As hipersensibilidades do tipo I são caracterizadas por um grupo heterogêneo de manifestações clínicas que atingem mais de 30% da população mundial. Novas reatividades a alérgenos regionais brasileiros têm sido descritas e muitas fontes ainda não são totalmente conhecidas. Dentre os alérgenos mais prevalentes estão os venenos de insetos. A vespa regional Polybia paulista (Hymenoptera vespidae) é endêmica no sudeste do Brasil e é responsável por acidentes graves, causando reações alérgicas que podem levar ao choque anafilático. Alguns componentes dos venenos de vespas de diferentes espécies apresentam mimetismo molecular ou biológico, podendo gerar reação imunológica cruzada, mas muitas vezes não são os responsáveis pelo desencadeamento da resposta alérgica. Isto ocasiona falha no diagnóstico e consequentemente no tratamento indicado, a imunoterapia alérgeno-específica. Diante desses fatos e do grande número de pacientes que procuram o Serviço de Imunologia Clínica e Alergia do Hospital das Clínicas de São Paulo (HCFMUSP) com manifestações clínicas de alergias a ferroadas de insetos, foi desenvolvida uma sistemática de investigação clínica e laboratorial, com ênfase na abordagem proteômica, para identificar e caracterizar físico-química e imunologicamente novos alérgenos do veneno da vespa Polybia paulista e estudar potenciais reatividades cruzadas com alérgenos já conhecidos. Vinte e um pacientes com história de anafilaxia a venenos de vespa foram selecionados para participar do estudo. Foram realizados testes cutâneos e in vitro com veneno de Polistes spp. disponível comercialmente e com o veneno da Polybia paulista, produzido seguindo o protocolo padronizado anteriormente. Os resultados mostraram que a maioria dos pacientes apresentam IgE específica para os dois venenos com maior reatividade ao veneno de Polybia e que o padrão de proteínas reconhecidas entre os dois venenos é diferente, evidenciando a necessidade de veneno de Polybia paulista na prática clínica nas regiões cuja vespa está presente. Foram identificadas mais de 2000 proteínas no extrato total do veneno de Polybia paulista e algumas proteínas alergênicas ainda não descritas. Dentre elas foi identificada uma nova isoforma ao antígeno 5 da vespa Polybia scutellaris relatada como hipoalergênica. A molécula foi produzida na forma recombinante com conformação adequada, pela primeira vez em E. coli. O alérgeno, registrado na IUIS como Poly p 5, foi reconhecido por IgEs no soro dos pacientes testados e apresenta reatividade cruzada com outros antígenos 5 homólogos. Testes de desgranulação de basófilos em linhagem celular de ratos mostraram que o Poly p 5 induziu pouca desgranulação, indicando seu potencial hipoalergênico / Type I hypersensitivity is characterized by heterogeneous clinical manifestations and specialists estimate that today around 30% of the general population suffers from an allergic disease. New allergens are being reported and some sources are not yet identified. Insect venoms are amongst the most prevalent allergen sources. The social wasp Polybia paulista (Hymenoptera vespidae) is endemic in the southeastern of Brazil and is responsible for serious accidents due to their venomous stings, causing allergic reactions that can lead to anaphylactic shock. Several components presenting molecular or biological mimicry can be found in different species of wasps and lead to a cross-immunological reaction but they are not always responsible for the allergic manifestations. Therefore, diagnostic and consequently immunotherapy is unsuccessful, since specific allergen identification is crucial. Considering the high number of patients attended at the \"Serviço de Imunologia Clínica e Alergia do Hospital das Clínicas de São Paulo\" with clinical manifestations of allergies not yet determined or barely studied, an approach involving a systematic clinical, laboratorial and investigative practice through a proteomic analysis was created to identify and characterize new allergens of Polybia paulista venom. Twenty-one patients with clinical history of anaphylaxis to Hymenoptera venoms were selected for this work. Cutaneous and in vitro tests were performed using Polistes venom commercially available as well as Polybia paulista venom, produced following a published protocol. The results shows that the majority of the patients has specific IgE for both venoms with biggest reactivity to Polybia paulista venom and the protein profile recognized in these venoms is different. More than 2000 proteins were identified in the whole venom extract of Polybia paulista and some of the allergenic proteins are not yet described in this venom. Among them, a new isoform that is similar to antigen 5 from Polybia scutellaris, already known as hypoallergenic. The molecule was produced as a recombinant properly folded for the first time in E. coli. The allergen, registered at IUIS as Poly p 5, was recognized by IgEs in the sera of 50% of the patients tested and has cross-reactivity with other homologs of antigen 5. Basophil degranulation tests in rat lineage cells showed that Poly p 5 induced little degranulation, indicating the hypoallergenic potential of this molecule

Diversos estudos em modelo animal indicam claramente que a transferência materna de IgG alérgeno-específica previne a resposta alérgica na prole. A presença de alérgeno no leite também mostrou proteger a prole por induzir tolerância oral. Neste estudo, analisamos em humanos a transferência materna de alérgenos dos ácaros Der p e Blo t e anticorpos específicos durante a gestação e amamentação em uma coorte de 91 amostras pareadas de soro materno, colostro e cordão umbilical. Demonstramos que tanto o Der p 1 como Blo t 5 podem estar presentes em amostras de colostro e cordão umbilical e identificamos a atopia materna como fator crítico para o aumento de IgG específica nestes compartimentos. No cordão umbilical, a maior diferença entre mães atópicas e não atópicas foi para a IgG4. A concentração de Der p 1 e Blo t 5 não apresentou correlação com o estado atópico materno ou concentração de anticorpos específicos. No colostro, apenas para o alérgeno Der p 1 a concentração foi maior em mães atópicas e apresentou correlação com os níveis de anticorpos IgG específicos. / Experimental data in rodents indicate that maternal allergen-specific IgG prevents allergic sensitization in the progeny. Airborne allergens in maternal milk also protects breastfeed mice by oral tolerance induction. In this study, we assessed in humans whether Der p and Blo t allergens and specific antibodies were transferred during pregnancy and breastfeeding in a cohort of 91 paired samples of maternal blood, colostrums and umbilical cord blood. Our study indicates that Der p 1 and Blo t 5 can be found in both, cord blood and colostrums, and identifies maternal atopy as a critical factor for increased levels of allergen-specific IgG in these compartments. In the cord blood the biggest difference between atopic and non atopic mothers was observed for IgG4. Der p 1 and Blo t 5 concentrations were not correlated with maternal atopic status nor specific-antibodies levels. In colostrums, only the concentration of Der p 1 was higher in atopic mothers and correlated with colostrums specific-IgG levels.

Resumo: Os venenos dos insetos da ordem Hymenoptera contêm uma variedade de proteínas alergênicas. As ferroadas desses insetos podem induzir reações alérgicas e ocasionalmente, anafilaxias fatais. Há um crescente interesse nos componentes químicos dos venenos desses insetos, sobretudo no campo da alergia e imunologia clínica. As principais reações desses venenos são as reações inflamatórias e/ou imunológicas em suas vítimas, podendo ocorrer alguns efeitos sistêmicos. Dentre os Hymenoptera sociais, os venenos de abelhas e vespas têm sido extensivamente estudados e muitos de seus componentes moleculares já foram isolados e identificados. Fosfolipase, hialuronidase, antígeno-5 e serinoprotease são proteínas antigênicas de elevada massa molecular que, quando injetadas durante o ato de ferroar, iniciam uma resposta imune peculiar, sensibilizando alguns indivíduos. Porém, poucos estudos têm sido realizados para a identificação e o mapeamento dos epítopos desses alérgenos. O conhecimento sobre a interação molecular dos principais alérgenos destes venenos certamente deverá contribuir para o aperfeiçoamento dos diagnósticos de alergia, bem como para o desenvolvimento de tratamentos mais seletivos de reações alérgicas mediadas por IgE. No presente estudo identificamos e mapeamos os epítopos lineares de células-B do antígeno-5 do veneno da vespa social Polybia paulista. O antígeno-5 é conhecido como um dos principais alérgenos do veneno de Hymenoptera com massa molecular em torno de 23 kDa e função biológica desconhecida, porém muitos estudos demonstram a sua alergenicidade. Tendo conhecimento da sequência primária do antígeno-5, a identificação e o mapeamento dos epítopos foram realizados através da síntese múltipla de peptídeos, utilizando as técnicas do SPOT-Synthesis, imunodetecção e método indireto do ELISA com soro de pacientes sensíveis... (resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The venom insects of Hymenoptera order contain a variety of allergenic proteins. The stings of these insects can induce allergic reactions and occasionally fatal anaphylaxis. There is a growing interest in the knowledge about the chemical components of the venom of these insects, especially in the field of allergy and clinical immunology. The main reactions of these venoms are inflammation and / or the induction of immune process in the victims; sometimes systemic effects also may be observed. Among the social Hymenoptera, the venoms of bees and wasps have been extensively studied and many of their molecular components have been isolated and identified. Phospholipase, hyaluronidase, antigen-5 and serine protease are antigenic proteins of high molecular weight, which may initiate a peculiar immune response to sensitize some individuals. However, few studies have been performed for the identification and mapping of the epitopes these allergens. The knowledge about the molecular interaction of the major allergens of these venoms with IgG and/or IgE will certainly contribute for improving the diagnosis of allergy, as well as to develop more selective treatments of reactions IgE-mediated allergy. In this study we identified and mapped the linear epitopes of B-cells of the antigen-5 from the venom of the social wasp Polybia paulista. The antigen-5 is known as one of the major allergens from Hymenoptera venoms with molecular weight around 23 kDa and unknown biological function, but many studies show its allergenicity. The aim of this study was to identify and to map the linear epitopes of B-cells of this allergen. Taking into account the knowledge the primary sequence of antigen-5, the identification and mapping of epitopes was performed by using multiple synthesis of peptides with the combination of different protocols: SPOT-Synthesis, immunoblotting and indirect method of ELISA with the sera... (Complete abstract click electronic access below) / Orientador: Mario Sergio Palma / Coorientador: Lucilene Delazari dos Santos / Banca: Salvatore Giovanni de Simone / Banca: Luisa Karla de Paula Arruda / Mestre

Diversos estudos em modelo animal indicam claramente que a transferência materna de IgG alérgeno-específica previne a resposta alérgica na prole. A presença de alérgeno no leite também mostrou proteger a prole por induzir tolerância oral. Neste estudo, analisamos em humanos a transferência materna de alérgenos dos ácaros Der p e Blo t e anticorpos específicos durante a gestação e amamentação em uma coorte de 91 amostras pareadas de soro materno, colostro e cordão umbilical. Demonstramos que tanto o Der p 1 como Blo t 5 podem estar presentes em amostras de colostro e cordão umbilical e identificamos a atopia materna como fator crítico para o aumento de IgG específica nestes compartimentos. No cordão umbilical, a maior diferença entre mães atópicas e não atópicas foi para a IgG4. A concentração de Der p 1 e Blo t 5 não apresentou correlação com o estado atópico materno ou concentração de anticorpos específicos. No colostro, apenas para o alérgeno Der p 1 a concentração foi maior em mães atópicas e apresentou correlação com os níveis de anticorpos IgG específicos. / Experimental data in rodents indicate that maternal allergen-specific IgG prevents allergic sensitization in the progeny. Airborne allergens in maternal milk also protects breastfeed mice by oral tolerance induction. In this study, we assessed in humans whether Der p and Blo t allergens and specific antibodies were transferred during pregnancy and breastfeeding in a cohort of 91 paired samples of maternal blood, colostrums and umbilical cord blood. Our study indicates that Der p 1 and Blo t 5 can be found in both, cord blood and colostrums, and identifies maternal atopy as a critical factor for increased levels of allergen-specific IgG in these compartments. In the cord blood the biggest difference between atopic and non atopic mothers was observed for IgG4. Der p 1 and Blo t 5 concentrations were not correlated with maternal atopic status nor specific-antibodies levels. In colostrums, only the concentration of Der p 1 was higher in atopic mothers and correlated with colostrums specific-IgG levels.

Orientadores: Maria Helena Andrade Santana, Ricardo de Lima Zollner / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Quimica / Made available in DSpace on 2018-07-27T03:55:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Victorino_IgorRicardodeSouza_M.pdf: 6760377 bytes, checksum: 05fc12e1f97a8b092dbd91b47b06441d (MD5) Previous issue date: 2000 / Resumo: Os lipossomas têm sido utilizados como imunoadjuvantes antigênicos, em estudos que enfatizam a sua atuação no sistema imunológico. Extratos peptídicos ou protéicos de várias fontes foram encapsulados em lipossomas ou associados à sua superficie, e aplicados em imunoterapias e vacinas. Apesar disso, poucos são os estudos voltados para a performance do processo de preparação desses lipossomas, eficiência da associação proteína/lipídio e estabilidade das vesículas. Este trabalho trata da avaliação do encapsulamento das proteínas: Albumina de Soro Bovino (BSA), Mioglobina (Mio) e Cito cromo C (Cit C), simulando extratos alergênicos provenientes de fungos e ácaros, no que se refere à faixa de peso molecular das suas proteínas. Os lipossomas foram preparados com os lipídios L-a-distearoilfosfatidi1colina (DSPC) e Colesterol (Col) na razão molar 70:30 respectivamente. As proteínas foram encapsuladas individualmente e em forma de misturas de composições molares BSA:Mio:Cit C de 20:40:40, 40:20:40 e 40:40:20, respectivamente. Além disso, a mistura de proteínas de composição 40:20:40 (BSA:Mio:Cit C) foi também associada covalentemente à superficie das vesículas. Os lipossomas foram caracterizados pelo teor de fósforo e diâmetro médio. O desempenho do encapsulamento foi analisado através dos perfis e eficiências de encapsulamento das proteínas individuais e em misturas, além da estabilidade das vesículas em tensoativo penta etileno glicol mono-n-dodecil éter (C12Es), e de plasma humano. Para as misturas, analisou-se a exclusão de proteínas durante o encapsulamento e a associação à superficie dos lipossomas. Os resultados indicam que a eficiência de encapsulamento depende mais das interações proteína:lipídio que do tamanho das proteínas. As eficiências de encapsulamento variaram entre 0,03% e 3,55% para as proteínas individuais e entre 1,04% e 3,94% para as misturas. Não houve alteração na estabilidade dos lipossomas em C12Es com a presença das proteínas. Em plasma, essas vesículas permaneceram estáveis por aproximadamente 20 horas. Na associação à superficie dos lipossomas, predominou a presença de BSA em relação às outras proteínas / Abstract: Liposomes has been studied as antigenic immunoadjuvants with emphasis on their performance in the imunological system. Peptides or proteins of various sources were encapsulated in liposomes or associated to their surface, and applied in immunotherapy and vaccines. In spite of this, there are few studies about the performance of preparation process ofthese liposomes, efficacy ofthe association proteinllipid and the stability ofvesic1es. This work concems with the evaluation of the encapsulation of the proteins Bovine Serum Albumin (BSA), Myoglobin (Myo) and Cythochrome C (Cyt C), simulating allergen extracts from molds and mites, related to the range of molecular weight of their proteins. Liposomes were prepared with lipid L-a-disteraoylphosphatidylcholine (DSPC) and Cholesterol (Chol) at molar ratio 70:30 respectively. The proteins were encapsulated individualyand in mixtures with molar composition BSA:Myo:Cyt C of20:40:40, 40:20:40 and 40:40:20 respectively. Furthermore, the mixture 40:20:40 (BSA:Myo:Cyt C) was also covalent1y associated to the surface of vesic1es. Liposomes were characterized by their phosphate contents and mean diameter. The performance of the protein encapsulation was evaluated through the profiles and efficiency of the encapsulation and throught the stability of vesic1es in the presence of the surfactant penta ethylene glycol mono-n-dodecyl ether (C12ES) and human plasma. For the mixtures, the exclusion of proteins duringentrapment or association to the liposome surface was also evaluated. The experimental results indicate that the efficacy of encapsulation is more dependent of the interactions proteinllipid than the size of the proteins. The efficiencies of encapsulation changed between 0.03% and 3,55% for individual proteins and were between 1,04% and 3,94% for the mixtures. The presence ofproteins does not altered the stability of liposomes in C12ES . In human plasma the vesic1es remained with stability about 20 hours. For the mixtures, the presence ofthe BSA protein predominated in the vesicles / Mestrado / Desenvolvimento de Processos Biotecnologicos / Mestre em Engenharia Química

As hipersensibilidades do tipo I são caracterizadas por um grupo heterogêneo de manifestações clínicas que atingem mais de 30% da população mundial. Novas reatividades a alérgenos regionais brasileiros têm sido descritas e muitas fontes ainda não são totalmente conhecidas. Dentre os alérgenos mais prevalentes estão os venenos de insetos. A vespa regional Polybia paulista (Hymenoptera vespidae) é endêmica no sudeste do Brasil e é responsável por acidentes graves, causando reações alérgicas que podem levar ao choque anafilático. Alguns componentes dos venenos de vespas de diferentes espécies apresentam mimetismo molecular ou biológico, podendo gerar reação imunológica cruzada, mas muitas vezes não são os responsáveis pelo desencadeamento da resposta alérgica. Isto ocasiona falha no diagnóstico e consequentemente no tratamento indicado, a imunoterapia alérgeno-específica. Diante desses fatos e do grande número de pacientes que procuram o Serviço de Imunologia Clínica e Alergia do Hospital das Clínicas de São Paulo (HCFMUSP) com manifestações clínicas de alergias a ferroadas de insetos, foi desenvolvida uma sistemática de investigação clínica e laboratorial, com ênfase na abordagem proteômica, para identificar e caracterizar físico-química e imunologicamente novos alérgenos do veneno da vespa Polybia paulista e estudar potenciais reatividades cruzadas com alérgenos já conhecidos. Vinte e um pacientes com história de anafilaxia a venenos de vespa foram selecionados para participar do estudo. Foram realizados testes cutâneos e in vitro com veneno de Polistes spp. disponível comercialmente e com o veneno da Polybia paulista, produzido seguindo o protocolo padronizado anteriormente. Os resultados mostraram que a maioria dos pacientes apresentam IgE específica para os dois venenos com maior reatividade ao veneno de Polybia e que o padrão de proteínas reconhecidas entre os dois venenos é diferente, evidenciando a necessidade de veneno de Polybia paulista na prática clínica nas regiões cuja vespa está presente. Foram identificadas mais de 2000 proteínas no extrato total do veneno de Polybia paulista e algumas proteínas alergênicas ainda não descritas. Dentre elas foi identificada uma nova isoforma ao antígeno 5 da vespa Polybia scutellaris relatada como hipoalergênica. A molécula foi produzida na forma recombinante com conformação adequada, pela primeira vez em E. coli. O alérgeno, registrado na IUIS como Poly p 5, foi reconhecido por IgEs no soro dos pacientes testados e apresenta reatividade cruzada com outros antígenos 5 homólogos. Testes de desgranulação de basófilos em linhagem celular de ratos mostraram que o Poly p 5 induziu pouca desgranulação, indicando seu potencial hipoalergênico / Type I hypersensitivity is characterized by heterogeneous clinical manifestations and specialists estimate that today around 30% of the general population suffers from an allergic disease. New allergens are being reported and some sources are not yet identified. Insect venoms are amongst the most prevalent allergen sources. The social wasp Polybia paulista (Hymenoptera vespidae) is endemic in the southeastern of Brazil and is responsible for serious accidents due to their venomous stings, causing allergic reactions that can lead to anaphylactic shock. Several components presenting molecular or biological mimicry can be found in different species of wasps and lead to a cross-immunological reaction but they are not always responsible for the allergic manifestations. Therefore, diagnostic and consequently immunotherapy is unsuccessful, since specific allergen identification is crucial. Considering the high number of patients attended at the \"Serviço de Imunologia Clínica e Alergia do Hospital das Clínicas de São Paulo\" with clinical manifestations of allergies not yet determined or barely studied, an approach involving a systematic clinical, laboratorial and investigative practice through a proteomic analysis was created to identify and characterize new allergens of Polybia paulista venom. Twenty-one patients with clinical history of anaphylaxis to Hymenoptera venoms were selected for this work. Cutaneous and in vitro tests were performed using Polistes venom commercially available as well as Polybia paulista venom, produced following a published protocol. The results shows that the majority of the patients has specific IgE for both venoms with biggest reactivity to Polybia paulista venom and the protein profile recognized in these venoms is different. More than 2000 proteins were identified in the whole venom extract of Polybia paulista and some of the allergenic proteins are not yet described in this venom. Among them, a new isoform that is similar to antigen 5 from Polybia scutellaris, already known as hypoallergenic. The molecule was produced as a recombinant properly folded for the first time in E. coli. The allergen, registered at IUIS as Poly p 5, was recognized by IgEs in the sera of 50% of the patients tested and has cross-reactivity with other homologs of antigen 5. Basophil degranulation tests in rat lineage cells showed that Poly p 5 induced little degranulation, indicating the hypoallergenic potential of this molecule

Avaliamos os mecanismos regulatórios desencadeados pela imunização materna na resposta alérgica da prole OVA. A imunização materna com OVA promoveu alterações como o aumento da expressão dos receptores FcgRIIb nos linfócitos B esplênicos dos neonatos aos 3 dias de idade (d.i.), o que se manteve até os 20 d.i. Com a imunização das proles no período neonatal a imunização materna inibiu a produção de anticorpos IgE anti-OVA. Além disso, foi observado na população de linfócitos B da prole o aumento da expressão dos receptores FcgRIIb e CD44. A transferência passiva de IgG de mães imunes no pós-natal mostrou uma inibição da produção de IgE, e no período pré-natal foi capaz de reduzir a expressão das moléculas CD40 e CD23 nos linfócitos B e a secreção de IL-10 em linfócitos T CD4 na prole no período neonatal. As evidências mostram que a imunização pré-concepcional com OVA induz mecanismos que regulam a resposta IgE da prole imunizada no período neonatal, o que foi parcialmente observado com a transferência passiva de anticorpos IgG durante o período pré e pós-natal. / To evaluate the regulatory mechanisms triggered by maternal immunization in the immune response of the offspring, the effect of preconceptional immunization with OVA was evaluated. Maternal immunization with OVA led to early alteration with increased expression of FcgRIIb in B lymphocytes from 3 days old pups. Offspring from immune mother showed diminished percentage of CD4 T cells IL-4+. The immunization of offspring during neonatal period showed that maternal immunization inhibits the production of anti-OVA IgE antibodies. The evaluation of CD4 T cell population revealed diminished IL-4+ cells. Passive IgG transfer from immune mother during neonatal period showed inhibition in the IgE synthesis, during pregnancy showed capacity to reduce the expression of CD40 molecules in B cells from neonatal pups. These evidences show that maternal OVA immunization down regulates the IgE response of offspring including phenotypic and functional alteration in B and CD4 T cells. These alterations were partially observed with IgG transfer during pregnancy or after birth.

Durante o repasto sanguíneo, fêmeas do mosquito Aedes aegypti inoculam saliva na pele de seu hospedeiro vertebrado, modulando suas funções imunológicas e facilitando a transmissão de doenças. Alguns componentes presentes na saliva de Ae. aegypti já foram descritos e caracterizados como alérgenos. No presente estudo, desenvolvemos um modelo de inflamação alérgica em camundongos expostos naturalmente às picadas de mosquitos Ae. aegypti. Nossos dados revelam que a sensibilização e posterior desafio com componentes salivares desse mosquito induz inflamação pulmonar com aumento no número de eosinófilos, células T CD4+, CD19+ e citocinas IL-4 e IL5 no lavado broncoalveolar, produção de muco e colágeno no pulmão, anticorpos IgE total e IgG1 e IgG2a específicos no soro, porém, sem alterações no padrão respiratório e reatividade das vias aéreas. Em conjunto, os resultados gerados neste trabalho confirmam o desenvolvimento de uma resposta alérgica diferente dos modelos clássicos dessa área com a presença de elementos que sugerem tanto um perfil Th1 quanto Th2 de resposta. / During blood feeding, Aedes aegypti female mosquitoes inoculate saliva into the skin of their vertebrate hosts, modulating their immune functions and facilitating disease transmission. Some components presents in the saliva of Ae. aegypti have been described and characterized as allergens. In this study, we developed a model of allergic inflammation in mice naturally exposed to Ae. aegypti mosquito bites. Our data show that the sensitization and subsequent challenged with this mosquito salivary components induces lung inflammation with increased numbers of eosinophils, T CD4+ and CD19+ cells and IL-4 and IL-5 in bronchoalveolar lavage, mucus and collagen production in lung, total IgE and specific IgG1 and IgG2a antibodies in serum, but no changes in breathing pattern and in the airways reactivity. Together, the results generated in the present study confirm the development of an allergic response that is different from classic models of this area with the presence of components which suggest both Th1 and Th2 responses.

[ES] En este trabajo se ha realizado la detección de analitos implicados en el sector sanitario (trombina) e industria alimentaria (alérgenos y patógenos), mediante el uso de un sistema de biosensado fotónico. Este sistema desarrollado por el equipo de LUMENSIA Sensors, emplea la tecnología de chips fotónicos de nitruro de silicio (Si3N4), basados en estructuras de anillos resonantes (RR). Las estrategias de funcionalización química e inmovilización de biomoléculas como aptámeros (fragmentos de ADN de cadena sencilla) y anticuerpos, se han realizado sobre superficies planas de Si3N4 para la detección de analitos, como paso previo a las medidas fotónicas. Por tanto, estas estrategias se han implementado en la preparación del chip fotónico para las medidas en un entorno de laboratorio (set-up). En cuanto a la estrategia aplicada, ésta consiste en la activación química de la superficie del sensor. Después sobre los RR del chip, cuyo tamaño es del orden de las micras, se inmoviliza la sonda de captura (anticuerpo o aptámero), siendo ésta la encargada de reconocer específicamente al analito de interés (trombina, alérgeno o patógeno). En los resultados obtenidos de trombina, se ha elaborado un estudio para la detección de trombina en el seno de diferentes matrices biológicas sobre superficies planas de Si3N4, además del control sobre la activación de una muestra de sangre mediante el uso de factor tisular (TF) y cloruro de calcio (CaCl2). Estos resultados han servido como un estudio preliminar a la optimización del aptámero empleado como sonda de captura, específico de la trombina para su detección sobre chips fotónicos. En lo referente a la detección de alérgenos, se han empleado dos estrategias claramente diferenciadas. Por un lado, la utilización de aptámeros como sondas de captura en la detección del Ovomucoide (OVO) y la Gliadina (GLN) sobre superficies planas Si3N4. Por otro lado, la implementación de anticuerpos monoclonales como moléculas biológicas de captura sobre chips fotónicos, se ha llevado a cabo en la detección de los alérgenos Gliadina (GLN) y caseína (CAS), cuyos resultados han dado lugar a una recta de calibrado. Asimismo, se ha realizado un ensayo para la detección de GLN en muestra real, procedente de un extracto cárnico con gluten de trigo. En cuanto a la detección de patógenos, se han utilizado dos tipos de estrategias, al igual que para los alérgenos. En primer lugar, el uso de aptámeros como sondas de captura han dado como resultado la detección de dos cepas de carácter no patogénico de la bacteria E.coli (Origami y XL1BLUE) sobre superficies planas de Si3N4. En segundo lugar, la utilización de un anticuerpo policlonal como sonda de captura, se ha inmovilizado sobre la superficie del chip fotónico para la detección del Circovirus Porcino tipo 2 (PCV2) en un estudio realizado sobre la dosis dependencia del virus a diferentes factores de dilución. Finalmente, el desarrollo de una plataforma de sensado para la detección de los analitos (trombina, alérgenos y patógenos) y donde se vayan a implementar los diferentes biosensores está en proceso. / [CA] En aquest treball s'ha realitzat la detecció d'anàlits implicats en el sector sanitari (trombina) i indústria alimentària (al·lergògens i patògens), mitjançant l'ús d'un sistema de biosensat fotònic. Aquest sistema desenvolupat per l'equip de LUMENSIA Sensors, empra la tecnologia de xips fotònics de nitrur de silici (Si3N4), basats en estructures d'anells ressonants (RR). Les estratègies de funcionalització química i immobilització de biomolècules com aptàmers (fragments d'ADN de cadena senzilla) i anticossos, s'han realitzat sobre superfícies planes de Si3N4 per a la detecció d'anàlits, com a pas previ a les mesures fotòniques. Per tant, aquestes estratègies s'han implementat en la preparació del xip fotònic per a les mesures en un entorn de laboratori (set-up). Quant a l'estratègia aplicada, aquesta consisteix en l'activació química de la superfície del sensor. Després sobre els RR del xip, la grandària del qual és de l'ordre de les micres, s'immobilitza la sonda de captura (anticòs o aptàmer), sent aquesta l'encarregada de reconèixer específicament a l'anàlit d'interés (trombina, al·lergogen o patogen). En els resultats obtinguts de trombina, s'ha elaborat un estudi per a la detecció de trombina en el si de diferents matrius biològiques sobre superfícies planes de Si3N4, a més del control sobre l'activació d'una mostra de sang mitjançant l'ús de factor tissular (TF) i clorur de calci (CaCl2). Aquests resultats han servit com un estudi preliminar a l'optimització del aptàmer empleat com sonda de captura, específic de la trombina per a la seua detecció sobre xips fotònics. Referent a la detecció d'al·lergògens, s'han emprat dues estratègies clarament diferenciades. D'una banda, la utilització de aptàmers com sondes de captura en la detecció del Ovomucoide (OVO) i la Gliadina (GLN) sobre superfícies planes Si3N4. D'altra banda, la implementació d'anticossos monoclonals com a molècules biològiques de captura sobre xips fotònics, s'ha dut a terme en la detecció dels al·lergògens Gliadina (GLN) i caseïna (CAS), els resultats de la qual han donat lloc a una recta de calibrat. Així mateix, s'ha realitzat un assaig per a la detecció de GLN en mostra real, procedent d'un extracte carni amb gluten de blat. Quant a la detecció de patògens, s'han utilitzat dos tipus d'estratègies, igual que per als al·lergògens. En primer lloc, l'ús de aptàmers com sondes de captura han donat com a resultat la detecció de dos ceps de caràcter no patogènic del bacteri E.coli (Origami i XL1BLUE) sobre superfícies planes de Si3N4. En segon lloc, la utilització d'un anticòs policlonal com sonda de captura, s'ha immobilitzat sobre la superfície del xip fotònic per a la detecció del Circovirus Porcí tipus 2 (PCV2) en un estudi realitzat sobre la dosi dependència del virus a diferents factors de dilució. Finalment, el desenvolupament d'una plataforma de sensat per a la detecció dels anàlits (trombina, al·lergògens i patògens) i on es vagen a implementar els diferents biosensors està en procés. / [EN] In this work the detection of analytes involved in the health sector (thrombin) and food industry (allergens and pathogens) has been carried out, through the use of a photonic biosensing system. This system, developed by the LUMENSIA Sensors team, uses the technology of silicon nitride (Si3N4) photonic chips, based on resonant ring structures (RR). The strategies of chemical functionalization and immobilization of biomolecules such as aptamers (single chain DNA fragments) and antibodies, have been performed on flat surfaces of Si3N4 for the detection of analytes, as a previous step to photonic measurements. Therefore, these strategies have been implemented in the preparation of the photonic chip for measurements in a laboratory environment (set-up). Refering to the strategy applied, it consists of the chemical activation of the sensor surface. Then on the RR of the chip, whose size is of the order of microns, the capture probe (antibody or aptamer) is immobilized, being the one in charge of specifically recognizing the analyte of interest (thrombin, allergen or pathogen). In the results obtained from thrombin, a study for the detection of thrombin in different biological matrices on flat surfaces of Si3N4 has been developed, in addition to the control on the activation of a blood sample through the use of tissue factor (TF) and calcium chloride (CaCl2). These results have served as a preliminary study to the optimization of the aptamer used as a capture probe, specific for thrombin for detection on photonic chips. Regarding the detection of allergens, two clearly differentiated strategies have been used. On the one hand, the use of aptamers as capture probes in the detection of Ovomucoid (OVO) and Gliadin (GLN) on Si3N4 flat surfaces. On the other hand, the implementation of monoclonal antibodies as biological capture molecules on photonic chips has been carried out in the detection of the allergens Gliadina (GLN) and casein (CAS), whose results have resulted in a calibration line. Likewise, an assay for the detection of GLN in real sample, from a meat extract with wheat gluten, has been carried out. As for the detection of pathogens, two types of strategies have been used, as for allergens. First, the use of aptamers as capture probes has resulted in the detection of two non-pathogenic strains of the E.coli bacteria (Origami and XL1BLUE) on flat surfaces of Si3N4. Secondly, the use of a polyclonal antibody as a capture probe has been immobilized on the surface of the photonic chip for the detection of Porcine Circovirus type 2 (PCV2) in a study on the dose dependence of the virus at different dilution factors. Finally, the development of a sensing platform for the detection of analytes (thrombin, allergens and pathogens) and where the different biosensors are going to be implemented is in process. / Quiero agradecer al Instituto de Salud Carlos III por el contrato i-PFIS concedido / Sánchez Sánchez, C. (2019). SISTEMA DE BIOSENSADO FOTÓNICO PARA LA DETECCIÓN DE TROMBINA, ALÉRGENOS Y PATÓGENOS. FUNCIONALIZACIÓN QUÍMICA DE CHIPS FOTÓNICOS BASADOS EN ESTRUCTURAS DE ANILLOS RESONANTES [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/133060 / TESIS

INTRODUÇÃO: O aumento da prevalência das doenças alérgicas tem sido associado a vários fatores de risco e a detecção destes e a avaliação da prevalência em diferentes regiões é fundamental. O protocolo padronizado ISAAC (International Study of Asthma and Allergies in Childhood), possibilitou a comparação destes dados epidemiológicos. Os OBJETIVOS deste estudo foram: avaliar a prevalência da asma, rinite e eczema alérgicos e sintomas relacionados, entre escolares de 13 a 14 anos, da região oeste da cidade de São Paulo, utilizando-se o questionário escrito ISAAC e identificar possíveis fatores de risco associados à presença de asma ou à positividade ao teste cutâneo de hipersensibilidade imediata (TCHI). MÉTODOS: Entre fevereiro de 2002 e outubro de 2003 foi aplicado questionário escrito ISAAC em 3181 alunos. Após amostragem sistemática, 528 alunos foram submetidos ao TCHI para o diagnóstico de atopia e responderam a um questionário complementar sobre antecedentes familiares e condições ambientais. Foram constituídos grupos de alunos com ou sem asma, considerando-se a presença de sintomas de asma nos últimos 12 meses, e com ou sem TCHI positivo a pelo menos um aeroalérgeno. A análise dos fatores de risco foi realizada pelo teste do qui-quadrado ou teste exato de Fisher e por regressão binária logística (Backward Stepwise). RESULTADOS: As prevalências encontradas foram: asma de 21,9%, diagnóstico médico de asma 8,9%, rinite de 30,1%, rinoconjuntivite de 19,8% , diagnóstico médico de rinite 18,9%, eczema atópico de 9,7% e o diagnóstico médico de eczema 8,6%. Houve associação entre asma, rinite e eczema atópico em 2,3% dos adolescentes. O sexo feminino foi prevalente em todas as questões sobre asma, rinite e eczema atópico. Houve associação entre TCHI e a presença de asma (OR = 2,6) e de rinite (OR = 1,9). Em relação à asma, os fatores de risco foram: sintomas de rinite no último ano (ORajustado = 3,2); positividade ao TCHI (ORajustado = 2,8); parto prematuro (ORajustado = 3,8); nunca consumir vegetais cozidos (ORajustado = 2,6); presença de eczema em locais característicos (ORajustado = 2,9) e mãe alérgica (ORajustado = 2,0). Em relação à positividade do TCHI, os fatores de risco foram: presença de asma (ORajustado = 2,3); sintomas de rinite no último ano (ORajustado = 1,9); pai alérgico (ORajustado = 2,2) e parto cesáreo (ORajustado = 1,7). CONCLUSÕES: A prevalência de asma neste estudo mostrou valores elevados em comparação ao diagnóstico médico de asma. A prevalência da rinoconjuntivite foi comparável ao diagnóstico médico de rinite, que foram menores que a prevalência de rinite no último ano. A prevalência de eczema atópico foi maior que aquela avaliada pelo critério combinado. Houve predomínio do sexo feminino nas respostas positivas para todas as doenças atópicas. Houve associação entre TCHI e presença de rinite ou asma. Os fatores de risco associados à asma foram: mãe alérgica, rinite, parto prematuro, eczema em locais característicos, dieta sem vegetais cozidos e TCHI positivos e os relacionados à positividade do TCHI: pai alérgico, cesárea, asma e rinite no último ano. / INTRODUCTION: The increase of allergic diseases has been associated to several risk factors, the detection of them and prevalences evaluations from different areas are essential. The written questionnaire standardized by "International Study of Asthma and Allergies in Childhood" - ISAAC, made possible the comparison of epidemiologic data. The aims of the present study were: to evaluate the prevalence of asthma, rhinitis and allergic eczema and related symptoms, among students from 13 to 14 years in the west area of São Paulo city, through the written questionnaire from the ISAAC study and to identify possible risk factors associated to asthma or positive skin prick test in this population. METHODS: In the period from February/2002 to October/2003 written questionnaire was applied to 3181 students. After selection by systematic samples, 528 students were submitted to skin prick test regarding the atopic diagnose and they answered a complementary questionnaire about family history and environmental conditions. The students' groups were constituted with or without asthma according the positive answer to asthma symptoms in the last 12 months, and with or without positive skin prick test at least one aeroallergen. The risk factors analysis was accomplished by univariated (qui-square or Fisher’ exact test) and multivariated analysis by binary logistic regression (Backward Stepwise). RESULTS: The prevalence found were: asthma 21,9%, medical diagnosis of asthma 8,9%, rhinitis 30,1%, rhinoconjunctivitis 19,8%, medical diagnosis of rhinitis 18,9%, atopic eczema 9,7% and the medical diagnosis of eczema 8,6%. There was association among asthma, rhinitis and atopic eczema in 2,3% of the adolescents. Female sex was prevalent in all of the subjects on asthma, rhinitis and atopic eczema. There was association between skin prick test and asthma (OR = 2,6) and rhinitis (OR = 1,9). In relation to asthma, the risk factors were: rhinitis symptoms in the last year (ORadjusted = 3,2); positive skin prick test (ORadjusted = 2,8); premature delivery (ORadjusted = 3,8); never to consume cooked vegetables (ORadjusted = 2,6); eczema presence in characteristic areas (ORadjusted = 2,9) and allergic mother (ORadjusted = 2,0). In relation to positive skin prick test, the risk factors were: asthma (ORadjusted = 2,3); rhinitis symptoms in the last year (ORadjusted = 1,9); allergic father (ORadjusted = 2,2) and cesarean section (ORadjusted = 1,7). CONCLUSIONS: This study showed high prevalence of asthma when compared with medical diagnosis of asthma. The prevalence of rhinoconjunctivitis was similar to medical diagnostic of rhinitis that was lower than the rhinitis prevalence in the last year. The prevalence of atopic eczema was higher than combined criteria. The female gender predominates in all positive responses regarding allergic diseases. There was association between skin prick test and asthma or rhinitis. The risk factors associated with asthma were allergic mother, rhinitis, premature delivery, eczema at characteristic areas, diet without cooked vegetables and positive skin prick test. The risk factors associated with positive skin prick test were: allergic father, cesarean section, asthma and rhinitis in the last year.