A tuberculose (TB) é uma séria doença infecciosa causada por Mycobacterium tuberculosis, e constitui um importante problema de saúde pública em todo o mundo. Novas drogas e vacinas de segunda geração são urgentemente necessárias para o controle da TB, mas a complexa biologia de M. tuberculosis tem dificultado o desenvolvimento de estratégias terapêuticas inovadoras. A manipulação genética de M. tuberculosis também é complicada, mas, atualmente, técnicas novas e mais eficientes de troca alélica permitem o estudo detalhado de diversos genes micobacterianos. No presente trabalho, os genes da corismato mutase (CM) e fosforilase de nucleosídeos purínicos (PNP) de M. tuberculosis e Mycobacterium smegmatis foram estudados. A CM catalisa a conversão de corismato em prefenato na rota de biossíntese dos aminoácidos aromáticos fenilalanina e tirosina em bactérias, fungos e plantas. Dois genes de CMs monofuncionais (aroQ e *aroQ) foram identificados, clonados, expressos e bioquimicamente caracterizados em ambas as espécies de micobactérias. Esses genes também foram investigados usando uma metodologia de recombinação homóloga e ensaios de atividade promotora. Os resultados indicam que os genes aroQ são provavelmente essenciais ao crescimento in vitro de M. tuberculosis e M. smegmatis, enquanto uma linhagem mutante para o gene *aroQ de M. smegmatis pôde ser obtida. A PNP catalisa a interconversão e reciclagem de bases, nucleosídeos e nucleotídeos purínicos na via de salvamento das purinas. A construção de mutantes para o gene deoD (que codifica a PNP) de M. tuberculosis e M. smegmatis, usando um método eficiente de troca alélica em duas etapas, não foi possível. Assim, sugere-se que, nas condições testadas, o gene deoD seja essencial ao crescimento in vitro dessas micobactérias. A identificação de genes essenciais é de fundamental importância, pois indica tanto a relevância biológica dos mesmos como, no caso de M. tuberculosis, que seus produtos constituem alvos moleculares interessantes para o desenvolvimento de novas drogas antimicobacterianas. / Tuberculosis (TB), a serious infectious disease caused by Mycobacterium tuberculosis, still remains a public health problem in the world. New drugs and second generation vaccines are urgently required to control TB, but the complex biology of M. tuberculosis has hindered the development of novel therapeutic tools. Genetic manipulation of M. tuberculosis is also difficult, but currently new, more efficient gene replacement techniques have allowed detailed studies of many mycobacterial genes. In the present work, the chorismate mutase (CM) and purine nucleoside phosphorylase (PNP) genes from M. tuberculosis and Mycobacterium smegmatis were studied. CM catalyzes the rearrangement of chorismate to prephenate in the biosynthetic pathway that forms phenylalanine and tyrosine in bacteria, fungi, and plants. Two monofunctional CM genes (aroQ and *aroQ) were identified, cloned, expressed, and biochemically characterized in both mycobacteria. Those genes were also investigated by homologous recombination methods and promoter activity assays. AroQ genes seem to be essential for the growth of M. tuberculosis and M. smegmatis, while an *aroQ mutant strain could be generated in M. smegmatis. PNP promotes the interconversion and recycling of purine bases, nucleosides, and nucleotides in the purine salvage pathway. Construction of deoD (which codes for PNP) deletion mutants of M. tuberculosis and M. smegmatis using an efficient two-step gene replacement technique was not possible. Thus, it is suggested that deoD is also essential for mycobacterial growth under the conditions tested. The identification of essential genes is of great importance, both because it indicates their biological significance, and because, with pathogens like M. tuberculosis, these may also indicate attractive molecular targets for the development of new antimycobacterial drugs.

A Doença do Xarope do Bordo (DXB) é uma desordem hereditária causada pela deficiência do complexo enzimático desidrogenase dos cetoácidos de cadeia ramificada, e como conseqüência ocorre o acúmulo dos aminoácidos de cadeia ramificada (AACR) leucina (Leu), isoleucina (Ile) e valina (Val), e seus respectivos cetoácidos α- cetoisocapróico (CIC), α-ceto-β-metilvalérico (CMV) e α-cetoisovalérico (CIV), que caracteriza a doença. Os pacientes afetados apresentam sintomas neurológicos graves, tais como convulsões, coma, retardo psicomotor e retardo mental. Entretanto, os mecanismos fisiopatológicos da doença ainda não estão esclarecidos. Em estudos anteriores, realizados em nosso laboratório, observamos que os α-cetoácidos de cadeia ramificada modificaram a fosforilação dos filamentos intermediários em córtex cerebral de ratos wistar em diferentes idades, alteraram a morfologia de células gliais e provocaram estresse oxidativo em células de glioma C6. Neste estudo, nós investigamos o efeito in vitro dos aminoácidos de cadeia ramificada, nas concentrações encontradas nos pacientes afetados por DXB, sobre a fosforilação dos filamentos intermediários de córtex cerebral de ratos durante o desenvolvimento. Fatias de córtex cerebral de ratos wistar de 9, 12,17 e 21 dias foram incubadas com os aminoácidos Leu, Ile e Val na presença de 32P-ortofosfato, a fração citoesquelética foi extraída e a radioatividade incorporada pelas subunidades dos filamentos intermediários foi medida. Os resultados obtidos não demonstraram alterações significativas no parâmetro estudado. Também foram realizados estudos morfológicos em cultura de células C6 através de microscopia de contraste de fase e técnicas de imunocitoquímica. As células foram incubadas por 3, 12 ou 24 horas na presença ou na ausência dos AACR. Os resultados demonstraram que os AACR alteraram a morfologia das células de redondas para fusiformes com a presença de vários processos de um modo dependente do tempo e do tipo de AACR. A imunocitoquímica com anticorpos anti-actina e anti-proteína glial fibrilar ácida (GFAP) demonstrou que estes metabólitos induziram uma reorganização do citoesqueleto. Além disso, observamos morte celular intensa na presença dos AACR. Por outro lado, verificamos que não houve alteração de fosforilação da proteína glial fibrilar ácida (GFAP) nas células C6, mas observamos que houve diminuição da glutationa e aumento da produção de óxido nítrico quando as células C6 foram incubadas por 3h com os AACR. Quando as células C6 foram tratadas com glutationa ou L-NAME e com os AACR estes antioxidantes foram capazes de prevenir as alterações metabólicas causadas por estes metabólitos, sugerindo o envolvimento do estresse oxidativo nas alterações causadas pelos AACR. Considerando que as células astrogliais são de fundamental importância para o desenvolvimento e o funcionamento do cérebro é provável que as alterações provocadas pelos AACR possam ter importantes conseqüências para a neurodegeneração característica dos pacientes portadores de DXB. / Maple syrup urine disease (MSUD) is a inherited disorder caused by a deficiency of the enzyme complex branched-chain α-keto acid dehydrogenase (BCKD), and consequently occurs the accumulation of branched-chain amino acids (BCAAs) leucine (Leu), isoleucina (Ile) and valine (Val), and theirs corresponding branched-chain α-keto acids (BCKAs) α-keto-isocaproic acid (KIC), α-keto-β-methyvaleric acid (CMV) and α- keto-isovaleric (KIV), that characterize the disease. Affected patients present severe neurological symptoms such as coma, psychomotor delay and mental retardation. However, the physiopathologic mechanisms are unknown. In previous studies carried through in our laboratory we observed that the BCKAs had modified the phosphorylation of the intermediate filaments (IF) in cerebral cortex of rats wistar in different ages. We also verified that these metabolites altered the morphology of glial cells and provoked oxidative stress in C6 cells. In this study, we investigate the in vitro effect of BCAAs, in the concentrations found in the patients affected with MSUD, on the phosphorylation of the IF from cerebral cortex of rats during development. Slices from cerebral cortex of wistar rats of 9, 12, 17 and 21 days were incubated with the amino acids Leu, Ile and Val in the presence of 32P-ortophosphate, the cytoskeleton fraction was extracted and the radioactivity incorporated into the subunits of the IF was measured. The results obtained do not demonstrate significant alterations in this studied parameter. We also performed morphologic studies in C6 cells through analyses of imunocitochemistry and phase contrast microscopy. The cells had been incubated for 3, 12 or 24 hours in the presence or the absence of the BCAAs. The results demonstrate that the BCAAs alter the morphology of the cells from rounded to fusiformes with the presence of some processes in a dependent way of the time and the type of BCAAs. The imunocitochemistry with anti-actin and antiglial fibrilary acid protein (GFAP) antibodies demonstrates that these metabolites induce a reorganization of cytoskeleton. Moreover, we observe intense cellular death in the presence of the BCAAs. On the other hand, we verify that it does not involve an alteration of the phosphorylation of GFAP in C6 cells. We also observe a reduction of glutathione and a increase of nitric oxide production when the cells were incubated for 3 hours with the BCAAs. When the C6 cells were treated with glutathione or L-NAME in the presence of the BCAAs these antioxidants were capable to prevent the metabolic alterations caused by these metabolites, suggesting the involvement of oxidative stress in the alterations caused by the BCAAs. Considering that the astroglials cells are have fundamental importance on the development and functioning of the brain it is feasible that the alterations provoked by the BCAAs have important consequences for the neurodegeneration characteristic of MSUD patients.

Um possível mecanismo de dano ao tecido induzido por hiperglicemia persistente na diabetes mellitus é a formação de produtos avançados de glicação (AGEs). Endogenamente, açúcares reduzidos reagem não enzimaticamente com grupos amino de proteínas, lipídeos e ácidos nucléicos através de uma série de reações que formam bases de Shiff seguida da formação de produtos de Amadori para a produção de AGEs. O glioxal e o metilglioxal são espécies reativas de carbonilas com ação de glicação, formados pela degradação de proteínas glicadas, intermediários glicolíticos e peroxidação lipídica e reagem com proteínas para formar os AGEs. No presente estudo nós avaliamos os efeitos dos glioxais in vitro sobre o metabolismo dos aminoácidos glicina, leucina e alanina, bem como sobre o metabolismo da glicose, lactato, acetato e glutamina em córtex cerebral de ratos Wistar de 10 dias de idade pós-natal e aos 3 meses de idade pós natal. Para verificar estes efeitos na incorporação à proteínas, síntese lipídica e produção de CO2 utilizamos os seguintes substratos: 0,2 mM de alanina, 0,2 mM glicina, 0,2 mM leucina, 2,0 mM glutamina, 5mM de glicose, ou 10mM de lactato ou 1mM de acetato As fatias de córtex cerebral foram incubadas com os substratos descritos a 37ºC em ambiente fechado. O CO2 captado foi determinado em contador de cintilação líquida. O homogeneizado foi lavado com TCA 10% para a extração dos lipídios com Clorofórmio:Metanol (2:1), e acrescentado o líquido de cintilação, a radioatividade incorporada foi determinada em contador de cintilação líquida. O precipitado resultante foi dissolvido em ácido fórmico para medida de incorporação a proteínas. Concluímos que os efeitos do glioxal foram superiores aos efeitos do metilglioxal sobre o metabolismo dos aminoácidos estudados; Os glioxais (glioxal e metilglioxal) não tiveram efeitos sobre os parâmetros estudados no metabolismo da glicose, lactato e acetato; Os glioxais não alteraram o metabolismo da glicina e da glutamina em córtex cerebral de ratos adultos; A utilização de antioxidantes (N-acetilcisteína e trolox) no meio de incubação não modificou os efeitos dos glioxais sobre o metabolismo dos aminoácidos; A N-acetilcisteína e a penicilamina exerceram um acentuado efeito sobre o metabolismo dos aminoácidos. O estudo não estabeleceu um mecanismo para os efeitos do glioxal. Especulamos que a quantidade do antioxidante trolox usada não foi suficiente. A N-acetilcisteína e a penicilamina tiveram um efeito próprio que impossibilitou uma conclusão. / A possible way of tissue damage induced by persistent hyperglycemia in diabetes mellitus is the production of advanced glycation end products (AGEs). Endogenously, reduced sugar, like glucose, react not enzimatically with amino groups of proteins, lipids and nucleic acids trough a plenty of reactions which form Shiff bases follow the formation of Amadori products to the next production of AGEs. The glyoxal and mthylglyoxal are reactive carbonyl species with a potential glycation action. They are formed by the degradation of glycated proteins, glycolitic intermediates and lipid peroxidation and react with protein to form AGEs. In the present study we evaluate the effects of the glyoxals in vitro on the metabolism of the amino acids glycine, leucine and alanine and on the metabolism of glucose, lactate, acetate and glutamine in cerebral cortex of Wistar mouse with 10 day old and with 3 months old. To verify this effect on the protein incorporation, lipid synthesis and production of CO2, we used the follow substrates: 2 mM of alanine, or glycine, or leucine, or glutamine, or 5mM of glucose, or 10 mM of lactate or 1mM of acetate. The slices of cerebral cortex were incubated with those substrates at 37ºC. The CO2 captured was determined in a liquid-scintillation counter. The homogenized was washed with TCA 10% for the extraction of lipids with Clorform:Methanol (2:1), and it was add scintillation liquid, the radioactivity incorporated was determined in a liquid-scintillation counter The result precipitate was dissolved in formic acid to the measure of the incorporation to protein. We could conclude that the effects of glyoxal were higher to the effects of methylglioxal on the metabolism of the amino acids studied; Glyoxal and Methylglyoxal didn't show effects on the metabolism of glucose, lactate and acetate; Glyoxals didn't change the metabolism of glycine and glutamine in cerebral cortex of adults Wistar mouse; The utilization of anti-oxidants (N-acetylcysteine and trolox) didn't change the effects of the glyoxals on the metabolism of the amino acids; N-acetylcysteine and penicillamine showed an accentuate effect on the metabolism of the amino acids. This data didn't establish a mechanism for the effects of glyoxal. We speculate that the amount of the antioxidant trolox used in the research wasn't sufficient. The N-acetilcysteine and penicilaminne showed an own effect the reason why we could not find a conclusion.

Made available in DSpace on 2014-06-12T16:31:57Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo6255_1.pdf: 3410858 bytes, checksum: ad49b00d2688bfb4c51d83ac9807becc (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2007 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Os relatos de Relação Estrutura Atividade (REA) da Talidomida e análogos revelam o potencial farmacofórico do anel ftalimídico e, ao mesmo tempo, denotam o perfil toxicofórico do grupamento glutarimida. Em conseqüência, o núcleo ftalimida vem sendo explorado visando-se agentes antiinflamatórios e antitumorais mais potentes e menos tóxicos. Merece destaque ainda o conhecimento de que pequenos resíduos de L-α-aminoácidos são utilizados como grupos transportadores na latenciação de agentes farmacológicos menos tóxicos. Em um estudo de REA preliminar, são descritos neste trabalho, a síntese e a avaliação das atividades antiinflamatória, citotóxica e imunomodulatória de derivados do tipo N-aminoacídicos-1,3-isoindolinadionas. Através da condensação entre o anidrido ftálico e os respectivos L-α-aminoácidos os produtos foram obtidos e, posteriormente, submetidos aos testes biológicos. Para avaliação da atividade antiinflamatória ‗in vivo empregou-se o ensaio do bolsão de ar em camundongos. As substâncias foram administradas por via oral, na dose de 100 mg.kg-1, tomou-se a Talidomida como droga padrão. Foram realizados ainda, ensaios ‗in vitro frente às células tumorais MDA-MB 435, HCT-8 e SF-295, assim como para a linhagem de células de mamíferos BALB/c. Os resultados apontaram o derivado N-(3-metil-ácido pentanóico)-1,3- isoindolinadiona (5) como o mais potente antiinflamatório desta série, com percentual de inibição comparável com a Talidomida. A avaliação do derivado 5 na dose de 10 mg.Kg-1 no ensaio antiinflamatório demonstrou potência semelhante ao padrão. Todos os compostos apresentaram baixo nível de citotoxicidade em esplenócitos de mamíferos e não inibiram o crescimento das linhagens testadas na concentração de 25 g.mL-1. No intuito de elucidar um possível mecanismo de atividade antiinflamatória por via imunomodulatória, as moléculas também foram testadas como possíveis inibidores da produção de óxido nítrico (NO). Todos os produtos foram capazes de inibir a produção de NO, no ensaio de ELISA, nas concentrações de 25 e 50 g.mL-1, e com níveis bem próximos da droga padrão. Portanto, além de sintetizar derivados do tipo N-aminoacídicos-1,3-isoindolinadionas, esses produtos foram testados em ensaios preliminares para determinação de suas potenciais atividades biológicas

Orientador: Ronei Jesus Poppi / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Quimica / Made available in DSpace on 2018-08-05T01:26:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Simas_RosineideCosta_M.pdf: 1496538 bytes, checksum: 7db4007f616ad7a1bac3103f400da288 (MD5) Previous issue date: 2005 / Mestrado / Mestre em Ciências

Orientador: Luiz Augusto Magalhães / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-21T19:20:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Seta_Lucianede_D.pdf: 7041259 bytes, checksum: 63818bb271fb5ebabc71fe09ec0a175a (MD5) Previous issue date: 1996 / Resumo: Estudamos a atração miraxonal frente à moluscos Biomphalaria glabrata e Biomphalaria tenagophila infectados ou não pelo Schistosoma mansoni, sua água de condicionamento (SCW), sua hemolinfa e seu extrato da glândula do albúmen. Em síntese, pudemos observar que moluscos B. tenagophila infectados atraíram mais miracídios de S. mansoni S1 que os moluscos não infectados. O mesmo ocorreu com sua SCW, sua hemolinfa e também seu extrato da glândula do albúmen. O mesmo não ocorreu em B. glabrata infectada por S. mansoni, que apresentou uma nítida repelência aos miracídios BH. Em B. glabrata observamos que sua SCW atraiu mais miracídios de S. mansoni BH que o próprio molusco. Moluscos B. glabrata sadios atraíram mais miracídios que os moluscos infectados. Ao compararmos a atração miraxonal frente ao extrato da glândula do albúmen de moluscos sadios e infectados com sua SCW pudemos verificar que: 1) Os componentes do extrato da glândula do albúmen seriam quimioatraentes para os miracídios de S. mansoni; 2) O extrato da glândula do albúmen atraiu mais miracídios que sua SCW, independente dessa SCW ser de moluscos sadios ou infectados por S. mansoni. Paralelamente analisamos o conteúdo de aminoácidos livres da hemolinfa, da SCW e do extrato da glândula do albúmen de B. glabrata e B. tenagophila infectadas ou não pelo S. mansoni. Na hemolinfa de B. glabrata sadia (HBgS) foram encontrados 28 aminoácidos livres, e na hemolinfa de moluscos infectados (HBgI) foram encontrados 32. Na hemolinfa de B. tenagophila sadia (HBtS) foram encontrados 28 aminoácidos livres e na hemolinfa dos moluscos infectados foram encontrados 33. Na hemolinfa de B. glabrata infectada houve um aumento geral da concentração de aminoácidos livres em relação ao encontrado na hemolinfa de moluscos sadios. Na hemolinfa de B. tenagophila infectada houve uma redução da concentração de aminoácidos livres em relação aos moluscos sadios. Na água de condicionamento (SCW) de B. glabrata sadias foram encontrados 19 aminoácidos livres, enquanto que na SCW desses moluscos, infectados por S. mansoni foram encontrados 17. Na SCW de B. tenagophila sadias foram encontrados 19 aminoácidos livres, enquanto que na SCW de B. tenagophila infectados foram encontrados 16. Não houve correspondência entre o conteúdo de aminoácidos livres da hemolinfa e da SCW. No extrato da glândula do albúmen de B. glabrata sadios foram encontrados 4 aminoácidos livres e nos moluscos infectados foram encontrados 5. No extrato da glândula do albúmen de B. tenagophila sadia foram encontrados 7 aminoácidos livres e nos moluscos infectados foram encontrados 6. Analisamos o conteúdo de aminoácidos livres como possíveis quimioatraentes para os miracídios de S. mansoni. Através da eletroforese em gel de poliacrilamida da hemolinfa verificamos haver uma redução de algumas frações proteicas na hemolinfa de B. tenagophila infectadas por S. mansoni, por volta de 45 Kda. A cromatografia de exclusão molecular da hemolinfa apresentou em ambas espécies de moluscos sadios ou infectados uma característica nítida da presença da hemoglobina e as demais frações de menor peso molecular. Tal resultado foi confirmado na eletroforese (SDS-P AGE) / Abstract: We studied the miraxonal atraction in the snails Biomphalaria glabrata and B. tenagophila, both infected with Schistosoma mansoni and non infected , the snail conditioned water (SCW), the hemolymph and the albwnen gland extract. We were able to observe that infected B. tenagophila atracted more SJ S. mansoni miracidia than the non-infected snails. The same fact was observed with the SCW, the hemolymph and the albwnen gland extract. The opposite results occur with infected B. glabrata snails, wich showed a clear repellence to the BH S. mansoni miracidia. In B. glabrata snails, we observed that their SCW atracted more BH S. mansoni miracidia than snails. Non infected B. glabrata atracted more miracidia than the infected ones. The comparison of the miraxonal atraction to the albumen gland extracts of non infected and infected snails with their SCW, showed that: 1) The components of the albumen gland extract were chemoattactive to S. mansoni miracidia; 2) The albwnen gland extracts attracted more miracidia than their SCW, regardless of the SCW being from infected or non infected snails. In addition, we analysed the presence of free amino acids in the hemolymph, SCW and albumen gland extracts of infected by S. mansoni or non infected B. glabrata and B. tenagophila. In the hemolymph of non infected B. glabrata (HBgS), we found 28 free amino acids, and in the hemolymph of snails infected with S. mansoni (HBgI) we found 32. In the hemolymph of infected B. glabrata, there was a general increase in concentration of free arnino acids when compared to the values observed in the hemolymph of non infected snails. In the snail conditioned water (SCW) of non infected B. glabrata (WBgS) we found 19 free amino acids, while in the SCW of snails infected with S. mansoni, on1y 17 amino acids were found. In the SCW of non infected B. tenagophila 19 free amino acids were found, whereas in the the SCW of infected B. tenagophila 16 free amino acids were found. No relationship between the content of free amino acids of the hemolymph and SCW was detected. In the albumen gland extract of non infected B. glabrata 4 free amino acids were found and 5 in the infected snails. In the albumen gland extract of non infected B. tenagophila we found 7 free amino acids and 6 in the infected snails. Free amino acids were tested as possible chemoattratents to the S.mansoni miracidia. Through polyacrilamide gell electrophoresis (SDS-P AGE) we verified a reduction of some protein fractions with molecular weight in the range of 45 Kda, in the hemolympph of B. tenagophila infected with S. mansoni. The molecular exc1usion cromatography of the hemolymph of both species of snails showed a c1ear presence of haemoglobin and other fractions with lower molecular weights. This result was confirmed by the electrophoresis (SDS-P AGE) / Doutorado / Parasitologia / Doutor em Ciências

Orientador: Ladaslaw Sodek / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-22T16:17:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Puiatti_Mario_D.pdf: 9205989 bytes, checksum: 9b01b61d9d046287511084df4a86ad39 (MD5) Previous issue date: 1997 / Resumo: Nitrogênio combinado, especialmente N03- exerce dois efeitos inibitórios fundamentais na associação simbiótica Bradyrhizobium-soja. Um deles é exercido no processo de nodulação, interferindo, possivelmente, desde as primeiras trocas de comunicação rizobia-planta, através da interferência nos sinais moleculares envolvidos nessa comunicação, até a síntese da N2ase do bacteróide e a sua entrada em funcionamento ativo. Em nódulos já formados, com a N2ase fixando ativamente N2 N03-atua inibindo a atividade da N2ase, e por conseguinte, a redução de N2 a NH4 + . Embora esses dois efeitos sejam conhecidos há cerca de um século, e durante esse tempo várias hipóteses terem sido formuladas, persistem, ainda hoje, dúvidas quanto ao(s) mecanismo(s) envolvido(s). Em razão de pesquisas recentes terem associado a possibilidade do envolvimento de etileno com o efeito inibitório de N03- na nodulação, e do envolvimento de N03- limitando O2 para a atividade fixadora de N2 de nódulos já formados, realizamos esse trabalho, o qual, além de investigar alguns aspectos gerais do mecanismo de inibição da nodulação e da fixação de N2 pelo N03- em nódulos de soja, teve como objetivos específicos: a) verificar o envolvimento de etileno na inibição da nodulação e da fixação de N2 pelo N03- ; b) verificar o envolvimento de uma possível limitação de O2 na inibição da fixação de N2 pelo N03-. Para verificar o possível envolvimento de etileno na inibição da nodulação e fixação de N2 pelo N03-, foram realizados dez experimentos (dois em vermiculita e oito em hidroponia). Para verificar a possível limitação de O2 há atividade de fixação de N2 do nódulo já formado, foram conduzidos cinco experimentos, submetendo plantas adultas, noduladas, inoculadas e cultivadas em vermiculita até a frutificação, fixando ativamente N2, a tratamentos de hidroponia e/ou N03- por períodos variáveis de até nove dias. Baseado nos resultados obtidos, concluímos que: inibidores da síntese de etileno (Co e A VG), não foram eficientes em prevenir a planta de soja do efeito inibitório de N03 na nodulação, nem na atividade fixadora de N2 do nódulo. Por outro lado, AIA (1,0 µM), apresentou alguns indícios de estar envolvido no processo da nodulação, prevenindo-a, parcialmente, do efeito inibitório de N03, todavia, AIA também não foi eficaz em prevenir a atividade fixadora de N2 dos nódulos do efeito inibitório de N03-. Além isso, AIA (1,0 µM), alterou as proporções dos aminoácidos livres presentes nos exsudatos do xilema, aumentando grandemente aspartato e diminuindo glutamina e asparagina, além de impedir o aumento de asparagina e a diminuição de aspartato proporcionados pelo N03- (4,0 mM). Hidroponia, mesmo com borbulhamento permanente da solução nutritiva com ar, inibiu atividade de fixação de N2 dos nódulos, sugerindo que o sistema limita O2 para a atividade da N2ase do bacteróide. Além disso, hidroponia proporcionou a diminuição de asparagina e de glutamina nos exsudatos do xilema, e um aumento muito grande de aspartato, embora não tenha sido possível explicar esse aumento de aspartato em termos do catabolismo de asparagina pela ação da asparaginase em nódulos. N03- inibiu a nodulação e a atividade de fixação de N2 dos nódulos, sendo a última mais sensível a esse efeito inibitório; além disso, o efeito inibitório foi manifestado com maior intensidade em hidroponia do que em vermiculita, sugerindo que N03- atue limitando ainda mais O2 para a atividade de fixação de N2 do nódulo. N03- em aerobiose (vermiculita ou hidroponia com aeração) promoveu aumento de asparagina e diminuição de glutamina nos exsudatos do xilema. Anaerobiose (anoxia parcial ou total), principalmente associada ao N03-, promoveu diminuição de asparagina, glutamina e aspartato nos exsudatos do xilema, e aumento acentuado de a lanina e serina. A atividade de fixação de N2 do nódulo foi diretamente proporcional ao teor de ureídeos totais presentes nos exsudatos do xilema e inversamente proporcional ao teor de N03-; todavia o teor de aminoácidos livres totais demonstrou ser uma característica pouco associada à atividade fixadora de N2 dos nódulos. O teor de Lb, dentro de cada tratamento, variou proporcionalmente ao de proteína solúvel total, apresentando menores teores os tratamentos de estresse de O2 associado com NO3- (hidroponia +NO3- e sem aeração); todavia a resposta da Lb aos tratamentos aplicados não foi muito expressiva, sugerindo que a Lb pode não ser um dos principais fatores limitantes do processo de fixação de N2 em nódulos de soja / Abstract: Mechanisms involved in inhibition of nodulation and N2 fixation process by NO3- in soybean plants (Glycine max (L.) Merril cv. Santa Rosa) cultivated by hydroponics technique. Combined nitrogen, especially N03-, performs two fundamental inhibitory effects in the Bradyrhizabium-saybean symbiotic association. One of them is performed during nodulation, and it interferes from the first communication exchanges rhizoid-plant, by means of the interference in the molecular signals which are involved in this communication exchanges, up to the bacteroid N2ase synthesis and its entry into the active functioning. N03- works as an inhibitor of the N2ase activity, in the already farmed nodules with the N2ase actively fixating the N2, and consequently inhibits the N2 a NH4 + reduction. In spite of these two effects being already known far around one century, and that during this time many hypothesis have been formulated, doubts in relation to the mechanism(s) which is(are) involved. Thanks to recent researches having associated the possibility of ethylene having he inhibitory effect aver the N03- in nodulation, and to the involvement of N03-, which limits O2 in the N2 fixating activity of the already farmed nodules, we have as well as making this work - in which, we investigate same general aspects of the nodulation inhibition mechanism and the N2 fixing by the N03- in soybean nodules - aimed on specific objectives such as: a) check on the involvement of ethylene in the nodulation inhibition mechanism and the N2 fixating by the. N03-, b) verify the involvement of a possible O2 limitation in the inhibiting mechanism of the N2 fixing by N03-. Ten experiments (two on vermiculite and the other eight on hydroponics) were performed in order to verify the possible involvement of ethylene in N03- nodulation inhibition and N2 fixation. Five experiments were done in order to check on the possible O2 limitation in the N2 fixating activity present in the already formed nodule, by subjecting adult plants, which were modulated, inoculated and cultivated in vermiculite up to its fructification, which was an activity that actively fixed the N2, to the hydroponics treatments and/or N03- for varied periods of up to nine days. We have concluded, based on the results which were obtained, that: inhibitors of the ethylene synthesis (Co and AVG), were not efficient in protecting the soybean plant from the inhibitory effect of the N03- in the nodulation, neither in the nodule N2 fixating activity. On the other hand, AIA (1,0 µM), presented some possibilities of it being involved in the nodulation process, which partially prevents the inhibitory effect of the N03- however, AIA was also not efficient in preventing the nodule N2 fixating activity, from the N03- inhibiting effect. However, AIA (1,0 µM), has altered the proportions of the free amino acids which are present in the xylem exudates, greatly enlarging aspartic acid and decreasing glutamine and asparagines, as well as stopping the asparagines increase and the aspartic acid decrease caused by the N03- (4.0 mM) . Hydroponics, even with a constant bubbling of the nutritive solution with air, has inhibited the nodules N2 fixating activity, which suggests that the system limits O2 for the N2ase activity of the bacteroid. Also, hydroponics has caused the decrease of asparagines and of glutamine in the xylem exudates, and a great a spartatic acid increase; a though it was not possible to explain this aspartic acid increase concerning the asparagines catabolism through the action of the asparagines in the nodules. N03- has inhibited the nodulation and the nodule N2 fixating activity, but the latter is more sensitive to this inhibitory effect. Besides, the inhibitory effect has been manifested more intensively in hydroponics than in vermiculite, suggesting that N03- would proceed restricting even more the O2 for the nodule N2 fixing activity. N03- in aerobic conditions (vermiculite or hydroponics with aeration) promoted the asparagines increase and the glutamine decrease in the xylem exudate. Anaerobic conditions (partial or total anoxia), especially when it is associated to N03-, caused the decrease of asparagine, glutamine and aspartic acid in the xylem exudate, and a great increase of alanine and serine. The nodule N2 fixating activity, was directly proportional to the total ureides amount present in the xylem exudate, and inversely proportional to .the N03-, does, the total amount of free amino acids, has shown to be a kind of characteristic which is not much associated to the nodule N2 fixating activity. The Lb amount, in each treatment, varied proportionally to the total amount of soluble protein, presenting lower amounts in 02associated to N03- (hydroponics +N03- and without aeration) stress treatment. However the Lb answers to the applied treatments were not toa expressive, which suggests that the Lb cannot be one of the main limiting factors of the soybean nodule N2 fixating process / Doutorado / Doutor em Ciências

Orientador: Paulo Arruda / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-27T11:28:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Papes_Fabio_D.pdf: 8780735 bytes, checksum: 7e88e4b74db4a0c013a8d319b89c52cf (MD5) Previous issue date: 2001 / Doutorado

A produtividade de uma lavoura de soja representa apenas, aproximadamente, 20% do potencial genético. Dessa forma, a exploração das características genéticas tem sido alvo dos pesquisadores para incrementar a produtividade da cultura. Dentro disso, a potencialização fisiológica pela aplicação de estimulantes biológicos, desde a germinação das sementes até a fase reprodutiva da cultura, tem sido uma das principais estratégias adotadas. Visando um aporte à pesquisa nas respostas fisiológicas da cultura, objetivou-se avaliar os efeitos fisiológicos do tratamento de sementes e aplicações foliares de micronutrientes, hormônios e aminoácidos e o quanto estes representam na produção em sistemas de alta produtividade. Foram realizados dois experimentos, sendo um em casa de vegetação (condições parcialmente controladas) (Experimento I) e outro a campo (Experimento II) no Centro Universitário de Patos de Minas (UNIPAM), Patos de Minas-MG, durante o período de janeiro a maio de 2013. Foram realizadas avaliações bioquímicas (atividade das enzimas nitrato redutase, urease, catalase, peroxidase e superóxido dismutase, peroxidação de lipídios e teor de prolina), fisiológicas (fotossíntese liquida) e fenométricas (emergência, índice de velocidade emergência, valor SPAD, taxa de crescimento de raiz, caule e folha, massa de matéria seca total e área foliar), além do número de vagens e da produtividade. Para o primeiro experimento, foram utilizados quatro tratamentos de sementes (controle; micronutrientes - Zn, Mn, B, Mo, Ni e Co; hormônios - ácido indol butírico, ácido giberélico e cinetina; e aminoácidos - ácido glutâmico, arginina, glicina, metionina e cisteína) com seis repetições em delineamento inteiramente casualizado. No segundo experimento, foram utilizados seis tratamentos de semente (controle; micronutrientes; hormônios; aminoácidos; micronutrientes e hormônios; e micronutrientes e aminoácidos) em dois sistemas de manejo: sistema convencional e sistema para produtividade potencial, com utilização de redutor de crescimento e aplicações periódicas de organominerais via foliar (doze tratamentos com quatro repetições em delineamento em blocos ao acaso). Com base nos resultados obtidos, conclui-se que: (i) o tratamento de sementes com micronutrientes potencializa a assimilação de nitrogênio e a fotossíntese líquida, e incrementa o teor de clorofila (valor Spad) e taxa de crescimento de plantas de soja; (ii) a utilização de aminoácidos ou hormônios reduz o nível de estresse das plantas durante o período inicial de crescimento e aumenta a produção de massa de matéria seca; (iii) o tratamento de sementes com micronutrientes, hormônios ou aminoácidos incrementa o teor de clorofila (valor Spad), (iv) o sistema para produtividade potencial potencializa a atividade fisiológica das plantas e, consequentemente, aumenta o número de vagens por planta e a produtividade em relação ao sistema convencional; (v) em sistema para produtividade potencial, o tratamento de sementes com micronutrientes é o mais responsivo (aumento de produtividade em 18,5%), e (vi) no sistema convencional, o tratamento com micronutrientes e aminoácidos aumenta a produtividade em 80%. / The actual soybean productivity represents about 20% of genetic potential. Thus, the exploitation of genetic characteristics has been targeted by researchers to increase crop yield. In addition, the physiological potentiation by applying biological stimulants, from seed germination to the reproductive stage of the crop, has been one of the main strategies adopted. Seeking a contribution to research on the physiological responses of soybean crop, aimed to evaluate the physiological effects of seed treatment and foliar applications of micronutrients, amino acids and hormones and how they represent in the production of the high productivity systems. Two experiments were carried out, one in the greenhouse (partially controlled conditions) (Experiment I) and other in the field (Experiment II) at the University Center of \"Patos de Minas\" (UNIPAM), \"Patos de Minas\", \"Minas Gerais\" State, Brazil, during the period of January to May 2013. Biochemical assessments (nitrate reductase, urease, catalase, peroxidase and superoxide dismutase activities, lipid peroxidation and proline content), physiological (net photosynthesis) and fenometric evaluations (emergency, emergency speed index, Spad value, leaf area, growth rate of root, stem, leaf, total dry matter and leaf area), beyond of the number of pods per plant and productivity. For the first experiment, four seed treatments (control; micronutrients - Zn, Mn, B, Mo, Ni and Co; hormones - indol butyric acid, gibberellic acid and kinetin; and amino acids - glutamic acid, arginine, glycine, methionine and cysteine) with six replications were carried out in a completely randomized design. For the second experiment, six seed treatments (control; micronutrients; hormones; amino acids; micronutrients and hormones; and micronutrients and amino acids) were used in two management systems: conventional system and system for potential productivity, using growth reducer and periodic leaf applications of biological stimulants (twelve treatments with four replications in a randomized blocks design). Based on obtained results, it is concluded that: (i) the seed treatment with micronutrients potentiates the nitrogen assimilation and net photosynthesis, and increases the chlorophyll content (Spad value) and soybean plant growth rate; (ii) the use of amino acids or hormones reduces plant stress level during the initial period of plant growth and increase the dry matter production; (iii) the seed treatment with micronutrients, hormones or amino acids increases chlorophyll content (Spad value); (iv) the system for potential productivity potentiates the physiological activity of plants and, consequently, increases the number of pods per plant and productivity when compared to conventional system; (v) under system for potential productivity, the seed treatment with micronutrients is the most responsive (increases productivity in 18.5%); and (vi) under conventional system, the treatment with micronutrients and amino acids increases the productivity in 80%.

Na maioria dos estudos de digestibilidade de aminoácidos em suínos usam-se animais de peso igual ou superior a 20 kg, isso se deve a menor dificuldade na implantação de cânulas íleo-cecais e a melhor recuperação pós-cirúrgica na fase do crescimento. No entanto, avaliar ingredientes com leitões mais jovens torna-se importante, visto que há limitações fisiológicas do trato gastrointestinal nesse período que podem afetar o seu desenvolvimento. Assim, 175 leitões desmamados, divididos em 7 ensaios experimentais com 25 animais cada, foram usados para determinar o balanço de nutrientes e da energia, a digestibilidade ileal aparente (AID) e estandardizada (SID) dos aminoácidos (AA) de sete ingredientes usualmente utilizados em dietas de leitões, com ou sem suplementação de multi-carboidrase (MC) e fitase (F). Os leitões foram desmamados aos 23 dias de idade e alojados em gaiolas para estudo de digestibilidade e metabolismo, permanecendo no experimento até os 45 dias de idade. Adaptação, coleta total de fezes e urina ocorreram do 10° ao 20° dia do período experimental e as amostragens do conteúdo ileal se deu ao abate, no 22° dia (45 dias de idade). Foi utilizado o delineamento experimental inteiramente casualisado com 4 tratamentos e cinco repetições. O leitão foi considerado como unidade experimental. As dietas experimentais consistiram de ingrediente teste sem enzimas e combinado a MC, F ou MC + F. Dois tipos de dieta referência foram usados como base para os cálculos do balanço nutricional e os coeficientes de digestibilidades aparente e estandardizada dos aminoácidos. Óxido de cromo (0,3%) foi usado como marcador indigestível nas avaliações dos aminoácidos. A enzima MC apresentava 10% de galactomananase, 10% de xilanase, 10% de β-glucanase, 60% de cevada maltada e 10% de α-galactosidase. A F era proveniente da fermentação de Saccharomyces cerevisiae com atividade de 10.000 FTU/g. Os ingredientes testados foram: farelo de arroz integral, soja integral micronizada, farelo de trigo, quirera de arroz, sorgo, milho e farinha de soja texturizada. Os resultados indicaram efeitos da combinação ingrediente e enzima exógena e as evidencias se deram de acordo com as características bromatológicas de cada um / Most of the studies, involving AA digestibility in pigs are used animals with 20 kg minimal weight or higher than. This is due difficulty to implant a simple T-cannula on distal ileum of younger pigs, besides a better post-surgical recovery in growing phase. However, ingredient evaluations with young pigs become important because there are physiological limitations in gastrointestinal tract that may affect its performance. Thus, 175 weaned pigs, divided into seven experimental trials with 25 animals each, were used to determine the nutrients and energy balance, the apparent (AID) and standardized (SID) ileal digestibility of amino acids (AA) from seven ingredients usually used in pig diets, with or without multi-carbohydrase (MC) and phytase (Phy) supplementation. Weaned piglets at 23 d old were housed in cages to studies digestibility and metabolism, remaining in the experiment until 45 d of age. Pig adaptation to feces and urine collection was 10 to 20 d experimental period and ileal content sampling at slaughter at 22 d (45 d old). A completely randomized experimental design was used with 4 treatments and 5 replicates. The pig was considered as an experimental unit. The experimental diets consisted of test ingredient as the sole source of protein with or without MC, Phy or MC+Phy. Two kind of reference diet were used to calculate the nutrient balance or AID and SID of AA. Titanium dioxide (0.3%) was used as indigestible marker. The MC enzyme had: galactomannanase, 10%; xylanase, 10%; beta-glucanase, 10%; malted barley, 60% and α-galactosidase, 10%. The Phy was obtained from the Saccharomyces cerevisiae fermentation with 10,000 FTU/g activity. The ingredients used were: rice bran, micronized full fat soybean meal, wheat bran, broken rice, sorghum, corn and texturized soybean meal. The results indicated effects from ingredients and enzymes combinations and the evidences occurred according to bromatological characteristics of each one