimed to determine whether treatments have action on the viral particles, destabilizing them or binding to them on an irreversible way. The second aims to determine whether the pure substances or those who are in extracts bind to cell receptors or other molecular structures causing lasting cellular changes. The third was carried out to determine the action of the compounds on four stages of the viral infective cycle, assessing whether they have antiviral action in specific stages of infection. The assay results showed that the maximum non-toxic concentrations obtained were respectively, 70, 100, 120, 110 and 70 μg/mL to quercetin, morin, rutin, cinnamic acid and monascus; 40, 40 and 90 μg/mL to extracts E1, E2, E3, respectively and 3.0% (v/v) to DMSO. In the tested concentrations, the DMSO didn’t cause significant variation in viral title in any of the assays, being, therefore, an inert compound. The rutin has not shown significant antiviral action in any of the tests. The extracts had greater antiviral potential against EHV-1 in vitro, followed by quercetin and morin. In the direct inactivation assay results, it was observed the action of three extracts, of quercetin and of morin. The E3 was the single to submit action in the assay ‘’End Point ". In the "Timing of Addition," all compounds showed antiviral action in at least one infection stage, except for rutin. Morin and monascus on adsorption, cinnamic acid on cell receptors and adsorption, quercetin and E2 during the adsorption and viral penetration phases, and E1 and E3 at all stages. The adsorption process was the most affected by compounds, suggesting action mainly on the viral particles and cell receptors, preventing infection initial stages. Possibly, there is in extracts a synergic effect resulted from action of more than one compound. With the results found in this work, we find that these compounds may have great importance in human and veterinary medicines for prevention and treatment of viral infections and for formulation of new medicines. / Dissertação antiga, liberada do sigilo via e-mail em 17/05/2016 pelo Dpto e Orientadora

Made available in DSpace on 2016-06-23T12:19:35Z (GMT). No. of bitstreams: 2 vanessa_costa_ioc_mest_2016.pdf: 1636709 bytes, checksum: f1482445c5dbfcfc935910c2f44a235f (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2016 / Made available in DSpace on 2016-07-05T23:52:48Z (GMT). No. of bitstreams: 3 vanessa_costa_ioc_mest_2016.pdf.txt: 178420 bytes, checksum: 70440b235431b251767ee3d5db881d5a (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) vanessa_costa_ioc_mest_2016.pdf: 1636709 bytes, checksum: f1482445c5dbfcfc935910c2f44a235f (MD5) Previous issue date: 2016 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto de Comunicação e Informação Científica e Tecnológica em Saúde. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Um dos fatores limitantes da eficácia da terapia antiviral no tratamento da infecção pelo vírus da Hepatite C (HCV) com o uso de inibidores de protease (IP) é o surgimento de resistência causada por mutações pontuais. Objetivo: Analisar a prevalência de mutações na região da serino-protease da NS3 associadas à resistência aos IP em pacientes infectados pelos subtipos 1a e 1b do HCV. Métodos: Extração de RNA viral, reação de PCR com primers específicos para cada subtipo e purificação seguida pela reação de sequenciamento nucleotídico foram realizadas. As sequências obtidas abrangendo os nucleotídeos 3466-3961 do genoma do HCV foram editadas no programa MEGA 6.0. As substituições observadas nas posições de aminoácidos associadas à resistência aos IP foram relacionadas após submissão ao site geno2pheno. Resultados: Um total de 65 amostras (Subtipo 1a: n=47; Subtipo 1b: n=18) de pacientes não-respondedores ao tratamento prévio por terapia dupla IFN/RBV (n=8) ou terapia tripla com IP boceprevir ou telaprevir (n=15) e virgens de tratamento (n=42) foram sequenciadas As mutações V36M/L e R155K foram observadas apenas no subtipo 1a, em 33,3% e 4,7% respectivamente, dos pacientes não-respondedores à terapia dupla/tripla. Em pacientes virgens de tratamento, a mutação V36M foi observada em uma (3,8%) sequência do subtipo 1a e a T54S em uma (6,25%) do subtipo 1b. A mutação Q80K associada à resistência ao Simeprevir não foi observada em nenhuma sequência do subtipo 1a neste estudo, porém foi detectada pela primeira vez no Brasil em uma sequência do subtipo 1b de paciente virgem de tratamento. Conclusão: Os dados desse trabalho destacam que os isolados brasileiros do HCV apresentam um padrão distinto de polimorfismos associados à resistência ao simeprevir em comparação a outros países, evidenciando que não há necessidade de incorporação de testes de resistência pré-tratamento para pacientes infectados por subtipos 1a e 1b do HCV / One of the limiting factors of the effectiveness of the antiviral therapy of hepatitis C virus (HCV) infection with the use of protease inhibitors (PI) is the emergence of resistance due to point mutations. Aim: To analyze the prevalence of mutations in the HCV NS3 serine protease associated with PI resistance in patients infected with subtypes 1a and 1b of HCV. Methods: Viral RNA extraction, PCR reactions with specific primers for each subtype and purification followed by nucleotide sequencing reaction were performed. The obtained sequences covering nucleotides 3466-3961 of the HCV genome were analyzed by MEGA 6.0 program. The substitutions observed in the amino acid positions associated with PI resistance were related after submission to the site geno2pheno. Results: A total of 65 samples (subtype 1a: n=47; subtype 1b: n=18) of non-responding patients to previous treatment by dual therapy IFN/RBV (n=8) or triple therapy with PI boceprevir or telaprevir (n=15) and treatment-naïve patients (n=42) were sequenced. V36M/L and R155K mutations were observed only in the subtype 1a, in 33.3% and 4.7%, respectively, of non-responders to double/triple therapy In treatment-naive patients, V36M mutation was observed in one (3.8%) sequence of subtype 1a and T54S in one (6.25%) of subtype 1b. The Q80K mutation associated with resistance to simeprevir was not observed in any sequence subtype 1a in this study, but was for the first time detected in Brazil in a subtype 1b sequence of a treatment-naive patient. Conclusion: Data from this study point out that the Brazilian isolates of HCV have a distinct pattern of polymorphisms associated with resistance to simeprevir in comparison to other countries, showing that there is no need to incorporate pretreatment resistance tests for infected patients with subtypes 1a and 1b of HCV

Orientadora: Profª Drª Helena Beatriz de Carvalho Ruthner Batista / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Biossistemas, 2017. / Apesar de ser uma das doenças mais antigas que se tem registro a raiva ainda é um desafio para a Saúde Pública. Esta zoonose acomete o sistema nervoso central (SNC) de todos os mamíferos sendo considerada fatal, porém foram registrados casos de cura no mundo que impulsionaram pesquisas na busca por potenciais mecanismos antivirais que atuem contra o vírus da raiva (RABV). O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito antiviral do extrato vegetal hidroetanólico derivado de Dalbergia variabilis contra diferentes linhagens do RABV. Inicialmente, foi determinada a concentração máxima tolerada (CMT) do extrato vegetal em células de neuroblastoma de murino (N2a), sendo 1,56 mg/ml identificada como CMT. A atividade antiviral do extrato vegetal derivado da Dalbergia variabilis foi avaliada pela diferença no título viral infeccioso expresso em doses infectantes em 50% do cultivo celular (DICC50), na presença e na ausência do extrato frente a quatro amostras de RABV (IP4005 - amostra de RABV com linhagem genética característica de morcego hematófago Desmodus rotundus, IP964 - amostra de RABV com linhagem genética característica de morcego insetívoro Eptesicus furinalis, IP4871 - amostra de RABV com linhagem genética característica de cachorro do mato Cerdocyon thous e amostra padrão do vírus da raiva "Pasteur vírus" - PV). Uma vez que houve diferença no título viral infeccioso entre as amostras de RABV analisadas na presença e na ausência do extrato vegetal, foram realizados experimentos subsequentes a fim de compreender melhor a forma de atuação deste extrato vegetal frente ao RABV. Foi possível identificar ação antiviral do extrato vegetal derivado de Dalbergia variabilis frente a amostras de RABV analisadas, através dos resultados obtidos, sendo que a interferência na replicação viral foi mais significativa frente a amostras de RABV com linhagem genética de morcegos. / Despite its status as one of the oldest registered diseases, rabies remains a public health challenge. This zoonosis affects the central nervous system (CNS) of all mammals and is usually considered fatal. However, some cases in which the disease was reportedly cured have been registered worldwide, leading to renewed interest in researching potential antiviral mechanisms against the rabies virus (RABV). The aim of this work was to evaluate the antiviral activity of the hydroethanolic plant extract Dalbergia variabilis against different genetic lineages of RABV. In the first step, the maximum tolerated concentration (MTC) of plant extract in murine neuroblastoma cells (N2a) was determined to be 1.56 mg/ml. The antiviral activity of plant extract Dalbergia variabilis was evaluated to determine the difference presence and absence of the plant extract in four samples of RABV (IP4005- sample of RABV with the genetic lineage characteristic of haematophagous bat, Desmodus rotundus; IP964- sample of RABV with the genetic lineage characteristic of insectivorous bat, Eptesicus furinalis; IP4871- sample of RABV with the genetic lineage characteristic of wild dog, Cerdocyon thous; and a standard sample of RABV, "Pasteur vírus" - PV). Since there was a difference in the infectious viral titer between the RABV samples analysed in the presence of the plant extract, subsequent experiments were carried out to better understand the performance of this plant extract against RABV. The antiviral activity of plant extract Dalbergia variabilis against samples of RABV was analysed, and the interference in viral replication was more significant against samples of RABV with genetic lineage characteristic of bats.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências da Saúde. Programa de Pós-Graduação em Farmácia / Made available in DSpace on 2013-07-15T23:11:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 231713.pdf: 1042022 bytes, checksum: 3bbc70817da6dd939072beccbaa98032 (MD5) / Passiflora edulis pertence a família Passifloraceae e é popularmente conhecida no Brasil, como maracujá. Há duas variedades de P. edulis: P. edulis Sims ou também P. edulis forma Sims (maracujá roxo) e P. edulis forma flavicarpa Degener (maracujá amarelo). Nesse trabalho, foi escolhida a espécie P. edulis f. flavicarpa como objeto de estudo. Essas espécies tem sido utilizadas na medicina popular principalmente como sedativas e calmantes. Foram analisados extratos das folhas, frutos e raízes de P. edulis. As análises cromatográficas indicaram a presença de flavonóides C-glicosídeos nas folhas e frutos de P. edulis. Nas raízes não foi identificada a presença de flavonóides C-glicosídeos. Nas folhas foi realizada a pesquisa de flavonóides e nas raízes foi investigada a presença de terpenóides e saponinas. O fracionamento de flavonóides C-glicosídeos no extrato metanólico das folhas resultou em duas sub-frações e possibilitou o isolamento de uma C-glicosilflavona, caracterizada através de técnicas espectroscópicas de RMN 1H e 13C. Predominam nas sub-frações as C-glicosilflavonas, vitexina, isovitexina, orientina e isoorientina. A partir da fração diclorometano das raízes, foram isoladas três substâncias. Uma dessas substâncias, codificada como SRI, foi elucidada como um triterpeno de núcleo urseno, através de medidas espectroscópicas de RMN 1H e 13C, DEPT, HETCOR, COSY e HMBC. O triterpeno foi identificado como 3 , 16 - diacetoxiurs-12-eno, substância não descrita previamente na literatura para as espécies do gênero Passiflora. A substância codificada como SRII foi identificada como sitosterol. Além disso, foi determinada a atividade antiinflamatória dos extratos aquosos liofilizados das folhas, pericarpo dos frutos maduros e raízes de P. edulis. O extrato das folhas (50, 100, 250 e 500 mg/Kg, i.p.), no modelo de pleurisia, induzida por carragenina, em camundongos, inibiu significativamente a migração de leucócitos. Os mesmos extratos foram avaliados em relação a potencial atividade antiviral. O extrato aquoso liofilizado das raízes apresentou valores de indíce de seletividae de IS = 6,21 e 11,8, respectivamente, para as cepas KOS e 29R (resistentes ao aciclovir), merecendo especial interesse para estudos posteriores visando a caracterização de frações ativas. Passiflora edulis is a member of the family Passifloraceae. It is populary know in Brazil as maracujá. Two types of P. edulis are grow commercially, the purple form (P. edulis Sims or also P. edulis forma Sims) and a yellow form (P. edulis forma flavicarpa Degener). This species have been used in medicine popular mainly as sedative and tranquilizer. In this work the P. edulis f. flavicarpa was researched. The phytochemical research was performed with the leaves, fruits and roots extracts. Chromatographic analyses on silica gel indicated flavonoids C-glycosides in the leaves and fruits extracts but not in the roots extracts. Fractionation of the leaves methanolic extract resulted in two sub-fractions and allowed the isolation of a C-glycosilflavon, identified on the basis of NMR - 1H e 13C spectral data. The main compounds identified in the sub-fractions were vitexin, isovitexin, orientin and isoorientin. From the dicloromethan fraction of the roots three compounds were isolated. The compound SRI was identified as a triterpenoid on the basis of NMR 1H and 13C, DEPT, HETCOR, COSY and HMBC, the 3 , 16 - diacetoxyurs-12-ene. This is the first report of this compound in Passiflora species. The compoud SRII was identified as sitosterol. Furthermore, the anti-inflammatory activities of the liophylized aqueous extracts obtained from the leaves, pericarp of the mature fruits and roots were evaluted in mouse model of pleurisy induced by carrageenan. The leaves extract (50, 100, 250 e 500 mg/Kg, i.p.), inhibited leukocyte migration. The antiviral potencial activity of the liophylized aqueous and hydroetanolic extracts obtained from the leaves, pericarp of the mature fruits and roots were evaluted. The results showed that the liophylized aqueous roots extract has antiviral activity with selectivity indices (SI=CC50/EC50) varying from 6,21 to 11,8, respectively, against KOS and 29R strains (aciclovir resistant). Further investigations are required to characterize the actives fractions.

Made available in DSpace on 2015-04-09T12:28:29Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-04-30Bitstream added on 2015-04-09T12:47:20Z : No. of bitstreams: 1 000808994_20150530.pdf: 370146 bytes, checksum: b57ece1272febc6027177478678bf29b (MD5) Bitstreams deleted on 2015-06-03T11:42:28Z: 000808994_20150530.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2015-06-03T11:44:00Z : No. of bitstreams: 1 000808994.pdf: 1388656 bytes, checksum: ff666b142c12af73f1f96183ae305879 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Embora novos medicamentos de ação direta anti-HCV tenham sido recentemente aprovados no mercado, com exceção do genótipo 1, a terapia mais utilizada ainda é baseada em Interferon (IFN) e Ribavirina. Desta forma, o genótipo 3 é o que apresenta mais baixa taxa de sucesso no tratamento, no atual cenário. Um dos fatores determinantes do insucesso deste tratamento no paciente é a variabilidade viral. O HCV apresenta alta taxa de mutação durante a replicação, implicando na produção de variantes intra-hospedeiro, denominadas quasispecies. A região hipervariável 1 (HVR1) da proteína do envelope é uma região de alta variabilidade do genoma viral. A detecção das quasispecies minoritárias pode ser realizada de forma confiável e eficiente por pirossequenciamento de alta cobertura (UPDS), técnica capaz de detectar variantes presentes em frequência <1% na população. Com base neste contexto, foram determinados quasispecies da HVR1-HCV de 14 pacientes infectados com o genótipo 3 do vírus, utilizando a técnica de UPDS. No total, 64.400 sequencias da HVR1 foram obtidas de amostras pré-tratamento. Destas, 27.398 sequências de alta qualidade foram filtradas e corrigidas. Valores de distância genética e entropia de Shannon não foram correlacionados a resposta ao tratamento. Estas sequências foram posteriormente submetidas a construção de redes median-joining e análise Bayesiana de estrutura populacional (BAPS). A análise identificou amostras com diferentes estruturas, desde altamente conservadas (apenas uma população de quasispecies) até altamente estratificadas (6 subpopulações). Este resultado foi condizente com a estrutura das redes median-joining. Várias mutações ao longo da HVR1 do mesmo paciente e algumas repetiram em pacientes do mesmo grupo de resposta. Quanto a avaliação de análise das sequências de aminoácidos, embora haja grande variação quanto a sequência e propriedades físico-químicas, pode-se ... / Hepatitis C is a major public health problem. New HCV antiviral drugs were released on market on 2010; however, excluding for genotype 1, the most used therapy used currently is still based on Interferon (IFN) and Ribavirin. Nowadays, genotype 3 is the one with the highest rate of treatment failure. Viral genome variability is one of the factors that lead in therapy failure. HCV presents a high mutability during replication course, implicating in arising of intra-host variants called quasispecies. The hypervariable region 1 (HVR1) from envelope protein presents as quasispecies and may be related to IFN therapy resistance. Resistant quasispecies may not represent majority of variants population in the host, therefore, in these cases traditional sequencing techniques are unable to detect. For detection of minority quasispecies, ultra-deep pyrosequencing (UPDS) is a reliable and efficient tool, being able to detect even variants with frequency <1% in the population. Regarding this issue, we determined HVR1 quasispecies from 14 patients infected with HCV genotype 3 using the UPDS approach. In total, 64,400 HVR1 sequences were obtained from pre-therapy sample. From these sequences, 27,398 ones with high quality were filtered. Genetic distance and Shannon entropy values were not related to therapy outcome. These sequences were analyzed using median-joining networks and Bayesian population structural analysis. These analysis identified samples with different structures, from high conserved (one sub-population) to high stratified ones (6 sub-populations). Networks analysis also confirmed this result. Mutations exclusive for a type of response of therapy were identified along HVR1. Amino acid sequences indicated that this region presents conserved structure, even if sequence and physical and chemicals properties seem flexible. Especially in turns and coils positions, this conservation seems notable. Potential epitopes positions are concentrated ...

Made available in DSpace on 2014-11-10T11:09:55Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-08-04Bitstream added on 2014-11-10T11:57:43Z : No. of bitstreams: 1 000791002_20160804.pdf: 831737 bytes, checksum: 6d599cf0a39dfb64c011d1df5972e520 (MD5) Bitstreams deleted on 2016-08-05T12:20:23Z: 000791002_20160804.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2016-08-05T12:20:58Z : No. of bitstreams: 1 000791002.pdf: 2689653 bytes, checksum: be72cf076309570a9dea496746ea9be2 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / A hepatite C é a inflamação do fígado decorrente da infecção pelo vírus da hepatite C (HCV), frequentemente evolui para quadros crônicos, sendo considerada mundialmente a maior causa de cirrose e carcinoma hepatocelular. O tratamento padrão com PEG-IFN e ribavirina não é efetivo contra alguns genótipos do HCV, possui alto custo e efeitos colaterais severos. Portanto, novos tratamentos vêm sendo buscados. A cafeína vem sendo associada a um efeito benéfico sobre várias doenças hepáticas incluindo a melhora da bioquímica anormal do fígado, cirrose e carcinoma hepatocelular. A cafeína atua diretamente desacelerando a progressão da fibrose, além de melhorar a função de vias celulares hepáticas, dentre elas vias utilizadas durante o ciclo replicativo do HCV. Embora a cafeína tenha demonstrado efetividade no controle de doenças hepáticas e interação direta com vias celulares utilizadas pelo HCV, não há na literatura correlação direta entre o efeito da cafeína e as etapas do ciclo replicativo do HCV. Assim, o presente estudo propôs estabelecer a relação direta entre a cafeína e sua capacidade inibitória sobre as diferentes etapas do ciclo replicativo completo do HCV. Para esse estudo foram utilizados o replicon subgenômico SGR-JFH-FEO, os replicons completos FL-J6/JFH-5′C19Rluc2AUbi e JFH-1 e a linhagem celular Huh-7.5. A expressão viral foi avaliada por ensaios de Luciferase, Western Blotting, Imunofluorescencia indireta e qPCR. A cafeína demonstrou inibição da replicação viral em todos os níveis avaliados, apresentando IC50 de 0.7263 mM e atingindo em concentrações seguras, inibição máxima da replicação de HCVcc em torno de 79 %. A cafeína demonstrou ainda inibição de 30 % sobre a entrada quando aplicada em conjunto ao sobrenadante infeccioso. Entretanto, essa inibição dobra quando há a exposição das partículas à cafeína previamente à introdução em cultura de células, ... / Hepatitis C is the liver inflammation arising from hepatitis C virus (HCV) infection, often evolves to chronic conditions and has been considered the major world cause of cirrhosis and hepatocellular carcinoma. Standard treatment using PEG-IFN and ribavirin is not effective against some HCV genotypes, besides that it has high cost and severe side-effects. Therefore, new treatments have been sought. Caffeine has been found to have beneficial effect in several liver disorders, including the improvement of abnormal liver biochemistry, cirrhosis and hepatocellular carcinoma. Caffeine acts directly by delaying fibrosis, beyond improving the function of liver cellular pathways and interfering with pathways used by the HCV replication cycle. Although, the caffeine showed positive effects for liver disorders and a direct interaction with cell pathways used by HCV, there is no evidence of a direct correlation between caffeine and HCV replication cycle. Thus, the current study proposed to establish the direct relationship between caffeine and different steps of HCV replication cycle. To this study, it was used the subgenomic replicon SGR-JFH-FEO, the full-length replicons FL-J6/JFH-5′C19Rluc2AUbi and JFH-1; and Huh-7.5 cell line. The viral expression was evaluated by Luciferase, Western blotting, Indirect immunofluorescence and qPCR. The caffeine demonstrated to be able to inhibit viral replication on different stages of viral replication, demonstrating an IC50 value of 0.7263 mM and reaching on safe concentrations, HCVcc maximal replication inhibition around 79 %. Caffeine demonstrated also 30 % of inhibition on viral entry on host cells when tested in combination with infectious supernatant. Moreover, this inhibition increased two fold when particles were exposed to caffeine before introduction on cell culture, possibly, indicating an interaction between caffeine and viral proteins. On the other hand, there is no influence of caffeine on viral ...

Orientador: Luis Octavio Regasini / Coorientadora: Paula Rahal / Banca: Rafaela Salgado Ferreira / Banca: Fatima Pereira de Souza / Resumo: Chalconas são flavonoides de cadeia aberta, apresentam diversas atividades biológicas e podem ser sintetizadas por várias metodologias, principalmente pela condensação de Claisen-Schmidt. A Hepatite C se apresenta como uma doença de grande incidência na população mundial, e dependendo de seu grau, pode levar a carcinoma hepatocelular. A paracocidioidomicose, uma micose sistêmica causada por Paracoccidioides brasiliensis, tem grande incidência no Brasil, principalmente em pessoas imunodeprimidas, sua forma aguda pode levar a comprometimentos de órgãos como baço e fígado. A mieloperoxidase (MPO) é uma enzima essencial na resposta imune contra a invasão de patógenos. No estresse oxidativo a atividade clorinante de MPO tem um aspecto negativo, pois está correlacionada a disfunções endoteliais. O presente trabalho teve como objetivo a síntese de três séries de aminochalconas e seus análogos arílicos, com grupos amino nas posições 2', 3' e 4' (anel A), substituintes doadores e aceptores de elétrons no anel B. A fim de avaliar seus efeitos de acordo com as posições dos grupos amino e do bioisosterismo de anel, essas substâncias foram testadas quanto à capacidade de inibição de replicação do HCV, de inibição do crescimento de P. brasiliensis, e da inibição da atividade clorinante de MPO. As substâncias foram sintetizadas com rendimentos altos, uma vez que para 79% das substâncias foram superiores a 75%. A substância LQVM 22 foi capaz de inibir a replicação do HCV em 41%, a 2 µmol L-1. As substâncias LQVM 16 e LQVM 17 demonstraram potente atividade anti-P. brasiliensis, exibindo valores de CIM90 de 0,49 µg mL-1. A substância LQVM 20 foi um potente inibidor da atividade clorinante de MPO, apresentando CI50 de 0,34 µmol L-1. Nossos estudos químicos e biológicos de aminochalconas e seus análogos arílicos conduziram a descoberta de hits, valiosos protótipos... / Abstract: Chalcones are open chain flavonoids. They show a broad range of biological activities. These compounds can be synthesized by several methodologies, mainly by ClaisenSchmidt condensation. Hepatitis C is a disease of great incidence in worldwide population, and according to its severity can lead to hepatocellular carcinoma. Paracoccidioidomycosis is a systemic mycosis caused by Paracoccidioides brasiliensis, and has a great incidence in Brazil, in imunodefficient pacients, its acute form can lead to commitment of organs such as spleen and liver. Myeloperoxidase (MPO) is an essential enzyme in imune response against patogen invasion. However, the MPO activity has been correlated with some endotelial disfunctions. The present work aimed the synthesis of three series of aminochalcones and the aryl analogues, with amino group at positions 2', 3' and 4' (ring A), and with donors and withdraw electron substituents on B ring. In order to evaluate the effects of the different positions of amino groups and the ring bioisosterism, these substances were evaluated for the inhibition of HCV replication, P. brasiliensis growth and clorinating MPO activity. The substances were synthesised with high yields, once 79% showed yield above 75%. Compound LQVM 22 was able to inhibit HCV replication in 41 %, at 2 µmol L-1. Compounds LQVM-16 and LQVM-17 demonstrated potent anti-P. brasiliensis activity, exhibiting MIC90 values of 0,49 µg mL-1. Compound LQVM-20 was the potentest inhibitor of MPO chlorinate activity, showing IC50 of 0,34 µmol L-1.Our chemical and biological studies of aminochalcones, and their aryl analogues led to the discovery of hits, which are valuable prototypes to developing of innovatives therapeutical agents... / Mestre

Orientador: Paula Rahal / Coorientador: Yury Khudyakov / Banca: Ana Carolina Gomes Jardim / Banca: Isabel Maria Vicente Guedes de Carvalho Mello Membro / Banca: Camila Malta Romano / Banca: Paola Jocelan Scarin Provazzi Trabulsi / Banca: Cintia Bittar / Resumo: Embora novos medicamentos de ação direta anti-HCV tenham sido recentemente aprovados no mercado, com exceção do genótipo 1, a terapia mais utilizada ainda é baseada em Interferon (IFN) e Ribavirina. Desta forma, o genótipo 3 é o que apresenta mais baixa taxa de sucesso no tratamento, no atual cenário. Um dos fatores determinantes do insucesso deste tratamento no paciente é a variabilidade viral. O HCV apresenta alta taxa de mutação durante a replicação, implicando na produção de variantes intra-hospedeiro, denominadas quasispecies. A região hipervariável 1 (HVR1) da proteína do envelope é uma região de alta variabilidade do genoma viral. A detecção das quasispecies minoritárias pode ser realizada de forma confiável e eficiente por pirossequenciamento de alta cobertura (UPDS), técnica capaz de detectar variantes presentes em frequência <1% na população. Com base neste contexto, foram determinados quasispecies da HVR1-HCV de 14 pacientes infectados com o genótipo 3 do vírus, utilizando a técnica de UPDS. No total, 64.400 sequencias da HVR1 foram obtidas de amostras pré-tratamento. Destas, 27.398 sequências de alta qualidade foram filtradas e corrigidas. Valores de distância genética e entropia de Shannon não foram correlacionados a resposta ao tratamento. Estas sequências foram posteriormente submetidas a construção de redes median-joining e análise Bayesiana de estrutura populacional (BAPS). A análise identificou amostras com diferentes estruturas, desde altamente conservadas (apenas uma população de quasispecies) até altamente estratificadas (6 subpopulações). Este resultado foi condizente com a estrutura das redes median-joining. Várias mutações ao longo da HVR1 do mesmo paciente e algumas repetiram em pacientes do mesmo grupo de resposta. Quanto a avaliação de análise das sequências de aminoácidos, embora haja grande variação quanto a sequência e propriedades físico-químicas, pode-se ... / Abstract: Hepatitis C is a major public health problem. New HCV antiviral drugs were released on market on 2010; however, excluding for genotype 1, the most used therapy used currently is still based on Interferon (IFN) and Ribavirin. Nowadays, genotype 3 is the one with the highest rate of treatment failure. Viral genome variability is one of the factors that lead in therapy failure. HCV presents a high mutability during replication course, implicating in arising of intra-host variants called quasispecies. The hypervariable region 1 (HVR1) from envelope protein presents as quasispecies and may be related to IFN therapy resistance. Resistant quasispecies may not represent majority of variants population in the host, therefore, in these cases traditional sequencing techniques are unable to detect. For detection of minority quasispecies, ultra-deep pyrosequencing (UPDS) is a reliable and efficient tool, being able to detect even variants with frequency <1% in the population. Regarding this issue, we determined HVR1 quasispecies from 14 patients infected with HCV genotype 3 using the UPDS approach. In total, 64,400 HVR1 sequences were obtained from pre-therapy sample. From these sequences, 27,398 ones with high quality were filtered. Genetic distance and Shannon entropy values were not related to therapy outcome. These sequences were analyzed using median-joining networks and Bayesian population structural analysis. These analysis identified samples with different structures, from high conserved (one sub-population) to high stratified ones (6 sub-populations). Networks analysis also confirmed this result. Mutations exclusive for a type of response of therapy were identified along HVR1. Amino acid sequences indicated that this region presents conserved structure, even if sequence and physical and chemicals properties seem flexible. Especially in turns and coils positions, this conservation seems notable. Potential epitopes positions are concentrated ... / Doutor

Orientador: Giovanni Faria Silva / Coorientador: Marjorie de Assis Golim / Resumo: A hepatite C é uma doença infecciosa que torna-se crônica em cerca de 85% dos infectadosque poderão desenvolver cirrose e carcinoma hepato celular. O tratamento antiviral em muitosdos pacientes não é eficaz, principalmente quando estes portam o genótipo 1 e fibroseavançada, a resposta inflamatória também desempenha seu papel sobre a resposta virológicasustentada (RVS) durante o tratamento com Interferon Peguilado (PegIFN) associado aRibavirina (RBV). Nesse estudo nosso objetivo principal foi avaliar a influência da respostainflamatória através de células e citocinas/quimiocinas sobre a resposta virológica do pacienteem tratamento antiviral com terapia tripla. Incluimos pacientes com RNA VHC+, nuncatratados (naive), portadores do genótipo 1, ambos os sexos e com fibrose avançada F3 (n=6);F4 (n=21) candidatos ao tratamento em regime triplo. Os pacientes tiveram suas amostrascoletadas e analizadas nas semanas 0 e 12 do tratamento e os seguintes parâmetros foramanalisados: IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-17A, TNF-α, IFN-γ, RANTES, MCP-1, MIG, IP-10, através de citometria de fluxo (método CBA). Foram incluídos 15 voluntários saudáveis(grupo controle) e 27 pacientes que foram separados em G1(RVS) e G2 (não RVS), a taxa deRVS foi de 63%. Os pacientes com hepatite C crônica tiveram os níveis circulantes de IP10,MCP-1, MIG, RANTES, IL-8 e IL-6 mais elevados quando comparados com voluntáriossaudáveis, quando comparados G1xG2 os níveis de RANTES (p=0,04... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Mestre

Orientador: Paula Rahal / Coorientador: Cintia Bittar Oliva / Coorientador: Ana Carolina Gomes Jardim / Banca: Ana Carolina Bernardes Terzian / Banca: Paola Jocelan Scarin Provazzi / Resumo: A Hepatite C, causada pelo vírus da Hepatite C (HCV), afeta cerca de 170 milhões de pessoas em todo o mundo. O HCV pertence à família Flaviviridae e gênero Hepacivirus, possuí genoma de RNA fita simples de polaridade positiva que codifica uma poliproteína posteriormente clivada por proteases virais e do hospedeiro, resultando em 10 proteínas virais. O tratamento atual, baseado na administração de Interferon e dos novos antivirais de ação direta, possuí um alto custo e a resposta virológica sustentada varia de acordo com o genótipo viral. Acridonas, um grupo de compostos extraído de fontes naturais, mostrou potencial ação antiviral contra o HCV, entretanto sua possível atividade antiviral foi pouco explorada em cultura de células. Dessa forma, esse estudo visou avaliar a influência de 14 acridonas sintéticas no ciclo replicativo do HCV. Os compostos foram triados utilizando a linhagem celular Huh 7.5 expressando estavelmente o replicon subgenômico SGR-JFH1-FEO. Células foram incubadas na presença e ausência de compostos por 72 horas. Viabilidade celular e níveis de replicação foram obtidos por ensaios de MTT e expressão de luciferase, respectivamente. A acridona Fac4 apresentou uma inibição de replicação de aproximadamente 90 % a 50 µM, com 100 % de viabilidade celular. O Fac4 foi selecionado para a realização dos experimentos seguintes. O efeito de Fac4 nas etapas de replicação e entrada viral foi avaliado em células Huh 7.5 infectadas com partículas virais de HCV JFH1 produzidas em laboratório (HCVcc). Fac4 inibiu a replicação do JFH1 em aproximadamente 70 %, enquanto que na etapa de entrada nenhum efeito foi observado. A expressão da proteína viral NS5A foi avaliada pelo ensaio de Western Blotting e não foi detectada na amostra tratada com Fac4, corroborando os resultados anteriores. Apesar desses resultados, nenhum efeito inibitório... / Abstract: Hepatitis C, caused by Hepatitis C Virus (HCV), affects about 170 million people worldwide. HCV belongs to Flaviviridae family and Hepacivirus genus, has a positive single stranded RNA genome that codifies a polyprotein, which is cleaved by host and viral proteases, resulting in 10 viral proteins. The current treatment, based on Interferon and the new Direct Acting Antivirals, has a high cost and variable response rates according to the virus genotype. Acridones, a group of compounds extracted from natural sources, showed potential antiviral actions against HCV, however their possible antiviral activity have been poorly explored in cell culture. Thus, this study aimed to evaluate the influence of a panel of 14 synthetic acridones on HCV life cycle. The compounds were screened using Huh 7.5 cell line expressing the HCV subgenomic replicon SGR-JFH1-FEO. Cells were incubated in the presence and absence of compounds for 72 hours. Cell viability and replication levels were accessed by MTT and luciferase assays, respectively. The Acridone Fac4 presented a replication inhibition of approximately 90 % at 50 µM and 100 % of cell viability and was selected for the follow-up experiments. The effect of Fac4 was evaluated in the replication and entry steps using Huh 7.5 cells infected with viral particles from JFH-1 strain produced in laboratory (HCVcc). Fac4 inhibited the replication of JFH-1 by approximately 70 %, while no effect was observed on virus entry. The expression of the viral protein NS5A was evaluated by Western Blotting assay and was undetectable in Fac4 treated sample, corroborating previous results. Despite these results, no inhibitory effect was observed against genotype 3 replication. Some acridones are known to intercalate in dsRNA molecules, which are replication intermediates, disrupting replication. We performed a dsRNA intercalation assay in order to test if this ... / Mestre