L’un des principaux défis de la thérapie génique est d’identifier un vecteur sûr capable d’assurer un transfert efficace et une expression soutenue d’un gène d’intérêt thérapeutique dans les cellules cibles. L’émergence de vecteurs plasmidiques de nouvelles générations a permis d’atteindre ces objectifs et de considérer la thérapie génique non virale comme une alternative prometteuse aux vecteurs viraux pour le traitement de maladies génétiques ou acquises. Appartenant à ces nouvelles générations, les dérivés du vecteur pFAR4 sont des miniplasmides dépourvus de gène de résistance à un antibiotique. Leur propagation dans les cellules d’Escherichia coli est basée sur la suppression d’une mutation non-sens de type ambre introduite dans un gène essentiel de la souche productrice, permettant ainsi d’éliminer les risques associés à l’utilisation de gène de résistance à un antibiotique tout en diminuant la taille du vecteur. Le but de cette thèse est d’étudier le potentiel de ces vecteurs dans deux contextes de thérapie génique non virale : Dans une première approche, le potentiel du vecteur pFAR4 a été évalué pour l’expression d’un gène thérapeutique dans le foie de souris. Pour ce faire, un dérivé de ce vecteur exprimant le gène Sgsh à partir d’un promoteur spécifique des hépatocytes et codant la protéine sulfamidase, protéine défectueuse chez les patients souffrant de la maladie de Sanfilippo de type A, a été administré par injection hydrodynamique à des souris. Nous avons montré que le vecteur pFAR4 promeut dans le foie une expression élevée et soutenue de la sulfamidase, qui décline rapidement lorsque le gène Sgsh est administré par un vecteur contenant un gène de résistance à la kanamycine. Dans le cadre de cette étude, il a été établi que le profil d’expression obtenu avec le vecteur pFAR4 n’est pas lié à son insertion dans le génome des hépatocytes mais résulte, de par sa taille réduite, d’une protection contre les phénomènes d’extinction de transgène couramment observés in vivo avec les vecteurs conventionnels. Dans une seconde approche, le vecteur pFAR4 a été combiné à la technologie Sleeping Beauty (SB), dont l’un des constituants majeurs est la transposase hyperactive SB100X qui promeut la transposition d’un transgène, en l’excisant du plasmide qui le porte et en l’insérant dans le génome des cellules hôtes. Cette combinaison a été étudiée in vitro dans des cellules HeLa, en utilisant un transposon contenant soit le gène de résistance à la néomycine soit le gène codant la protéine fluorescente Vénus. Nous avons ainsi montré que le plasmide pFAR4 constituait un vecteur efficace pour les composants du système SB et que la combinaison pFAR4/SB conduisait à un taux de transgénèse augmenté par rapport à une association avec des plasmides conventionnels. Cette efficacité élevée résulte d’un niveau de transfection et d’un taux d’excision augmentés, tous deux favorisés par la taille réduite du plasmide. La combinaison pFAR4/SB devrait prochainement être utilisée pour transférer le gène codant le facteur anti-angiogénique PEDF (Pigment Epithelium-Derived Factor) à des cellules primaires de l’épithélium pigmentaire de la rétine ou de l’iris dans deux essais cliniques (Phase I/II) de thérapie génique ex vivo pour le traitement de la dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA). / One of the main challenges in gene therapy is to identify safe vectors that promote an efficient gene delivery and a sustained therapeutic transgene expression level in targeted cells. The development of novel plasmid vectors allowed to reach these objectives and to consider non-viral gene therapy approaches as attractive alternatives to treat genetic and acquired disorders. The pFAR4 vector is a novel antibiotic-free mini-plasmid. In Escherichia coli, its propagation is based on the suppression of an amber nonsense mutation introduced into an essential gene, thus eliminating safety concerns classically attributed to antibiotic resistance markers present on conventional plasmid DNA vectors and allowing a reduction in plasmid size. The aim of this work was to investigate the potential of pFAR4 as a gene vector in two different non-viral gene therapy approaches. In a first approach, the potential of the pFAR4 vector was assessed for the expression of a therapeutic gene in mouse liver. To this end, a pFAR4 derivative expressing the Sgsh gene from a liver-specific promoter and coding the sulfamidase, an enzyme deficient in patients suffering from the Sanfilippo A disease, was tail vein hydrodynamically injected into mouse liver. We showed that the pFAR4 derivative promoted a high and prolonged sulfamidase expression which rapidly declined when the same expression cassette was delivered by a conventional plasmid containing a kanamycin resistance marker. It was established that the superior expression profile obtained with the pFAR4 derivative did not result from its integration in host genome but seemed to benefit from protection against transcriptional silencing. In a second approach, the pFAR4 vector was combined to the Sleeping Beauty transposon system that mediates transgene integration into host genomes, after its excision from a plasmid donor by the hyperactive SB100X transposase, in order to obtain a long-term expression in dividing cells. This combination was studied in vitro, delivering either the neomycin resistance gene or the fluorescent Venus protein-encoding gene into HeLa cells. We showed that the combination pFAR4/SB led to an increased transgenesis rate in comparison to the association of SB with conventional plasmids. The pFAR4/SB combination seemed to benefit from an elevated transfection efficiency and a higher excision rate, resulting from the reduced size of the pFAR4 vector. The two technologies should be soon used for the delivery of the anti-angiogenic pigment epithelium-derived factor (PEDF) gene into autologous primary pigment epithelial cells, in the context of two PhaseI/II clinical trials based on an ex vivo gene therapeutic approach for the treatment of neovascular age-related macular degeneration (nAMD).

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Les aminoglycosides, des dérivés aminés de saccharides, interfèrent avec le mécanisme de synthèse des protéines chez les bactéries en se fixant au site de décodage de l'ARN de transfert aminoacylé (site A) situé en 3' de l'ARN ribosomique 16S. Au cours de ce travail de thèse, les structures de trois complexes entre des fragments d'ARN incorporant le site A et les aminoglycosides paromomycine, tobramycine et généticine, ont été résolues par cristallographie aux rayons X à 2,40-2,54 Å. L'analyse des structures montre que la reconnaissance et la fixation spécifiques des aminoglycosides au site A font intervenir de nombreuses liaisons hydrogène directes et pontées par des molécules d'eau. Dans ces structures, la partie néamine commune aux aminoglycosides (cycles I et II) s'intercale dans l'hélice de manière similaire : le cycle I (non plan) forme une pseudo paire de bases avec l'adénine 1408 ; la néamine oblige les adénines 1492 et 1493 à pointer hors de l'hélice. La comparaison des structures 3D de ces trois complexes offre des explications moléculaires aux différents résultats de biochimie et de microbiologie, ainsi qu'à certains phénomènes de résistances et de toxicités. Les conformations du site A et des aminoglycosides au sein de ces complexes sont similaires à celles du site A et de la paromomycine au sein de la sous-unité ribosomique 30S. Ainsi, la stratégie développée permet une description des interactions et des modes de fonctionnement des aminoglycosides proche du contexte naturel mais plus précise, essentielle à notre connaissance du système ARN/aminoglycoside. De ces résultats découlent des lignes directrices laissant envisager sous un jour nouveau la conception d'antibiotiques moins sujets aux résistances et moins toxiques.

L’arthrite septique chez les bovins est une affection le plus souvent d’origine bactérienne qui est une cause de boiterie fréquente associée à des pertes économiques importantes. Le traitement, qui doit être initié le plus rapidement possible, s’appuie sur l’utilisation combinée d’anti-inflammatoires non stéroïdiens, d’un ou de plusieurs lavages articulaires ainsi que d’antibiotiques administrés de façon systémique pour un minimum de 3 semaines. Cette durée d’administration constitue une difficulté pour les élevages dits biologiques pour lesquels un cahier des charges strict limite un recours prolongé aux antibiotiques. Ainsi le traitement efficace de diverses conditions infectieuses et celui de l’arthrite septique en particulier dans ces élevages peut être compromis. L’objectif de ce travail est de s’appuyer sur les propriétés antimicrobiennes des solutions de saline hypertonique (SSH) pour limiter l’utilisation des antibiotiques dans les cas d’arthrite septique chez les veaux en intégrant ces solutions pour le lavage des articulations infectées. Notre première étude a consisté à déterminer la sécurité d’emploi de deux concentrations de SSH (une commerciale à 7.2% et une maison à 15%) dans des articulations supposées saines chez le veau. Une synovite sévère associée à des signes cliniques caractéristiques d’atteintes articulaires a été observé lors de l’utilisation de SSH 15%. Son utilisation clinique comme solution de lavage articulaire est par conséquent déconseillée. Concernant la SSH 7.2%, malgré une synovite d’intensité variable, nous n’avons pas noté des signes cliniques caractéristiques d’atteintes articulaires. Son utilisation dans un contexte expérimental d’infection articulaire nous a paru réaliste. Notre seconde étude a permis d’évaluer les effets du lavage articulaire avec de la SSH 7.2% dans un modèle expérimental d’infection à Escherichia coli. Trois groupes de traitement ont été constitués. Dans le premier groupe (traitement standard), un lavage était effectué avec du lactate de Ringer (LRS) et les veaux recevaient une administration biquotidienne de ceftiofur par voie intraveineuse pour 21 jours. Dans le deuxième groupe (LRS), un lavage était effectué avec du LRS et aucun antibiotique n’était administré. Enfin dans le troisième groupe (SSH), un lavage était effectué avec de la SSH 7.2% sans qu’aucun antibiotique ne soit administré. Tous les veaux ont reçu du kétoprofen quotidiennement pendant 3 jours. L’inoculation s’est fait au jour 1 et les traitements ont débuté au jour 2. L’efficacité des traitements a été établie sur des critères cliniques, bactériologiques et cytologiques. Dans le modèle que nous avons utilisé, les trois groupes de traitements ont conduits à une guérison clinique et bactériologique satisfaisante (absence de boiterie, de douleur et de croissance bactérienne dans le liquide articulaire en fin d’étude). La guérison cytologique n’a quant à elle pas été jugée satisfaisante avec des moyennes de comptage et de pourcentage en neutrophiles tout groupe confondu bien supérieures aux valeurs normales (11.39x109/l de neutrophiles représentant 74.73% des leucocytes en fin d’étude). Le traitement avec la SSH 7.2% s’est révélé être significativement plus traumatique et pas plus efficace dans l’élimination de l’infection comparativement au traitement LRS. D’autre part, le lavage articulaire au LRS s’est révélé être aussi efficace et sécuritaire que le traitement standard de l’arthrite septique qui incluait 21 jours de ceftiofur administré par voie intraveineuse. Ainsi, bien que le lavage avec de la SSH 7.2% n’est pas démontré de résultats satisfaisants qui permettrait de limiter le recours aux antibiotiques dans les filières biologiques, l’association d’un lavage au LRS avec le ketoprofen s’est révélée être une alternative possible. De nouvelles études sont requises pour confirmer ses résultats et pour déterminer le rôle respectif du lavage articulaire et du ketoprofen dans la guérison lors d’arthrite septique. / Septic arthritis in cattle is mainly an infectious bacteriological disease that is a frequent cause of lameness and is associated with great economic losses. Treatment must be prompt and includes non steroidal anti-inflammatory drugs with one or several joint lavage along with systemic antibiotics for at least 3 weeks. This long course of administration is unachievable for organic production systems where the use of antibiotics is strictly regulated. Thus the treatment of infectious disease with septic arthritis in particular may be jeopardized in these herds. The objectives of this work is to use antimicrobial properties of hypertonic saline solution (HSS) to limit the use of antibiotics in septic arthritis cases in calves, using HSS for joint lavage. In our first study, we assessed the safety of two HSS of different concentrations (commercial 7.2% and home-made 15%) in healthy calves joint. A severe synovitis associated with typical clinical signs of joint lesions was observed when HSS 15% was used. Therefore this solution cannot be recommended for joint lavage in calves. A synovitis of variable degree was observed when HSS 7.2% was used. However no clinical signs or joint lesions were noted. Based on these results, we felt that HSS 7.2% could be tested in an experimental setting of joint infection. In our second study, we evaluate the effects of joint lavage with HSS 7.2% in an experimental infection model with Escherichia coli. Three treatment groups were formed. In the first group, the joint lavage was realized with Lactated Ringer’s Solution (LRS) and calves also received ceftiofur intravenously two times a day for 21 days. In the second group, the joint lavage was realized with LRS and saline was used instead of ceftiofur. In the last group, the joint lavage was realized with HSS 7.2% and saline was used instead of ceftiofur. All calves in this study received ketoprofen once a day for 3 days intravenously. Inoculation of bacteria took place on day 1 and all treatments started on day 2. Treatment’s effectiveness was established upon clinical, bacteriological and cytological criteria. In our model, all treatment groups led to clinical and bacteriological recovery (no lameness, pain or positive culture in the synovial fluid at the end of the experiment). Whatever the treatment group, cytological recovery was no achieved at the end of the study with mean number and percentage of neutrophils far superior when compared to usual values (11.39x109/l of neutrophils representating 74.73% of total leucocytes at the end of the experiment). Joint lavage with HSS 7.2% combined with ketoprofen successfully treat septic arthritis in this model but was significantly more harmful compared to joint lavage with LRS combined with ketoprofen. On the other hand, joint lavage with LRS combined with ketoprofen was found as efficient and safe than the standard treatment of septic arthritis which includes a 21 day administration of intravenous ceftiofur. Therefore, even if HSS 7.2% joint lavage cannot be a good choice to treat septic with the restriction of use of antibiotics in organic herds, the combination of a LRS joint lavage with ketoprofen showed promising results. Further studies are warranted to confirm these latter results and to determine specific effects of the lavage and of ketoprofen.

Les antibiotiques aminoglycosidiques sont des agents bactéricides de grande valeur et d’efficacité à large spectre contre les pathogènes Gram-positifs et Gram-négatifs, dont plusieurs membres naturels et semisynthétiques sont importants dans l’histoire clinique depuis 1950. Des travaux crystallographiques sur le ribosome, récompensés par le prix Nobel, ont démontré comment leurs diverses structures polyaminées sont adaptées pour cibler une hélice d’ARN dans le centre de codage de la sous-unité 30S du ribosome bactérien. Leur interférence avec l’affinité et la cinétique des étapes de sélection et vérification des tARN induit la synthèse de protéines à basse fidélité, et l’inhibition de la translocation, établissant un cercle vicieux d’accumulation d’antibiotique et de stress sur la membrane. En réponse à ces pressions, les pathogènes bactériens ont évolué et disséminé une panoplie de mécanismes de résistance enzymatiques et d’expulsion : tels que les N acétyltransférases, les O phosphotransférases et les O nucleotidyltransférases qui ciblent les groupements hydroxyle et amino sur le coeur des aminoglycosides; des méthyl-transférases, qui ciblent le site de liaison ribosomale; et des pompes d’expulsion actives pour l’élimination sélective des aminoglycosides, qui sont utilisés par les souches Gram-négatives. Les pathogènes les plus problématiques, qui présentent aujourd’hui une forte résilience envers la majorité des classes d’antibiotiques sur le bord de la pan-résistance ont été nommés des bactéries ESKAPE, une mnémonique pour Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa et Enterobacteriaceae. La distribution globale des souches avec des mécanismes de résistance envers les standards cliniques aminoglycosides, tels que la tobramycine, l’amikacine et la gentamicine, est comprise entre 20 et 60% des isolées cliniques. Ainsi, les aminoglycosides du type 4,6-disubstitués-2-deoxystreptamine sont inadéquats comme thérapies anti-infectieuses à large spectre. Cependant, la famille des aminoglycosides 4,5-disubstitués, incluant la butirosine, la neomycine et la paromomycine, dont la structure plus complexe, pourrait constituter une alternative. Des collègues dans le groupe Hanessian et collaborateurs d’Achaogen Inc. ont démontré que certains analogues de la paraomomycine et neomycine, modifiés par désoxygénation sur les positions 3’ et 4’, et par substitution avec la chaîne N1-α-hydroxy-γ-aminobutyramide (HABA) provenant de la butirosine, pourrait produire des antibiotiques très prometteurs. Le Chapitre 4 de cette dissertation présente la conception et le développement d’une stratégie semi-synthétique pour produire des nouveaux aminoglycosides améliorés du type 4,5 disubstitués, inspiré par des modifications biosynthétiques de la sisomicine, qui frustrent les mécanismes de résistance bactérienne distribuées globalement. Cette voie de synthèse dépend d’une réaction d’hydrogénolyse de type Tsuji catalysée par palladium, d’abord développée sur des modèles monosaccharides puis subséquemment appliquée pour générer un ensemble d’aminoglycosides hybrides entre la neomycine et la sisomicine. Les études structure-activité des divers analogues de cette nouvelle classe ont été évaluées sur une gamme de 26 souches bactériennes exprimant des mécanismes de résistance enzymatique et d’expulsion qui englobe l’ensemble des pathogènes ESKAPE. Deux des antibiotiques hybrides ont une couverture antibacterienne excellente, et cette étude a mis en évidence des candidats prometteurs pour le développement préclinique. La thérapie avec les antibiotiques aminoglycosidiques est toujours associée à une probabilité de complications néphrotoxiques. Le potentiel de toxicité de chaque aminoglycoside peut être largement corrélé avec le nombre de groupements amino et de désoxygénations. Une hypothèse de longue date dans le domaine indique que les interactions principales sont effectuées par des sels des groupements ammonium, donc l’ajustement des paramètres de pKa pourrait provoquer une dissociation plus rapide avec leurs cibles, une clairance plus efficace et globalement des analogues moins néphrotoxiques. Le Chapitre 5 de cette dissertation présente la conception et la synthèse asymétrique de chaînes N1 HABA β substitutées par mono- et bis-fluoration. Des chaînes qui possèdent des γ-N pKa dans l’intervalle entre 10 et 7.5 ont été appliquées sur une neomycine tétra-désoxygénée pour produire des antibiotiques avancés. Malgré la réduction considérable du γ N pKa, le large spectre bactéricide n’a pas été significativement affecté pour les analogues fluorés isosteriques. De plus, des études structure-toxicité évaluées avec une analyse d’apoptose propriétaire d’Achaogen ont démontré que la nouvelle chaîne β,β difluoro-N1-HABA est moins nocive sur un modèle de cellules de rein humain HK2 et elle est prometteuse pour le développement d’antibiotiques du type neomycine avec des propriétés thérapeutiques améliorées. Le chapitre final de cette dissertation présente la proposition et validation d’une synthèse biomimétique par assemblage spontané du aminoglycoside 66-40C, un dimère C2 symétrique bis-imine macrocyclique à 16 membres. La structure proposée du macrocycle a été affinée par spectroscopie nucléaire à un système trans,trans-bis-azadiène anti-parallèle. Des calculs indiquent que l’effet anomérique de la liaison α glycosidique entre les anneaux A et B fournit la pré-organisation pour le monomère 6’ aldéhydo sisomicine et favorise le produit macrocyclique observé. L’assemblage spontané dans l’eau a été étudié par la dimérisation de trois divers analogues et par des expériences d’entre croisement qui ont démontré la généralité et la stabilité du motif macrocyclique de l'aminoglycoside 66-40C. / Aminoglycosides are valuable and effective broad-spectrum bactericidal antibiotics against Gram-positive and Gram-negative pathogens, with several members of natural and semisynthetic origin occupying prominent roles in clinical practice since 1950. Nobel-prize winning crystallographic studies on the ribosome have revealed how their diverse polyaminated sugar framework is tailored to target a RNA helix within the decoding centre of the bacterial 30S subunit. By interfering with the affinity and kinetics of the tRNA selection and proof-reading steps, they induce error-prone protein synthesis, and translocation inhibition and lead to a lethal cycle of antibiotic uptake and membrane stress. In retaliation, bacterial pathogens have evolved and disseminated a number of enzymatic and efflux resistance mechanisms. These include N acetyl-transferases, O phosphotransferases and O nucleotidyltransferases, which target the core hydroxyl and amino groups of aminoglycosides promiscuously; methyltransferases, which target the ribosomal binding-site; and energy-dependent drug efflux pumps for aminoglycoside-selective elimination, in Gram-negative pathogens. The most problematic infectious pathogens which are currently resilient to most unrelated antibiotic classes and in the verge of pan-resistance have been defined ‘ESKAPE’ bacteria, a mnemonic for Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa and Enterobacteriaceae. The world-wide spread of aminoglycoside resistance to current clinical standards, such as tobramycin, amikacin and gentamicin, ranges from 20 to 60% of clinical isolates. Hence, the contemporary 4,6-disubstituted-2-deoxystreptamine aminoglycosides are currently inadequate as broad-spectrum anti-infective therapies. The 4,5-disubstituted class of aminoglycosides are a challenging framework for medicinal chemistry, which includes butirosin, neomycin and paromomycin. Exploring the potential of these alternatives, colleagues in the Hanessian group and collaborators of Achaogen Inc. have demonstrated that paromomycin and neomycin analogs modified by deoxygenation of positions 3' and 4', as well as N1-substituted analogs possesing the α hydroxy-γ-aminobutyryl amide (HABA) chain of butirosin, could produce promising antibiotics. Chapter 4 of this dissertation features the conception and development of an expedient semi-synthetic strategy to access novel aminoglycosides of the 4,5 disubstituted class, inspired from biosynthetic modifications of the sisomicin subfamily, that surmount the wide-spread bacterial resistance mechanisms. This synthetic methodology relies on a novel Tsuji palladium-catalyzed hydrogenolysis developed on model monosaccharides, which was applied to generate a library of aminoglycosides comprising ring A hybrids of the neomycin and sisomicin families. The structure-activity relationships of this new class were assessed against a panel of 26 bacterial strains expressing modifying enzymes and efflux systems to provide an overview of ESKAPE pathogens. Two novel hybrid aminoglycoside analogs exhibited excellent antibacterial coverage, and may be promising candidates for preclinical development. Aminoglycoside therapy is also invariably associated with a probability of nephrotoxic complications. Aminoglycoside toxicity has been largely correlated with the number of amino groups, and more loosely with the extent of deoxygenation. A long standing hypothesis in the field states that because the foremost interactions are effected by ammonium group salts, the tuning of pKa parameters could provide a higher target dissociation rate, more effective clearance and overall less nephrotoxic analogs. Chapter 5 in this dissertation features the conception and asymmetric synthesis of isosteric β substituted N1 HABA chains, modified by mono- and bis-fluorination. These chains covering a range of γ-N pKa values from 10 to 7.5 were applied to advanced tetra-deoxygenated neomycin antibiotics. In spite of the important reduction in γ N pKa, broad spectrum antimicrobial activity was not significantly disrupted for isosteric fluorinated analogs. Furthermore, structure-toxicity relationships, assessed by Achaogen’s proprietary luciferase-coupled apoptosis assay, revealed that the novel β,β difluoro-N1-HABA chain is less harmful in a Human Kidney 2 cell-line model and promising for the development as new generation neomycin antibiotics with improved therapeutic properties. The final chapter in this dissertation features the proposal and validation of the concise biomimetic synthesis and self-assembly of aminoglycoside 66-40C, a remarkable C2-symmetric 16 membered macrocyclic bis-imine dimer. The proposed structure was spectroscopically characterized as an anti-parallel s-trans-bis-azadiene macrocyclic system. Calculations indicate the anomeric effect of the α glycosidic bond between rings A and B is important for pre-organization of the monomeric sisomicin 6' aldehyde and favors the observed macrocycle product. Self-assembly in aqueous solutions was studied through the dimerization of three diverse analogs and cross-over experiments, which demonstrated the generality and stability of the macrocyclic motif of aminoglycoside 66-40C.

Le Staphylococcus aureus résistant à la méthicilline (SARM) est un pathogène important qui a été identifié comme agent d‟infection chez les animaux d‟élevage et les travailleurs exposés à ces animaux. Au Canada, très peu d‟informations sont disponibles concernant les SARMs d‟origine porcine. L‟objectif de cette étude était de déterminer la prévalence des SARMs provenant de porcs à l‟abattoir, de caractériser leur résistance aux antibiotiques ainsi que d‟évaluer le niveau de séroconversion des porcs envers le S. aureus chez les animaux porteurs ou non du SARM. Un total de 107 isolats ont été identifiés positifs aux SARMs sur 660 échantillons. La prévalence de SARMs à l‟abattoir A était de 30,8% et de 23,8% à l‟abattoir B. La susceptibilité aux antibiotiques a été déterminée en utilisant la méthode de micro-dilution de Sensititre. Tous les isolats ont démontré une sensibilité envers la ciprofloxacine, la gatifloxacine, la gentamicine, la lévofloxacine, le linézolide, la quinupristine/dalfopristine, la rifampicine, la streptomycine, le triméthoprime/sulfaméthoxazole et la vancomycine. De la résistance a été observée envers la daptomycine (0,93%), l‟érythromycine (29%), la clindamycine (29%), la tétracycline (98,1%). De plus, 30% des SARMs isolés étaient résistants à plus de deux antibiotiques autres que les β-lactamines. Par typage, deux clones prédominants ont été obtenus ainsi que deux types de SCCmec (type V et possiblement un nouveau type comprenant les cassettes III et IVb). 15 clones ont été identifiés par typage MLVA, comprenant les clones prédominants VI (40.1%; 43/107) et XI (17.7%; 19/107). Deux souches de SARMs ont été caractérisées par biopuce à ADN et des gènes d‟antibiorésistance, de typage (SCCmec et MLST) et de virulence ont été identifiés. Sans considération pour le site de colonisation, les porcs SA-/MRSA- (n=34) et les porcs SA+ (n=194) montrent, respectivement, des taux de séroconversion de 20.6% et 32.5%. Les porcs colonisés par un SARM à un site de iv prélèvement et non colonisés par un SA à l‟autre site (n=18) montrent une séroconversion (5.6%) significativement (P < 0.05) plus faible comparativement aux porcs colonisés par SA à un ou deux sites de prélèvement et n‟ayant pas de SARM. Nos résultats démontrent que les porcs provenant d‟abattoir peuvent être colonisés par des SARMs multi-résistants aux antibiotiques. De plus, ces SARMs sont possiblement capable de coloniser leurs hôtes sans stimuler la production d‟anticorps et ce par l‟atténuation de la réponse immunitaire ou par la colonisation de porcs qui sont moins immunocompétents. / Methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) found in food producing animals is a major public health concern. Transmission to humans has been reported and MRSA represents a reservoir of antimicrobial resistance genes. Little is known on how MRSA successfully establishes colonization and how it is able to persist in the host. This study was conducted to determine the occurrence and the antimicrobial resistance profile of MRSA from abattoir pigs and their level of seroconversion toward S. aureus (SA). A total of 107 isolates were identified as MRSA from 660 samples. Antimicrobial susceptibilities were determined by broth microdilutions. Fifteen clones were identified by MLVA with clones VI (40.1%; 43/107) and XI (17.7%; 19/107) being the most predominant. All MRSA isolates were pvl-, tst-, eta- and etb-negative. Most isolates were SCCmec type V (70.1%; 75/107). All MRSA isolates were susceptible to ciprofloxacin, gatifloxacin, gentamicin, levofloxacin, linezolid, quinupristin/dalfopristin, rifampin, streptomycin, trimethroprim/sulfamethoxazole and vancomycin. However, resistance was observed toward clindamycin (29%), daptomycin (0.9%), erythromycin (29%) and tetracycline (98.1%). Multi-resistance was confirmed in MRSA since 28% of all isolates were resistant toward three antimicrobials other than β-lactams. The effect of MRSA carriage on seroconversion was examined to see whether the host responded differently to MRSA or SA colonization. The presence of SA-specific antibodies in pig serums was measured for each animal using indirect ELISA and a mixture of two widespread SA antigens (IsdH [HarA] and IsdB). Regardless of the colonization site, SA-/MRSA- pigs (n=34) and SA+ pigs (n=194) showed 20.6% and 32.5% seroconversion, respectively. Notably, pigs colonized by MRSA at one body site and no SA at the other sampling site (n=18) showed a significantly lower (5.6%) seroconversion (P < 0.05) compared to pigs colonized by SA at one or both vi sites without MRSA. The findings of the study show that the nares and axillae of abattoir pigs can harbor MRSA strains with multiple antimicrobial resistances. In addition, these MRSA were possibly able to colonize the host either without stimulating antibody production, by attenuating the immune response or by colonizing pigs that are less immunocompetent. This may explain the success of MRSA colonization and persistence in pigs. Further studies are required to better elucidate MRSA colonization in abattoir pigs and their public health risk.

Plusieurs aminoglycosides font partie d’une famille d’antibiotiques à large spectre d’action. Les aminoglycosides ayant une activité antibiotique viennent interférer dans la synthèse protéique effectuée par les bactéries. Les protéines mal codées entraineront la mort cellulaire. Au fil des années, de nombreux cas de résistance ont émergé après une utilisation soutenue des aminoglycosides. De nombreux aminoglycosides semi-synthétiques ont été synthétisés avec comme objectif de restaurer leur activité antimicrobienne. Parmi les modifications ayant connu du succès, notons la didésoxygénation d’un diol et l’introduction de la chaine latérale HABA. Des études précédentes ont montré l’efficacité de ces modifications sur les aminoglycosides. Les présents travaux portent sur l’installation de la chaine latérale HABA et la didésoxygénation d’un diol sur la paromomycine et la néomycine. La didésoxygénation sélective des diols a été effectuée en utilisant la méthodologie développée par Garegg et Samuelsson, une variation de la réaction de Tipson-Cohen. Cette méthode a permis l’obtention du motif didésoxygéné sur les cycles A et D dans des rendements jamais égalés pour ce motif synthétique. La chaîne latérale a été introduite en tirant profit de la réactivité et de la sélectivité d’un carbamate cyclique. Ces méthodes combinées ont permis la synthèse efficace de nombreux analogues semi-synthétiques nouveaux. La 3',4'-didéhydro-N-1-HABA-néomycine et la 3',4',3''',4'''-tétradésoxy-N-1-HABA-néomycine montrent une activité impressionnante contre des souches de bactéries résistantes aux aminoglycosides. Des tests de toxicité effectués en collaboration avec Achaogen Inc. ont démontré que ces composés sont relativement toxiques sur les cellules rénales de type H2K, ce qui réduit de façon importante leur index thérapeutique. Afin d’abaisser la toxicité des composés, la relation entre toxicité et basicité a été explorée. Des substitutions de l’amine en 6''' ont été effectuées afin d’abaisser la basicité de l’amine. Les résultats de toxicité et d’activité antimicrobienne démontrent une corrélation importante entre la basicité des amines et la toxicité/activité des aminoglycosides antibiotiques. L’effet d’une modulation du pKa a aussi été exploré en installant des chaines fluorées sur l’amine en 6''' de la paromomycine et de la néomycine. Une séquence synthtétique pour isoler l’amine en 6''' de la néomycine a aussi été développée. / Some aminoglycosides are part of a broad-spectrum family of antibiotics used in the clinic. They interfere in protein synthesis in bacterium cell by interfering with the transcription of proteins leading to cellular death. After an intense usage of aminoglycosides in the clinic, numerous cases of resistance have been encountered which render aminoglycosides less effective. Semi-synthetic aminoglycosides have been synthesized with the objective of restoring their original antimicrobial activity. Deoxygenation of the diol on ring A and introduction of the lateral chain HABA at N-1 had a significant impact on their antimicrobial activity against resistant strains. The present work will focus on deoxygenation of the diol at 3', 4' and on the introduction of the lateral HABA chain on aminoglycoside, more specificaly on paromomycin and neomycin. The selective dideoxygenation of the A ring diol was done using a methodology developed by Garegg and Samuelsson, which is a modification of the original Tipson-Cohen reaction. This method allows the dideoxygenation on ring A and D with unprecedented yields. The lateral HABA chain was introduced via the ring opening of a cyclic carbamate. These methods were combined to produce very potent analogs such as 3',4'-didehydro-N-1-HABA-neomycin and 3',4',3''',4'''-tetradeoxy-N-1-HABA-neomycin. Toxicity tests done in collaboration with Achaogen Inc. showed that these analogs were toxic to H2K renal cells, which reduced significantly their therapeutic index. In order to lower the toxicity of those compounds, the relation between toxicity and basicity was explored. Substitution of the amine at 6''' was done in order to lower the basicity of this amine. The results showed a strong correlation beetween the basicity of this amine and toxicity/activity. The pKa of this amine was modulated by installing fluorinated alkyl chain on the amine at 6''' in order to see the effect of the pKa on the activity/toxicity on paromomycin and neomycin. A synthetic sequence was also developed to allow the 6''' amine on neomycin to be modified selectively.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

La quinocarcine, la tétrazomine et la lémonomycine constituent une sous-famille appartenant à la famille des tétrahydroisquinoléines trisubstituées naturelles. Ce sont des puissants agents cytotoxiques et possèdent de nombreuses activités biologiques telles qu'antitumorales et antibiotiques. Leur complexité structurale, leurs intérêts biologiques ainsi que leur faible rendement d'extraction du milieu naturel font de ces molécules des cibles attrayantes pour les chimistes de synthèse.Ces trois molécules sont constituées d'une tétrahydroisoquinoléine différemment substitué fusionnée avec un diazabicycle[3.2.1]octane commun. Le but de ce projet était de mettre au point une stratégie commune à cette sous-famille et divergente grâce à la synthèse du diazabicyclooctane en premier. Une première stratégie faisant intervenir une aziridine n'a pas permis de construire le bicycle. Cet objectif a été réalisé grâce à une seconde stratégie. Elle repose sur une première cyclisation d'un hémiaminal puis d'une cyclisation par addition nucléophile d'un éther d'énol silylé sur un N-acylimmonium formé in situ au départ d'un N,S-acétal.Parallèlement à cette étude synthétique, nous avons mis au point une réaction multicomposant séquentielle qui permet l'accès rapide et général aux a-amidosulfures, comblant un manque dans la littérature. Ensuite nous avons étudié la réactivité de ces composés en tant que précurseurs simples de N-acylimines en conditions acides douces. Trois conditions réactionnelles, nous ont permis d'accéder à cette objectif : l'utilisation stœchiométrique d'acétate d'argent, catalytique d'acide phosphorique ainsi que le NIS en quantité stœchiométrique et catalytique. Cette dernière réaction est très attrayante. En effet, ce réactif doux et neutre permet l'élimination efficace du thiol formant la N-acylimine puis son activation pour se faire piéger in situ par un nucléophile. Les rendements atteints sont très hauts en moins de 5 minutes.

La résistance bactérienne aux antibiotiques dans les établissements de santé complique la prise en charge thérapeutique et entraîne une surmortalité des patients infectés. L'objectif de ce travail était d'évaluer différentes approches ayant pour finalité la prévention et la maîtrise des infections nosocomiales. Ce travail s'articule autour de trois questions : (i) Existe-t-il une stratégie de promotion d'un juste usage des antibiotiques à privilégier ? (ii) Comment évaluer la performance en matière d'hygiène des mains ? (iii) Quelles mesures pouvons-nous proposer pour limiter la diffusion de P. aeruginosa ?Nous avons d'abord montré que la diffusion de recommandations sous la forme de guides régionaux ou de messages de pharmacovigilance était suivie d'une modification des prescriptions antibiotiques conformes aux recommandations.Ensuite, nous avons évalué le niveau de performance des établissements de santé en matière d'hygiène des mains en étudiant plus particulièrement l'indicateur de consommation de solution hydro-alcoolique (ICSHA). Nous avons ainsi pu montrer que le nombre minimal d'opportunité d'hygiène des mains servant à son calcul, était sous-estime. Dans une autre étude, nous avons été confrontés aux limites liées à sa construction, ces dernières étant en partie responsable de l'absence de relation observée entre cet indicateur et la prévalence des infections associées aux dispositifs invasifs.Enfin, nous avons montré que la charge en soins et la contamination des réseaux d'eau propre des établissements de santé étaient des facteurs de risque contextuels d'acquisition du bacille pyocyanique. Un autre travail a mis en évidence que les réseaux d'eau usée étaient impliqués dans la diffusion extra-hospitalière de souches résistantes. Une étude est actuellement en cours pour évaluer l'intérêt d'une approche globale associant dépistage et précautions complémentaires chez les patients porteurs de P. aeruginosa.En conclusion, si ce travail confirme l'efficacité de certaines actions de prévention tout en mettant en avant les limites d'autres approches, il ne permet pas de privilégier une stratégie particulière. Il apparaît ainsi nécessaire de mettre en place des stratégies globales et transversales allant au-delà des seuls établissements de santé / Bacterial resistance to antibiotics in health care facilities complicates the therapeutic burden and increased mortality of infected patients. The objective of this work was to evaluate different approaches which aim was to prevent and control hospital-acquired infections. This work focuses on three issues: (i) Is there a strategy already in place to promote the appropriate use of antibiotics? (ii) How can we evaluate performance in terms of hand hygiene? (iii) What measures can we implement to limit the spread of P. aeruginosa?We first showed that the distributions of regional guidelines or drug monitoring alerts were followed by a change in the uptake of antibiotic prescriptions in line with such recommandations.Then we evaluated the performance of health care facilities for hand hygiene, focusing especially on the index of consumption of alcohol-base hand-rub solution. We showed that the number of alcohol-based hand-rub is far higher than that defined by the French Ministry of Health. In another study, we were faced with limitations in its construction, the latter being partly responsible for the lack of a relationship between this indicator and the prevalence of invasive devices associated with infections.Finally, we have shown that the burden of care and the contamination of clean water networks of health facilities were contextual risk factors for acquisition of Pseudomonas aeruginosa. Another study showed that wastewater networks were involved in extra-hospital spread of resistant strains. A study is currently underway to assess the value of a global approach combining screening and additional precautions in patients with P. aeruginosa.In conclusion, this study confirms the effectiveness of some preventive measures while underlining the limitations of other approaches. However it does not promote a particular strategy. Because in terms of BMR, it is necessary to define global and cross-sectorial strategies which go beyond the health care facilities