Orientadores: Joyce Maria Annichino-Bizzacchi, Nicola Amanda Conran Zorzetto / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-22T04:29:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Zapponi_KiaraCristinaSenger_M.pdf: 3766938 bytes, checksum: e4531f39f9f53ff883ad33f684d56647 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: Tromboembolismo venoso (TEV) é uma doença multifatorial que afeta 1-3:1000 indivíduos mundialmente. A formação do trombo venoso na superfície endotelial é um processo multicelular, de estrutura laminar composta por camadas de plaquetas, leucócitos, eritrócitos e fibrina, originando uma resposta inflamatória loco-regional. A relação entre inflamação e coagulação é bidirecional. e tem sido principalmente avaliada através de interações de proteínas entre citocinas próinflamatórias e elementos da cascata de coagulação. As células inflamatórias tais como neutrófilos, não foram previamente correlacionadas com os processos trombóticos ou pró-coagulantes. Objetivo: Avaliar as propriedades adesivas de neutrófilos, eritrócitos e plaquetas, assim como a expressão das moléculas de adesão de superfície dos neutrófilos em pacientes com TEV, correlacionando-os com marcadores sistêmicos da resposta inflamatória, presença de trombo residual e D-dímero aumentado. Pacientes e Métodos: Foram incluídos neste estudo 10 pacientes com TEV agudo atendidos no Hospital de Clínicas da Unicamp (HCUNICAMP), 30 pacientes com TEV crônico (1 a 6 anos após o evento agudo), atendidos no Hemocentro de Campinas-UNICAMP, e controles normais pareados aos pacientes por idade, gênero e etnia. A adesão de neutrófilos, eritrócitos e plaquetas foram determinados através de ensaio estático usando fibronectina (FN) e fibrinogênio (FB) como ligantes. A expressão das moléculas de adesão dos neutrófilos (CD11a, CD11b, CD18) foi avaliada por citometria de fluxo. Os níveis dos marcadores inflamatórios (IL-6, IL-8, TNF-_ e PCR) foram avaliados por ELISA e nefelometria. O trombo residual (TR) por ultrassom com Doppler e o Dímero-D (DD) por método coagulométrico. Resultados: A adesão de plaquetas ao fibrinogênio com e sem estímulo de trombina em pacientes dos grupos agudo e crônico foi semelhante ao observado nos controles normais. Da mesma forma, não houve diferença da adesão de eritrócitos à fibronectina nesses mesmos grupos analisados. No subgrupo de pacientes com alto risco de recorrência de TEV definido pela presença de altos níveis de D-dímero (>0,55mg/L) e trombo residual observou-se um aumento significativo da adesão de neutrófilos em relação aos controles (24.68% vs 19.07%, P<0.05). A atividade inflamatória também estava aumentada neste subgrupo em comparação aos outros pacientes, demonstrada pelo aumento significativo dos níveis séricos de IL-6, IL-8, TNF-_ e PCR (2.08pg/mL VS 0.90pg/mL, P=0.01; 28.72pg/mL vs 16.46pg/mL, P=0.02; 4.50pg/mL vs 2.11pg/mL, P=0.04; 0.35 pg/mL vs 0.14 pg/mL, P=0.09, respectivamente). Houve uma correlação das propriedades adesivas de neutrófilos com IL-6 (r=0.3815 e P=0.0375), e D-dímero (r=0.3831 e P=0.0367). A quantificação das proteínas de superfície (CD11a, CD11b e CD18) de neutrófilos não foi diferente entre os grupos analisados. Conclusão: Nossos resultados sugerem que pacientes com TEV não apresentam aumento das propriedades adesivas de plaquetas e eritrócitos. Entretanto, as propriedades adesivas dos neutrófilos foram aumentadas em pacientes com D-dímero aumentado e presença de trombo residual, independente da expressão quantitativa das proteínas de superfície em sua membrana. A hipótese para este aumento pode ser devido as alterações na afinidade das moléculas de adesão de superfície aos seus ligantes, como consequência do processo inflamatório associado com a hipercoagulabilidade que é característica desta doença / Abstract: Venous Thromboembolism (VTE) is a multifactorial disease that affects 1-3:1000 individuals worldwide. The venous thrombus develops via a multicellular process on the surface of the endothelium and presents a laminar structure comprised of layers of platelets, leukocytes, erythrocytes and fibrin. The relationship between inflammation and coagulation is bidirectional, and has been mainly evaluated through protein interactions between pro-inflammatory cytokines and elements of the coagulation cascade. Inflammatory cells such as neutrophils, have not been previously correlated with thrombotic or procoagulant processes. Objective: To evaluate the adhesive properties of neutrophils, erythrocytes and platelets, as well as the expression of neutrophil adhesion molecules in patients with VTE, correlating them with markers of the systemic inflammatory response, and with the presence of residual vein obstruction (RVO) and higher D-dimer (DD). Patients and Methods: Study group consisted of 30 chronic VTE patients (1-6 years after the acute episode) followed in our outpatient clinic, and 10 patients with VTE during the acute episode treated at the Hospital of Clinics (HC-UNICAMP) Campinas, as well as age, gender and ethnic background-matched healthy. Adhesive properties of neutrophils, erythrocytes and platelets were determined by a static adhesion assay using ligands such as fibrinogen (FB) and fibronectin (FN). The expression of neutrophils adhesion molecules (CD11a, CD11b, CD18) was evaluated by flow cytometry. Levels of inflammatory markers (IL-6, IL-8, TNF-_, PCR) were evaluated by ELISA and nephelometry. RVO was evaluated by Doppler ultrasound and DD by coagulometric method. Results: No significant difference could be observed in the platelets adhesion (basal: 16.37% vs. 14.59%, p=0.309; and stimulated with thrombin: 33.45% vs. 26.62%, p=0.200) and erythrocytes adhesion (7.28% vs 7.49%, p=0.859) between chronic VTE patients and healthy individuals. Similarly, no statistical differences were observed in the platelets adhesion (basal: 28.36% vs. 21.63%, p=0.109; and stimulated with thrombin: 38.45% vs. 30.15%, p=0.715) and erythrocytes adhesion (6.00% vs 4.62%, p=0.326) in the VTE acute xxii patients when compared to their respective controls. Interestingly, in patients with a higher risk of recurrent VTE (defined by the presence of high levels of DD and RVO), a significant increase in neutrophils adhesion was observed when compared to healthy individuals (24.68% vs. 19.07%, p <0.05). Inflammatory markers (IL-6, IL-8, TNF-_ and CRP) were significantly elevated (2.08pg/mL vs 0.90pg/mL, p=0.01; 28.72pg/mL vs 16.46pg/mL, p=0.02; 4.50pg/mL vs 2.11pg/mL, p=0.04; 0.35 pg/mL vs 0.14 pg/mL, p=0.09, respectively) in this subgroup of patients when compared to the other patients. Adhesive properties of neutrophils were correlated with IL-6 (r= 0.3815 and p= 0.0375) and D-dimer levels (r= 0.3831 and p= 0.0367). Neutrophils adhesion molecules (CD11a, CD11b and CD18) were not altered in any of the groups. Conclusion: Our results suggest that VTE patients do not exhibit increased adhesive properties of platelets and erythrocytes. Neutrophils adhesive properties were increased in patients with higher D-dimer levels and RVO, independently of the expression of neutrophil adhesion molecules. A hypothesis for this increase is alterations in affinity of surface adhesion molecules to their ligands, as a response to inflammatory processes associated with the hypercoagulability demonstrated in this subgroup of patients / Mestrado / Biologia Estrutural, Celular, Molecular e do Desenvolvimento / Mestra em Fisiopatologia Médica

Orientador: Nicola Amanda Conran Zorzetto / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-26T23:21:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Vital_DaianaMorelli_M.pdf: 1971637 bytes, checksum: 022329e1e83ad1bd2ea02de3d37d61c9 (MD5) Previous issue date: 2015 / Resumo: A inflamação é uma resposta fisiológica normal à infecção ou lesão tecidual que permite a sobrevivência do indivíduo a diversos agentes lesivos e mantém a homeostase dos tecidos sob uma variedade de condições nocivas. Os neutrófilos têm um papel importante em processos inflamatórios e, na presença de estímulos inflamatórios, como citocinas e quimiocinas, são recrutados da circulação para o tecido inflamado por uma sequência de interações adesivas. Recentemente, novas técnicas in vitro têm levado a importantes avanços no entendimento de patologias vasculares e hematológicas e sistemas microfluídicos, que mimetizam a microcirculação humana, demonstrando a utilidade para o estudo de interações adesivas de células inflamatórias. As interações dos neutrófilos e outros leucócitos com a parede vascular tem contribuição importante para as doenças inflamatórias crônicas, como a anemia falciforme (AF) e aterosclerose, pois podem participar em processos de oclusão vascular. O objetivo deste trabalho foi avaliar se a hidroxiureia (HU), uma droga utilizada como terapia na AF, modula as propriedades adesivas de neutrófilos quando incubados in vitro com a droga e frente um estímulo inflamatório. Os neutrófilos, isolados do sangue periférico de indivíduos saudáveis, foram estimulados com a citocina TNF-? (Fator de Necrose Tumoral alfa) e tratados com HU em três concentrações (100, 500, 1000 ?M); as propriedades adesivas das células foram avaliadas por ensaios de adesão estática e por ensaios microfluídicos, utilizando como ligantes proteínas expressas no endotélio (ICAM-1 e E-selectina), proteínas da matriz extracelular (fibronectina - FN) e células endoteliais (HUVEC). Além disso, foi analisada a ativação celular (spreading celular, observado como o espalhamento das células redondas que se tornam achatadas sobre um substrato sólido 2D). Observamos que os neutrófilos, quando estimulados com TNF-?, demonstram aumentos significantes na adesão e spreading celular. O pré-tratamento das células com HU reduziu significativamente o spreading dos neutrófilos nas três proteínas estudas (FN, ICAM-1 e E-selectina). Sob condições estáticas, o pré e o pós-tratamento dos neutrófilos com a HU diminuiu significativamente a adesão à FN quando comparados ao estimulados por TNF-?. Nos ensaios de adesão em fluxo, foi possível observar que o pré-tratamento com HU nas três concentrações (100, 500 e 1000 ?M) diminuiu significativamente a adesão dos neutrófilos a FN e o pós-tratamento com HU diminuiu apenas na concentração de 100 ?M. Avaliamos a adesão em fluxo de neutrófilos aderidos a proteínas de adesão presentes no endotélio, ICAM-1 e E-selectina; o pré e o pós-tratamento de neutrófilos com HU diminuiu a suas propriedades adesivas frente ao estímulo inflamatório de TNF-? à proteína E-selectina, enquanto que o pré-tratamento nas três concentrações diminuiu a adesão dos neutrófilos ao ICAM-1 e ao ICAM-1 e E-selectina adicionados juntos ao chip. A técnica de citometria de fluxo demonstrou que as integrinas LFA-1 (CD11a) e Mac-1 (CD11b), mostraram-se aumentadas na superfície dos neutrófilos após estímulo com TNF-?. Todavia, a expressão da L-selectina, mostrou-se diminuída com este potente estímulo inflamatório, provavelmente devido o mecanismo de "shedding" celular. A incubação dos neutrófilos com HU, após o estímulo com o TNF-?, reduziu significativamente a expressão de CD11a nos neutrófilos tratados com HU nas concentrações de 100 e 1000 ?M para níveis de expressão equivalentes ao grupo de neutrófilos não estimulados com TNF-?. Observamos também que houve aumento da presença da integrina LFA-1 (CD11a) na sua conformação ativada, após estímulo com TNF-? e que a pós-incubação das células estimuladas com HU na concentração de 1000 ?M, reduziu a ativação da subunidade CD11a da molécula de adesão LFA-1, comparado ao grupo apenas estimulado com TNF-?. Diante destes resultados, é possível concluir que o tratamento de neutrófilos com HU foi capaz de proteger ou até reverter algumas das ações inflamatórias do TNF-?. A HU é utilizada como uma terapia de uso crônico em pacientes com AF, mas estes dados indicam que a HU também pode exercer efeitos imediatos que são independentes da elevação de hemoglobina fetal. Dados melhor clarificam o mecanismo de ação de HU na AF e sugerem que a droga pode ter potencial para uso em outras doenças inflamatórias. Ainda será necessário entender como a HU exerce estes efeitos anti-inflamatórios nos neutrófilos / Abstract: Inflammation is a normal physiological response to infection or tissue injury that defends against various damaging agents and maintains tissue homeostasis in a variety of deleterious conditions. Neutrophils play an important role in inflammatory processes and, in the presence of inflammatory stimuli, such as cytokines and chemokines, are recruited from the circulation into the inflamed tissue by a sequence of adhesive interactions. Recently, new in vitro techniques have led to significant advances in our understanding of vascular and hematological conditions and microfluidic systems that mimic the human microcirculation have been shown to be useful for the study of adhesive interactions in inflammatory cells. The interaction of neutrophils and other leukocytes with the vascular wall makes an important contribution to chronic inflammatory diseases, such as sickle cell anemia (SCA) and atherosclerosis, as these may participate in vascular occlusion processes. The aim of this study was to evaluate whether hydroxyurea (HU), a drug used as a therapy in SCA, modulates the adhesive properties of neutrophils in vitro under an inflammatory stimulus. The neutrophils isolated from the peripheral blood of healthy subjects were stimulated with the cytokine TNF-? (Tumor Necrosis Factor alpha) and treated with HU in three concentrations (100, 500, 1000 ?M); the adhesive properties of the cells were evaluated by static adhesion assays and microfluidic assays using ligands such as proteins expressed on the endothelium (ICAM-1 and E-selectin), extracellular matrix proteins (fibronectin - FN) and endothelial cells (HUVEC). Furthermore, cellular activation was evaluated as cell spreading (observed when round cells become flattened and spread on a 2D solid substrate). When stimulated with TNF-?, neutrophils presented a significant increase in cell adhesion and spreading. Pre-treatment of cells with HU significantly reduced neutrophil spreading on all three proteins studied (FN, ICAM-1 and E-selectin). Under static conditions, the pre-treatment and post-treatment of neutrophils with HU significantly decreased adhesion to FN, compared to TNF-?-stimulated cells. In the flow adhesion assays, pre-treatment of neutrophils with HU at three concentrations (100, 500 and 1000 ?M) significantly reduced the adhesion of neutrophils to FN and post-treatment with HU decreased only at the concentration of 100 ?M. We evaluated the in vitro flow adhesion of neutrophils to proteins present on endothelial cells, ICAM-1 and E-selectin; pre-treatment and post-treatment of neutrophils with HU decreased their adhesive properties after TNF-? inflammatory stimulus to the E-selectin ligand, while pre-treatment in the three concentrations decreased neutrophil adherence to ICAM-1 ligand and ICAM-1/E-selectin ligands added together to the chip. Flow cytometry demonstrated that the expressions of the integrins LFA-1 (CD11a) and Mac-1 (CD11b) were elevated on the surface of neutrophils after a TNF-? stimulus. However, L-selectin expression was reduced with this potent inflammatory stimulus, probably due to the mechanism of "shedding". Incubation of neutrophils with HU (100 and 1000 ?M), after stimulation with TNF-?, significantly reduced the CD11a expression on neutrophils to levels similar to those found on the neutrophils of the non-TNF-?-stimulated group. We also observed that there was an increased expression of the LFA-1 (CD11a) integrin in its active conformation after stimulation with TNF-? and that, post-incubation with HU (1000 ?M) was able to reduce the activation of the adhesion molecule CD11a (LFA-1 subunit), compared to the group with TNF-? stimulus only. Given these results, it is possible to conclude that treatment of neutrophils with HU was able to protect or even reverse some of the inflammatory actions of TNF-?. HU is used as a chronic therapy in patients with SCA, but our data indicate that HU may also have immediate effects that are independent of the increase in fetal hemoglobin usually observed in patients in therapy. Our results further clarify the mechanism of action of HU in SCA and suggest that this drug may have potential for use in other inflammatory diseases. Further studies will be needed to better comprehend how these HU anti-inflammatory effects act on neutrophils / Mestrado / Fisiopatologia Médica / Mestra em Ciências

O patógeno Trichophyton rubrum é um fungo queratinofílico e o principal agente de micoses cutâneas humanas. O processo de degradação de substratos queratinizados por dermatófitos está relacionado com a alcalinização do ambiente, o que modula a expressão e a secreção de enzimas responsáveis pela captação e utilização dos nutrientes presentes no microambiente hospedeiro. Essa modulação do pH parece determinante para o sucesso do processo infeccioso, quando o fungo se depara com o pH ácido da pele humana. A hipótese deste trabalho foi verificar se há influência do pH e da fonte nutricional na modulação da expressão de genes de T. rubrum que codificam proteínas envolvidas nos processos de autofagia (atg8 e atg15), adesão celular (sowgp) e de alguns fatores de transcrição (pacC, bZIP/cys-3 e nuc-1), e se estes processos estão relacionados à patogenicidade deste dermatófito. De modo a avaliar a modulação da expressão destes genes na patogenicidade e sobrevivência fúngica, T. rubrum foi cultivado em meios de cultura tamponados (pH 5,0 e pH 8,0) e não tamponados, contendo glicose, glicina, glicose com glicina, ou queratina como fonte nutricional. Os genes envolvidos no processo de autofagia também foram avaliados na presença do inibidor de autofagia 3-metiladenina (3-MA). Além disso, o perfil transcricional destes genes de T. rubrum foi avaliado durante a interação ex vivo com unha e pele humana. As análises demonstraram a influência concomitante da fonte nutricional e do pH ambiente na modulação da expressão dos transcritos gênicos estudados nas diferentes linhagens de T. rubrum utilizadas neste trabalho (CBS, H6 e pacC-1). Nossos resultados revelaram que o crescimento destas linhagens é maior na fonte nutricional queratina, quando comparado com as outras fontes nutricionais (glicose e glicina), havendo uma diferença na taxa de crescimento entre as linhagens neste substrato preferencial. Os genes bZIP/cys-3 e nuc-1 apresentaram perfil de expressão semelhante, mais elevada durante cultivos longos, respondendo a condições de estresse nutricional e pH alcalino, sugerindo a participação dos mesmos nos processos de crescimento e sobrevivência do fungo. Além disso, mecanismos regulatórios diferentes destes genes devem ocorrer nas três linhagens de T. rubrum em relação ao crescimento na fonte nutricional queratina. A variação transcricional do gene pacC em resposta às diferentes fontes nutricionais sugere que sua expressão depende das condições nutricionais encontradas por esse fungo, sendo o pH uma resposta secundária. Nossos resultados sugerem ainda que a via de autofagia seja importante para o desenvolvimento e sobrevivência de T. rubrum nestes substratos, e que o FT PacC atue regulando um dos pontos deste processo, visto que o gene atg15 apresenta um perfil semelhante de expressão ao gene pacC, e o gene atg8 tem perfil antagônico de expressão nas linhagens H6 e pacC-1, nas condições avaliadas neste trabalho. 3-MA inibiu a transcrição dos genes atg8 e atg15 em T. rubrum de modo especifico, e por consequência a via de macroautofagia. Os dados de expressão de sowgp sugerem que essa molécula atue durante a privação nutricional e situações de estresse pelo dermatófito, provavelmente desempenhando seu papel na progressão e manutenção do processo infeccioso, permitindo a permanência do fungo em tecidos queratinizados, e auxiliando na fixação do fungo ao epitélio humano. Desta maneira, nossos resultados fornecem informações sobre os eventos moleculares envolvidos na regulação da expressão genica durante a adaptação de T. rubrum ao pH, à variação nutricional, e interação com células e moléculas do microambiente hospedeiro. Os resultados revelam o envolvimento do processo de autofagia e de moléculas de adesão no sensoriamento e resposta a variações ambientais, e a modulação dos fatores de transcrição bZIP/Cys-3, Nuc-1 e PacC durante a adaptação de T. rubrum ao pH e à fonte nutricional podem ser importantes na regulação de moléculas necessárias para sua patogenicidade. / The pathogen Trichophyton rubrum is a keratinophylic fungi and the major agent of cutaneous mycosis in humans. The process of degradation of keratinized substrates by dermatophytes is related with environment alkalinization, which modulates the expression and secretion of the enzymes responsible for the acquisition and utilization of nutrients from the host microenvironment. This pH modulation seems to be determinant for the success of the infectious process when the fungus encounters the acidic pH of the human skin. The hypothesis of this study was to determine whether there is influence of ambient pH and nutritional source in the modulation of gene expression of T. rubrum genes coding for proteins involved in the processes of autophagy (atg8 and atg15), cellular adhesion (sowgp) and some transcription factors (pacC, bZIP/cys-3 and nuc-1), and if they are related with the pathogenicity of this dermatophyte. To evaluate the modulation of the expression of these genes in fungal pathogenicity and survival, T. rubrum was cultivated in buffered (pH 5.0 and pH8.0) or non-buffered media, containing glucose, glycine, glucose and glycine, or keratin as nutrient source. The autophagy-related genes were also analyzed in the presence of 3- methyladenine (3-MA) autophagy inhibitor. Moreover, the transcriptional profile of these genes was evaluated during T. rubrum ex vivo interaction with human nail and skin. The analyses demonstrate the simultaneous influence of the nutritional source and environment pH in the modulation of gene transcription in the different T. rubrum strains evaluated here (CBS, H6 and pacC-1). Our results revealed that growth of these strains is higher in keratin source, compared with other nutrient sources (glucose or glycine), and that they present different growth rates in this preferential substrate. The genes bZIP/cys-3 and nuc-1 presented a similar expression profile, which is higher during longer periods of growth, responding to nutritional stress and alkaline pH, suggesting their involvement in fungal growth and survival. Also, different regulatory mechanisms of these genes in these three T. rubrum strains might be implicated during keratin degradation. The transcriptional variation in the pacC gene in response to different nutritional sources, suggests that its expression is dependent on the nutritional conditions, being the ambient pH a secondary response. Furthermore, our results indicate that the autophagy pathway is important for T. rubrum survival and development during nutrient and pH adaptation, and that PacC might regulates some points of this process, since atg15 and pacC genes presented a similar expression profile, and atg8 has antagonistic expression profiles in the H6 and pacC-1 strains, in the conditions evaluated here. 3-MA inhibited the transcription of atg8 and atg15 T. rubrum genes in a specific manner, and thus inhibited the macroautophagy process. The expression profile of the sowgp gene suggests that this molecule is important during nutrient starvation and stress situation, probably having a role in the progression and maintenance of the infectious process, allowing fungal maintenance in the host keratinized tissues, contributing to fungal adherence to human epithelia. Taken together, our results provide insights into the molecular events involved in the regulation of gene expression during T. rubrum adaptation to pH, nutritional variation and interaction with the host cells and molecules. Our data reveals the involvement of the autophagy process and adhesion molecules in sensing and response of environmental changes, and the modulation of the bZIP/Cys-3, Nuc-1 and PacC transcription factors during T. rubrum adaptation to pH and nutrient source might be important in the regulation of molecules required for its pathogenicity.

INTRODUÇÃO: A interação entre leucócitos e plaquetas é fundamental para o início e a progressão da reestenose e da aterosclerose. Recentemente foi evidenciado em estudos in vitro que a integrina Mac-1 dos leucócitos se liga à glicoproteína Ibalfa (GP Ibalfa) das plaquetas e que esta interação possui uma função central na firme adesão e transmigração de leucócitos em locais de deposição de plaquetas. Entretanto, não há estudos in vivo que avaliam a importância da interação entre a integrina Mac-1 dos leucócitos e a GP Ibalfa das plaquetas (alfaMbeta2-GP Ibalfa) em modelo experimental de lesão vascular. MÉTODO: Um peptídeo denominado M2 ou anticorpo anti-M2 foi desenvolvido para bloquear a interação da integrina Mac-1 dos leucócitos com a GP Ibalfa das plaquetas, visando, deste modo, inibir a adesão de leucócitos na superfície do vaso coberta por plaquetas, a proliferação celular e a hiperplasia neointimal. Este peptídeo foi injetado e comparado com anticorpo-controle em camundongos C57B1/6J submetidos à lesão vascular da artéria femoral com corda-guia. Um dia (controle: n= 6; anti-M2: n= 6), 5 dias (controle: n= 9; anti-M2: n= 9) ou 28 dias (controle: n= 9; anti-M2: n= 9) após a lesão vascular, as artérias femorais foram retiradas para a realização de morfometria e imunohistoquímica. RESULTADOS: O bloqueio da interação alfaMbeta2-GP Ibalfa promoveu redução estatisticamente significativa de 75% do número de leucócitos na camada média no primeiro dia após a lesão vascular (controle: 7,9 ± 5,0% do total de células na camada média; versus anti-M2: 2,0 ± 1,6%; p=0,021), bem como determinou diminuição estatisticamente significativa de 42% em 5 dias (controle: 42,3 ± 12,9% do total de células na neoíntima; versus anti-M2: 24,6 ± 10,8%; p=0,047) e de 58% em 28 dias do acúmulo de leucócitos na neoíntima em desenvolvimento (controle: 7,9 ± 3,0% versus anti-M2: 3,3 ± 1,3%; p=0,012). A proliferação celular na camada média do vaso em 5 dias pós-lesão vascular apresentou redução estatisticamente significativa de 64% com o bloqueio da interação alfaMbeta2-GP Ibalfa (controle: 5,0 ± 2,9% do total de células na camada média; versus anti-M2: 1,8 ± 0,5%; p=0,043), assim como houve diminuição significativa de 47% da proliferação celular na camada íntima do vaso em 28 dias (controle: 3,8 ± 1,7% do total de células na camada íntima; versus anti-M2: 2,0 ± 1,2%; p=0,047). O bloqueio da interação alfaMbeta2-GP Ibalfa também determinou redução estatisticamente significativa de 56% do espessamento intimal em 28 dias (controle: 10.395 ± 3.549um2; versus anti-M2: 4.561 ± 4.915um2; p=0,012). CONCLUSÕES: O recrutamento de leucócitos após a lesão vascular é dependente da interação alfaMbeta2-GP Ibalfa e a neutralização desta interação inibe a proliferação celular e a formação neointimal. / INTRODUCTION: The interaction between leukocytes and platelets is fundamental for the beginning and the progression of restenosis and atherosclerosis. Recent in vitro studies have shown that the leukocyte integrin Mac-1 binds to the platelet glycoprotein (GP) Ibalfa, and this interaction plays a central role in the leukocyte firm adhesion and transmigration at sites of platelet deposition. However, there is no in vivo study evaluating the importance of the integrin Mac-1 and GP Ibalfa (alfaMbeta2-GP Ibalfa) interaction in experimental models of vascular injury. METHODS: A peptide termed M2 or anti-M2 antibody was developed to block the leukocyte Mac-1 and platelet GP Ibalfa interaction, aiming to inhibit the adhesion of leukocytes to the platelet-coated surface of vessels as well as the cellular proliferation and the neointimal hyperplasia. The peptide was injected and compared with a control-antibody in C57B1/6J mice subjected to wire-induced femoral artery injury. One day (control: n= 6; anti-M2: n= 6), 5 days (control: n= 9; anti-M2: n= 9) or 28 days (control: n= 9; anti-M2: n= 9) after vascular injury, the femoral arteries were harvested for morphometry and immunohistochemistry. RESULTS: The alfaMbeta2-GP Ibalfa interaction blockade promoted a statistically significant 75% reduction in leukocytes in the medial layer on the first day after vascular injury (control: 7.9 ± 5.0% out of the total cells in the medial layer versus anti-M2: 2.0 ± 1.6%; p=0.021), as well as determined a statistically significant 42% decrease 5 days later (control: 42.3 ± 12.9% out of the total cells in the neointima versus anti-M2: 24.6 ± 10.8%; p=0.047), and a 58% decrease in leukocyte accumulation in the developing neointima 28 days later (control: 7.9 ± 3.0% versus anti-M2: 3.3 ± 1.3%; p=0.012). The cellular proliferation in the vessel medial layer 5 days after vascular injury presented a statistically significant 64% reduction by the alfaMbeta2-GP Ibalfa interaction blockade (control: 5.0 ± 2.9% out of the total cells in the medial layer versus anti-M2: 1.8 ± 0.5%; p=0.043), and there was also a significant 47% decrease in the vessel intimal layer cellular proliferation 28 days later (control: 3.8 ± 1.7% out of the total cells in the intimal layer versus anti-M2: 2.0 ± 1.2%; p=0.047). Furthermore, the alfaMbeta2-GP Ibalfa interaction blockade determined a statistically significant 56% reduction in the intimal thickening 28 days after vascular injury (control: 10,395 ± 3,549um2 versus anti-M2: 4,561 ± 4,915um2; p=0.012). CONCLUSIONS: The leukocyte recruitment after vascular injury depends on the alfaMbeta2-GP Ibalfa interaction, and its neutralization inhibits cellular proliferation and neointimal formation.

A adesão celular está ligada à formação e disseminação de metástases, a principal causa de óbito de pacientes diagnosticados com câncer. O objetivo deste trabalho foi investigar in vitro o efeito de fotossensibilizadores na adesão celular. Foram utilizadas porfirinas comerciais (PpIX, CPpI, TSPP, TMPyP e Zn(II)TMPyP) e um fotossensibilizador sintetizado através da ligação de poli-L-lisina à protoporfirina IX (PLLPpIX). A adesão celular foi estudada por RICM, técnica que permite quantificar a área de contato entre uma célula e um substrato por binarização das imagens digitais utilizando limiares apropriados. A técnica foi padronizada e revelou dois regimes de adesão celular: um limitado e outro não limitado pela quantidade de proteína de adesão adsorvida na superfície. Neste último foi observada lise celular. Todos os fotossensibilizadores estudados foram capazes de aumentar a adesão celular na ausência de irradiação comparados ao controle sem fotossensibilizador, o que não havia sido observado nos ensaios de resistência à tripsinização normalmente utilizados para estudar o efeito de fotossensibilizadores na adesão celular. Quanto maior a anfifilicidade do fotossensibilizador, maior foi o efeito na adesão, o que é explicado pela capacidade das moléculas em se intercalarem na membrana, mudando a sua rigidez. Este aumento da adesão no escuro correlaciona com a diminuição da migração segundo ensaios de ferida. A análise do padrão de expressão de integrinas na superfície celular revela que o aumento da adesão correlaciona com o aumento na expressão de &#945;V. Quando os fotossensibilizadores estão concentrados na região perimembranar (1 minuto de incubação) e as células são irradiadas, há um aumento da adesão em relação ao controle sem fotossensibilizador, mas uma diminuição em relação ao controle tratado com o fotossensibilizador e não irradiado, o que implica que a PDT leva a uma diminuição da adesão celular e não a um aumento como reportado na literatura. Com 3h de incubação, PLLPpIX impede a adesão celular, enquanto PpIX praticamente não muda a adesão comparado ao controle não irradiado. Esta ausência do efeito da irradiação sugere que a PpIX afeta a adesão celular principalmente devido a sua intercalação na membrana e não devido à formação de espécies reativas. Com 3h de incubação os fotossensibilizadores não se encontram na membrana e, portanto, o efeito na adesão celular é indireto e também não está relacionado à diferenças na eficiência de internalização. O comportamento observado deve ter relação com diferenças de citolocalização. Outro processo que pode alterar a adesão celular é a oxidação das proteínas do soro fetal bovino. Como observado nos estudos de fotossensibilização de células, PLLPpIX foi capaz de impedir a adesão celular, diferentemente da PpIX. A maior eficiência da PLLPpIX foi associada a presença do polímero, o qual força por questões estéricas que a interação da PLLPpIX com a albumina, o componente majoritário do soro, fique restrita à superfície da proteína, deixando o fotossensibilizador disponível para interagir com o oxigênio molecular e gerar oxigênio singlete. Assim, a funcionalização com um polímero tornou a PpIX capaz de modular a adesão celular tanto agindo dentro da célula quanto na matriz extracelular. / Cell adhesion is associated to the formation and spread of metastasis, the leading cause of death in cancer patients. The aim of this study was to investigate, in vitro, the effect of photosensitizers in cell adhesion. Five commercial porphyrins (PpIX, CPpI, TSPP, TMPyP e Zn(II)TMPyP) and Protoporphyrin IX covalently tethered to poli-L-lysine (PLLPpIX) were used. Cell adhesion was mainly studied by RICM, a technique that allows quantifying the contact area between a cell and a substrate for binarization of digital images using appropriate thresholds. The technique was standardized and disclosed two systems for cell adhesion: a system limited by the amount of adhesion proteina adsorbed on the surface and another one no limited, in which cell lysis was observed. All photosensitizers were able to enhance cell adhesion in the absence of irradiation compared to control without photosensitizer, which had not been observed in the trypsinization resistance tests usually used to study the effect of photosensitizers in cell adhesion. The greater the amphiphilicity of the photosensitizer, the greater was the effect on cell adhesion. This is explained by the ability of molecules to fit in the membrane, changing its tension. This increased adhesion correlates with the decrease in migration according to wound healing assays. Analysis of the integrin expression pattern on cell surface reveals that increased adhesion correlates with increased expression of alpha V. When photosensitizers are concentrated in the perimembranar region (1 minute of incubation) and cells are irradiated, there is an increase in adhesion when compared to control without photosensitizer, but a decrease relative to controls treated with the photosensitizer without irradiation, implying that PDT leads to a reduction of cell adhesion and not to an increase as reported in the literature. With 3h of incubation PLLPpIX prevents cell adhesion, while PpIX practically does not change the adhesion compared to dark control. This lack of effect of irradiation suggests that PpIX affects cell adhesion primarily because of its intercalation into the membrane and not due to the formation of reactive species. With 3h of incubation the photosensitizers are not on the membrane and therefore the effect on cell adhesion is indirect and it is not also related to differences in uptake efficiency. The observed behavior must be related to differences in subcellular localization arising from differences in molecular structure. Another process that can alter the cell adhesion is serum protein oxidation. As noted in the studies with cells, photosensitization of serum with PLLPpIX (but not with PpIX) was capable of preventing cell adhesion. The greater efficiency of PLLPpIX was associated with the presence of the polymer, which, by the steric hindrance, forces that interaction of PLLPpIX with albumin, the major serum component, is restricted to the protein surface, leaving the photosensitizer available to interact with molecular oxygen and generate singlet oxygen. Thus, the functionalization of a polymer has turned PpIX capable of modulating cell adhesion by acting both within and outside (in extracellular matrix) the cell

Orientador: Mônica Alonso Cotta / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Física Gleb Wataghin / Made available in DSpace on 2018-09-02T02:33:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Monteiro_MoniellenPires_D.pdf: 5193520 bytes, checksum: fab290a9074ae3dd188d4ebb636ff0e7 (MD5) Previous issue date: 2017 / Resumo: Nesta tese investigamos processos de adesão da Xylella fastidiosa, bactéria gram-negativa, fitopatógena, que forma biofilmes no xilema de plantas. O trabalho teve como objetivos entender alguns aspectos do processo de adesão bacteriana e do mecanismo de transporte de células e biofilmes em sistemas que simulam os vasos do xilema. Consideramos em particular as estratégias utilizadas pela X.fastidiosa para aderir à superfície, dentre elas, a secreção de substâncias poliméricas extracelulares (EPS), a presença de adesinas fimbriais (pili) e afimbriais (XadA1) e moléculas sinalizadoras de detecção de quórum (relacionadas à formação de agregados). Como ponto de partida quantificamos as propriedades elásticas do sistema composto pelo EPS e células bacterianas, em diferentes tempos de cultivo bacteriano. Para isso utilizamos medidas de espectroscopia de força e Raman confocal durante os estágios iniciais de adesão celular e formação de agregados. Mostramos que a rigidez do sistema célula/EPS diminui progressivamente com o aumento do tempo de crescimento bacteriano. Verificamos que existe uma mudança no valor de rigidez em diferentes partes da célula, região polar e corpo bacteriano; os menores valores de rigidez encontrados no polo sugerem uma resposta mecânica mais flexível nesta região, associada com o ponto de adesão inicial da célula à superfície. No estudo de adesão e mobilidade da X.fastidiosa, utilizamos dispositivos microfluídicos modificados quimicamente, via funcionalização de superfície (em microcanais Polidimetilsiloxano/vidro) e via introdução de molécula de detecção de quórum (em microcanais impressos em poliácido láctico), para tornar o ambiente mais próximo ao do xilema da planta. Foram feitas funcionalizações de superfície com uma celulose sintética, simulando a composição química dos vasos do xilema (majoritariamente composto por celulose), e com a adesina XadA1, e observamos os efeitos sobre a adesão, crescimento e mobilidade celular. Verificamos que a adesina XadA1 aumenta a densidade bacteriana se comparada às demais superficies, além de aumentar a força de adesão bacteriana à superfície. Quanto a inserção de molécula sinalizadora, observamos que a presença destas moléculas no cultivo bacteriano aumenta a densidade celular e altera a forma de pequenos agregados / Abstract: In this thesis we investigated the adhesion processes of Xylella fastidiosa, a gram-negative, phytopathogenic bacterium that forms biofilms in the xylem of plants. The objective of this work was the understanding of several aspects of the bacterial adhesion process, as well as the mechanism of cell and biofilm transport in systems that simulate xylem vessels. In particular, we considered the strategies used by X.fastidiosa to adhere to a surface; among them, the secretion of extracellular polymeric substances (EPS), the presence of fimbrial (pili) and afimbrial (XadA1) adhesins and quorum detection molecules (related to cluster formation). As a starting point we quantified the elastic properties of the system composed of EPS and bacterial cells, at different times of bacterial culture. For this purpose, we used force spectroscopy and confocal Raman measurements during the initial stages of cell adhesion and cluster formation. We have shown that stiffness decreases progressively with increasing bacterial growth time. We observed that stiffness values varied along different parts of the cell, polar region and bacterial body. The lower stiffness values found at the pole suggest a more flexible mechanical response in this region, associated with the initial adhesion point of the cell to the surface. For the investigation on X.fastidiosa adhesion and mobility, we used chemically modified microfluidic devices via surface functionalization (in Polydimethylsiloxane / glass microchannels) and via the introduction of a quorum detection molecule (in microchannels printed on polylactic acid) to make the environment more closely resemble the plant xylem. Surface functionalizations were performed with a synthetic cellulose, simulating the chemical composition of xylem vessels (mainly composed of cellulose), and the XadA1 adhesin, and we observed the effects on cell adhesion, growth and mobility. Our results showed that immobilized XadA1 increased the bacterial density when compared to other surfaces studied; furthermore, it increased the bacterial adhesion force to the surface. Regarding the addition of the signaling molecules, we observed that their presence in the bacterial culture increases cell density and changes the shape of small clusters / Doutorado / Física / Doutora em Ciências / 2010/51748-7 / 479486/2012-3 / FAPESP / CNPQ

A lagarta da espécie Lonomia obliqua é medicamente importante, cujo veneno, presente nas espículas, causa uma síndrome hemorrágica caracterizada por equimoses, alterações da coagulação, dentre outros sintomas. Isto sugere a presença de peptídeos bioativos com potencial farmacêutico, devido à capacidade de modular o comportamento das células endoteliais. O objetivo deste estudo é analisar os potenciais efeitos do veneno de Lonomia obliqua na angiogênese. Uma linhagem celular endotelial (HUVEC) foi exposta a diferentes concentrações do extrato de espículas da Lonomia obliqua (Lonomia obliqua Bristle extract - LOBE) 5 μg/mL, 10 μg/mL, 20 μg/mL e 50 μg/mL. Empregando citometria de fluxo, observou-se que nenhuma das doses afetou o ciclo celular, viabilidade ou apoptose das células endoteliais após 24h de exposição. Os esferóides das células HUVEC foram plaqueados numa matriz 3D de colágeno e observou-se que LOBE (10 μg/mL, 20 μg/mL e 50 μg/mL) induz um aumento na migração celular, consistente com o processo de angiogênese. A análise da dinâmica da VE-caderina indica que a exposição imediata a LOBE (10 μg/mL) induz um desprendimento da junção célula-célula, o que corrobora com a hemorragia observada nas vítimas de envenenamento. Através de espectrometria de massa, observou-se que LOBE possui vários potenciais peptídeos bioativos. Grupos destes peptídeos foram isolados por fracionamento com metanol a partir do veneno bruto. Os peptídeos presentes, em cada uma das 10 frações, foram caracterizados por espectrometria de massa e foram analisados os efeitos de cada fração sobre a angiogênese. Os resultados sugerem que alguns dos efeitos do envenenamento por Lonomia obliqua são devidos à presença de peptídeos bioativos que modulam o comportamento das células endoteliais. / The caterpillar of the species Lonomia obliqua is medically important, whose venom present in the bristles leads to an hemorrhagic syndrome characterized by ecchymosis, coagulation disorders and others symptoms. This suggests the presence of bioactive peptides with pharmaceutical potencial due to the ability to modulate the behavior of endothelial cells. The aim of this study is to analyze the potential effects of Lonomia obliqua venom on angiogenesis. An endothelial cell line (HUVEC) was exposed to different concentrations (5 μg/mL, 10 μg/mL, 20 μg/mL and 50 μg/mL) of Lonomia obliqua bristle extract (LOBE). Using flow cytometry, it was observed that none of the doses affected endothelial cell cycle, cell viability or apoptosis after 24h of exposition. Spheroids of HUVEC cells were plated in a 3D-collagen matrix and it was observed that LOBE (10 μg/mL, 20 μg/mL and 50 μg/mL) induced an increase on cell migration consistent with the angiogenesis process. Analysis of VE-cadherin dynamics indicates that the immediate exposition to LOBE (10 μg/mL) induced a loosening of cell-cell junction, which corroborates with the hemorrhage observed in the victims. By mass spectroscopy, it was observed that LOBE possesses several potentially bioactive peptides. Groups of these peptides were isolated by a methanol-based fractioning of the crude venom. The peptides present in each of the 10 fractions were characterized by mass spectroscopy and it was analyzed the effects of each fraction on angiogenesis. The results suggest that some of the effects of Lonomia obliqua envenomation are due to the presence of bioactive peptides that modulate the behavior of endothelial cells.

Submitted by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2017-01-17T10:39:11Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Mariana Quirino Silveira Soares - 2013.pdf: 13435092 bytes, checksum: 9f0cdc0e0760b610575d58eeeda768a1 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2017-01-17T10:39:45Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Mariana Quirino Silveira Soares - 2013.pdf: 13435092 bytes, checksum: 9f0cdc0e0760b610575d58eeeda768a1 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-01-17T10:39:45Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Mariana Quirino Silveira Soares - 2013.pdf: 13435092 bytes, checksum: 9f0cdc0e0760b610575d58eeeda768a1 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2013-08-03 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / E-cadherin (E-cad), β-catenin (β-cat), α2β1 and α3β1 integrins play important roles in cell adhesion, and alterations of their expression have been reported in several neoplasms. Nevertheless, their participation in oral squamous cell carcinoma (OSCC) progression and metastasis remains controversial. The aim of this study was to investigate the immunoexpression of E-cad, β-cat, α2β1 and α3β1 integrins in non-metastatic and metastatic OSCC and in metastatic cells of positive cervical lymph nodes. Molecules’ immunoexpression was evaluated in forty samples of OSCC in Lesion’s Center (LC), Invasive Tumor Front (ITF) and in Metastatic Lymph Node Cells (MLNC) and classified as low expression (<50%) or high expression (≥50% ). Low cytoplasmic membrane expression and high cytoplasmic expression of E-cadherin was observed in LC and in the ITF in non-metastatic and metastatic groups. In LC, the β-catenin presented significantly lower expression in cytoplasmic membrane in metastatic OSCC (p= 0.013) and in ITF low expression was noticed in both groups. Integrins presented highly granular cytoplasmic expression regardless of the presence of metastasis in LC or ITF. When molecules’ expression was compared in metastatic OSCC in LC, ITF and MCLN, E-cadherin and β-catenin presented a significant decrease of cytoplasmic membrane (p= 0.007 and p= 0.043, respectively) and cytoplasmic expression (p= 0.021 and p= 0.002, respectively). Integrins presented high cytoplasmic expression in LC, ITF and MCLN. In conclusion, abnormal expression of E-cad and β-cat with loss of membranous and high cytoplasmic expression added to high expressiveness of α2β1 and α3β1 integrins suggest that these molecules contribute to lymph node metastasis in OSCC. / A E-caderina (E-cad), β-catenina (β-cat), integrinas α2β1 e α3β1 desempenham papéis importantes na adesão celular e alterações de sua expressão têm sido relatadas em diversos tipos de neoplasias. No entanto, sua participação na progressão e metastase do carcinoma espinocelular oral (CEC) permanece controversa. O objetivo deste estudo foi investigar a imunoexpressão da E-cad, β-cat e integrinas α2β1 e α3β1 na CEC não-metastático e metastático e em células metastáticas de linfonodos cervicais positivos. A imunoexpressão das moléculas foi avaliada em quarenta amostras de CEC, no centro de Lesão (CL), fronte de invasão tumoral (FIT) e nas células neoplasicas de linfonodos metastáticos (CNLM) e as amostras foram classificadas como baixa expressão (<50%) ou alta expressão (≥ 50%). A baixa expressão em membrana citoplasmática de E-cad e elevada expressão citoplasmática foi observada no CL e no FIT nos grupos não metastático e metastático. No CL, a β-cat apresentou significativamente menor expressão em membrana citoplasmática no CEC metastático (p= 0,013) e no FIT foi observada baixa expressão nos grupos metastáticos e não metastáticos. As integrinas apresentaram alta expressão citoplasmática granular, independentemente da presença de metástases no CL e no FIT. Quando a expressão das moléculas foi comparada no CEC metastático no CL, FIT e nas CNLM, a E-cad e a β-cat apresentaram uma diminuição significativa de expressão em membrana celular (p= 0,007 e p= 0,043, respectivamente) e em citoplasma (p= 0,021 e p= 0,002, respectivamente). Integrinas apresentaram alta expressão citoplasmática no CL, FIT e CNLM. Em conclusão, a expressão anormal de E-cad e β-cat com perda de expressão em membrana citoplasmática e alta expressão em citoplasma somada à alta expressividade de integrinas α2β1 e α3β1 sugerem que essas moléculas contribuem para a metástase em linfonodal em CEC.

Made available in DSpace on 2015-04-22T22:14:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 daniele barros de castro.pdf: 2223140 bytes, checksum: 269a3eddf50c97bcbed1bbb50151d917 (MD5) Previous issue date: 2010-09-10 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Hepatitis C is a major public health problem today, with approximately 170 million people infected worldwide. HCV is a highly immunogenic infectious agent leading to the development of an intense humoral and cellular response. However, about 80% of patients progress to a chronic disease may develop cirrhosis or liver cancer. The HCV infection of cells rapidly triggers intracellular signaling events leading to cytokine production and changes in the pattern of expression of cell adhesion molecules, providing a barrier to replication and viral spread. The aim of this study was to characterize the expression of adhesion molecules and cytokine profile in peripheral blood from blood donors of the Foundation HEMOAM HCV positive. For this, we analyzed blood samples from 50 individuals who were reactive in serological screening test for HCV, and as a negative control, we analyzed 53 samples of healthy blood donors. For analysis of expression of cell adhesion molecules in leukocytes, the samples were stained with monoclonal antibodies and analyzed by flow cytometry. Quantification of serum cytokine Th1, Th2 and Treg profile was performed by ELISA. The prevalence of HCV infection in the population of blood donors of the Foundation HEMOAM living in Manaus, from August/2009 to July/2010, was 0.1% and was greater prevalent in the group of first-time blood donors, compared to repeat blood donors. It was observed that the expression of cell adhesion molecules on leukocytes in peripheral blood is influenced by HCV infection, resulting in changes in the pattern of leukocyte recruitment to the liver and thus alters the course of the disease. There is evidence that the immune response against HCV in the population of blood donors, provide a toward Th1 profile, characterized by a high concentration of IL-12 and IL-10 in peripheral blood. The concentration of cytokines in peripheral blood from donors infected with HCV correlated with the expression pattern of cell adhesion molecules of leukocytes. However, our results reinforce the importance of the relationship between cell adhesion molecules, cytokine production and HCV infection. / A hepatite C é um grande problema de saúde pública atual, com aproximadamente 170 milhões de pessoas infectadas no mundo todo. O HCV é um agente infeccioso altamente imunogênico levando ao desenvolvimento de uma intensa resposta imune humoral e celular. Entretanto, cerca de 80% dos pacientes evoluem para uma doença crônica, podendo desenvolver cirrose hepática ou câncer. A infecção das células pelo HCV rapidamente desencadeia eventos sinalizadores intracelulares que levam à produção de citocinas e a mudanças no padrão de expressão de moléculas de adesão celular, propiciando uma barreira à replicação e à disseminação viral. O objetivo do presente estudo foi caracterizar a expressão de moléculas de adesão e o perfil de citocinas em sangue periférico de doadores de sangue da Fundação HEMOAM infectados pelo vírus da hepatite C. Para isso, foram analisadas amostras de sangue de 50 indivíduos que apresentaram reatividade nos teste da triagem sorológica para HCV e, como controle negativo, foram analisadas 53 amostras de doadores de sangue saudáveis. Para fenotipagem dos leucócitos quanto a expressão de moléculas de adesão celular as amostras foram marcadas com anticorpos monoclonais e analisadas por citometria de fluxo. A quantificação da concentração sérica das citocinas de perfil Th1, Th2 e Treg foi realizada por ELISA. A prevalência de infecção por HCV na população de doadores de sangue da Fundação HEMOAM, residentes em Manaus, no período de agosto/2009 a julho/2010, foi de 0,1%, sendo mais prevalente no grupo de primodoadores, quando comparado aos doadores de repetição. Foi observado que a expressão das moléculas de adesão celular em leucócitos no sangue periférico é influenciada pela infecção por HCV, o que resulta em alterações no padrão de recrutamento de leucócitos para o fígado e, consequentemente, altera o curso da doença. Há evidências de que a resposta imune contra o HCV, na população de doadores de sangue, apresente uma polarização para o perfil Th1, caracterizada por uma alta concentração de IL-12 e IL-10 no sangue periférico. A concentração de citocinas no sangue periférico de doadores infectados pelo HCV apresentou correlação com o padrão de expressão de moléculas de adesão celular dos leucócitos. Contudo, nossos resultados reforçam a importância da relação entre as moléculas de adesão celular, a produção de citocinas e a infecção pelo HCV.

A aterosclerose é uma doença degenerativa crônica dos vasos, com conseqüências clínicas agudas que incluem o infarto do miocárdio e o acidente vascular cerebral, resultantes geralmente da ruptura da placa e trombose. É atualmente reconhecida como de característica inflamatória, iniciada e propagada no contexto da hipercolesterolemia. Um trabalho de nosso grupo utilizou técnicas de phage display para comparar placas ateroscleróticas e carótidas normais objetivando a busca de proteínas alteradas potencialmente envolvidas na patogênese da doença. Diversas semaforinas e plexinas (receptores de semaforinas) foram identificadas dentre elas a plexina B1, que possui alta afinidade por CD100, sugerindo assim uma concentração aumentada de CD100 na placa aterosclerótica. CD100 foi a primeira semaforina descrita no sistema imune e a única até hoje descrita como possuidora de duas formas de funcionalidades distintas, sendo uma de membrana (mCD100) e outra solúvel (sCD100). Neste trabalho demonstramos a expressão da semaforina CD100 em macrófagos e células espumosas em placas ateroscleróticas humanas, assim como seu padrão de expressão ao longo da diferenciação monócito-macrófago-célula espumosa, e sob estímulos distintos. Além disso, identificamos pela primeira vez o receptor que medeia suas atividades nessas células, a plexina B2. Adicionalmente, detectamos também pela primeira vez detectamos a expressão de CD100 em células endoteliais teciduais e cultivadas in vitro, o que sugere um papel significativo da semaforina em fenômenos vasculares. Com base nessas observações e nos resultados de experimentos de bloqueio de adesão constatamos que CD100 pode atuar na fase mais precoce da aterosclerose, como uma molécula de adesão envolvida na ligação entre monócitos e células endoteliais. Verificamos ainda que CD100 diminui a captação de LDLox em macrófagos e células espumosas. Poucos estudos relatam a presença ou possível atividade biológica de CD100 tanto na aterosclerose quanto em macrófagos. Devido às já estabelecidas ações no sistema imune, acreditamos que a expressão diferencial dessa semaforina desempenha um papel amplificador na patogênese da aterosclerose. Posteriormente, essa proteína poderá servir como alvo de inibição da progressão da doença e de suas complicações / Atherosclerosis is a chronic degenerative disease affecting vessels, with acute clinical consequences that include myocardium infarction or stroke, generally resulting from plaque rupture and thrombosis. It is now recognized as an inflammatory disease, initiated and developed in a hipercholesterolemic context. A work in our lab has used phage display techniques to compare atherosclerotic plaques and normal carotids, searching for altered proteins potentially involved in the pathogenesis of the disease. Many semaphorins and plexins (semaphorin receptors) have been identified, among which plexin B1, a high affinity receptor for CD100, suggesting an augmented level of CD100 in the atherosclerotic plaques. CD100 is the first semaphorin described in the immune system, and the only to possess two forms with distinct functionalities, being one associated to the membrane, mCD100, and another soluble form, sCD100. In the present work we have demonstrated CD100 expression in macrophages and foam cells of human atherosclerotic plaques, as well as its pattern of expression along monocyte-macrophage-foam cell differentiation and under distinct stimuli. Furthermore, we have identified for the first time the receptor involved in CD100 activities in these cells, namely plexin B2. Aditionally, we have detected CD100 expression in tissue as well as in in vitro cultured endothelial cells, also for the first time. According to these informations and adhesion blockage experiments we have shown that CD100 may act in the earliest phase of the establishment of atherosclerosis, as an adhesion molecule involved in monocyte-endothelial cell association. We have also verified that CD100 diminishes the intake of oxLDL in macrophages and foam cells. Only a few studies describe the presence or possible biological activity of CD100 in atherosclerosis or macrophages. Since the molecule has been shown to participate in the immune system, we believe that the differential expression of this semaphorin plays an amplifying role in the pathogenesis of atherosclerosis. In the future, this protein could act as an inhibition target of the disease progression as well as its complications