Orientadores: Clarice Weis Arns, Luciana Konecny Kohn / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-22T17:08:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Sakata_SoniaTatsumi_M.pdf: 14113239 bytes, checksum: 26dfdfbc0c87c2a3a37c6143072df6c6 (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: Produtos naturais isolados a partir de invertebrados e organismos marinhos tem sido objeto de pesquisas contínuas ao longo dos últimos cinquenta anos, principalmente devido à sua complexidade estrutural e potentes atividades biológicas. O presente trabalho teve como proposta ampliar e aprofundar a investigação de substâncias bioativas em extratos de organismos marinhos, junto ao IQSC-USP/Projeto temático, realizando bioensaios de atividade antiviral no laboratório de virologia da Unicamp. Com o objetivo de realizar uma triagem para pesquisar substâncias com ação antiviral, foram eleitas duas espécies de vírus de destaque na avicultura, o Metapneumovirus aviário (aMPV) e o vírus da Doença de Newcastle (NDV), representantes da família Paramyxoviridae. As propriedades em comum dos vírus dentro das respectivas subfamílias, como a organização genômica, sequências das proteínas e suas atividades biológicas, permitem a utilização do aMPV como modelo de estudo para importantes agentes infecciosos da subfamília Pneumovirinae, e o NDV da subfamília Paramyxovirinae. Para a triagem de compostos antivirais foi realizada a avaliação in vitro na linhagem celular Chicken Embryo Related (CER) para a propagação dos vírus e analisar os resultados de inibição viral frente a diferentes extratos e substâncias. Dos cento e vinte e cinco extratos testados frente ao aMPV, sete demonstraram ser ativos, e seis com alto potencial antiviral. Inicialmente, cento e quarenta e sete extratos foram testados frente ao NDV, porém, o resultado foi inconclusivo devido a problema com o título da amostra viral. Assim, os sete extratos ativos e os seis com alto potencial antiviral contra o aMPV foram testados quanto à capacidade de inibição do NDV. Apesar das similaridades dos vírus da família Paramyxoviridae, os extratos não tiveram atividade contra o NDV, como ocorreu frente ao aMPV. As amostras ativas foram estudadas em três tipos de tratamento a fim de determinar os possíveis mecanismos de ação dos extratos: Pré-tratamento, fases de adsorção e/ou penetração do vírus na célula; Pós-tratamento, etapas intracelulares de replicação do vírus; e Inativação Viral. Pela análise visual do efeito citopático, os sete extratos ativos contra aMPV, quatro interrompem as etapas intracelulares de replicação do vírus, dois agem nas fases de adsorção e/ou penetração do vírus à célula, e um não tinha quantidade suficiente para realizar o teste. Com a finalidade de avaliar os possíveis mecanismos de ação com maior objetividade, menor risco de contaminação e alta especificidade, testou-se a metodologia de reação em cadeia da polimerase (PCR) em tempo real. Utilizando um composto puro (pirocina A) frente ao aMPV em CER, a metodologia se demonstrou eficiente. Esse dado foi confirmando pela diminuição de RNA viral quando ocorre a atividade antiviral, dando indícios de atuação do composto em etapas intracelulares de replicação do aMPV. A detecção de extratos com atividade antiviral nas situações testadas neste trabalho corrobora o valor da biodiversidade marinha como fonte de produtos promissores na terapêutica de enfermidades virais. Portanto, a necessidade de estudos sobre esses vírus e do desenvolvimento de novos insumos a serem utilizados nos seus controles é de grande importância ponderado a crescente projeção da indústria avícola brasileira no comércio mundial / Abstract: Natural products isolated from invertebrates and marine organisms have been studied over the past fifty years, mainly due to their structural complexity and potent biological activities. This project was proposed to broaden and deepen the research of bioactive substances in extracts of marine organisms, with the IQSC-USP group, performing bioassays antiviral activity in the laboratory of virology at Unicamp. In order to perform a screening to search antiviral substances were elected two species prominent in poultry, the avian Metapneumovirus (aMPV) and Newcastle disease virus (NDV), representatives of the family Paramyxoviridae. The common properties of the virus within their respective subfamilies, such as genomic organization, sequences of proteins and their biological activities, allow the use of aMPV as a study model for important infectious agents of Pneumovirinae subfamily, and NDV Paramyxovirinae subfamily. For antiviral screening, compounds were tested in vitro using Chicken Embryo Related (CER) cell lineage for the propagation of the virus and analyze the results of viral inhibition against various substances. Among one hundred twenty five extracts tested against aMPV, seven were actives and six have been shown high antiviral potential against the virus. Initially, one hundred fourty seven extracts were tested against NDV. However, the result was inconclusive due to problems with the titer of the viral sample. Thus, the seven active extracts and six extracts with high antiviral potential against the aMPV were tested for the ability to inhibit NDV. Despite the similarities of viruses of the family Paramyxoviridae, the extracts had no activity against NDV, as occurred against aMPV. The active samples were studied in three types of treatment in order to determine the possible mechanisms of action of the extracts: Pre-treatment, stages of adsorption and / or penetration of the virus into the cell; Post-treatment, intracellular steps of virus replication; and Viral Inactivation. At visual analysis of cytopathic effect, from all 7 extracts active against aMPV, 4 disrupt intracellular steps of virus replication, 2 acts on adsorption and / or penetration stages of the virus into the cell, and 1 was not enough to perform the test. In order to assess the possible mechanisms of action more objectively, lower contamination risk and high specificity, the polymerase chain reaction (PCR) in real time methodology was tested. Using a pure compound (pirocina A) against aMPV in CER cell lineage, the methodology is demonstrated efficient. This was confirmed by the decrease of viral RNA when occurs antiviral activity, an evidence of compound's action on intracellular steps of aMPV replication. The detection of extracts with antiviral activity in this study confirms the value of marine biodiversity as a source of promising products in the viral diseases therapeutic. Therefore, the primordiality for more studies and the development of new inputs to control these viruses is extremely important to increasing of Brazilian poultry industry in world trade / Mestrado / Microbiologia / Mestra em Genética e Biologia Molecular

Orientador: Clarice Weis Arns / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-19T02:57:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Barros_AlyneVieira_M.pdf: 608733 bytes, checksum: 93e4d814c0f99c65741a343e76d35fc4 (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: Estudos de plantas medicinais com conhecimento tradicional têm sido uma fonte potencial de substâncias com atividades farmacológicas e biológicas significantes. Guettarda angelica Mart. ex Müll. Arg. (Rubiaceae) é uma planta medicinal no qual suas raízes são popularmente utilizadas para diversos fins terapêuticos, incluindo veterinário. Estudos antimicrobianos com raízes desta planta também relataram uma atividade in vitro contra bactérias. Como as infecções virais ainda continuam sendo um sério problema mundial, a etnofarmacologia fornece uma abordagem alternativa para descoberta de novos agentes antivirais. O objetivo do presente trabalho foi o estudo antiviral de extratos da casca das raízes, folhas e sementes de G. angelica frente aos herpesvírus bovino (BoHV-1), suíno (SuHV-1) e equino (EHV-1), reovírus (ARV) e metapneumovírus aviário (aMPV). A atividade antiviral foi testada in vitro em células Vero e MDBK utilizando os ensaios de redução do título viral e o ensaio quantitativo colorimétrico através do MTT. Inicialmente, a concentração máxima não-citotóxica (MNCC) dos extratos foi determinada nas células através da observação de suas alterações morfológicas. Estudos realizados através da redução dos títulos virais mostrou que apenas o extrato aquoso de sementes (AEs) apresentou uma atividade antiviral contra o BoHV-1, SuHV-1, EHV-1 e ARV. Assim, esse extrato foi posteriormente avaliado pelo método MTT para determinação do CC50 (concentração citotóxica a 50%), IC50 (concentração inibitória a 50%) e o SI (índice de seletividade). Os valores de CC50 do extrato AEs foram 400,60 e 920,50 para células Vero e MDBK, respectivamente. E os valores de IC50 e SI foram 22, 79 e 40,39 para BoHV-1; 91,30 e 10,08 para SuHV-1; 19,95 e 20,08 para EHV-1; e 23,59 e 17,00 para ARV. Esses resultados indicam que a semente de G. angelica contém compostos com atividade antiviral promissora e baixa toxicidade / Abstract: Study of medicinal plants with traditional knowledge has been a potential source of substances with significant pharmacological and biological activities. Guettarda angelica M. (Rubiaceae) is a medicinal plant where its roots are popularly used for various therapeutic purposes including veterinary. In vitro antimicrobial studies also related antibacterial activity of these roots against bacteria. Like viral infections still remain a serious worldwide problem, the ethnopharmacology provides an alternative approach for discovery of new antiviral agents. The aim of the present work was the antiviral study of extracts from roots bark, leaves and seeds of G. angelica against bovine (BoHV-1), swine (SuHV-1) and equine (EHV-1) herpesviruses, avian reovirus (ARV) and metapneumovirus (aMPV) The antiviral activity was tested in vitro on Vero and MDBK cells using the viral titer assay and the quantitative colorimetric assay through MTT. Initially, the maximum non-citotoxic concentration (MNCC) of extracts was determined in cells by observation of their morphological alterations. Studies through the reduction of viral titers showed that only the aqueous extract from seeds (AEs) presented an antiviral activity against BoHV-1, SuHV-1, EHV-1 and ARV. Then, this extract was further evaluated by MTT method to determine the CC50 (50% cytotoxic concentration), IC50 (50% inhibitory concentration) and SI (selectivity index). The values of CC50 of AEs extract were 400.60 and 920.60 to Vero and MDBK cells, respectively. And the values of IC50 and SI were 22.79 and 40.39 for BoHV-1; 91.30 e 10.08 for SuHV-1; 19.95 and 20.08 for EHV-1; 23.59 and 17.00 for ARV. These results indicate that the seeds from G. angelica contain composts with promising antiviral activity and low toxicity / Mestrado / Ciencias Basicas / Mestre em Clinica Medica

Introdução: A adesão ao tratamento da hepatite B crônica na vida real tem sido pouco estudada em todo o mundo. Neste estudo, foram avaliados os desfechos virológicos e de adesão ao tratamento antiviral de longo prazo em pacientes monoinfectados com hepatite B crônica. Métodos: Trata-se de um estudo prospectivo de coorte com pacientes portadores de hepatite B crônica (n = 183), tratados com adefovir, entecavir, lamivudina e / ou tenofovir, realizado em um centro de referência terciário brasileiro. A adesão ao tratamento foi avaliada por um questionário validado, denominado CEAT-HBV, em três momentos (2010/2011, 2013/2014 e 2014/2015). As variantes de resistência às drogas para hepatite B e a farmacocinética de um único ponto foram determinadas por sequenciamento e cromatografia líquida com espectrômetro de massa em tandem, respectivamente. Resultados: CEAT-HBV identificou 79/183 (43%) pacientes em não-adesão ao tratamento antiviral e entre esses, 53/79 (67%) tinham maior frequência de HBV DNA positiva. Porém, 38% (70/183) tiveram carga viral positiva sugerindo não resposta ao tratamento. As mais frequentes variantes de resistência aos antivirais foram M204I/V (78%), L180M (59%), L80I (15%), V173L (7%) e Q215H (6%). As principais causas associadas com a ausência de resposta ao tratamento antiviral foram variantes de resistência às drogas (39%), variantes de resistência às drogas e não adesão (23%), não adesão (13%), duração de tratamento insuficiente (10%), e indeterminada (16%). A farmacocinética de dose única indicou 48% (31/65) de não adesão ao antiviral. Dois anos depois da primeira avaliação, o CEAT-HBV indicou que 101/143 (71%) pacientes estavam em adesão ao tratamento, baseado na análise da população per-protocol. Entretanto, 21% (40/183) dos pacientes não puderam ser avaliados e foram excluídos. As principais razões para exclusão foram óbito (20/183), 11 dos 20 óbitos causados pelo carcinoma hepatocelular, perda de seguimento (16/183) e outras (4/183). Todos os participantes receberam nesse momento uma cartilha para orientação do tratamento. A terceira avaliação do CEAT-HBV (2014/2015) mostrou que 112/135 (83%) pacientes estavam em adesão ao tratamento (população per-protocol) e 8/143 (6%) foram excluídos. Desfechos de longo prazo mostraram que a taxa de adesão baseado no CEAT-HBV continua a aumentar após 4 anos (p < 0,001). Conclusões: Nossos dados realçam a importância do monitoramento da avaliação de adesão à terapia para hepatite B crônica. Desfechos de adesão de longo prazo podem ser dinâmicos e é possível aumentar a taxa de migração para o grupo com adesão/HBV DNA negativa / Background: Chronic hepatitis B (CHB) real-life treatment adherence has been poorly studied worldwide. In this study, it was evaluated long term virological and adherence outcomes regarding antiviral treatment in monoinfected CHB patients. Methods: A prospective cohort study with CHB patients (n=183) treated with adefovir, entecavir, lamivudine and / or tenofovir was performed in a Brazilian reference tertiary center. Treatment adherence was evaluated by a validate questionnaire named CEAT-HBV within three year-periods (2010/2011, 2013/2014 and 2014/2015). HBV drug resistance variants and single-dose pharmacokinetics were determined by sequencing and LC-MS/MS, respectively. Results: CEAT-HBV identified 79/183 (43%) patients with non-adherence to antiviral treatment and among them, 53/79 (67%) were more frequently viral load positive. However, 38% (70/183) had positive viral loads suggesting treatment non-response. Most frequent antiviral resistance variants were M204I/V (78%), L180M (59%), L80I (15%), V173L (7%) and Q215H (6%). The main causes associated with nonresponse to antiviral treatment were drug resistance variants (39%), drug resistance variants and nonadherence together (23%), non-adherence (13%), insufficient treatment duration (10%), and undetermined (16%). Single-dose pharmacokinetics indicated 48% (31/65) antiviral non-adherence. Two years after the first assessment, the CEATHBV indicated that 101/143 (71%) patients were adhered treatment, on basis of an analysis of the per-protocol population. However, 21% (40/183) of the patients could not be evaluated and were excluded. The main reasons for exclusion were death (20/183), 11 out 20 deaths due to hepatocellular carcinoma, loss to follow up (16/183) and others (4/183). HBV booklet was used for medical education. The third CEAT-HBV assessment (2014/2015) showed that 112/135 (83%) patients were on treatment adherence (per-protocol population) and 8/143 (6%) were excluded. Longterm evaluation showed that adherence rate based on CEAT-HBV continue to increase after 4-years (p < 0.001). Conclusions: Our data highlights the importance of CHB therapy adherence assessment monitoring. Long-term adherence outcomes may be dynamic and it is possible to increase the migration rate to adherence/HBV DNA negative group

Orientador: Alvaro de Baptista Neto / Banca: Alberto Colli Badino Junior / Banca: Fernando Lucas Primo / Resumo: Com o desenvolvimento da indústria moderna, houve o aumento na utilização de colorantes artificiais em diferentes áreas, entre elas destaca-se o setor alimentício e farmacêutico. Com a utilização contínua desses colorantes no ramo alimentício foi verificado, dependendo da classe e da concentração, o grande potencial desses compostos causarem diversas doenças, dentre elas o câncer. Com isso, é possível observar um crescente desenvolvimento de tecnologias que visam à obtenção de processos de produção de colorantes naturais, de origem biológica, que são considerados mais saudáveis e menos nocivos à saúde humana. Nesse contexto, as antraquinonas, se destacam por possuírem compostos que podem ser utilizados como colorante natural. Há muitos trabalhos na literatura destacando diversas ações desses compostos naturais, como por exemplo, atividade hepatoprotetora, anticancerígena, antimicrobiana, antifúngica, antiviral, antidiabética, antioxidante, entre outras. Nesse sentido, visto a grande importância de colorantes naturais pertencentes ao grupo das antraquinonas, o presente trabalho teve como objetivo desenvolver métodos para extração e quantificação de um colorante natural pertencente à classe das antraquinonas, e os resultados foram satisfatórios. Foi possível determinar o processo de purificação e extração através de cromatografia de adsorção, utilizando como adsorvente a resina IRA-410 e como eluente solução de Cloreto de Sódio 5,0% e Etanol PA, onde foi possível obter uma recu... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: With modern industry development, the use of artificial colors in different areas has increased, among them, the alimentary segment. With the continuous use of these dyes in the food industry, it was verified that depending on the class and concentration, there's a huge potential of these compounds cause various diseases, among them cancer. With this, it is possible to observe a growing development of technologies that aim at obtaining biological origin natural dyes production processes, that are considered healthier and less harmful to human health. In this context, the anthraquinones, stand out because they have compounds that can be used as a natural dye. There are many works in the literature highlighting several actions of these natural compounds, such as hepatoprotective, anticancer, antimicrobial, antifungal, antiviral, antidiabetic, antioxidant, among others activities. In this sense, given the great importance of natural dyes belonging to the quinones group, the present work aimed to develop methods for extracting and quantifying a natural dye belonging to the class of anthraquinones, and the results were satisfactory. It was possible to determine the purification and extraction process by adsorption chromatography using as adsorbent IRA-410 resin and as eluent 5.0% Sodium Chloride solution and Ethanol PA, where it was possible to obtain a recovery of 100% and a yield of 86% when the fixed bed tests were performed, obtaining a promising method for determining the con... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Métodos in vitro utilizando epitélio intestinal animal são importantes ferramentas para avaliar a permeabilidade de fármacos, propriedade que é um importante parâmetro de biodiosponibilidade. Considerando que o maior objetivo na indústria farmacêutica é desenvolver novos fármacos com boa biodisponibilidade oral, o projeto teve como objetivo padronizar o modelo de permeação com membrana de intestino de rã (Rana catesbeiana) em células de Franz, comparando seus resultados com ensaios de células Caco-2. Os fármacos modelo utilizados foram os antivirais zidovudina e aciclovir. A quantidade de fármaco permeado foi determinada por método de eletroforese capilar para o método com intestino de rã touro e por HPLC-UV para os ensaios com células Caco-2. O parâmetro de permeação foi o coeficiente de permeabilidade aparente (Papp) dos fármacos para ambos modelos experimentais. Para estabelecimento do protocolo experimental dos estudos de permeabilidade intestinal de rã, foi proposto um projeto fracionado 24-1 com 4 ensaios adicionais usando o software Minitab, e as variáveis foram: secção intestinal, pH da solução de Ringer e temperatura. A análise do planejamento experimental feita pela estimativa dos parâmetros da regressão obtidos através dos resultados do modelo fatorial possibilitou a determinação dos coeficientes da equação matemática que definiu a influência das variáveis sobre o coeficiente de permeabilidade aparente dos fármacos. Os efeitos das variáveis pH e temperatura interpretados conjuntamente apresentaram interferência leve, porém as variáveis fármaco e secção intestinal interpretados juntos tiveram interferência importante, mostrando maior permeação dos fármacos através da secção inicial do intestino da rã. Os resultados de Papp foram: para o metoprolol, pelo método das células Caco-2 foi de 28 x 10-6 cm/s, valor que está de acordo com demais dados de células Caco-2 na literatura e o valor obtido com células de Franz que mais se adequada a estes resultados e demais disponíveis provenientes de outras técnicas na literatura, foi de 28,1 x 10-6 cm/s, em uma das condições do planejamento estatístico utilizando segmento final da membrana epitelial da rã. No caso do aciclovir, o resultado de Papp de 0,48 x 10-6 cm/s também obtido em uma das condições envolvendo segmento intestinal final da rã foi exatamente igual a o valor 0,48 x 10 - 6 cm/s, encontrado com células Caco-2 no presente estudo e estão de acordo com outros valores disponíveis na literatura por Trapani e colaboradores, 2004 e também com células Caco-2. Para zidovudina o valor de Papp obtido em uma das condições utilizando segmento intestinal inicial da rã, de 13 x 10-6 cm/s, foi a que mais se assemelhou ao obtido pela técnica de células Caco-2, 13,6 x 10-6 cm/s, e também está de acordo com demais dados da literatura. / There are lots of different in vitro technics in the literature using animal intestinal epithelium to estimate permeability of drugs, property that is an important parameter of bioavailabity. Considering that the main objective of Pharmaceutical Companies is the development of new drugs with good oral bioavailabity, the aim of this work was to standardize the permeability of antivirals using in vitro/ex vivo method of intestinal epithelium of Rana catesbeiana in Franz cells and compare these results to those obtained from studies using Caco-2 cells. Zidovudine and Acyclovir were selected as model drugs. The amount of drug permeated will be determined by the method of capillary electrophoresis for assays using Rana Catesbeiana and HPLC-UV for studies with Caco-2 cells. The permeation parameter determined was the apparent permeability coefficient (Papp) of drugs for both experimental models. To establish the experimental protocol to studies of intestinal permeability of frog, it was proposed a fractional 24-1 design with 4 additional tests using Minitab software and the variables were: intestinal section, pH of Ringer solution and temperature. The analysis of the experimental design made by the estimate of the regression parameters obtained from the factorial model results allowed the determination of the coefficients of the mathematical equation that defines the influence of the variables on the apparent permeability coefficient of acyclovir and zidovudine. The effects of pH and temperature interpreted jointly presented a slight interference, but the variables drug and intes tinal section interpreted together had major interference, showing greater permeation of drugs through the initial section of the intestine of the frog . The results of Papp were: for metoprolol, with the method of Caco-2 cells was 28 x 10-6 cm/s, a value which is consistent with other data of Caco-2 cells provided in the literature and the condition obtained with Franz cells that are most suitable for these and other results obtained from other techniques available in the literature, was 28.1 x 10-6 cm/s, provided with the final intestinal segment using frog epithelial membrane. In the case of acyclovir, the result of Papp of 0.48 x 10-6 cm/s obtained in one condition with final frog intestinal segment was exactly equal to the value of 0.48 x 10-6 cm/s, found with Caco-2 cells in the present study and are in agreement with other values available in the literature for Trapani and colegues, 2004 and also with Caco-2 cells. The Papp value for zidovudine obtained with the initial gut segment of frog, 13 x 10-6 cm /s was which more resembled that obtained by the technique of Caco-2 cells, 13.6 x 10-6 cm/s and is also consistent with other literature data.

Introdução: Indivíduos com infecção pelo vírus de Hepatite C (HCV) frequentemente apresentam uso de álcool, contudo, pacientes com consumo moderado ainda são pouco estudados, especialmente, sobre qual o impacto desse uso de álcool nos sintomas depressivos e ansiosos. Objetivos: Caracterização dos pacientes portadores de HCV e investigação do impacto do uso moderado de álcool na presença e intensidade dos sintomas de depressão e ansiedade nessa população. Métodos: Foram selecionados 109 indivíduos, portadores de HCV, provenientes dos ambulatórios de Hepatologia e Moléstias Infecciosas do Hospital das Clínicas da FMUSP, que aguardavam o início do tratamento para HCV. Os pacientes foram submetidos à entrevista psiquiátrica, análise dos dados clínicolaboratoriais e elastografia hepática transitória não invasiva com FibroScan®; os sintomas depressivos e ansiosos foram avaliados por meio das escalas de BDI e BAI. Os participantes foram divididos em dois grupos, de acordo com o consumo de álcool, baseado em pontuação positiva na segunda questão do ASSIST (teste de triagem para o uso de álcool, tabaco e outras substâncias). O grupo com ASSIST positivo para uso de álcool foi comparado ao grupo com ASSIST negativo para uso de álcool, referente aos dados sociodemográficos, clínicos, sintomas depressivos e ansiosos. Resultados: Nessa amostra, 44% dos participantes encontravam-se na faixa etária a partir dos 60 anos, 59% eram do gênero masculino, 59% casados e 53% completaram o ensino fundamental I. Em relação às características relacionadas ao HCV: 82% apresentavam o genótipo tipo 1 e 61% apresentavam avaliação da fibrose hepática pelo FibroScan®, entre F3 e F4. Ao comparar os grupos com ASSIST positivo e negativo para uso de álcool, não foram observadas diferenças significativas nos dados sociodemográficos, clínicolaboratoriais, sintomas depressivos e ansiosos. Ao associar o uso moderado de álcool, bem como sintomas depressivos (BDI) e ansiosos (BAI), não foi encontrada diferença estatisticamente significante entre os grupos. Conclusão: Nessa amostra, o uso moderado de álcool, em indivíduos portadores de HCV não submetidos ao tratamento com antivirais de ação direta, não foi associado à maior intensidade de sintomas depressivos e ansiosos / Background: Individuals with hepatitis C virus infection (HCV) frequently present alcohol use; however, patients with moderate alcohol consumption are still poorly studied, especially regarding the impact of this alcohol use on depressive and anxiety symptoms in patients with HCV. Aims: Characterization of patients with HCV and investigation of the impact of moderate alcohol use on the presence and intensity of symptoms of depression and anxiety in this population. Methods: We selected 109 individuals with HCV from the Hepatology and Infectious Diseases clinics of the Hospital das Clinicas of FMUSP, who were waiting to start HCV treatment. Those patients were submitted to a psychiatric interview, analysis of clinical and laboratory data and non-invasive transient hepatic elastography with FibroScan®; depressive and anxiety symptoms were evaluated using the BDI and BAI scales. Participants were divided into two groups according to alcohol consumption based on a positive score on the second point of the ASSIST (screening test for alcohol, tobacco and other substances). The positive ASSIST group for alcohol use was compared to the negative ASSIST group for alcohol use, referring to socio-demographic, clinical data, and depression and anxiety symptoms. Results: In this sample, 44% of the participants were above 60 years old, 59% were males, 59% were married, and 53% completed elementary education I. In relation to HCV-related characteristics, 82% were type 1 genotype and 61% presented FibroScan® assessment of hepatic fibrosis between F3 and F4. When comparing the groups with positive and negative ASSIST for alcohol use, no significant differences were observed in sociodemographic, clinical and laboratory data or depression and anxiety symptoms. By associating moderate use of alcohol and depression (BDI) and anxiety (BAI) symptoms, no statistically significant difference was found between the groups. Conclusion: In this sample, the moderate use of alcohol in HCV patients not submitted to treatment with direct-acting antivirals was not associated with a greater intensity of depression and anxiety symptoms

Nos últimos anos o tratamento da infecção crônica pelo HCV passou por importantes mudanças. Recentes avanços em biologia molecular proporcionaram o melhor conhecimento sobre a estrutura molecular do HCV e permitiram o desenvolvimento de moléculas que tem como alvo proteínas específicas integrantes do ciclo replicativo do vírus, denominados agentes antivirais de ação direta (DAAs). No Brasil, atualmente, os DAAs aprovados para o tratamento da Hepatite C são: Simeprevir (2ª geração de inibidor de protease), Daclatasvir (inibidor de NS5A) e o Sofosbuvir (inibidor análogo nucleotídeo de polimerase). A combinação dessas diferentes classes de DAAs permite maior eficácia no tratamento do HCV, reduz a duração do tratamento e o risco da emergência de resistência. Ao mesmo tempo em que o desenvolvimento de DAAs promete melhorar a chance de sucesso do tratamento dos pacientes crônicos infectados pelo HCV, a emergência de variantes associadas à resistência representa um grande desafio ao sucesso da terapia antiviral atualmente proposta e informações sobre a presença dessas mutações ainda são escassas. Este estudo tem como objetivo o mapeamento de variantes associadas à resistência (RAVs) primárias aos inibidores da polimerase (NS5B) do HCV em pacientes monoinfectados (HCV) e em pacientes coinfectados (HCV/HIV). Para tal, o rastreamento de substituições de aminoácidos foi realizado entre as posições 159 e 495 da proteína NS5B do HCV nas sequências de 244 pacientes infectados pelo HCV-1: 133 monoinfectados [1b (n=93); 1a (n=40)] e 111 coinfectados [1a (n=93); 1b (n=18)]. A ocorrência natural de RAVs nos resíduos S282, L320 e P495 não foi observada nas sequências analisadas neste estudo. As RAVs encontradas no grupo de monoinfectados foram: L159F (16,1% - 1b), C316N (16,3% - 1b) e A421V (21,4% - 1a; 3,2 - 1b) ; e no grupo de coinfectados foram: C316N (7,1% - 1b), V321A (1,6% - 1a), M414V (1,3% - 1a); A421V (23,7% - 1a; 6,3% - 1b), A421G (1,3% - 1a); Y448H (1,3% - 1a). Entre os pacientes monoinfectados, a região NS5B do HCV-1a apresentou menor número de variantes associadas à resistência (RAVs) quando comparada ao subtipo 1b, ao contrário do observado nos coinfectados. A variante C316N foi a única que ocorreu em combinação com outras variantes. Houve a ocorrência concomitante das variantes L159F e C316N em 8 pacientes monoinfectados pelo HCV-1b (8/56; 14,3%). Entre os coinfectados, foi observada a ocorrência concomitante das variantes C316N e A421V em apenas 1 paciente infectado pelo HCV-1b (1/14; 7,1%). A presença de RAVs foi detectada nas duas populações estudadas neste estudo. Contudo, outros estudos são necessários para que se possa avaliar o real impacto dessas mutacões na resposta ao tratamento / The treatment of chronic HCV infection has undergone important changes recently. Advances in molecular biology provided a better knowledge of the HCV molecular structure and allowed the development of molecules which target specific proteins that have important roles in the viral replicative cycle, known as direct action antiviral agents (DAAs). In Brazil, DAAs approved for treating hepatitis C are Simeprevir (2nd generation protease inhibitor), Daclatasvir (NS5A inhibitor) and sofosbuvir (nucleotide analogue NS5B polymerase inhibitor). The combination of these different DAAs classes leads to a greater efficacy in the treatment of HCV, reducing its duration and the risk of resistance associated variants (RAVs) emergence. DAAs increase the chance of successful treatment of HCV chronic infected patients. RAVs emergence represents a major challenge to the success of antiviral therapy. Nevertheless, data about the presence of these mutations are still scarce. The aim of this study was to verify the presence of primary RAVs associated to HCV polymerase inhibitors primary resistance in monoinfected (HCV) and coinfected (HCV / HIV) patients. For this purpose, amino acid substitutions identification was conducted between positions 159 and 495 of the HCV NS5B protein in the sequences of 244 patients with HCV-1: 133 monoinfected [1a (n=40); 1b (n=93)] and 111 coinfected [1a (n=93); 1b (n=18)]. Naturally occurring RAV in S282, L320 and P495 residues were not observed among the sequences analyzed in this study. RAVs found in monoinfected patients were L159F (16.1% - 1b), C316N (16.3% - 1b) and A421V (21.4% - 1a; 3.2% - 1b); while in co-infected group, the following RAVs were identified: C316N (7.1% - 1b), V321A (1.6% - 1a), M414V (1.3% - 1a); A421V (23.7% - 1a; 6.3% - 1b), A421G (1.3% - 1a); Y448H (1.3% - 1a). Among monoinfected patients, HCV-1a NS5B region showed fewer RAVs when compared to HCV-1b, conversely to what was observed in HIV coinfected patients. Variant C316N occurred in combination with other ones: there was the simultaneous occurrence of L159F and C316N variants 8/56 (14.3%) 8 HCV-1b monoinfected patients Among the coinfected patients, it was observed concomitant occurrence of C316N and A421V variant in only 1/14 (7.1%) HCV-1b infected patient. RAVs were detected in both HCV and HCV/HIV infected populations in this study. Further studies are required to assess the real impact of these changes in response to treatment

O objetivo principal deste estudo foi avaliar a frequência de cepas do HBV com mutações de resistência aos análogos nucleos(t)ídeos (AN) utilizados no tratamento da hepatite B entre indivíduos cronicamente infectados, não submetidos a tratamento, procedentes de diferentes regiões do Brasil. Além disso, foram avaliadas a presença de mutações que alteram a antigenicidade do HBsAg promovendo escape dos anticorpos anti-HBs; mutações nos genes pré-core/core e a associação dos diferentes subgenótipos com as mutações encontradas e características demográficas e laboratoriais dos pacientes. Foram incluídas 779 amostras de soro de pacientes com infecção crônica pelo HBV e virgens de tratamento com AN ou interferon, as quais foram coletadas no período de 2006 a 2011. Os pacientes eram procedentes dos seguintes estados brasileiros: Pará, Maranhão, Bahia, Minas Gerais, São Paulo, Paraná e Rio Grande do Sul. O DNA do HBV foi extraído das amostras de soro utilizando o Kit QIAamp DNA Blood Mini Kit (Qiagen) e posteriormente foi realizada a amplificação das regiões S/polimerase (S/P) e pré-core/core (PCC) do genoma viral por nested PCR. O fragmento amplificado foi submetido a sequenciamento direto em sequenciador automático de DNA (ABI 3500) e as sequências obtidas foram analisadas para identificação dos genótipos e subgenótipos do HBV, pesquisa de mutações na polimerase, no HBsAg e nos genes pré-core/core. A região S/Pol foi amplificada e sequenciada com sucesso em 702 amostras, as quais foram incluídas para atender aos objetivos deste estudo. Entre as 702 amostras analisadas sete genótipos e 12 subgenótipos do HBV foram identificados. O subgenótipo A1 foi o mais frequente (63,7%, 447/702), seguido pelo HBV/D3 (14,5%, 102/702). Os demais genótipos e subgenótipos encontrados e suas frequências foram as seguintes: A2 (3,3%, 23/702), A3 (0,1%, 1/702), B1 (0,1%, 1/702), B2 (0,1%, 1/702), C2 (0,9%, 6/702), D1 (0,9%, 6/702), D2 (4,6%, 32/702), D4 (5,1%, 36/702), D com subgenótipo não identificado (0,7%, 5/702), E (0,6%, 4/702), F2a (4,6%, 32/702), F4 (0,4%, 3/702), e G (0,4%, 3/702). Cepas do HBV com mutações de resistência (rtS202G, rtM204V/I, rtA194T, rtM250I, rtA181T/S, rtT184S) associadas ou não a mutações compensatórias (rtL80I, rtV173L, rtL180M, rtV207I) foram identificadas em 1,6% (11/702) das amostras analisadas. Cepas com mutações potencialmente associadas com resistência ao adefovir (rtS85A, rtL217R, rtI233V, rtN238T, rtN238D, rtN248H, rtV214A,e rtQ215S) ou ao entecavir (rtS219A) foram identificadas em 7,7% (54/702) e 2,6% (16/702) dos pacientes, respectivamente. Cinquenta e sete (8,5%) amostras apresentaram cepas do HBV com mutações na principal região hidrofílica do HBsAg previamente relacionadas com escape dos anticorpos anti-HBs ou com prejuízo na secreção do HBsAg. Foram feitas análises estatísticas para avaliar a correlação entre os subgenótipos do HBV mais frequentes na casuística (A1, A2, D1, D2, D3, D4 e F2a) e a presença de mutações nos genes PCC. Dentre as mutações nos genes PCC associadas com redução ou falha na expressão do HBeAg, as mutações A1762T/T1764A estiveram associadas aos subgenótipos A1 e F2a; G1862T e mutações nas posições 1809-1812 ao subgenótipo A1; G1896A e/ou G1899A aos subgenótipos D2, D3 e D4. Mutações associadas com evolução da doença foram detectadas e entre essas as mutações C1766T e T1768A estiveram associadas aos subgenótipos A1 e F2a, e a mutação G1888A foi associada ao subgenótipo A1. As cepas do HBV que circulam nas diferentes regiões brasileiras estudadas apresentam grande variabilidade genética e a distribuição dos genótipos e subgenótipos reflete a formação histórica de cada região e do fluxo migratório mais recente. A frequência de cepas do HBV com mutações de resistência aos AN circulando entre pacientes virgens de tratamento com esses medicamentos nas diferentes regiões do Brasil estudadas é baixa, sendo que o perfil de mutações que confere resistência total à lamivudina e parcial ao entecavir parece ser o mais disseminado. Embora tenham sido detectados casos de infecção com cepas do HBV portando mutações com grande impacto na antigenicidade dessa proteína todas as amostras apresentaram HBsAg detectável. Pacientes com HBeAg negativo foram mais frequentes na casuística estudada, independente do subgenótipo. As mutações encontradas nos genes PCC sugerem que há perfis de mutações diferentes envolvidos na negatividade do HBeAg para cada subgenótipo / The main aim of this study was to evaluate the frequency of HBV strains harboring mutations that confer resistance to nucleos(t)ide analogues (NA) used to hepatitis B treatment among treatment-naïve patients with chronic hepatitis B from different Brazilian region. Furthermore, we evaluated the presence of mutations that alter the antigenicity of HBsAg causing anti-HBs escape; mutations in genes pre-core/core and the association of different subgenotypes with the mutations detected and demographic and laboratory characteristics of the patients. Serum samples from 779 treatment-naïve patients with chronic HBV infection were included in this study. The samples were collected between 2006 to 2011 and the patients were from the following states: Pará, Maranhão, Bahia, Minas Gerais, São Paulo, Paraná and Rio Grande do Sul. HBV DNA was extracted from serum samples using the QIAamp DNA Blood Mini Kit (Qiagen) and amplification of S/polymerase (S/Pol) and pre-core/core (PCC) regions were performed by nested PCR. The amplified PCR products were submitted to sequencing in an automatic DNA sequencer (ABI 3500). The sequences obtained were analyzed to classify HBV genotypes/subgenotypes and to analyze the presence of mutations. S/Pol region was amplified and sequenced successfully from 702 samples, which were included in this study. Among these 702 samples, seven genotypes and 12 subgenotypes have been identified. HBV subgenotype A1 was the most frequent (63.7%, 447/702), followed by HBV/D3 (14.5%; 102/ 702). The remaining genotypes and subgenotypes identified and their frequencies were as follows: A2 (3.3%, 23/702), A3 (0.1%, 1/702), B1 (0.1%, 1/702), B2 (0.1%, 1/702), C2 (0.9%, 6/702), D1 (0.9%, 6/702), D2 (4.6%, 32/702), D4 (5.1%, 36/702), D unclassified subgenotype (0.7%, 5/702), E (0.6%, 4/702), F2a (4.6%, 32/702), F4 (0.4%, 3/702), and G (0.4%, 3/702). HBV strains harboring mutations conferring NA resistance alone (rtS202G, rtM204V/I, rtA194T, rtM250I, rtA181T/S, rtT184S) or combined with compensatory mutations (rtL80I, rtV173L, rtL180M, rtV207I) were identified in 1.6% (11/702) of the patients. Isolates harboring mutations potentially associated with adefovir resistance (rtS85A, rtL217R, rtI233V, rtN238T, rtN238D, rtN248H, rtV214A, and rtQ215S) or entecavir resistance (rtS219A) were identified in 7.7% (54/702) and 2.6% (16/702) of the patients, respectively. HBV with HBsAg mutations previous related with anti-HBs escape or impaired secretion were detected in 8.5% (57/702) of the samples. Statistical analyzes were performed to assess the correlation between the more frequent HBV subgenotypes found in this study (A1, A2, D1, D2, D3, D4 and F2a ) and mutations in PCC genes. Among the mutations found in these genes that were associated with reduction or failure in HBeAg synthesis, A1762T/T1764A mutations were associated to subgenotypes A1 and F2a; G1862T and mutations at positions 1809-1812 to subgenotype A1; G1896A and/or G1899A to subgenotypes D2, D3 and D4. Other mutations associated with disease progression were found: C1766T and T1768A mutations were associated with subgenotypes A1 and F2a, and the G1888A mutation was associated with subgenotype A1. HBV strains circulating in different Brazilian regions studied showed high genetic variability and distribution of genotypes and subgenotypes reflects the population formation history of each region and the occurrence of recent events of migration. The frequency of HBV strains with NA resistance mutations circulating among treatment-naive patients in different regions of Brazil studied is low and the profile of mutations that confer total resistance to lamivudine and partial resistance to entecavir is more widespread. Although some cases of infection have been detected with HBV strains carrying mutations associated with major impact on the antigenicity of this protein, all samples had detectable HBsAg. HBeAg negative cases were more frequent in the studied population, regardless of subgenotype. Different pattern of mutations were found in PCC genes, suggesting that different mechanisms are involved in HBeAg negativity for each subgenotype

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Made available in DSpace on 2016-06-02T19:02:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 4328.pdf: 9852557 bytes, checksum: 9a38f4661fc82092a95f76aa328b7cf9 (MD5) Previous issue date: 2012-02-16 / Financiadora de Estudos e Projetos / In recent years, the technology animal cells culture has allowed the development of many byproducts, especially those with pharmacological interest. Some of these products, the recombinant proteins, can be produced by heterologous expression systems on a commercial scale. Bacteria, yeast, mammalian cells and insects are some of the hosts used in these processes. As source of proteins with farmacological interest, the catterpillar Lonomia obliqua hemolinph was demonstrated to be a helpful organismo. Antiviral, antiapoptotic, antimicrobial and inducing growth proteins, are some of examples. Since the control of viral infections is a major interest to public health, the searching for new antiviral drugs has utmost importance. Several studies have reported the presence of active principles in the arthropods hemolymph. Recently, we demonstrated the existence of an antiviral protein in the hemolymph of the caterpillar Lonomia obliqua. This purified protein induced viral production reduction (TCID50 mL-1) over 157 times in cells infected with the measles virus, 61 times for polio and 61 times for influenza virus H1N1 infections. Thus, the present goals were building and expression of a recombinant plasmid contained coding sequences for expression of viral proteins (using baculovirus) in insect cell Sf-9 system. By this process, it was aimed to test biological activity of the protein. Further sequence analyses of this protein were performed using bioinformatics tools. The RNA of L. obliqua was extracted with Trizol reagent. RNA product was used in RT-PCR reactions with primers specific for the antiviral protein, based on the sequence of the cDNA libraries of L. obliqua tegument and spines, using all possible frame of translation for each cDNA. Restriction sites were inserted in cDNA sequence to insert it in pFastBacTM1 donor vector (Invitrogen). The sequence contained in selected clone of Escherichia coli DH5&#945; was used for transformation into E. coli DH10Bac to obtain a bacmid by transposition process. This bacmid was used for antiviral recombinant protein expression in Sf-9 cells. This recombinant protein activity was tested in Picorna (EMC enchephalomiocardite), Rubeola and Herpes virus. In these trials, it was observed a replication reduction of 10,000, 10,000 and 1,000000 times, respectively. The bioinformatics analysis demonstrated that this protein is secreted, globular and probably belongs to a new class of proteins. / A tecnologia de cultivo de celulas animais tem permitido nos ultimos anos o desenvolvimento de inumeros bioprodutos. Principalmente com interesse farmacologico, alguns desses produtos, as proteinas recombinantes, podem ser produzidas em sistemas de expressao heterologos em escala comercial. Bacterias, leveduras, celulas de mamiferos e de insetos sao alguns dos hospedeiros utilizados nestes processos. Como fonte de proteinas de interesse farmacologico, a hemolinfa da lagarta Lonomia obliqua mostrou-se um organismo bastante promissor. Proteinas antivirais, antiapoptoticas, antimicrobianas e indutoras de crescimento sao alguns destes exemplos. Como o controle das infeccoes virais e de grande interesse pra saude publica, a busca por novos antivirais e de extrema importancia. Diversos estudos relatam a presenca de principios ativos na hemolinfa de artropodes. Recentemente nos demonstramos a existencia de uma proteina antiviral na hemolinfa da lagarta Lonomia obliqua. Esta proteina purificada mostrou-se capaz de reduzir a producao viral (TCID50 mL 1) mais de 157 vezes o virus do sarampo, 61 vezes para o virus da polio e 61 vezes para o virus influenza H1N1. Assim, este estudo objetivou a construcao e expressao de um recombinante contendo sequencias de codificacao da proteina antiviral para a expressao em sistema baculovirus/celula de inseto Sf-9 e a realizacao de testes de atividade biologica e caracterizacao por bioinformatica. Para sintetizar cDNA, o RNA de L. obliqua foi extraido com o reagente Trizol e usado nas reacoes de RT-PCR com primers especificos para a proteina antiviral, com base na sequencia das bibliotecas de cDNA de L. obliqua de tegumento e espiculas, utilizando todos os frames de traducao possiveis para cada cDNA. Sitios de restricao foram inseridos no cDNA para ligacao ao vetor doador pFastBacTM 1 (Invitrogen). O plasmideo recombinante selecionado em Escherichia coli DH5&#945; foi utilizado na transformacao em E. coli DH10Bac para a obtencao do bacmideo pelo processo de transposicao. O bacmideo recombinante foi utilizado para a expressao da proteina antiviral em celulas SF-9. A atividade desta proteina recombinante foi testada em Picornavirus (EMC - encephalomiocardite), Rubeola e Herpes. Nestes testes foi observado que a proteina reduziu em 10.000, 10.000 e 1.000.000 a titulacao viral, respectivamente. As analises de bioinformatica demonstraram que esta proteina e secretada, globular e provavelmente pertenca a uma nova classe de proteinas.