É grande a preocupação na identificação de compostos envolvidos no desenvolvimento de processos deletérios, como o câncer. O tetraidrofurano (THF) é um solvente amplamente utilizado em indústria e pesquisa e estudos recentes indicaram uma atividade carcinogênica em animais experimentais, incentivando a investigação da sua possível interação com biomoléculas. Adutos de DNA servem como marcadores para a identificação da atividade genotóxica de substâncias e para o monitoramento da exposição humana aos agentes genotóxicos. Estudos realizados in vitro, em células em cultura, bem como em animais experimentais, permitem que mecanismos sejam desvendados e metodologias sejam desenvolvidas para uma posterior avaliação da exposição humana. O contínuo desenvolvimento de técnicas de análise de adutos em DNA para monitoramento biológico constitui importante preocupação para pesquisadores envolvidos com a saúde ocupacional e a medicina preventiva. No presente trabalho foi investigada a reação de produtos de oxidação do THF com os nucleosídeos 2\'-desoxiadenosina (dAdo) e 2\'-desoxicitidina (dCyd). As estruturas dos adutos formados foram elucidadas por análises de espectros de massas (ESI/MS-MS) e ressonância magnética nuclear (RMN) após purificação de quantidade suficiente dos produtos por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC). Com isso, foi aberta a possibilidade de validação de novos marcadores de exposição a THF. Tais lesões foram detectadas em DNA incubado com THF oxidado in vitro, após o desenvolvimento de uma metodologia sensível e seletiva baseada em HPLC/ESI/MS-MS. Além disso, camundongos foram expostos a vapor de THF e foi feita análise de dano oxidativo (8-oxo-2-desoxiguanosina) no DNA de fígado e rim. Um aumento de aproximadamente oito vezes no nível de 8-oxo-2-desoxiguanosina foi observado no DNA dos órgãos dos camundongos expostos ao THF. Nossos estudos in vitro apontam para a possibilidade de ação genotóxica do THF oxidado (formação de adutos com o DNA). A ocorrência dessa via in vivo será investigada em estudos posteriores. Adicionalmente, há aumento de dano oxidativo em órgãos alvos de carcinogênese induzida por esse solvente. / There is a huge concern to identify compounds involved in the development of harmful processes, like cancer. Tetrahydrofuran (THF) is a solvent widely used in industries and recent researches and studies indicated a carcinogenic activity in experimental animals, instigating the investigation of its possible interaction with biomolecules. DNA adducts are used as markers for the identification of genotoxic activity of substances and monitoring the human exposition to genotoxic agents. Studies carried out in vitro, in culture cells and in experimental animals allow to disclose mechanisms and develop methodologies for a posterior evaluation of the human exposition. The continuous development of techniques for the analysis of DNA adducts for biological monitoring constitutes a remarkable concern for the researchers involved with occupational health and preventive medicine. In the present paper, the reaction of THF oxidation products with the nucleosides 2\'-deoxyadenosine (dAdo) and 2\'-deoxycitidine (dCyd) were investigated. The structures of the formed adducts were elucidated by mass spectra analysis (ESI/MS-MS) and nuclear magnetic resonance (RMN) after purification of sufficient quantities of the products by high-performance liquid chromatography (HPLC). Thus, the validation of new markers of exposition to THF was made possible. Such damages were detected in DNA incubated with oxidized THF in vitro, after the development of a sensible and selective methodology based on HPLC/ESI/MS-MS. Moreover, mice were exposed to THF vapors and an oxidative damage analysis (8-oxo-2\'-deoxyguanosine) was carried out on DNA from liver and kidney. An approximate 8-fold increase in the level of 8-oxo-2\'-deoxyguanosine was observed on DNA from the mices organs exposed to THF. Our in vitro studies indicate the possibility of oxidized THF genotoxic action (formation of adducts with DNA). The occurrence of this path in vivo will be investigated in future studies. In addition, the oxidative damage in target organs of carcinogenesis induced by this solvent was increased.

Os efeitos de ribonucleosídeos de guanina substituídos na posição C-8 na proliferação de linfócitos B estão bem documentados na literatura. Esses compostos são análogos de adutos formados pela adição de radicais livres a ribonucleosídeos e a RNA. Neste trabalho, verificamos as propriedades proliferativas de dois desses adutos, 8-metilguanosina (8-MeGuo) e 8-oxo-7 ,8-di-hidroguanosina (8-OxoGuo) e comparamos com 8-bromoguanosina (8-BrGuo), o composto mais estudado como indutor da proliferação de linfócitos B. 8-MeGuo e 8-OxoGuo foram sintetisados em rendimentos de 28 e 55%, respectivamente, e foram caracterizados por UV, NMR e CG-massa. Seus efeitos sobre a incorporação de timidina radioativa ([3H] TdR) no DNA de células de baço, fibroblasto 3T3(A31) e melanoma B16F10 foram examinados. Os dois adutos foram mitogênicos para células de baço mas foram seletivos quanto as células imortalizadas. 8-MeGuo atuou sobre células 3T3(A31) e 8-OxoGuo sobre as células de melanoma B16F10. O análogo não fisiológico 8-BrGuo foi efetivo em todas as células testadas. Experimentos de contagem de células, citotoxicidade e citometria de fluxo, indicaram que a síntese de DNA induzida pelas guanosinas substituídas na posição C-8 refletia crescimento celular. Foi proposto que os compostos agem de dentro da célula uma vez que seus efeitos são bloqueados em presença de um inibidor de transporte de nucleosídeo, mas não foram inibidos por um antagonista de receptor purinérgico. Os resultados obtidos, junto com os descritos na literatura, sugerem que no caso dos fibroblastos 3T3(A31) e células de baço de camundongo os efeitos proliferativos dos compostos não são dependentes do metabolismo desses compostos via salvação das purinas. No caso das células de melanoma, entretanto, os compostos parecem fazer parte do \"pool\" de nucleosídeos. A demonstração de que adutos produzidos por ataques radicalares em ribonucleosídeos e RNA são capazes de induzir proliferação celular, abre novas perspectivas para a compreensão do papel de radicais livres em processos carcinogênicos. / The ability of CS-substituted guanine ribonucleosides to induce B cell proliferation has been well documented in the literature. These compounds are analogues of adducts formed from free radical attack on ribonucleosides and RNA. Here we examined the proliferative properties of two of these radical adducts, 8-methylguanosine (8-MeGuo) and 8-oxo-7 ,8-dihydroguanosine (8-OxoGuo) and compared them with those of the well studied B cell mitogen, 8-bromoguanosine (8-BrGuo). 8-MeGuo and 8-OxoGuo were synthesized in yields of 28 and 55 %, respectively, and were characterized by UV, NMR and CG-MS. Their effects upon [3H] thymidine uptake by Swiss mice splenocytes, mouse embryo 3T3 (A31) fibroblasts and mouse B16F10 melanocytes were examined. Both guanosine radical adducts were shown to increase [3H] thymidine uptake by mice splenocytes but displayed selectivity in regard to continuous cell lines. 8-MeGuo acted upon 3T3(A31) fibroblasts whereas 8-OxoGuo acted upon B16F10 melanocytes. The non physiological analogue 8-BrGuo acted upon all tested cells. Parallel experiments of cell counting, cytotoxicity, and cell sorting indicated that DNA synthesis induced by the C8-substituted guanosines reflected cell growth. It is proposed that the compounds act intracellularly because their proliferative effects were blocked in the presence of a nucleoside transport inhibitor but were not inhibited by an antagonist of the A2 purine receptor. The obtained results, taken together with data from the literature suggest that in the case of 3T3 (A31) fibroblasts and mice splenocytes the proliferative effects of the compounds are not dependent on metabolism through purine salvage pathways. In the case of melanocytes, however, the compounds are likely to become part of the purine nucleoside pool. The demonstration that adducts produced by free radical attack on ribonucleosides and RNA are able to induce cell proliferation opens new perspectives for the understanding of free radical mediated carcinogenesis.

Tetraidrofurano (THF) é um solvente muito utilizado industrialmente, com demonstrada ação carcinogênica em animais experimentais, mas pouco se sabe sobre sua toxicidade celular, danos a biomoléculas e genotoxicidade. Em trabalho anterior realizado no laboratório, foi verificado que adutos de DNA são formados a partir da reação de THF oxidado com 2\'-desoxiguanosina (dGuo), 2\'-desoxiadenosina (dAdo) e 2\'-desoxicitidina (dCyd) in vitro. A ocorrência dessas lesões em sistemas biológicos expostos a THF nunca foi demonstrada e pode indicar uma via de ação genotóxica desse solvente, até o momento não considerada nos estudos de carcinogênese e toxicidade. Neste trabalho foi investigada a indução de lesões em DNA e RNA de sistemas biológicos expostos ao THF, assim como alterações epigenéticas. Como sistemas biológicos foram utilizados homogenato de fígado de camundongos, cultura de células HepG2 e fígado e rim de camundongos que foram, em trabalho anterior, expostos a vapores do solvente. Métodos de HPLC-ESI-MS/MS foram validados para quantificação de todas as lesões em DNA. Foi verificado que THF é um solvente de baixa citoxicidade para células HepG2, sendo necessárias concentrações acima de 50 mM por período de incubação superior a 24 h para ser observada perda de viabilidade. Houve indução de dano oxidativo em DNA de células HepG2 e de fígado de camundongos expostos. Uma vez que o solvente esteja oxidado, a espécie reativa THF-OH presente no meio de cultura é capaz de reagir com RNA e DNA das células e DNA de homogenato de fígado de camundongos, gerando adutos com dAdo, dGuo e Ado. A espécie reativa possui maior afinidade por dGuo que por dAdo no DNA. Entretanto, as células HepG2 não biotransformaram THF para o intermediário reativo. Além disso, THF induziu hipermetilação no DNA das células HepG2 expostas a 50 e 100 mM do solvente e em DNA de fígado de camundongos fêmeas C57BL/6J expostos a vapores de THF (vapor de 1 mL/h, 6h/dia, 5 dias). Este estudo mostra pela primeira vez a reatividade do solvente THF oxidado (contendo THF-OH) com DNA e RNA em sistemas biológicos, assim como alteração epigenética induzida pelo solvente, e servirá para uma melhor compreensão dos mecanismos envolvidos na indução de câncer por THF. / Tetrahydrofuran (THF) is a widely used industrial solvent with demonstrated carcinogenic action in experimental animals, but little is known about its cellular toxicity and genotoxic damage to biomolecules. Previous work of this group showed that DNA adducts are formed from the reaction of oxidized THF with 2\'-deoxyguanosine (dGuo), 2\'-deoxyadenosine (dAdo), and 2\'-deoxycytidine (dCyd) in vitro. The occurrence of these lesions in biological systems exposed to THF has never been demonstrated and may indicate a genotoxic pathway of this solvent, so far not considered in carcinogenesis and toxicity studies. It was investigated here the induction of DNA and RNA lesions in biological systems exposed to THF, as well as epigenetic changes. The biological systems used were mice liver homogenate, HepG2 cell culture, and liver and kidney of mice that were exposed to solvent vapors in a previous work. HPLC-ESI-MS/MS methods were validated for quantitation of all lesions in DNA. It was found that THF is of low cytotoxicity to HepG2 cells, requiring concentrations above 50 mM for incubation period over 24 h to induce loss of viability. DNA oxidative damage was induced in HepG2 cells and liver of exposed mice. Once the solvent is oxidized, the reactive species THF-OH present in the culture medium is able to react with DNA and RNA of HepG2 cells and DNA from mice liver homogenate, generating adducts with dAdo, dGuo and Ado. The reactive species has higher affinity for dGuo than for dAdo in DNA. However, HepG2 cells were not able to activate THF to the reactive intermediate. In addition, THF induced DNA hypermethylation in HepG2 cells exposed to 50 and 100 mM of the solvent and in liver of C57BL/6J female mice exposed to THF vapors (1 mL vapor / h 6h/dia, 5 days). This study shows for the first time the reactivity of oxidized THF (containing THF-OH) with DNA and RNA in biological systems, as well as epigenetic change induced by the solvent, and may contribute for a better understanding of the mechanisms involved in the induction of cancer by THF.

Bisfenol A (BPA) é um insumo largamente utilizado na produção de plástico policarbonato e amplamente difundido no meio ambiente, levando o ser humano à exposição crônica desde o período intrauterino. A literatura aponta a possibilidade de BPA aumentar o risco de diversos tipos de câncer, mas são necessários estudos que possibilitem o entendimento de mecanismos pelos quais isso pode ocorrer. Neste trabalho foram investigados os efeitos do BPA ou nitro-BPA em células HL-60, MCF-7 e tecidos de ratos. Células HL-60 foram expostas ao BPA ou nitro-BPA nas concentrações de 25, 100 e 250 µM (0,1 % DMSO v/v) por 2, 24 ou 48 horas na presença ou ausência de H2O2 (40 nmol/5 x 104 células). Células MCF-7 foram expostas da mesma forma, sem o uso de H2O2, mas na presença e ausência de agonista (PCB) de receptor Ah. Ratos Sprague-Dawley machos receberam BPA diariamente ao longo de 4 semanas (50 mg/kg de peso corpóreo) por gavagem, na vigência e ausência de diabetes, com subsequente coleta de urina, fígado, rins, medula óssea e sangue. Nos experimentos com as células, a viabilidade, ciclo celular, fragmentação do DNA e a produção intracelular de espécies reativas de oxigênio (ROs) foram avaliadas por citometria de fluxo, a atividade da cadeia respiratória mitocondrial pelo ensaio do XTT, e a atividade de MPO de células HL-60 por ensaio de fluorescência, bem como a produção de •NO. A metilação e hidroximetilação global do DNA e os adutos 8-oxodG, CEdG, 1,N6-εdA, 1,N2-εdG e BPA-Gua no DNA das células, tecidos, meio de cultura e urina foram analisados por HPLC-ESI-MS/MS. O hemograma e mielograma dos animais foram obtidos no Laboratório de Hematologia Experimental da FCF USP. Observou-se que tanto BPA quanto nitro-BPA induziram a geração de ROS em células HL-60 logo após 2h de incubação. BPA levou subsequentemente à perda de atividade da cadeia respiratória mitocondrial, aumento da permeabilidade da membrana plasmática, fragmentação do DNA, parada na fase G2/M do ciclo celular e hipermetilação acompanhada de hipohidroximetilação global do DNA. A citotoxicidade induzida pelas mesmas concentrações de nitro-BPA em células HL-60 foi menos pronunciada, sem perda de atividade da cadeia respiratória mitocondrial, com pouca fragmentação do DNA, mas com parada na fase G0/G1 do ciclo celular e indução de hipohidroximetilação global do DNA na presença de H2O2. Não foi observada a indução de adutos de DNA nas células HL-60 incubadas com BPA, mas sim de CEdG nas células incubadas com nitro-BPA. Os dados obtidos a partir da exposição das células HL-60 a BPA e nitro-BPA nos indicam que as duas moléculas provocam alterações metabólicas distintas nesse tipo celular, independentes da via estrogênica, que levam a alterações predominantemente epigenéticas (BPA) ou genéticas e epigenéticas (nitro-BPA), que podem ter consequências fenotípicas, como progressão maligna, que precisam ser investigadas. Foi observado que as células MCF-7 são mais resistentes que as células HL-60 à citotoxicidade induzida por BPA e nitro-BPA. Como resultado da exposição das células MCF-7 a BPA, houve pequeno aumento da permeabilidade da membrana plasmática (250 µM), indução dos níveis de ROS após 24 h (25 µM) e aumento da população de células em sub G1, ou seja, com DNA fragmentado (100 µM e 250 µM), mas sem alteração do ciclo celular. No caso de nitro-BPA, foi observada parada do ciclo celular em G2/M (25 µM, 100 µM e 250 µM), assim como aumento de permeabilidade da membrana plasmática após 24 h de incubação (25 µM, 250 µM), sem indução de ROS ou aumento de células em sub G1. Entretanto, observou-se aumento dos níveis de CEdG e 8-oxodG no DNA das células incubadas com BPA (100 µM, 250 µM) sem a ativação prévia de receptores Ah. A ativação dos receptores Ah com PCB levou a menor aumento do nível das lesões após as incubações com BPA. A maior resistência das células MCF-7 aos efeitos citotóxicos do BPA está provavelmente relacionada à ação estrogênica desse xenobiótico. A sinalização estrogênica juntamente com o aumento dos níveis de lesões no DNA aumenta a chance de mutações e de transformação maligna. Nas células com ativação do receptor Ah, BPA levou ainda ao aumento da hidroximetilação global, sem alteração da metilação global do DNA. Os animais não diabéticos expostos ao BPA apresentaram quantidades diminuídas de promielócitos, blastos e bastonetes na medula óssea (aplasia medular), sem alteração no hemograma. Houve aumento dos níveis de CEdG no fígado, da metilação e hidroximetilação global do DNA hepático, e não foi observada alteração das marcas epigenéticas e adutos de DNA no rim ou na urina. Os animais diabéticos expostos ao BPA apresentaram aumento do número de eosinófilos e linfócitos na medula óssea, podendo-se sugerir a indução de um estado inflamatório alérgico, e aumento do número total de hemácias circulantes e do hematócrito. Houve aumento dos níveis de CEdG, da metilação e hidroximetilação global do DNA hepático, aumento dos níveis de 8-oxodG no DNA renal, sem alteração das marcas epigenéticas no rim, e não foi observada alteração dos adutos de DNA na urina. Os dados obtidos apontam para a geração de ROS como uma importante via de cito- e genotoxicidade induzidas por BPA. Sua biotransformação para BPA-3,4- quinona nos modelos utilizados parece ter menor importância para os efeitos, uma vez que não foi detectada a lesão BPA-Gua em nenhuma amostra de DNA, meio de cultura das células ou urina dos animais. Alterações metabólicas induzidas por BPA e ROS podem favorecer as alterações das marcas epigenéticas observadas no DNA das células HL-60, MCF-7 e fígado dos animais. Todas essas alterações podem contribuir para a transformação maligna de células expostas ao BPA. / Bisphenol A (BPA) is a compound widely used in polycarbonate plastic production and widespread in the environment, humans are chronic exposed to BPA in intrauterine period and entire life. The literature suggests the possibility of BPA increase the risk of developing cancers, but studies are required to enable the understanding of mechanisms by which this can occur. HL -60 cells were exposed to BPA or nitro-BPA at concentrations of 25, 100 and 250 uM (0.1% DMSO v/v) for 2, 24 or 48 hours in presence or absence of H2O2 (40 nmol/5x104 cells), MCF-7 cells followed a similar profile of exposure without the use of H2O2, but in presence or absence of Ah agonist receptor (PCB126). Male Sprague-Dawley rats received BPA daily over 4 weeks (50 mg/kg body weight) by gavage in presence and absence of diabetes, with subsequent collection of urine, liver, kidney, bone marrow and circulating blood. The viability, cell cycle, DNA fragmentation and the intracellular production of reactive oxygen species (ROS) was evaluated by flow cytometry, MPO activity and NO production was evaluated by fluorescence assay for HL- 60 cells, mitochondrial activity by XTT assay, and the global DNA methylation was checked by HPLC-PDA. DNA adducts 8-oxodG, CEdG, 1,N6-εdA, 1,N6-εdG and BPA-Gua were quantified by HPLC- ESI-MS/MS in DNA of cells, culture medium, urine and tissue collected from Sprague-Dawley rats. Blood count and bone marrow examination were obtained in collaboration with Experimental Hematology Laboratory of University of Sao Paulo We observed that both BPA and BPANO2 induced ROS generation in HL- 60 cells after 2 hours of incubation. BPA subsequently led to failure of mitochondrial respiratory chain activity, increased permeability of the plasma membrane, DNA fragmentation, arrest in G2/M phase of cell cycle, DNA hypermethylation with global hipohydroxymethylation. We saw low cytotoxicity in HL-60 cells induced by nitro-bpa n the same concentration, without loss of mitochondrial respiratory chain activity, discrete DNA fragmentation, but leading cell cycle to stopping at G0/G1 phase, and induction of DNA global hypermethylation. No lesions were observed in the DNA of HL-60 cells.The results obtained from the exposure of HL-60 cells to BPA and nitro-BPA indicate that these two molecules induce different metabolic abnormalities in this cell line, independent of estrogen pathway, leading to changes in epigenetic (BPA) or genetic and epigenetic (nitro-BPA) profile, that can induce phenotypic consequences such as malignant progression. It was observed along the study that MCF-7 cells are more resistant than HL-60 cells to cell damage induced by BPA and nitro-BPA. As a result of MCF-7 cells exposure to BPA, we saw a slight increase in membrane permeability (250 mM), ROS generation after 24h (25 mM) and increase in cell population in sub G1, so we had DNA fragmentation (100 uM and 250 uM), but with no effect on cell cycle. However, we observed increased levels of CEdG and 8-oxodG on DNA of cells incubated with BPA (100 uM, 250 mM) without prior activation of Ah receptors. The activation of Ah receptors with PCB took a small increase in the level of DNA lesions after incubations with BPA. MCF-7 cells resistance to the cytotoxic effects of BPA is probably related to estrogen action of this compound. Estrogen signaling in addition with the increased levels of DNA damage increases the chance of mutations and malignant transformation. In cells with Ah receptor activation, BPA also led to increased DNA global hydroxymethylation, without changing the global DNA methylation. Nondiabetic animals exposed to BPA had decreased amounts of promyelocytes, blasts and rods in the bone marrow, with any change in blood count. There were an increase of CEdG levels in liver, methylation and global hydroxymethylation on hepatic DNA, and was observed any alteration on epigenetic markers and DNA adducts in kidney or urine. On the other hand diabetic animals exposed to BPA showed increased numbers of eosinophils and lymphocytes in bone marrow, suggesting the induction of an allergic inflammatory state. There were increased levels of CEdG, methylation and global hydroxymethylation on hepatic DNA, increased 8-oxodG levels on kidney DNA without changing epigenetic markers, was not observed DNA adducts in urine. The data obtained indicate that the generation of ROS could be the major route of cytotoxic and genotoxic induced by BPA exposure. BPA biotransformation to BPA-3,4-quinone used in the models seem to have poor effects, since we was not detected BPA-Gua lesion in any DNA sample, culture medium of cells or urine of the animals. Metabolic changes induced by BPA and ROS can enable changes in epigenetic markers observed in the DNA of HL-60 cells, MCF-7 and liver tissue. All these changes may contribute to malignant transformation of cells that were exposed to BPA.

Tetraidrofurano (THF) é um solvente muito utilizado industrialmente, com demonstrada ação carcinogênica em animais experimentais, mas pouco se sabe sobre sua toxicidade celular, danos a biomoléculas e genotoxicidade. Em trabalho anterior realizado no laboratório, foi verificado que adutos de DNA são formados a partir da reação de THF oxidado com 2\'-desoxiguanosina (dGuo), 2\'-desoxiadenosina (dAdo) e 2\'-desoxicitidina (dCyd) in vitro. A ocorrência dessas lesões em sistemas biológicos expostos a THF nunca foi demonstrada e pode indicar uma via de ação genotóxica desse solvente, até o momento não considerada nos estudos de carcinogênese e toxicidade. Neste trabalho foi investigada a indução de lesões em DNA e RNA de sistemas biológicos expostos ao THF, assim como alterações epigenéticas. Como sistemas biológicos foram utilizados homogenato de fígado de camundongos, cultura de células HepG2 e fígado e rim de camundongos que foram, em trabalho anterior, expostos a vapores do solvente. Métodos de HPLC-ESI-MS/MS foram validados para quantificação de todas as lesões em DNA. Foi verificado que THF é um solvente de baixa citoxicidade para células HepG2, sendo necessárias concentrações acima de 50 mM por período de incubação superior a 24 h para ser observada perda de viabilidade. Houve indução de dano oxidativo em DNA de células HepG2 e de fígado de camundongos expostos. Uma vez que o solvente esteja oxidado, a espécie reativa THF-OH presente no meio de cultura é capaz de reagir com RNA e DNA das células e DNA de homogenato de fígado de camundongos, gerando adutos com dAdo, dGuo e Ado. A espécie reativa possui maior afinidade por dGuo que por dAdo no DNA. Entretanto, as células HepG2 não biotransformaram THF para o intermediário reativo. Além disso, THF induziu hipermetilação no DNA das células HepG2 expostas a 50 e 100 mM do solvente e em DNA de fígado de camundongos fêmeas C57BL/6J expostos a vapores de THF (vapor de 1 mL/h, 6h/dia, 5 dias). Este estudo mostra pela primeira vez a reatividade do solvente THF oxidado (contendo THF-OH) com DNA e RNA em sistemas biológicos, assim como alteração epigenética induzida pelo solvente, e servirá para uma melhor compreensão dos mecanismos envolvidos na indução de câncer por THF. / Tetrahydrofuran (THF) is a widely used industrial solvent with demonstrated carcinogenic action in experimental animals, but little is known about its cellular toxicity and genotoxic damage to biomolecules. Previous work of this group showed that DNA adducts are formed from the reaction of oxidized THF with 2\'-deoxyguanosine (dGuo), 2\'-deoxyadenosine (dAdo), and 2\'-deoxycytidine (dCyd) in vitro. The occurrence of these lesions in biological systems exposed to THF has never been demonstrated and may indicate a genotoxic pathway of this solvent, so far not considered in carcinogenesis and toxicity studies. It was investigated here the induction of DNA and RNA lesions in biological systems exposed to THF, as well as epigenetic changes. The biological systems used were mice liver homogenate, HepG2 cell culture, and liver and kidney of mice that were exposed to solvent vapors in a previous work. HPLC-ESI-MS/MS methods were validated for quantitation of all lesions in DNA. It was found that THF is of low cytotoxicity to HepG2 cells, requiring concentrations above 50 mM for incubation period over 24 h to induce loss of viability. DNA oxidative damage was induced in HepG2 cells and liver of exposed mice. Once the solvent is oxidized, the reactive species THF-OH present in the culture medium is able to react with DNA and RNA of HepG2 cells and DNA from mice liver homogenate, generating adducts with dAdo, dGuo and Ado. The reactive species has higher affinity for dGuo than for dAdo in DNA. However, HepG2 cells were not able to activate THF to the reactive intermediate. In addition, THF induced DNA hypermethylation in HepG2 cells exposed to 50 and 100 mM of the solvent and in liver of C57BL/6J female mice exposed to THF vapors (1 mL vapor / h 6h/dia, 5 days). This study shows for the first time the reactivity of oxidized THF (containing THF-OH) with DNA and RNA in biological systems, as well as epigenetic change induced by the solvent, and may contribute for a better understanding of the mechanisms involved in the induction of cancer by THF.

É grande a preocupação na identificação de compostos envolvidos no desenvolvimento de processos deletérios, como o câncer. O tetraidrofurano (THF) é um solvente amplamente utilizado em indústria e pesquisa e estudos recentes indicaram uma atividade carcinogênica em animais experimentais, incentivando a investigação da sua possível interação com biomoléculas. Adutos de DNA servem como marcadores para a identificação da atividade genotóxica de substâncias e para o monitoramento da exposição humana aos agentes genotóxicos. Estudos realizados in vitro, em células em cultura, bem como em animais experimentais, permitem que mecanismos sejam desvendados e metodologias sejam desenvolvidas para uma posterior avaliação da exposição humana. O contínuo desenvolvimento de técnicas de análise de adutos em DNA para monitoramento biológico constitui importante preocupação para pesquisadores envolvidos com a saúde ocupacional e a medicina preventiva. No presente trabalho foi investigada a reação de produtos de oxidação do THF com os nucleosídeos 2\'-desoxiadenosina (dAdo) e 2\'-desoxicitidina (dCyd). As estruturas dos adutos formados foram elucidadas por análises de espectros de massas (ESI/MS-MS) e ressonância magnética nuclear (RMN) após purificação de quantidade suficiente dos produtos por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC). Com isso, foi aberta a possibilidade de validação de novos marcadores de exposição a THF. Tais lesões foram detectadas em DNA incubado com THF oxidado in vitro, após o desenvolvimento de uma metodologia sensível e seletiva baseada em HPLC/ESI/MS-MS. Além disso, camundongos foram expostos a vapor de THF e foi feita análise de dano oxidativo (8-oxo-2-desoxiguanosina) no DNA de fígado e rim. Um aumento de aproximadamente oito vezes no nível de 8-oxo-2-desoxiguanosina foi observado no DNA dos órgãos dos camundongos expostos ao THF. Nossos estudos in vitro apontam para a possibilidade de ação genotóxica do THF oxidado (formação de adutos com o DNA). A ocorrência dessa via in vivo será investigada em estudos posteriores. Adicionalmente, há aumento de dano oxidativo em órgãos alvos de carcinogênese induzida por esse solvente. / There is a huge concern to identify compounds involved in the development of harmful processes, like cancer. Tetrahydrofuran (THF) is a solvent widely used in industries and recent researches and studies indicated a carcinogenic activity in experimental animals, instigating the investigation of its possible interaction with biomolecules. DNA adducts are used as markers for the identification of genotoxic activity of substances and monitoring the human exposition to genotoxic agents. Studies carried out in vitro, in culture cells and in experimental animals allow to disclose mechanisms and develop methodologies for a posterior evaluation of the human exposition. The continuous development of techniques for the analysis of DNA adducts for biological monitoring constitutes a remarkable concern for the researchers involved with occupational health and preventive medicine. In the present paper, the reaction of THF oxidation products with the nucleosides 2\'-deoxyadenosine (dAdo) and 2\'-deoxycitidine (dCyd) were investigated. The structures of the formed adducts were elucidated by mass spectra analysis (ESI/MS-MS) and nuclear magnetic resonance (RMN) after purification of sufficient quantities of the products by high-performance liquid chromatography (HPLC). Thus, the validation of new markers of exposition to THF was made possible. Such damages were detected in DNA incubated with oxidized THF in vitro, after the development of a sensible and selective methodology based on HPLC/ESI/MS-MS. Moreover, mice were exposed to THF vapors and an oxidative damage analysis (8-oxo-2\'-deoxyguanosine) was carried out on DNA from liver and kidney. An approximate 8-fold increase in the level of 8-oxo-2\'-deoxyguanosine was observed on DNA from the mices organs exposed to THF. Our in vitro studies indicate the possibility of oxidized THF genotoxic action (formation of adducts with DNA). The occurrence of this path in vivo will be investigated in future studies. In addition, the oxidative damage in target organs of carcinogenesis induced by this solvent was increased.

Made available in DSpace on 2015-05-14T13:21:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 2772098 bytes, checksum: 3c1518599ff53c3339b74cffefd4da7a (MD5) Previous issue date: 2010-09-28 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / In this work were synthesized, characterized and studied experimentally and theoretically, the compounds of general formula [MX3 (L)], where M = Sb or Bi, X = Cl, Br, L = 2,2'-bipyridine (Bpy), 1,10-phenanthroline (Phen). The synthesized compounds were characterized by elemental analysis (C, H, N, Cl and Br), thermal analysis (TG / DTA) and absorption spectroscopy in the infrared region. The results of elemental analysis suggest a stoichiometry of 1:1 salt / ligand in agreement with the stoichiometry suggested by thermogravimetric analysis. The infrared data of the ligands when compared with those of the adducts indicate a strengthening of the CC bonds, CN the aromatic ring with the coordination.The Thermochemical parameters were obtained experimentally by solution calorimetry. The enthalpy of reaction, acid-Lewis base, determined by calorimetry indicate the strongest basic character of Phen compared to metals. Enthalpies of metal-nitrogen bond follows the order of bonding strength: [BiBr3(Phen)] > [SbCl3(Phen)] > [BiBr3(Bpy)] > [SbCl3(Bpy)]. The theoretical studies were aimed to the structural properties and thermochemistry in the gas phase, through the semi-empirical PM3 method. The results of the calculations predict a geometry type distorted square pyramidal for all the adducts studied, indicating the strong influence of the lone pair of electrons of metals over distance of bond metal-nitrogen. Dipole moments are calculated in the range 10-14D, suggesting a large polar character of the compounds studied. / Nesse trabalho foram sintetizados, caracterizados e estudados experimentalmente e teoricamente, os compostos de formula geral [MX3(L)], onde M = Sb ou Bi; X= Cl, Br; L= 2,2 -bipiridina (Bpy) , 1,10-fenantrolina (Phen). Os compostos sintetizados foram caracterizados por análise elementar (C,H,N,Cl e Br), análise térmica (TG/DTA) e espectroscopia de absorção na região do infravermelho. Os resultados da analise elementar sugerem uma estequiometria de 1:1 sal/ligante em concordância com a estequiometria sugerida pela análise termogravimétrica. Os dados de infravermelho dos ligantes quando comparados com os do adutos indicam um fortalecimento das ligações CC,CN do anel aromático com a coordenação. Os parâmetros termoquímicos foram obtidos experimentalmente por calorimetria em solução. As entalpias de reação, ácido-base de Lewis, determinadas por calorimetria indicam o maior caráter básico da Phen frente aos metais estudados. Das entalpias de ligação metal-nitrogênio segue a ordem de força de ligação: [BiBr3(Phen)] > [SbCl3(Phen)] > [BiBr3(Bpy)] ] > [SbCl3(Bpy)]. Os estudos teóricos foram realizados visando as propriedades estruturais e termoquímicas em fase gasosa, através do método sem-empírico PM3. Os resultados dos cálculos predizem uma geometria do tipo pirâmide de base quadrada distorcida para todos os adutos estudados, indicando a forte influência do par de elétrons isolado dos metais sobre as distâncias de ligação metal-nitrogênio. Os momentos de dipolo calculados estão na faixa 10-14D, sugerindo um elevado caráter polar dos compostos estudados.

Submitted by Geandra Rodrigues (geandrar@gmail.com) on 2018-01-08T14:04:31Z No. of bitstreams: 1 leticiamoronilacerda.pdf: 1709656 bytes, checksum: e9330eeb2472bbbef60623d8c02b95fb (MD5) / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2018-01-22T18:43:42Z (GMT) No. of bitstreams: 1 leticiamoronilacerda.pdf: 1709656 bytes, checksum: e9330eeb2472bbbef60623d8c02b95fb (MD5) / Made available in DSpace on 2018-01-22T18:43:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 leticiamoronilacerda.pdf: 1709656 bytes, checksum: e9330eeb2472bbbef60623d8c02b95fb (MD5) Previous issue date: 2017-02-22 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Nos últimos anos, tem se notado uma mudança no perfil populacional, com consequente redução das doenças infectocontagiosas e aumento da prevalência de doenças crônicas não transmissíveis (DCNTs) que, em sua maioria, compartilham uma patogênese de caráter inflamatório. A inflamação é uma reação normal à perturbação da homeostase do tecido, seguida por uma fase de resolução e reparo. Dentre as células que participam do processo inflamatório, os macrófagos têm recebido grande atenção, uma vez que são responsáveis pela produção de uma grande variedade de mediadores, como citocinas, quimiocinas, espécies reativas de oxigênio e nitrogênio bem como mediadores lipídicos. Apesar de benéfica, a inflamação precisa ser finamente controlada visto que sua exacerbação pode resultar no surgimento de diversos tipos de patologias. Neste contexto, é crescente a necessidade de se desenvolver novos compostos capazes de atuar nos processos inflamatórios e/ou no câncer, de maneira efetiva e com o mínimo de efeitos adversos. Assim, o objetivo do presente estudo foi avaliar a atividade anti-inflamatória e antitumoral de novos adutos da reação de Morita-Baylis-Hillman (MBH), verificando se esta atividade tinha relação com uma possível atividade antioxidante, também testada. Para isso, primeiramente, foi determinada a viabilidade das células RAW 264.7 e J774A.1 após tratamento com adutos utilizando o ensaio de MTT. Em seguida, a ação destes adutos sobre a produção de óxido nítrico (NO), TNF-α, IL-6, CCL2 e moléculas coestimuladoras (CD80, CD86 e CD40) foi determinada em células RAW 264.7, enquanto sua ação sob a IL-1β foi determinada em células J774A.1. O melhor dos adutos foi também submetido aos testes in vivo em modelo murino de edema de orelha. Além disso, foi avaliada a viabilidade de células 4T1 e B16 tratadas com os compostos através do método do MTT enquanto a ação antioxidante foi determinada pelo teste de DPPH. Os resultados mostraram que somente um dos adutos apresentou citotoxicidade significativa na concentração de 75uM enquanto a 50uM nenhum dos adutos foi citotóxico. Concomitantemente, o tratamento com os adutos foi capaz de reduzir, a produção de NO, assim como de TNF-α, IL-6, IL-1β e CCL2. Os compostos também modularam a expressão das moléculas co-estimuladoras CD86 e CD40. In vivo, o aduto 4Br foi eficaz em reduzir o edema de orelha, o infiltrado inflamatório e a atividade da enzima mieloperoxidase (MPO), embora não tenha sido capaz de reduzir a produção de IL-1β, IL-6 e CCL-2 no tecido auricular. Em relação à viabilidade de células tumorais, cinco adutos foram tóxicos para células 4T1, enquanto seis deles foram efetivos em induzir a redução da viabillidade de células B16. Nenhum dos adutos apresentou atividade antioxidante, o que sugere que os mecanismos anti-inflamatórios e antitumorais desencadeados pelos adutos são independentes do potencial antioxidante. Os resultados encontrados até o momento sugerem uma possível aplicabilidade destes adutos em novas estratégias de combate a doenças inflamatórias e/ou na terapia contra o câncer. / Over the years, there has been a change in the population profile with a consequent reduction of infectious diseases and an increase in the prevalence of chronic noncommunicable diseases which, for the most of them, share an inflammatory pathogenesis. Inflammation is a normal reaction to disturbance of tissue homeostasis, followed by a resolution and repair phase. Among the cells that participate in the inflammatory process, macrophages have received great attention, since they are responsible for the production of a great variety of mediators, such as cytokines, chemokines, reactive species of oxygen and nitrogen as well as lipid mediators. Despite of beneficial, inflammation needs to be finely controlled since its exacerbation can result in the onset of various types of pathologies. In this context, the need to develop new compounds capable of acting in inflammatory processes and/or cancer is increasing in an effective way and with the minimum of adverse effects. Thus, the objective of the present study was to evaluate the anti-inflammatory and antitumor of new adducts of the Morita-Baylis-Hillman (MBH) reaction, verifying if this activity was related to a possible antioxidant activity, also tested. For this, the viability of RAW 264.7 and J774A.1 cells was determined after treatment with adducts using the MTT assay. The action of these adducts on the production of nitric oxide, TNF-α, IL-6, CCL2 and costimulatory molecules (CD80, CD86 and CD40) was determined in RAW 264.7 cells, while its action under IL- 1β was determined in J774A.1 cells. The best of the adducts was also submitted to in vivo tests in a murine model of ear edema. In addition, the viability of 4T1 and B16 cells treated with the compounds was assessed by the MTT method while the antioxidant action was determined by the DPPH test. The results showed that only one of the adducts presented significant cytotoxicity at the concentration of 75uM whereas at 50uM none of the adducts was cytotoxic. Concomitantly, treatment with adducts was able to reduce NO production, as well as TNF-α, IL-6, IL-1β and CCL2. The compounds also modulated the expression of CD86 and CD40 costimulatory molecules. In vivo, the 4Br adduct was effective in reducing ear edema, inflammatory infiltrate and myeloperoxidase enzyme activity. Although it was not able to reduce the production of IL-1β, IL-6 and CCL-2 in the tissue of the ears. Regarding the viability of tumor cells, five adducts were toxic to 4T1 cells, while six of them were effective in inducing the reduction of viability of B16 cells. None of the adducts presented antioxidant activity, which suggests that the anti-inflammatory and antitumor mechanisms triggered by the adducts are independent of the antioxidant potential. The result suggests a possible applicability of these adducts in new strategies to combat inflammatory diseases and/or cancer therapy.

Bisfenol A (BPA) é um insumo largamente utilizado na produção de plástico policarbonato e amplamente difundido no meio ambiente, levando o ser humano à exposição crônica desde o período intrauterino. A literatura aponta a possibilidade de BPA aumentar o risco de diversos tipos de câncer, mas são necessários estudos que possibilitem o entendimento de mecanismos pelos quais isso pode ocorrer. Neste trabalho foram investigados os efeitos do BPA ou nitro-BPA em células HL-60, MCF-7 e tecidos de ratos. Células HL-60 foram expostas ao BPA ou nitro-BPA nas concentrações de 25, 100 e 250 µM (0,1 % DMSO v/v) por 2, 24 ou 48 horas na presença ou ausência de H2O2 (40 nmol/5 x 104 células). Células MCF-7 foram expostas da mesma forma, sem o uso de H2O2, mas na presença e ausência de agonista (PCB) de receptor Ah. Ratos Sprague-Dawley machos receberam BPA diariamente ao longo de 4 semanas (50 mg/kg de peso corpóreo) por gavagem, na vigência e ausência de diabetes, com subsequente coleta de urina, fígado, rins, medula óssea e sangue. Nos experimentos com as células, a viabilidade, ciclo celular, fragmentação do DNA e a produção intracelular de espécies reativas de oxigênio (ROs) foram avaliadas por citometria de fluxo, a atividade da cadeia respiratória mitocondrial pelo ensaio do XTT, e a atividade de MPO de células HL-60 por ensaio de fluorescência, bem como a produção de •NO. A metilação e hidroximetilação global do DNA e os adutos 8-oxodG, CEdG, 1,N6-εdA, 1,N2-εdG e BPA-Gua no DNA das células, tecidos, meio de cultura e urina foram analisados por HPLC-ESI-MS/MS. O hemograma e mielograma dos animais foram obtidos no Laboratório de Hematologia Experimental da FCF USP. Observou-se que tanto BPA quanto nitro-BPA induziram a geração de ROS em células HL-60 logo após 2h de incubação. BPA levou subsequentemente à perda de atividade da cadeia respiratória mitocondrial, aumento da permeabilidade da membrana plasmática, fragmentação do DNA, parada na fase G2/M do ciclo celular e hipermetilação acompanhada de hipohidroximetilação global do DNA. A citotoxicidade induzida pelas mesmas concentrações de nitro-BPA em células HL-60 foi menos pronunciada, sem perda de atividade da cadeia respiratória mitocondrial, com pouca fragmentação do DNA, mas com parada na fase G0/G1 do ciclo celular e indução de hipohidroximetilação global do DNA na presença de H2O2. Não foi observada a indução de adutos de DNA nas células HL-60 incubadas com BPA, mas sim de CEdG nas células incubadas com nitro-BPA. Os dados obtidos a partir da exposição das células HL-60 a BPA e nitro-BPA nos indicam que as duas moléculas provocam alterações metabólicas distintas nesse tipo celular, independentes da via estrogênica, que levam a alterações predominantemente epigenéticas (BPA) ou genéticas e epigenéticas (nitro-BPA), que podem ter consequências fenotípicas, como progressão maligna, que precisam ser investigadas. Foi observado que as células MCF-7 são mais resistentes que as células HL-60 à citotoxicidade induzida por BPA e nitro-BPA. Como resultado da exposição das células MCF-7 a BPA, houve pequeno aumento da permeabilidade da membrana plasmática (250 µM), indução dos níveis de ROS após 24 h (25 µM) e aumento da população de células em sub G1, ou seja, com DNA fragmentado (100 µM e 250 µM), mas sem alteração do ciclo celular. No caso de nitro-BPA, foi observada parada do ciclo celular em G2/M (25 µM, 100 µM e 250 µM), assim como aumento de permeabilidade da membrana plasmática após 24 h de incubação (25 µM, 250 µM), sem indução de ROS ou aumento de células em sub G1. Entretanto, observou-se aumento dos níveis de CEdG e 8-oxodG no DNA das células incubadas com BPA (100 µM, 250 µM) sem a ativação prévia de receptores Ah. A ativação dos receptores Ah com PCB levou a menor aumento do nível das lesões após as incubações com BPA. A maior resistência das células MCF-7 aos efeitos citotóxicos do BPA está provavelmente relacionada à ação estrogênica desse xenobiótico. A sinalização estrogênica juntamente com o aumento dos níveis de lesões no DNA aumenta a chance de mutações e de transformação maligna. Nas células com ativação do receptor Ah, BPA levou ainda ao aumento da hidroximetilação global, sem alteração da metilação global do DNA. Os animais não diabéticos expostos ao BPA apresentaram quantidades diminuídas de promielócitos, blastos e bastonetes na medula óssea (aplasia medular), sem alteração no hemograma. Houve aumento dos níveis de CEdG no fígado, da metilação e hidroximetilação global do DNA hepático, e não foi observada alteração das marcas epigenéticas e adutos de DNA no rim ou na urina. Os animais diabéticos expostos ao BPA apresentaram aumento do número de eosinófilos e linfócitos na medula óssea, podendo-se sugerir a indução de um estado inflamatório alérgico, e aumento do número total de hemácias circulantes e do hematócrito. Houve aumento dos níveis de CEdG, da metilação e hidroximetilação global do DNA hepático, aumento dos níveis de 8-oxodG no DNA renal, sem alteração das marcas epigenéticas no rim, e não foi observada alteração dos adutos de DNA na urina. Os dados obtidos apontam para a geração de ROS como uma importante via de cito- e genotoxicidade induzidas por BPA. Sua biotransformação para BPA-3,4- quinona nos modelos utilizados parece ter menor importância para os efeitos, uma vez que não foi detectada a lesão BPA-Gua em nenhuma amostra de DNA, meio de cultura das células ou urina dos animais. Alterações metabólicas induzidas por BPA e ROS podem favorecer as alterações das marcas epigenéticas observadas no DNA das células HL-60, MCF-7 e fígado dos animais. Todas essas alterações podem contribuir para a transformação maligna de células expostas ao BPA. / Bisphenol A (BPA) is a compound widely used in polycarbonate plastic production and widespread in the environment, humans are chronic exposed to BPA in intrauterine period and entire life. The literature suggests the possibility of BPA increase the risk of developing cancers, but studies are required to enable the understanding of mechanisms by which this can occur. HL -60 cells were exposed to BPA or nitro-BPA at concentrations of 25, 100 and 250 uM (0.1% DMSO v/v) for 2, 24 or 48 hours in presence or absence of H2O2 (40 nmol/5x104 cells), MCF-7 cells followed a similar profile of exposure without the use of H2O2, but in presence or absence of Ah agonist receptor (PCB126). Male Sprague-Dawley rats received BPA daily over 4 weeks (50 mg/kg body weight) by gavage in presence and absence of diabetes, with subsequent collection of urine, liver, kidney, bone marrow and circulating blood. The viability, cell cycle, DNA fragmentation and the intracellular production of reactive oxygen species (ROS) was evaluated by flow cytometry, MPO activity and NO production was evaluated by fluorescence assay for HL- 60 cells, mitochondrial activity by XTT assay, and the global DNA methylation was checked by HPLC-PDA. DNA adducts 8-oxodG, CEdG, 1,N6-εdA, 1,N6-εdG and BPA-Gua were quantified by HPLC- ESI-MS/MS in DNA of cells, culture medium, urine and tissue collected from Sprague-Dawley rats. Blood count and bone marrow examination were obtained in collaboration with Experimental Hematology Laboratory of University of Sao Paulo We observed that both BPA and BPANO2 induced ROS generation in HL- 60 cells after 2 hours of incubation. BPA subsequently led to failure of mitochondrial respiratory chain activity, increased permeability of the plasma membrane, DNA fragmentation, arrest in G2/M phase of cell cycle, DNA hypermethylation with global hipohydroxymethylation. We saw low cytotoxicity in HL-60 cells induced by nitro-bpa n the same concentration, without loss of mitochondrial respiratory chain activity, discrete DNA fragmentation, but leading cell cycle to stopping at G0/G1 phase, and induction of DNA global hypermethylation. No lesions were observed in the DNA of HL-60 cells.The results obtained from the exposure of HL-60 cells to BPA and nitro-BPA indicate that these two molecules induce different metabolic abnormalities in this cell line, independent of estrogen pathway, leading to changes in epigenetic (BPA) or genetic and epigenetic (nitro-BPA) profile, that can induce phenotypic consequences such as malignant progression. It was observed along the study that MCF-7 cells are more resistant than HL-60 cells to cell damage induced by BPA and nitro-BPA. As a result of MCF-7 cells exposure to BPA, we saw a slight increase in membrane permeability (250 mM), ROS generation after 24h (25 mM) and increase in cell population in sub G1, so we had DNA fragmentation (100 uM and 250 uM), but with no effect on cell cycle. However, we observed increased levels of CEdG and 8-oxodG on DNA of cells incubated with BPA (100 uM, 250 mM) without prior activation of Ah receptors. The activation of Ah receptors with PCB took a small increase in the level of DNA lesions after incubations with BPA. MCF-7 cells resistance to the cytotoxic effects of BPA is probably related to estrogen action of this compound. Estrogen signaling in addition with the increased levels of DNA damage increases the chance of mutations and malignant transformation. In cells with Ah receptor activation, BPA also led to increased DNA global hydroxymethylation, without changing the global DNA methylation. Nondiabetic animals exposed to BPA had decreased amounts of promyelocytes, blasts and rods in the bone marrow, with any change in blood count. There were an increase of CEdG levels in liver, methylation and global hydroxymethylation on hepatic DNA, and was observed any alteration on epigenetic markers and DNA adducts in kidney or urine. On the other hand diabetic animals exposed to BPA showed increased numbers of eosinophils and lymphocytes in bone marrow, suggesting the induction of an allergic inflammatory state. There were increased levels of CEdG, methylation and global hydroxymethylation on hepatic DNA, increased 8-oxodG levels on kidney DNA without changing epigenetic markers, was not observed DNA adducts in urine. The data obtained indicate that the generation of ROS could be the major route of cytotoxic and genotoxic induced by BPA exposure. BPA biotransformation to BPA-3,4-quinone used in the models seem to have poor effects, since we was not detected BPA-Gua lesion in any DNA sample, culture medium of cells or urine of the animals. Metabolic changes induced by BPA and ROS can enable changes in epigenetic markers observed in the DNA of HL-60 cells, MCF-7 and liver tissue. All these changes may contribute to malignant transformation of cells that were exposed to BPA.

Globalmente, os problemas de poluição são mais severos em regiões densamente povoadas ou industrializadas. A Região Metropolitana de São Paulo (RMSP) é um exemplo de megalópole com um conjunto único de emissões, insolação e condições meteorológicas que determinam sua elevada poluição atmosférica. Entre os compostos mais tóxicos presentes nesta atmosfera estão os aldeídos, moléculas de grande potencial mutagênico e carcinogênico que podem ser originados da oxidação de combustíveis fósseis e etanol, além de possuir fontes endógenas. Sua adição covalente em biomoléculas como DNA e proteínas é estudada como mecanismo de sua ação mutagênica e carcinogênica. Desenvolvemos um método ultrassensível de HPLC acoplado à espectrometria de massas para análise simultânea de vários adutos de DNA com aldeídos presentes na atmosfera urbana como formaldeído, acetaldeído, crotonaldeído e acroleína, além de modificações oxidativas. Foram utilizados para validação da metodologia células modelo de Anemia Fanconi e tecido de músculo de ratos modelo para ELA (Esclerose Lateral Amiotrófica), os quais apresentaram níveis basais dos adutos de formaldeído, acetaldeído, acroleína e crotonaldeído. Outros modelos de exposição aos aldeídos foram utilizados na validação desta metodologia, como a fumaça de cigarro de tabaco e de cannabis sendo que a formação desses adutos também foi verificada em DNA de timo de bezerro. Pela primeira vez, foi mostrada a formação inequívoca do aduto de acetaldeído (1,N2-propanodGuo) em pulmões e cérebros de ratos Wistar expostos à 10 ppb de acetaldeído isotopicamente marcado e sua estrutura confirmada por espectrometria de massas de alta resolução. Esse resultado comprova o mecanismo de formação do aduto por meio da adição de duas moléculas de acetaldeído in vivo por inalação e em baixa concentração, sendo crucial para formulação de políticas públicas por agências ambientais. / Globally, air pollution problems are more severe in densely populated or industrialized regions. The Metropolitan Region of São Paulo (RMSP) is an example of a megalopolis with a unique set of emissions, insolation and meteorological conditions that determinates its high atmospheric pollution. Among the most toxic compounds present in this atmosphere are aldehydes, molecules of great mutagenic and carcinogenic potential that can be originated from the oxidation of fossil fuels and ethanol, besides having endogenous sources. Its covalent addition in biomolecules like DNA and proteins is studied as a mechanism of its mutagenic and carcinogenic action. We developed an ultra-sensitive HPLC method coupled with mass spectrometry for the simultaneous analysis of several DNA adducts with aldehydes present in the urban atmosphere as formaldehyde, acetaldehyde, crotonaldehyde and acrolein and oxidative lesions as well. To validate the method, we used a cell model of Fanconi Anemia and muscle tissue from a rat model for ALS (Amyotrophic Lateral Sclerosis) which presented basal levels of the adducts of formaldehyde, acetaldehyde, acrolein and crotonaldehyde. Other models of exposure to aldehydes were used to validate the method, such as tobacco and cannabis smoke and the formation of these adducts was also verified in Calf Thymus DNA. For the first time, the unequivocal formation of the acetaldehyde (1, N2-propanodGuo) adduct was shown in lungs and brains of Wistar rats exposed to 10 ppb of isotopically labeled acetaldehyde and its structure was confirmed by high resolution mass spectrometry. This result confirms the mechanism of adduct formation by the addition of two molecules of acetaldehyde in vivo by inhalation of a low concentration of acetaldehyde, being crucial for the formulation of public policies by environmental agencies.