Danos em biomoléculas podem ocorrer a partir de uma interação direta entre as biomoléculas e espécies reativas de oxigênio e nitrogênio como também, pela reação de produtos secundários dessas espécies como eletrófilos gerados na peroxidação lipídica. Alguns desses produtos secundários possuem estabilidade química maior que as espécies reativas das quais foram derivadas e podem se ligar covalentemente as biomoléculas comprometendo o funcionamento normal das mesmas. Portanto, modificações em proteínas por aldeídos gerados na lipoperoxidação têm sido investigadas por suas implicações com desordens patológicas relacionadas à agregação proteica, e modificações em diversas vias de sinalização amplificando os efeitos deletérios em sistemas biológicos. Os objetivos desse trabalho foi contribuir na elucidação dos mecanismos moleculares associados ao desenvolvimento da esclerose lateral amiotrófica (ELA) através da identificação, caracterização e quantificação de modificações póstraducionais em proteínas pelos aldeídos 4-hidroxi-2-hexenal (HHE) e trans-4-hidroxi-2-nonenal (HNE) in vitro (citocromo c) e in vivo (modelo ELA) a partir de técnicas de Western blot, imunoprecipitação e espectrometria de massa com abordagem proteômica de \"shotgun\" em ratosSOD1G93A modelo de esclerose lateral amiotrófica (ELA). Estudos com citocromo c mostraram a ligação dos aldeídos ao citocromo c e mecanismos de reação foram propostos. Foram encontrados seis peptídeos modificados por HHE e um para o HNE, e o peptídeo TGPNLHGLFGR se mostrou modificado pelos dois aldeídos paralelamente. Foi demonstrado que a histidina 33 é um \"hot spot\" frente as adições pelos aldeídos. Nas análises por western blot das proteínas ligadas a aldeídos foi possível observar uma tendência de aumento na concentração de proteínas ligadas ao HNE nos animais ELA, mais acentuada nas amostras de 70 dias comparadas ao controle. Com relação aos resultados obtidos com HHE tanto os animais pré-sintomáticos quanto os sintomáticos não apresentaram diferenças de HHE-proteína, tantonos controles quanto nos animais ELA. Nas amostras dos animais sintomáticos não detectamos diferença significativa na concentração de aldeído-proteína entre os grupos. Já as análises proteômicas revelaram 24 proteínas diferencialmente expressas, com destaque para proteínas com os maiores valores de significância (p-value), como a ubiquitina no grupo dos pré- sintomáticos e a neurogranina, no grupo dos animais sintomáticos e várias proteínas de metabolismo energético, de neurofilamentos, proteínas de processos redox e proteínas ligadas o metabolismo de cálcio (fundamentais na fisiopatologia em ELA). Algumas proteínas importantes foram encontradas com exclusividades nos grupos pré-sintomáticos e sintomáticos pelo diagrama de Venn. Com relação a proteínas modificadas pelos aldeídos, foram encontradas algumas relevantes como a proteína 2 de interação com a polimerase delta que foi modificada por HNE via adição de Michael encontrada nos animais ELA pré-sintomáticos e sintomáticos, a catalase que foi encontrada modificada por HNE via base de Schiff apenas nos ELA pré- sintomáticos, e a tiol redutase induzível por interferon gama no grupo dos animais ELA sintomáticos. Com relação a proteínas modificadas por HHE, foram encontradas a Janus quinase e proteína 3 de interação com microtúbulo, modificadas tanto por adição de Michael quanto via base de Schiff nos animais ELA sintomáticos. É interessante ressaltar que algumas modificações encontradas em proteínas não caracterizadas podem indicar proteínas novas ainda não descritas como modificadas por esses aldeídos. Os resultados mostram que algumas das proteínas modificadas por HNE e HHE encontradas neste trabalho, estão relacionadas ao estresse redox, vias metabólicas energéticas, proteínas envolvidas na resposta a danos oxidativos, e processos inflamatórios. Tais modificações ocorrem não só no modelo de neurodegeneração, mas foram previamente descritas em outros processos patológicos, como doença cardiovascular, lesão hepática por uso crônico de álcool. / Damage to biomolecules can occur from a direct interaction between biomolecules and reactive of oxygen and nitrogen species as well as from the reaction of secondary products of these species as electrophiles generated in lipid peroxidation. Some of these by-products have greater chemical stability than the derived reactive species and can bind to biomolecules compromising their normal function. Therefore, protein modifications by aldehydes generated during lipoperoxidation have been investigated for their implications with pathological disorders related to protein aggregation and modifications in signaling pathways amplifying the deleterious effects in biological systems. The aim of this work was to contribute to the elucidation of the molecular mechanisms associated with the development of amyotrophic lateral sclerosis (ALS) through the identification, characterization and quantification of posttranslational modifications in proteins by 4-hydroxy-2-hexenal (HHE) and trans-4-hydroxy-2- nonenal (HNE) in vitro, cytochrome c, and in vivo, rat model (SOD1G93A) of amyotrophic lateral sclerosis (ALS), throught Western blot techniques, and mass spectrometry with shotgun proteomics approach. The results showed the binding of aldehydes to cytochrome c. Six peptides were modified by HHE and one by HNE. The peptide TGPNLHGLFGR was modified by the two aldehydes. Histidine 33 has been shown to be a hot spot against aldehydes additions. By western blot analysis of the aldehyde-bound proteins, it was possible to observe a tendency of increase in the concentration of HNE-bound proteins in the ALS animals, more pronounced in the samples of 70 days compared to control samples. Regarding the results obtained with HHE, both pre-symptomatic and symptomatic animals did not show HHE-protein differences, both in controls and in ALS animals. We did not detect a significant difference in the aldehyde-protein concentration between the groups in the samples of the symptomatic animals. Proteomic analysis revealed 24 differentially expressed proteins, with emphasis on proteins with thehighest values of significance (p-value), such as the ubiquitin in the pre-symptomatic group and neurogranin in the group of the symptomatic animals and several proteins of the energetic metabolism pathways, neurofilaments, proteins of redox processes and proteins linked to calcium metabolism (fundamental in the pathophysiology of ALS). Some important proteins were found exclusivity in the pre-symptomatic and symptomatic groups by the Venn diagram. With regard to aldehyde-modified proteins, some relevant ones such as Delta-2 polymerase interaction protein, that was modified by HNE via the addition of Michael found in presymptomatic and symptomatic ELA animals, catalase that was found to be modified by HNE via Schiff\'s base only in pre-symptomatic ALS, and gamma interferon-inducible thiol reductase in the group of symptomatic ALS animals. Janus kinase and microtubule interaction protein 3, were found to be modified by Michael addition and Schiff base pathway respectively in symptomatic ALS animals. It is interesting to note that some modifications found in uncharacterized proteins may indicate new proteins not yet described as modified by these aldehydes. The results show that some of the proteins modified by HNE and HHE found in this work are related to redox stress, energetic metabolic pathways, proteins involved in the response to oxidative damage, and inflammatory processes. Such modifications occur not only in the neurodegeneration model, but were previously described in other pathological processes, such as cardiovascular disease, liver injury due to chronic alcohol use

CI Disperse Blue 291 (CI DB 291) é um corante dinitrobromoaminoazobenzeno com atividade mutagênica para S. typhimurium, aumentada na presença de nitrorredutase, o-acetiltransferase e enzimas microssomais (S9). Neste estudo foram isolados e caracterizados quatro produtos da redução de DB 291 com ditionito de sódio (in vitro), sendo denominados 2- fenilbenzotriazóis não clorados (não-ClPBTAs). Os espectros de absorbância não apresentam o pico correspondente à ligação azo (?λ=613 nm), indicando a redução dessa ligação. Espectros de massas e 1H RMN mostram que os produtos são dois pares de tautômeros com m/z 465 [M+H]+ e m/z 449 [M+H]+. Esses produtos foram acetilados com piridina/anidrido acético e espectros de massas desses produtos indicam adição de grupamento acetil na molécula e formação de produtos com m/z 507 [M+H]+ e m/z 491 [M+H]+. Esses compostos foram reagidos com dGuo e obtivemos dois produtos com m/z 632 [M+H]+ e m/z 683 [M+H]+, sendo os possíveis adutos. A partir do composto não clorado com m/z 449 obtido após redução com ditionito de sódio, sintetizamos o análogo clorado (PBTA) após reação de cloração. Espectros de massa confirmam a formação do composto clorado com m/z 483 [M+H]+. Também incubamos o corante CI DB 291 com nitrorredutase/NADH. Análises por HPLC/ESI/MS indicam a formação de não-ClPBTA (m/z 449). Uma vez que não-ClPBTAs são mais mutagênicos para linhagens de S. typhimurium (com fração S9) que seus dinitrofenilazo corantes precursores, a conversão enzimática do corante para não-ClPBTAs pode ser uma via importante para sua bioativação. / C.I. Disperse Blue 291 (C.I. DB 291) is a dinitrobromoaminoazobenzene dye with mutagenic activity to S. typhimurium, that is increased in the presence of nitroreductase, o-acetyltransferase and microsomal enzymes (S9). In this study were isolated and characterized four products of the reduction of DB 291 with sodium dithionite (in vitro), named non- chlorinated 2- phenylbenzotriazoles (non-ClPBTAs). The absorbance spectra do not present the peak corresponding to the band of azo bond (λ= 613 nm), indicating that the reduction of this bond occured. Mass spectra and 1H NMR show that the products are two pairs of tautomers with m/z 465 [M+H]+ and m/z 449 [M+H]+. These compounds were acetylated with pyridine/acetic anhydride and their mass spectra indicate the addition of an acetyl group to the molecules and formation of products with m/z 507 [M+H]+ e m/z 491 [M+H]+. After reaction of these compounds with dGuo we have got two products with m/z 632 [M+H]+ and m/z 683 [M+H]+, which are possible adducts. Starting from the non chlorinated compound with m/z 449, obtained through the dye reduction with sodium dithionite, we have synthesized the chlorinated analogous (PBTA) after chlorination reaction. Mass spectrum confirms formation of the chlorinated product with m/z 483 [M+H]+. The DB 291 dye was also incubated with nitroreductase NADH. HPLC/ESI/MS analyses indicate the formation of a non chlorinated PBTA (m/z 449). Since non- chlorinated PBTAs are more mutagenic to S. typhimurium strains (with S9 mix) than the parent phenylbenzotriazole dye, enzymatic conversion of this type of dye non chlorinated PBTAs may be an important way for its bioactivation.

A presente tese apresenta: I - Uma revislo bibliográfica sobre os adutos de Diels-Alder entre benzoquinonas 2-mono-substituídas ou benzoquinona não-substituída e ciclopentadieno; II - Uma visão mecanística, de literatura, sobre as reações de ciclo-adição; III - A síntese, por nós efetuada, de uma série de adutos de Diels-Alder entre ciclopentadieno e benzoquinonas 2-mono-substituídas por cloro, bromo, ou ainda, substituintes contendo nitrogênio, oxigênio, enxofre ou selênio; IV - O estudo que empreendemos sobre a fotociclização dos adutos acima mencionados. Na obtenção dos adutos, foram empregados dois métodos distintos: a reação de Diels-Alder e a substituição do halogênio por nucleófilos, nos adutos halogenados. Nove adutos inéditos foram isolados e caracterizados. A estereoquímica dos treze adutos preparados foi esclarecida por RMN de 13C e de 1H. O estudo da fotociclização dos adutos visava dois aspectos: sintético, para a obtenção de compostos-gaiola, e mecanístico. Foram isolados e caracterizados sete novos compostos-gaiola. Foi sugerido o mecanismo das referidas fotociclizações, através das determinações dos rendimentos quânticos e dos resultados de voltametria cíclica. Foi, também, fornecida uma possível explicação para a falta de reatividade fotoquímica de alguns adutos. / This thesis contains: I - A literature review about cyclopentadiene Diels-Alder adducts of benzoquinone and its 2-mono-substituted derivatives; II - A mechanistic overview of cycloaddition reactions; III - The synthesis of a series of Diels-Alder adducts of cyclopentadiene and 2-mono-substituted (by chloro-, bromo- or groups containing nitrogen, oxigen, sulfur or selenium) benzoquinones; IV - The investigation about the photocyclization of the same adducts. Two different methods were employed for the obtention of these adducts: either the Diels-Alder reaction, or the substituition of the halogen by nucleophiles, in the halo-containing adducts. Nine previously unreported adducts were isolated and characterized. The sterochemistry of the thirteen adducts prepared was determined through 13C and 1H NMR. The investigation about the photocyclization of the adducts had two main objectives: the synthesis of the corresponding cage-compounds and the elucidation of the photocyclization\'s mechanism. Seven new cage-compounds, previously unreported, were obtained and characterized. Quantum yield determinations and cyclic voltammetry data led to the proposition of a mechanism for the photocyclization reactions. An explanation for the lack of photoreactivity presented by some adducts was also furnished.

A produção de radicais de carbono \"in vivo\" durante a biotransformação da hidrazina foi demonstrada por ressonância para magnética eletrônica, utilizando o método do captador de spin. Eritrócitos de rato também oxidaram a hidrazina, formando radicais de carbono e nitrogênio, além de espécies reativas de oxigênio. Todas estas espécies, possivelmente formadas \"in vivo\", são potencialmente causadoras de dano a macromoléculas. Podem, por exemplo, iniciar reações secundárias formando radicais de componentes celulares, como ocorreu com a hemoglobina que foi oxidada a radicais tiil-hemoglobina em eritrócitos tratados com hídrazina. Radicais de carbono formados durante a biotransformação da hidrazina em animais expostos provêm necessariamente de substâncias endógenas e podem ser direta ou indiretamente responsáveis pela modificação ( alquilação ) de bases no DNA \"in vivo\". A hidrazona do formaldeído é descrita na literatura como um intermediário da alquilação induzida por hidrazina \"in vivo\". Células L 1210, catalase ou oxihemoglobina de rato foram capazes de formar radicais de carbono durante a oxidação da hidrazona do formaldeído. A oxidação da hidrazona do formaldeído pela catalase foi estudada \"in vítro\" e os radicais de carbono formados, identificados como radicais metila. A base modificada C8 -metil-guanina foi formada em animais expostos, como demonstrado por cromatografia líquida de alta eficiência associada à detecção eletroquímica, sugerindo que ocorreu alquilação do DNA por radicais metila durante a biotransformação da hidrazina \"in vivo\". / The production of carbon-centered radicais during hydrazine biotransformation \"in vivo\" was demonstrated by electron paramagnetic resonance ( EPR ) spin trapping technique. Rat red blood cells also oxidized hydrazine, forming carbon and nitrogen centered radicais, besides oxygen reactive speties. Ali these species, possibly formed \"in vivo\", are potentially harmful to macromolecules. For example, they can initiate secondary reactions in which the radicais from cell components are formed, as it occurred with hemoglobin, forming thiyl-hemoglobin radicais in the red blood cells treated with hydrazine. Carbon-centered radicais produced during the biotransformation of hydrazine in exposed animais must be derived from endogenous sources and may be directly or indirectly responsible for the modificaton ( alkylation ) of DNA bases \"in vivo\". The formaldehyde hydrazone is reported in the literature as an intermediate of hydrazine-induced alkylation \"in vivo\". L1210 cells, catalase and rat hemoglobin were able to produce carbon-centered radicais during the oxidation of the formaldehyde hydrazone. The oxidation of formaldehyde hydrazone by catalase was studied \"in vitro\" and the generated carbon-centered radicais were identified as methyl radicais. The modified base C8 -methylguanine was formed in exposed animais, as demonstrated by high performance liquid chromatography with electrochemical detection, suggesting that DNA alkylation by methyl radicais occurred during hydrazine biotransformation \"in vivo.\"

Neste trabalho a síntese e caracterizaçcão de adutos entre tiocianatos de terras raras trivalentes (La, Ce Pr, Nd, Sm, Eu, Gd, Tb, Dy, Ho, Er, Tm Yb, Lu e Y) e tripiperidinofosfinóxidos (tpppO) são reportados. Os adutos foram preparados pela reação entre tiocianatos de lantanídeos e tpppO em soluções etanólicas. Os complexos foram caracterizados por análises elementares, análises termogravimétricas, medidas de condutância em soluções milimolares, espectroscopias de absorção na região do infravermelho, espectroscopia de absorção na região do visível do complexos de neodímio, espectroscopia de emissão na região do visível do composto de európio, térbio e disprósio, difratograma de raios -X pelo método do pó e difratogramas de raios -X pelo método do mono cristal do composto de praseodímio. As análises elementares sugeriram fortemente a fórmula [Ln(SCN)3(tpppO)3] como representativa de toda a série de complexos. As medidas de condutividade de soluções milimolares em acetonitrila resultaram em valores entre 22 e 75 S cm2 mol-1. Esses valores sugeriram a natureza não eletrolítica dos adutos. Os difratogramas pelo método do pó sugeriram a existência de três séries isomorfas, formadas pelos seguintes elementos: 1) La; 2) Ce, Nd, Pr; 3) Sm, Gd, Eu, Ho, Er, To, Lu, Y. Todos os espectros de absorção na região do infravermelho dos adutos são semelhantes e exibem ν(CN)na região de 2050 cm-1.Isso é indicativo da coordenação do ânion a através do átomo de nitrogênio. Os complexos são portanto da classe dos isotiocianatos. Adicionalmente esses pico estão desdobrados em dois picos ( exceto para o Eu e Tb), evidenciando que esses ãnions não são todos equivalentes. Nos espectros de infravermelho observou-se ainda o pico δ(NCS) at ca. 470-480 nm e isso indica também a coordenação através do átomo de nitrogênio. O pico atribuído ao estiramento da ligação PO, ν (PO), está deslocado para regiões menos energética do espectro quando comparado ao espectro do ligante não coordenado. Isso indica a coordenação do tpppO pelo átomo de oxigênio. Nota-se também que os picos ν (PN) apresentando um desvio consistente para regiões mais energéticas para toda a série de complexos sintetizados. O espectro de absorção na região do visível do complexo de neodímio foi registrado e apresentou a banda atribuída á transição 4G5/2, 2G7/2 ← 4I9/2. A banda atribuída à transição 2P1/2 ← 4I9/2 não pode ser observada. A primeira transição foi observada a 17124 cm-1 Desse valor foram calculados: o parâmetro nefelauxético, β = 0,989; o fator de covalência, b 1/2 = 0,072; e o fator de covalência de Sinha δ = 1,06. Esses valores mostram a natureza eletrostática das ligações entre o íon da terra rara e os ligantes. O espectro de emissão do composto de európio, a 77 K, apresenta uma pico atribuído à transição 5D0 →7D0 (578 nm), três picos à 5D0 → 7D1 (593 , 595, 597nm), e cinco à 5D0 → 7D2 (611, 614, 617, 618, 620 nm). Sabendo que a presença do pico 5D0 → 7D0 e os desdobramentos dos picos 5D0 → 7D1 e 5D0 → 7D2 a simetria C3v é a mais provável para o poliedro de coordenação. As análises térmicas foram conduzidas para os complexos de Ce, Nd, Gd. A curva de Tg-DTG mostra perdas de massa começando em 284 -320 ºC e terminando em 1000 ºC. Em 1200 ºC, outra perda de massa ocorre. As curvas, no entanto, mostram algumas diferenças entre si. Enquanto o complexo de cério apresenta cinco eventos não resolvidos entre 300 e 400 ºC, o complexo de Nd apresenta dois eventos não resolvidos e o complexo de Gd apresenta apenas um pico largo na mesma faixa de temperatura. As massas dos resíduos finais de aquecimento (temperaturas maiores que 1300 ºC) são compatíveis com as de fosofatos dos respectivos lantanídeos e o espectro de absorção na região do infravermelho desses resíduos confirmam esses resultados. A análise de difração de raios -X do composto de preseodímio mostrou como sitema critalino o monoclínico, o grupo espacial é o Cc, com quatro moléculas por célula unitária. O Poliedro de coordenação é um prisma trigonal levmente distrocido com simetria de C3V. O número de coordenação é seis com os ânions tiocianatos coordenados pelo nitrogênio, enquanto os os tpppO estão coodenados pelos átomo de hidrogênios. / In this work the synthesis and characterization of trivalent rare earth (La, Ce Pr, Nd, Sm, Eu, Gd, Tb, Dy, Ho, Er, Tm Yb, Lu and Y) adducts between isothiocyanate with tripiperidinophosphinoxide (tpppO) are reported. The rare earth adducts were prepared by the reaction between lanthanides thiocyanates and tpppO in ethanolic solution. The complexes were characterized by elemental analysis, thermo gravimetric analysis, conductance measurements in millimolar acetonitrila solutions, IR absorption spectroscopy, uv-vis absorption spectrum of the neodymium compound, emission spectrum of europium, dysprosium and terbium compounds, X- ray powder patterns and X-ray diffraction through the monocrystal method of the praseodymium compound. Elemental analyses data strongly suggest the general formula [Ln(SCN)3(tpppO)3] for the complete series. Electrolytic conductivity measurements in milllimolar acetonitrile solutions yielded values in range 75 to 22 S cm2 mole-1. These values suggest the nonelectrolyte natures of the adducts. X-Ray powder diffraction pattern suggest the existence of three isomorphous series: 1) La; 2) Ce, Nd Pr; 3) Sm, Gd, Eu, Ho, Er, Tb, Lu and Y. All absortption spectra in IR region are similar and exhibit ν(CN) in the region of 2050 cm-1. This is indicative that the anion is coordinated through the nitrogen atom, or, in other words, the anion is in the isothiocyanate form. ln addition, these bands are split into two components in all complexes ( except for Eu and Tb ), evidencing that these anions are not all equivalent. In the IR spectra it is also possible to observe δ(NCS) at ca. 470-480 cm-1 and this also point out coordination through the nitrogen atom. In the IR spectra also ν (PO) is shifted to lower energies by ca. 10 cm1 with respect to free tpppO. This indicat coordination through the phosphoryl oxygen. It is also nortworthy that ν (PN) presents a consistent positive shift throghout the whole series of complexes. Absorption spectra of a neodymium compound were recorded. The hypersensitive band 4G5/2, 2G7/2 ← 4I9/2 appears, while the 2P1/2← 4I9/2 could not be observed experimentally. The first transition was observed to be centered at 17124 cm-1. From this value, the nephelauxetic parameter, β = 0,989, covalente factor, bl/2 = 0,072 and Sinha covalence parameter δ = 1,06 were calculated. These value point out the essentially electrostactic nature of metal-ligand bonds. The emission spectra of europium compound at 77 K presents one 5D0 → 7D0 peak (578 nm), three 5D0 → 7D1 peaks (593,595, 597nm) and five for 5D0 → 7D2 band (611,614, 617, 618, 620 nm). Taking into account the presence of 5D0 → 7D0 and the splits of 5D0 → 7D2 and 5D0 → 7D1 peaks the C3v symmetry can be proposed for this coordination polyhedron. Thermal analyses were carried out for Ce, Nd and Gd complexes. Tg-DTG curves show mass lasses starting at 284-320 ºC up to 1000 ºC. At 1200 ºC another mass loss occurs. The curves , however, are quite different whereas the Ce complex shows five non-resolved events between 300 and 400ºC, the Nd adducts shows two non-resolved events and the Gd only a broad peak. The mass of the final residues (above 1300ºC) are consistent with the corresponding lanthanide phosphate. Infrared spectra of these residues were recorded, confirming this assumption. Single- crystal X-ray diffraction analysis of the Pr complex was carried out. The crystal system is the monoclinic, space group Cc, with four molecules per unit cell. The coordination polyhedron is a slightly distorted trigonal antiprism with C3v symmetry. The coordination number is 6. All anion are in the thyocianate form and coordinated through their nitrogen atoms in one base of antiprism whereas the ligand (tpppO) are bonded to the other base through their oxygen atoms.

Neste trabalho a síntese e caracterizaçcão de adutos entre tiocianatos de terras raras trivalentes (La, Ce Pr, Nd, Sm, Eu, Gd, Tb, Dy, Ho, Er, Tm Yb, Lu e Y) e tripiperidinofosfinóxidos (tpppO) são reportados. Os adutos foram preparados pela reação entre tiocianatos de lantanídeos e tpppO em soluções etanólicas. Os complexos foram caracterizados por análises elementares, análises termogravimétricas, medidas de condutância em soluções milimolares, espectroscopias de absorção na região do infravermelho, espectroscopia de absorção na região do visível do complexos de neodímio, espectroscopia de emissão na região do visível do composto de európio, térbio e disprósio, difratograma de raios -X pelo método do pó e difratogramas de raios -X pelo método do mono cristal do composto de praseodímio. As análises elementares sugeriram fortemente a fórmula [Ln(SCN)3(tpppO)3] como representativa de toda a série de complexos. As medidas de condutividade de soluções milimolares em acetonitrila resultaram em valores entre 22 e 75 S cm2 mol-1. Esses valores sugeriram a natureza não eletrolítica dos adutos. Os difratogramas pelo método do pó sugeriram a existência de três séries isomorfas, formadas pelos seguintes elementos: 1) La; 2) Ce, Nd, Pr; 3) Sm, Gd, Eu, Ho, Er, To, Lu, Y. Todos os espectros de absorção na região do infravermelho dos adutos são semelhantes e exibem ν(CN)na região de 2050 cm-1.Isso é indicativo da coordenação do ânion a através do átomo de nitrogênio. Os complexos são portanto da classe dos isotiocianatos. Adicionalmente esses pico estão desdobrados em dois picos ( exceto para o Eu e Tb), evidenciando que esses ãnions não são todos equivalentes. Nos espectros de infravermelho observou-se ainda o pico δ(NCS) at ca. 470-480 nm e isso indica também a coordenação através do átomo de nitrogênio. O pico atribuído ao estiramento da ligação PO, ν (PO), está deslocado para regiões menos energética do espectro quando comparado ao espectro do ligante não coordenado. Isso indica a coordenação do tpppO pelo átomo de oxigênio. Nota-se também que os picos ν (PN) apresentando um desvio consistente para regiões mais energéticas para toda a série de complexos sintetizados. O espectro de absorção na região do visível do complexo de neodímio foi registrado e apresentou a banda atribuída á transição 4G5/2, 2G7/2 ← 4I9/2. A banda atribuída à transição 2P1/2 ← 4I9/2 não pode ser observada. A primeira transição foi observada a 17124 cm-1 Desse valor foram calculados: o parâmetro nefelauxético, β = 0,989; o fator de covalência, b 1/2 = 0,072; e o fator de covalência de Sinha δ = 1,06. Esses valores mostram a natureza eletrostática das ligações entre o íon da terra rara e os ligantes. O espectro de emissão do composto de európio, a 77 K, apresenta uma pico atribuído à transição 5D0 →7D0 (578 nm), três picos à 5D0 → 7D1 (593 , 595, 597nm), e cinco à 5D0 → 7D2 (611, 614, 617, 618, 620 nm). Sabendo que a presença do pico 5D0 → 7D0 e os desdobramentos dos picos 5D0 → 7D1 e 5D0 → 7D2 a simetria C3v é a mais provável para o poliedro de coordenação. As análises térmicas foram conduzidas para os complexos de Ce, Nd, Gd. A curva de Tg-DTG mostra perdas de massa começando em 284 -320 ºC e terminando em 1000 ºC. Em 1200 ºC, outra perda de massa ocorre. As curvas, no entanto, mostram algumas diferenças entre si. Enquanto o complexo de cério apresenta cinco eventos não resolvidos entre 300 e 400 ºC, o complexo de Nd apresenta dois eventos não resolvidos e o complexo de Gd apresenta apenas um pico largo na mesma faixa de temperatura. As massas dos resíduos finais de aquecimento (temperaturas maiores que 1300 ºC) são compatíveis com as de fosofatos dos respectivos lantanídeos e o espectro de absorção na região do infravermelho desses resíduos confirmam esses resultados. A análise de difração de raios -X do composto de preseodímio mostrou como sitema critalino o monoclínico, o grupo espacial é o Cc, com quatro moléculas por célula unitária. O Poliedro de coordenação é um prisma trigonal levmente distrocido com simetria de C3V. O número de coordenação é seis com os ânions tiocianatos coordenados pelo nitrogênio, enquanto os os tpppO estão coodenados pelos átomo de hidrogênios. / In this work the synthesis and characterization of trivalent rare earth (La, Ce Pr, Nd, Sm, Eu, Gd, Tb, Dy, Ho, Er, Tm Yb, Lu and Y) adducts between isothiocyanate with tripiperidinophosphinoxide (tpppO) are reported. The rare earth adducts were prepared by the reaction between lanthanides thiocyanates and tpppO in ethanolic solution. The complexes were characterized by elemental analysis, thermo gravimetric analysis, conductance measurements in millimolar acetonitrila solutions, IR absorption spectroscopy, uv-vis absorption spectrum of the neodymium compound, emission spectrum of europium, dysprosium and terbium compounds, X- ray powder patterns and X-ray diffraction through the monocrystal method of the praseodymium compound. Elemental analyses data strongly suggest the general formula [Ln(SCN)3(tpppO)3] for the complete series. Electrolytic conductivity measurements in milllimolar acetonitrile solutions yielded values in range 75 to 22 S cm2 mole-1. These values suggest the nonelectrolyte natures of the adducts. X-Ray powder diffraction pattern suggest the existence of three isomorphous series: 1) La; 2) Ce, Nd Pr; 3) Sm, Gd, Eu, Ho, Er, Tb, Lu and Y. All absortption spectra in IR region are similar and exhibit ν(CN) in the region of 2050 cm-1. This is indicative that the anion is coordinated through the nitrogen atom, or, in other words, the anion is in the isothiocyanate form. ln addition, these bands are split into two components in all complexes ( except for Eu and Tb ), evidencing that these anions are not all equivalent. In the IR spectra it is also possible to observe δ(NCS) at ca. 470-480 cm-1 and this also point out coordination through the nitrogen atom. In the IR spectra also ν (PO) is shifted to lower energies by ca. 10 cm1 with respect to free tpppO. This indicat coordination through the phosphoryl oxygen. It is also nortworthy that ν (PN) presents a consistent positive shift throghout the whole series of complexes. Absorption spectra of a neodymium compound were recorded. The hypersensitive band 4G5/2, 2G7/2 ← 4I9/2 appears, while the 2P1/2← 4I9/2 could not be observed experimentally. The first transition was observed to be centered at 17124 cm-1. From this value, the nephelauxetic parameter, β = 0,989, covalente factor, bl/2 = 0,072 and Sinha covalence parameter δ = 1,06 were calculated. These value point out the essentially electrostactic nature of metal-ligand bonds. The emission spectra of europium compound at 77 K presents one 5D0 → 7D0 peak (578 nm), three 5D0 → 7D1 peaks (593,595, 597nm) and five for 5D0 → 7D2 band (611,614, 617, 618, 620 nm). Taking into account the presence of 5D0 → 7D0 and the splits of 5D0 → 7D2 and 5D0 → 7D1 peaks the C3v symmetry can be proposed for this coordination polyhedron. Thermal analyses were carried out for Ce, Nd and Gd complexes. Tg-DTG curves show mass lasses starting at 284-320 ºC up to 1000 ºC. At 1200 ºC another mass loss occurs. The curves , however, are quite different whereas the Ce complex shows five non-resolved events between 300 and 400ºC, the Nd adducts shows two non-resolved events and the Gd only a broad peak. The mass of the final residues (above 1300ºC) are consistent with the corresponding lanthanide phosphate. Infrared spectra of these residues were recorded, confirming this assumption. Single- crystal X-ray diffraction analysis of the Pr complex was carried out. The crystal system is the monoclinic, space group Cc, with four molecules per unit cell. The coordination polyhedron is a slightly distorted trigonal antiprism with C3v symmetry. The coordination number is 6. All anion are in the thyocianate form and coordinated through their nitrogen atoms in one base of antiprism whereas the ligand (tpppO) are bonded to the other base through their oxygen atoms.

Exposição a Hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (HPAs) está relacionada com o aumento de risco de câncer. Esses carcinógenos dependem da sua ativação para intermediários eletrofílicos para causar danos em biomoléculas. As vias de ativação melhor estudadas incluem (i) a formação de diol-epóxido nas regiões de baía ou fjord dos HPAs através de epoxidações catalisadas pela citocromo P450 (CYP450), com uma hidrólise intermediária pela epóxido hidrolase e (ii) oxidação (CYP450 ou peroxidases) levando à formação de um cátion radical reativo. Outras vias incluem a formação de derivados metilados, quinonas e metabólitos de anel aberto cujas contribuições para a carcinogênese ainda são pouco estudadas, assim como o papel do estresse oxidativo na toxicidade dos HPAs. Neste trabalho foi investigado a citotoxicidade e genotoxicidade do indeno[1,2,3-cd]pireno, trifenileno e coroneno e seus produtos de oxidação (quinonas e hidroquinonas). Linhagens de carcinoma hepatocelular humano (HepG2) e de hepatócitos humanos normais (THLE-2) foram incubadas com os HPAs e suas respectivas quinonas e hidroquinonas acetiladas para análise de viabilidade celular (MTT) em diferentes condições de cultivo (por 16 horas, de 20 a 200 uM). Células HepG2 foram incubadas por 16 horas com indeno[1,2,3-cd]pireno (50 µM), coroneno (20 µM), trifenileno (10 uM) ou seus produtos de oxidação (quinonas e hidroquinonas acetiladas) para análise de dano oxidativo em DNA e peroxidação lipídica. Nas concentrações descritas acima, esses HPAs estruturalmente diferentes e seus produtos de oxidação são citotóxicos e levam ao aumento dos níveis de 7,8- dihidro-8-oxo-2\'-desoxiguanosina e malonaldeído. Tais danos podem contribuir para o aumento do risco de desenvolvimento de doenças, como o câncer, na população exposta. / Exposure to Polycyclic Aromatic Hydrocarbons (PAH) is related to the increase in the risk of cancer. These carcinogens depend on their activation by electrophilic intermediates to cause damage on biomolecules. The best understood activation pathways include (i) the formation of diol-epoxide in the bay and fjord regions of the PAH through epoxidations catalyzed by cytochrome P450 (CYP450), with an intermediate hydrolysis by epoxide hydrolase and (ii) oxidation (CYP450 or peroxidases) leading to the formation of a reactive cationic radical. Other pathways include the formation of methylated derivatives, quinones and open-ring metabolites whose contributions to carcinogenesis, as well as the role of oxidative stress on PAH toxicity, have not been extensively studied yet. This work investigated the cytotoxicity and genotoxicity of indene[1,2,3-cd]pyrene, triphenylene and coronene and their oxidation products (quinones and hydroquinones). Strains of human hepatocellular carcinoma (HepG2) and of normal human hepatocytes (THLE-2) were incubated with PAH and their respective quinones and acetylated hydroquinones and afterwards analyzed for cell viability (MTT) under different culture conditions (for 16 hours, 20 to 200 BM). HepG2 cells were incubated for 16 hours with indene[1,2,3-cd]pyrene (50 BM), coronene (20 BM), triphenylene (10 BM) or their oxidation products (quinones and acetylated hydroquinones) and afterwards analyzed for oxidative damage on DNA and lipid peroxidation. In the mentioned concentrations, these structurally different PAHs and their oxidation products are cytotoxic and lead to an increase in the levels of 7,8-dihydro-8-oxo-2\'-deoxyguanosine and malonaldehyde. Such damages may contribute to increase the risk of diseases like cancer in the exposed population.

CI Disperse Blue 291 (CI DB 291) é um corante dinitrobromoaminoazobenzeno com atividade mutagênica para S. typhimurium, aumentada na presença de nitrorredutase, o-acetiltransferase e enzimas microssomais (S9). Neste estudo foram isolados e caracterizados quatro produtos da redução de DB 291 com ditionito de sódio (in vitro), sendo denominados 2- fenilbenzotriazóis não clorados (não-ClPBTAs). Os espectros de absorbância não apresentam o pico correspondente à ligação azo (?λ=613 nm), indicando a redução dessa ligação. Espectros de massas e 1H RMN mostram que os produtos são dois pares de tautômeros com m/z 465 [M+H]+ e m/z 449 [M+H]+. Esses produtos foram acetilados com piridina/anidrido acético e espectros de massas desses produtos indicam adição de grupamento acetil na molécula e formação de produtos com m/z 507 [M+H]+ e m/z 491 [M+H]+. Esses compostos foram reagidos com dGuo e obtivemos dois produtos com m/z 632 [M+H]+ e m/z 683 [M+H]+, sendo os possíveis adutos. A partir do composto não clorado com m/z 449 obtido após redução com ditionito de sódio, sintetizamos o análogo clorado (PBTA) após reação de cloração. Espectros de massa confirmam a formação do composto clorado com m/z 483 [M+H]+. Também incubamos o corante CI DB 291 com nitrorredutase/NADH. Análises por HPLC/ESI/MS indicam a formação de não-ClPBTA (m/z 449). Uma vez que não-ClPBTAs são mais mutagênicos para linhagens de S. typhimurium (com fração S9) que seus dinitrofenilazo corantes precursores, a conversão enzimática do corante para não-ClPBTAs pode ser uma via importante para sua bioativação. / C.I. Disperse Blue 291 (C.I. DB 291) is a dinitrobromoaminoazobenzene dye with mutagenic activity to S. typhimurium, that is increased in the presence of nitroreductase, o-acetyltransferase and microsomal enzymes (S9). In this study were isolated and characterized four products of the reduction of DB 291 with sodium dithionite (in vitro), named non- chlorinated 2- phenylbenzotriazoles (non-ClPBTAs). The absorbance spectra do not present the peak corresponding to the band of azo bond (λ= 613 nm), indicating that the reduction of this bond occured. Mass spectra and 1H NMR show that the products are two pairs of tautomers with m/z 465 [M+H]+ and m/z 449 [M+H]+. These compounds were acetylated with pyridine/acetic anhydride and their mass spectra indicate the addition of an acetyl group to the molecules and formation of products with m/z 507 [M+H]+ e m/z 491 [M+H]+. After reaction of these compounds with dGuo we have got two products with m/z 632 [M+H]+ and m/z 683 [M+H]+, which are possible adducts. Starting from the non chlorinated compound with m/z 449, obtained through the dye reduction with sodium dithionite, we have synthesized the chlorinated analogous (PBTA) after chlorination reaction. Mass spectrum confirms formation of the chlorinated product with m/z 483 [M+H]+. The DB 291 dye was also incubated with nitroreductase NADH. HPLC/ESI/MS analyses indicate the formation of a non chlorinated PBTA (m/z 449). Since non- chlorinated PBTAs are more mutagenic to S. typhimurium strains (with S9 mix) than the parent phenylbenzotriazole dye, enzymatic conversion of this type of dye non chlorinated PBTAs may be an important way for its bioactivation.

Exposição a Hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (HPAs) está relacionada com o aumento de risco de câncer. Esses carcinógenos dependem da sua ativação para intermediários eletrofílicos para causar danos em biomoléculas. As vias de ativação melhor estudadas incluem (i) a formação de diol-epóxido nas regiões de baía ou fjord dos HPAs através de epoxidações catalisadas pela citocromo P450 (CYP450), com uma hidrólise intermediária pela epóxido hidrolase e (ii) oxidação (CYP450 ou peroxidases) levando à formação de um cátion radical reativo. Outras vias incluem a formação de derivados metilados, quinonas e metabólitos de anel aberto cujas contribuições para a carcinogênese ainda são pouco estudadas, assim como o papel do estresse oxidativo na toxicidade dos HPAs. Neste trabalho foi investigado a citotoxicidade e genotoxicidade do indeno[1,2,3-cd]pireno, trifenileno e coroneno e seus produtos de oxidação (quinonas e hidroquinonas). Linhagens de carcinoma hepatocelular humano (HepG2) e de hepatócitos humanos normais (THLE-2) foram incubadas com os HPAs e suas respectivas quinonas e hidroquinonas acetiladas para análise de viabilidade celular (MTT) em diferentes condições de cultivo (por 16 horas, de 20 a 200 uM). Células HepG2 foram incubadas por 16 horas com indeno[1,2,3-cd]pireno (50 µM), coroneno (20 µM), trifenileno (10 uM) ou seus produtos de oxidação (quinonas e hidroquinonas acetiladas) para análise de dano oxidativo em DNA e peroxidação lipídica. Nas concentrações descritas acima, esses HPAs estruturalmente diferentes e seus produtos de oxidação são citotóxicos e levam ao aumento dos níveis de 7,8- dihidro-8-oxo-2\'-desoxiguanosina e malonaldeído. Tais danos podem contribuir para o aumento do risco de desenvolvimento de doenças, como o câncer, na população exposta. / Exposure to Polycyclic Aromatic Hydrocarbons (PAH) is related to the increase in the risk of cancer. These carcinogens depend on their activation by electrophilic intermediates to cause damage on biomolecules. The best understood activation pathways include (i) the formation of diol-epoxide in the bay and fjord regions of the PAH through epoxidations catalyzed by cytochrome P450 (CYP450), with an intermediate hydrolysis by epoxide hydrolase and (ii) oxidation (CYP450 or peroxidases) leading to the formation of a reactive cationic radical. Other pathways include the formation of methylated derivatives, quinones and open-ring metabolites whose contributions to carcinogenesis, as well as the role of oxidative stress on PAH toxicity, have not been extensively studied yet. This work investigated the cytotoxicity and genotoxicity of indene[1,2,3-cd]pyrene, triphenylene and coronene and their oxidation products (quinones and hydroquinones). Strains of human hepatocellular carcinoma (HepG2) and of normal human hepatocytes (THLE-2) were incubated with PAH and their respective quinones and acetylated hydroquinones and afterwards analyzed for cell viability (MTT) under different culture conditions (for 16 hours, 20 to 200 BM). HepG2 cells were incubated for 16 hours with indene[1,2,3-cd]pyrene (50 BM), coronene (20 BM), triphenylene (10 BM) or their oxidation products (quinones and acetylated hydroquinones) and afterwards analyzed for oxidative damage on DNA and lipid peroxidation. In the mentioned concentrations, these structurally different PAHs and their oxidation products are cytotoxic and lead to an increase in the levels of 7,8-dihydro-8-oxo-2\'-deoxyguanosine and malonaldehyde. Such damages may contribute to increase the risk of diseases like cancer in the exposed population.

Submitted by Maike Costa (maiksebas@gmail.com) on 2017-06-27T14:23:29Z No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 5840129 bytes, checksum: 587ce0612688b158f82e9c8c528f38e7 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-27T14:23:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 5840129 bytes, checksum: 587ce0612688b158f82e9c8c528f38e7 (MD5) Previous issue date: 2016-08-15 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / This work was performed in order to synthesize and bioavaliar the activity of new adducts Morita-Baylis-Hillman (AMBH) as potential drug candidates. The AMBH were synthesized from the twin drug approach (approach twin drugs) and bioavaliados against Leishmania promastigote form donovanii, a kind of visceral leishmaniasis and more severe disease, which has a drug used for the treatment accompanied by high toxicity. As Michael acceptor to be used in Morita-Baylis-Hillman (MRBH) was synthesized diacrylate ethylene glycol (50) from the esterification reaction between ethylene glycol (65) and acrylic acid (66). The first MRBH was investigated between two equivalent 2-nitrobenzaldehyde (57) and one equivalent of diacrylate 50, in acetonitrile as solvent in the presence of DABCO, yielding two products: an adduct 67 and an adduct homodimeric 42. In investigations of experimental parameters the MRBH, DMF, DABCO and room temperature proved to be the most favorable conditions for the formation of adducts homodimeric, these being obtained in yields of 35-94% and reaction times between 24 and 20 days, isolated by liquid / liquid and via flash chromatography. Homodimers and other bioavaliados AMBH results were satisfactory to excellent IC50 for homodimeric adducts (IC50 126.20 to 0,50M). All homodimeric AMBH had higher bioactivity the corresponding AMBH, showing the success of the twin drugs approach against promastigote species of leishmania donovanii, reaching the impressive result, in the case of 49 homodimer be 393.1 times more active than the corresponding AMBH 56, being 1.24 more active than the anfoterinica B, and no reported toxicity exposure in red blood cells of human blood (iS> 400 against iS = 18.73 amphotericin B). These results show that 49 homodimer is a promising molecule in the search for new drug candidates. / Este trabalho foi realizado com o objetivo de sintetizar e bioavaliar a atividade de novos Adutos de Morita-Baylis-Hillman (AMBH) como potenciais candidatos a fármacos. Os AMBH foram sintetizados a partir da abordagem drogas gêmeas (twin drugs approach) e bioavaliados contra a forma promastigota Leishmania donovanii, uma espécie da forma visceral e mais grave da doença, a qual possui o fármaco utilizado para o tratamento acompanhado de grande toxicidade. Como aceptor de Michael para ser utilizado na reação de Morita-Baylis-Hillman (RMBH), foi sintetizado o diacrilato do etileno glicol (50) a partir da reação de esterificação entre o etileno glicol (65) e o ácido acrílico (66). A primeira RMBH investigada foi entre dois equivalentes 2-nitrobenzaldeído (57) e um equivalente do diacrilato 50, em acetonitrila como solvente na presença de DABCO, obtendo-se dois produtos: um aduto 67 e um aduto homodimérico 42. Nas investigações dos parâmetros experimentais da RMBH, o DMF, o DABCO e a temperatura ambiente mostraram ser as condições mais favoráveis para a formação dos adutos homodiméricos, sendo esses obtidos com rendimentos entre 35-94% e em tempos reacionais entre 24h e 20 dias, isolados por extração líquido/líquido e via cromatográfia flash. Os homodímeros e os demais AMBH bioavaliados tiveram resultados de satisfatórios a excelentes de CI50 para os adutos homodiméricos (CI50 126,20 a 0,50M). Todos os AMBH homodiméricos tiveram bioatividade superior aos AMBH correspondentes, evidenciando o sucesso da abordagem de drogas gêmeas contra a espécie promastigota da leishmania donovanii, chegando ao impressionante resultado, no caso do homodímero 49, ser 393,1 vezes mais ativo que o AMBH correspondente 56, sendo 1.24 mais ativo que a anfoterinica B, além de não apresentar toxicidade na exposição em glóbulos vermelhos do sangue humano (IS > 400, contra IS = 18,73 da anfotericina B). Estes resultados evidenciam que homodímero 49 é uma molécula promissora na busca de novos candidatos a fármacos.