Les Streptomyces sont des bactéries communes des écosystèmes forestiers tempérés. Elles sont présentes au sein de différentes niches écologiques telles que la rhizosphère des plantes, la mycorhizosphère ou encore la minéralosphère. Dans ces niches, elles interagissent avec de nombreux autres genres bactériens et différents champignons symbiotiques, pathogènes et saprophytes. Nous avons entrepris une étude sur l'interaction entre deux souches bactériennes modèles du sol Streptomyces ambofaciens ATCC23877 et Pseudomonas fluorescens BBc6R8. Des expériences de cocultures sur différents milieux gélosés ont révélé que chaque souche bactérienne affecte la production de métabolites secondaires chez l'autre partenaire. Ainsi, P. fluorescens inhibe la capacité de S. ambofaciens à produire la kinamycine, un « effet ping-pong » a été mis en évidence. D'autre part, sur un milieu déficient en fer, P. fluorescens est capable d'utiliser les desferrioxamines et la coelicheline produites par S. ambofaciens en tant que xénosiderophores et ne produit alors plus ses propres sidérophores, la pyoverdine et l’énantio-pyochéline. Enfin, au cours des études d’interactions, P. fluorescens BBc6R8 s’est révélée capable d’inhiber la production du pigment bleu diffusible γ-actinorhodine chez Streptomyces coelicolor A3(2) M145 en acidifiant le milieu par la production d’acide gluconique. L’ensemble de ces résultats nous permet de proposer différentes hypothèses sur l’importance écologique de ces trois interactions en les replaçant au sein du contexte de l’écosystème sol / Streptomyces are common bacteria in temperate forest ecosystems, which inhabit various ecological niches such as plant rhizosphere and mycorrhizosphere, as well as mineralosphere. In these niches, they interact with many other bacterial genera and different symbiotic, pathogenic and saprotrophic fungi. We have initiated a study on interaction between two soil model bacteria strains Streptomyces ambofaciens ATCC23877 and Pseudomonas fluorescens BBc6R8. Cocultures experiments on different agar media have revealed that each bacteria affects the production of secondary metabolites in the other partner. Thus, P. fluorescens inhibits the ability of S. ambofaciens to produce kanamycin, a "ping-pong effect" was highlighted. On the other hand, on iron deficient medium, P. fluorescens is able to use the desferrioxamines and coelichelin produced by S. ambofaciens as xenosiderophores and does no longer produce its own siderophores, pyoverdin and enantio-pyochelin. In another way, during pairwise co-culture experiments, Pseudomonas fluorescens BBc6R8 was shown to prevent the production of the diffusible blue pigment antibiotic γ-actinorhodin by Streptomyces coelicolor A3(2) M145 by acidifying the medium through the production of gluconic acid. Other fluorescent Pseudomonas strains and the opportunistic pathogen Pseudomonas aeruginosa PAO1 also prevented the γ-actinorhodin production in a similar way. Altogether these results prompt us to propose some hypotheses on the ecological significance of these three interactions by replacing them in the soil ecosystem context

La résistance aux antibiotiques est l'une des menaces les plus graves pour la santé mondiale de nos jours. L'émergence de bactéries multirésistantes encourage les chercheurs à développer de nouveaux antibiotiques et stratégies pour compenser leurs différents mécanismes de résistance. L'un de ces mécanismes de défense est la formation de biofilms. Sous cette forme, les bactéries développent une matrice extracellulaire protectrice les rendant plus résistantes à divers traitements antimicrobiens. Nous avons conçu et synthétisé des composés de déstabilisation des membranes avec des caractéristiques clés : un cation benzimidazolium ou imidazolium, une chaîne apolaire hydrophobe et/ou un site de reconnaissance des anions lipophiles. Ces caractéristiques leur confèrent une activité antimicrobienne accrue et une grande capacité à perturber les membranes cellulaires. Ces composés perturbateurs de la membrane agissent via un mécanisme rapide et efficace et ont montré de bons résultats contre les souches de SARM (staphylococcus aureus résistant à la méthiciline) en tant que candidats antibiofilms prometteurs. Ces nouveaux agents ont le potentiel de se disperser et d'inhiber la formation de biofilms et pourraient avoir un impact positif sur la médecine humaine à l'avenir. / Antibiotic resistance is one of the most serious threats to global health nowadays. Emergence of resistant bacteria encourages researchers to develop new antibiotics and strategies to mitigate their different resistance mechanisms. One of these defense mechanisms is the formation of biofilms. In this form, bacteria develop a protective extracellular matrix making them more resistant to various antimicrobial treatments. We have designed and synthesized membrane destabilizing compounds with three key features: a benzimidazolium or an imidazolium cation, a hydrophobic apolar chain, and a lipophilic anion recognition site. These characteristics give these compounds increased antimicrobial activity and greater ability to disrupt cell membranes. These membrane-disrupting compounds act via a fast and efficient mechanism and showed good results against MRSA (methicillin-resistant staphylococcus aureus) strains as promising antibiofilms candidates. These new agents have the potential to disperse and inhibit the formation of biofilms and could have a positive impact on human medicine in the future.

L’ostéomyélite chronique est une infection chronique du tissu osseux et de la moelle. C’est une infection grave du fait de sa localisation au sein d’un tissu profond, de la complexité de sa prise en charge thérapeutique et de la mise en jeu du pronostic fonctionnel. L’incidence de l’ostéomyélite chronique est accrue sur certains terrains (drépanocytose, diabète, et polyarthrite rhumatoïde entre autres). Son traitement classique repose sur un curettage chirurgical associé à une antibiothérapie par voie générale durant au moins 6 semaines. Ce traitement est marqué le plus souvent par des échecs du fait de la difficulté de faire parvenir des antibiotiques à doses efficaces et de manière prolongée ou continue au niveau de l'os infecté.<p>\ / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

La tuberculose (TB), maladie pulmonaire causée par le Mycobacterium tuberculosis (Mtb), reste la première cause de mortalité par un agent infectieux. La TB est responsable de près de 1,7 million de morts et de 10,4 millions de nouveaux cas par an dans le monde. L’émergence et la propagation de souches bactériennes multi-résistantes aux antibiotiques (MDR) représentent une menace majeure grandissante et reflètent l’efficacité partielle des thérapies actuelles. Le traitement des patients atteints de TB-MDR est constitué actuellement de combinaisons d’antibiotiques, souvent toxiques, administrés pendant une longue durée, avec une efficacité limitée. Il existe donc un besoin urgent de développer de nouveaux traitements antituberculeux. L’immunothérapie, dont l’objectif est d’améliorer la réponse immunitaire de l’hôte contre le Mtb, représente une approche complémentaire intéressante dans le but de diminuer la durée et d’augmenter l’efficacité des traitements actuels de la TB-MDR. Le premier objectif de cette thèse a été de caractériser un nouveau vaccin thérapeutique, basé sur le virus de la vaccine modifié d’Ankara (Modified Vaccinia virus Ankara, MVA), le MVATG18598, qui exprime dix antigènes représentatifs des trois phases de l’infection par Mtb. En utilisant différentes lignées de souris, nous avons montré que la vaccination par MVATG18598 entraîne l'induction de réponses spécifiques cellulaires et humorales. Les cellules T produisent plusieurs cytokines de type Th1 et présentent une activité cytolytique. Dans des modèles murins d’efficacité, le MVATG18598, associé à un traitement antibiotique, réduit significativement la charge bactérienne dans les animaux infectés ainsi que le taux de rechute de la maladie après l’arrêt du traitement. Le deuxième objectif de cette thèse a été d'analyser l'impact des antituberculeux sur l'immunogénicité du vaccin MVATG18598. Nous avons montré que les antibiotiques de première ligne, et principalement l’isoniazide, diminuent la réponse immunitaire Th1 induite par le MVATG18598. De plus, nous avons démontré que la réponse humorale induite par le candidat vaccin est modifiée et s’oriente vers une augmentation du rapport IgG1/IgG2a en présence d’antibiotiques. En conclusion, nous montrons qu'un vaccin immunothérapeutique, tel que le MVATG18598, a la capacité de contribuer au contrôle de la tuberculose en augmentant l'efficacité des traitements antituberculeux. De plus, nos résultats indiquent que les antibiotiques modulent la réponse immunitaire induite par le vaccin, données devant être prises en compte lors du développement des futures stratégies immunothérapeutiques / Tuberculosis (TB), a lung disease caused by Mycobacterium tuberculosis (Mtb), remains the leading cause of death worldwide from an infectious disease. TB is responsible for an estimated 1,7 million of deaths and 10,4 million new cases annually. The emergence and spreading of multidrug resistance (MDR) Mtb strains represent a major global threat and reflect limitation of current treatments. Patients with MDR-TB are currently treated with multiple drug regimens, often toxic, given for long durations, with a limited efficacy. Therefore, developing novel TB therapies is urgently needed. Immunotherapy aiming at triggering specific immune response against Mtb represents an attractive approach to shorten the duration and increase the efficacy of current MDR-TB treatment. The first aim of this PhD project was to characterize a novel therapeutic vaccine, based on the Modified Vaccinia virus Ankara (MVA), MVATG18598, expressing ten antigens representative of the three phases of Mtb infection. Using different strains of mouse, we showed that MVATG18598 vaccination is able to trigger Mtb antigens-specific humoral and cellular responses. Both CD4 and CD8 T cells display the capacity to produce multiple Th1-cytokines together with cytolytic activity. In post-exposure mouse models, MVATG18598 combined with an antibiotic regimen decreases significantly the bacterial burden in lungs of infected mice as well as the disease relapse rate after treatment completion. The second aim of this project was to analyze the impact of TB antibiotics on the immunogenicity of the MVATG18598 vaccine. We showed that first-line antibiotic regimen, mostly isoniazid, decreases antigen-specific Th1 immune response triggered by MVATG18598 vaccination in mice. Moreover, we demonstrated that Mtb-specific antibody response induced by the vaccine candidate is modified and shifted towards an increase of IgG1/IgG2a ratio in presence of drugs. Altogether, these results illustrate that immunotherapeutic vaccine such as MVATG18598 has the capacity to contribute to the control of TB by improving efficiency of anti-TB drugs treatment. In addition, our results indicate that antibiotics are able to modulate vaccine-induced immune response, a feature to consider for the future development of immunotherapies

Les réactions multicomposants représentent un axe de recherche important en chimie organique. La capacité de regrouper en une même réaction plus de trois produits départs est la base de synthèse de molécules complexes proches de composés bioactifs. Par ailleurs, de part leur diversité, ces réactions sont des outils précieux pour la réalisation de librairies dans la recherche pharmaceutique. Les réactions multicomposants à base d'isonitrile, particulièrement la réaction Ugi, sont largement utilisées. Malgré les nombreuses applications de cette réaction, elle souffre encore de nombreuses limitations notamment lorsque des fonctionnalisations des adduits de Ugi sont recherchées sur la nouvelle position peptidyle crée. Du fait de fort encombrement stérique autour de cette position, seules des réactions intramoléculaires étaient décrites dans la littérature. Ainsi nous avons développé des stratégies efficaces pour la réalisation d'addition intermoléculaires sur des adduits d’Ugi. Nous avons exploré la formation de dianions 1,3-amide permettant d'augmenter la nucléophilie de nos composés et de réaliser des alkylations avec différents agents électrophiles à température ambiante et avec d'excellents rendements. Une application très simple de cette approche a été réalisée en couplant l'allylation de la position peptidyle à une réaction de metathèse cyclisante. Ceci pourrait être réalisé en introduisant un fragment allylique dans les produits de départ d’Ugi, nécessaire pour la métathèse. Les piperidines et pipéridones formées appartiennent à des classes de produits très exploitées dans le domaine pharmaceutique. Par ailleurs, poursuivant sur le potentiel de ces dianions 1,3-amides, nous avons voulu piéger ces intermédiaires par des électrophiles plus complexes nous permettant de former des dérivés cycliques. L'utilisation du diiodométhane en particulier, nous a permis d'ouvrir une voie très prometteuse dans la synthèse de β-lactames. Non limitée aux produits d’Ugi, des amides beaucoup plus simples issus d'esters maloniques ont pu être aussi transformés en β-lactames. En plus, les activités biologiques de ces β-lactames nouvellement synthétisées ont été examinées. Enfin, nous avons étendu cette approche à la formation de pyrrolidinones en une séquence monotope d'alkylation/cyclisation en travaillant sur la propargylation de ces adduits d’Ugi. La fonction énamine des 5-méthylène-pyrrolidin-2-ones synthétisées a pu être exploitée dans la reaction de Pictet-Spengler permettant la synthèse de dérivés de benzoindolizidine proches de différents alcaloïdes naturels. Néanmoins, la cascade propargylation/Pictet-Spengler a pu être réalisée avec succès dans une seule étape avec de bons rendements. / Multicomponent reactions represent an important line of research in organic chemistry. It permits the reaction between three or more starting materials, providing adducts which are considered as synthons for the syntheses of complex molecules close to bioactive compounds. As a result of their diversity, these reactions are considered as valuable tools for the preparation of libraries of organic structures in the pharmaceutical research field. The isonitrile-based multicomponent reactions, particularly the Ugi reaction, are the most frequently employed. Despite the wide applications of this reaction, it still suffers from numerous limitations, particularly when the newly formed peptidyl position is involved in the post-condensation reactions. Due to the steric hindrance around this position, only intramolecular reactions were described in the literature. Thus we have developed effective strategies for the intermolecular reactions involving Ugi adducts through the formation of 1,3-amide dianions to increase their nucleophilicity. Accordingly, such intermediates undergo alkylation reactions with different electrophilic agents at room temperature and with excellent yields. A very simple application of this approach has been attained by coupling the allylation at the peptidyl position to a ring closure metathesis reaction. This could be achieved by introducing an allylic fragment into the starting Ugi materials, necessary for metathesis. Such protocol allowed the synthesis of various piperidines and piperidones derivatives. Moreover, examining the potential of these 1,3-amide dianion intermediates by employing more complex electrophiles, allowed us to prepare cyclic derivatives. The use of diiodomethane in particular, has opened an access to a very promising way in the synthesis of β-lactams. Simpler malonic ester amides and their derivatives could also be converted to β-lactams following the same strategy, hence, it is not only limited to Ugi adducts. Additionally, the biological activities of such newly synthesized β-lactams were examined. Finally, we extended this approach to the preparation of pyrrolidinones through an alkylation/cyclization sequence via the propargylation of these Ugi adducts. The enamine functional group in the synthesized 5-methylene-pyrrolidin-2-ones could be exploited in a Pictet-Spengler reaction allowing the synthesis of benzoindolizidine derivatives, which are close in structure to natural alkaloids. Nevertheless, the propargylation/Pictet-Spengler cascade could be successfully performed in a one-pot reaction with good yields.

La construction d’animaux transgéniques est une technique clef qui a permis l’étude de nombreux aspects de la biologie du nématode Caenorhabditis elegans. Les animaux transgéniques peuvent être construits soit en injectant l’ADN exogène dans les gonades syncitiales de l’hermaphrodite adulte, soit en bombardant une population de vers avec des microbilles enrobées d’ADN. Dans les deux cas, l’utilisation de marqueurs génétiques est indispensable pour l’identification des individus transgéniques et la maintenance des lignées. Nous avons développé un vecteur d’expression pour les nématodes contenant le gène de résistance à la néomycine (neo), qui fonctionne comme marqueur génétique. Le gène neo confère la résistance au G-418, un antibiotique qui inhibe la synthèse de protéines chez les eucaryotes et qui est létal pour les nématodes sauvages. Nous avons montré que le marqueur neo est un marqueur génétique très puissant qui permet l’identification rapide des animaux transgéniques et qui permet l’enrichissement des populations transgéniques en présence de l’antibiotique, facilitant ainsi la maintenance des lignées. Ce système ne nécessite aucun contexte génétique particulier pour fonctionner et est donc compatible avec des lignées receveuses mutantes, ainsi que des lignées transgéniques ayant été transformées avec d’autres marqueurs génétiques. De plus, le gène neo est sous le contrôle du promoteur du gène de C. elegans rps-27, codant pour une protéine ribosomale dont la séquence est hautement conservée entre les nématodes. Nous avons utilisé ce gène comme marqueur génétique pour la transgénèse de l’espèce Caenorhabditis briggsae, ce qui suggère que le système neo pourrait aussi être utilisé pour d’autres espèces de la famille Caenorhabditis. Finalement, nous avons aussi montré que le système neo peut être utilisé dans le contexte des techniques d’ingénierie génétique basées sur le transposon Mos1. En conclusion, la sélection en présence de G-418 offre des nouvelles possibilités d’expériences pour la transgénèse de C. elegans et d’autres espèces proches. Les avantages du système neo devraient ainsi contribuer à développer des techniques de transgénèse du ver plus flexibles et efficaces. / The generation of transgenic animals has been instrumental to study many biological aspects of Caenorhabditis elegans biology. Transgenic animals can be obtained by either microinjection of the exogenous DNA into the syncitial gonad of the hermaphrodite or by bombardment of a population of worms with DNA coated microparticles. Both techniques rely on the use of genetic markers to facilitate the recovery of transformed animals and the maintenance of transgenic lines. We developed a nematode expression vector carrying the neomycin resistance gene (neo) as a selection marker. This gene confers resistance to G-418, an antibiotic that normally inhibits protein synthesis in eukaryotes and is lethal for wild-type nematodes. We showed that the neo marker is a potent tool that allows a clear-cut selection of transgenic animals and hands-off maintenance of non-integrated populations on G-418 plates. This system does not imply any prerequisite on the original genotype of the recipient strain and can therefore be used on mutants lines as well as transgenic strains obtained with common markers. Moreover, we placed the neo gene under the control of the C. elegans rps-27 promoter, a highly conserved ribosomal protein throughout the nematode phylogeny. We were able to provide resistance to Caenorhabditis briggsae using this vector; this likely indicates that neo can be used in any species from the Caenorhabditis family. Finally, we demonstrated that this powerful selection system can be used in the context of Mos1 transposon excision-repair methods. Therefore, the neo system offers a wide range of new possibilities for transgenesis both in C. elegans and in other related species. We therefore believe that the benefits of the neo system should contribute to the development of more flexible and efficient techniques for nematode transgenesis.

Les antibiotiques aminoglycosidiques sont des agents bactéricides de grande valeur et d’efficacité à large spectre contre les pathogènes Gram-positifs et Gram-négatifs, dont plusieurs membres naturels et semisynthétiques sont importants dans l’histoire clinique depuis 1950. Des travaux crystallographiques sur le ribosome, récompensés par le prix Nobel, ont démontré comment leurs diverses structures polyaminées sont adaptées pour cibler une hélice d’ARN dans le centre de codage de la sous-unité 30S du ribosome bactérien. Leur interférence avec l’affinité et la cinétique des étapes de sélection et vérification des tARN induit la synthèse de protéines à basse fidélité, et l’inhibition de la translocation, établissant un cercle vicieux d’accumulation d’antibiotique et de stress sur la membrane. En réponse à ces pressions, les pathogènes bactériens ont évolué et disséminé une panoplie de mécanismes de résistance enzymatiques et d’expulsion : tels que les N acétyltransférases, les O phosphotransférases et les O nucleotidyltransférases qui ciblent les groupements hydroxyle et amino sur le coeur des aminoglycosides; des méthyl-transférases, qui ciblent le site de liaison ribosomale; et des pompes d’expulsion actives pour l’élimination sélective des aminoglycosides, qui sont utilisés par les souches Gram-négatives. Les pathogènes les plus problématiques, qui présentent aujourd’hui une forte résilience envers la majorité des classes d’antibiotiques sur le bord de la pan-résistance ont été nommés des bactéries ESKAPE, une mnémonique pour Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa et Enterobacteriaceae. La distribution globale des souches avec des mécanismes de résistance envers les standards cliniques aminoglycosides, tels que la tobramycine, l’amikacine et la gentamicine, est comprise entre 20 et 60% des isolées cliniques. Ainsi, les aminoglycosides du type 4,6-disubstitués-2-deoxystreptamine sont inadéquats comme thérapies anti-infectieuses à large spectre. Cependant, la famille des aminoglycosides 4,5-disubstitués, incluant la butirosine, la neomycine et la paromomycine, dont la structure plus complexe, pourrait constituter une alternative. Des collègues dans le groupe Hanessian et collaborateurs d’Achaogen Inc. ont démontré que certains analogues de la paraomomycine et neomycine, modifiés par désoxygénation sur les positions 3’ et 4’, et par substitution avec la chaîne N1-α-hydroxy-γ-aminobutyramide (HABA) provenant de la butirosine, pourrait produire des antibiotiques très prometteurs. Le Chapitre 4 de cette dissertation présente la conception et le développement d’une stratégie semi-synthétique pour produire des nouveaux aminoglycosides améliorés du type 4,5 disubstitués, inspiré par des modifications biosynthétiques de la sisomicine, qui frustrent les mécanismes de résistance bactérienne distribuées globalement. Cette voie de synthèse dépend d’une réaction d’hydrogénolyse de type Tsuji catalysée par palladium, d’abord développée sur des modèles monosaccharides puis subséquemment appliquée pour générer un ensemble d’aminoglycosides hybrides entre la neomycine et la sisomicine. Les études structure-activité des divers analogues de cette nouvelle classe ont été évaluées sur une gamme de 26 souches bactériennes exprimant des mécanismes de résistance enzymatique et d’expulsion qui englobe l’ensemble des pathogènes ESKAPE. Deux des antibiotiques hybrides ont une couverture antibacterienne excellente, et cette étude a mis en évidence des candidats prometteurs pour le développement préclinique. La thérapie avec les antibiotiques aminoglycosidiques est toujours associée à une probabilité de complications néphrotoxiques. Le potentiel de toxicité de chaque aminoglycoside peut être largement corrélé avec le nombre de groupements amino et de désoxygénations. Une hypothèse de longue date dans le domaine indique que les interactions principales sont effectuées par des sels des groupements ammonium, donc l’ajustement des paramètres de pKa pourrait provoquer une dissociation plus rapide avec leurs cibles, une clairance plus efficace et globalement des analogues moins néphrotoxiques. Le Chapitre 5 de cette dissertation présente la conception et la synthèse asymétrique de chaînes N1 HABA β substitutées par mono- et bis-fluoration. Des chaînes qui possèdent des γ-N pKa dans l’intervalle entre 10 et 7.5 ont été appliquées sur une neomycine tétra-désoxygénée pour produire des antibiotiques avancés. Malgré la réduction considérable du γ N pKa, le large spectre bactéricide n’a pas été significativement affecté pour les analogues fluorés isosteriques. De plus, des études structure-toxicité évaluées avec une analyse d’apoptose propriétaire d’Achaogen ont démontré que la nouvelle chaîne β,β difluoro-N1-HABA est moins nocive sur un modèle de cellules de rein humain HK2 et elle est prometteuse pour le développement d’antibiotiques du type neomycine avec des propriétés thérapeutiques améliorées. Le chapitre final de cette dissertation présente la proposition et validation d’une synthèse biomimétique par assemblage spontané du aminoglycoside 66-40C, un dimère C2 symétrique bis-imine macrocyclique à 16 membres. La structure proposée du macrocycle a été affinée par spectroscopie nucléaire à un système trans,trans-bis-azadiène anti-parallèle. Des calculs indiquent que l’effet anomérique de la liaison α glycosidique entre les anneaux A et B fournit la pré-organisation pour le monomère 6’ aldéhydo sisomicine et favorise le produit macrocyclique observé. L’assemblage spontané dans l’eau a été étudié par la dimérisation de trois divers analogues et par des expériences d’entre croisement qui ont démontré la généralité et la stabilité du motif macrocyclique de l'aminoglycoside 66-40C. / Aminoglycosides are valuable and effective broad-spectrum bactericidal antibiotics against Gram-positive and Gram-negative pathogens, with several members of natural and semisynthetic origin occupying prominent roles in clinical practice since 1950. Nobel-prize winning crystallographic studies on the ribosome have revealed how their diverse polyaminated sugar framework is tailored to target a RNA helix within the decoding centre of the bacterial 30S subunit. By interfering with the affinity and kinetics of the tRNA selection and proof-reading steps, they induce error-prone protein synthesis, and translocation inhibition and lead to a lethal cycle of antibiotic uptake and membrane stress. In retaliation, bacterial pathogens have evolved and disseminated a number of enzymatic and efflux resistance mechanisms. These include N acetyl-transferases, O phosphotransferases and O nucleotidyltransferases, which target the core hydroxyl and amino groups of aminoglycosides promiscuously; methyltransferases, which target the ribosomal binding-site; and energy-dependent drug efflux pumps for aminoglycoside-selective elimination, in Gram-negative pathogens. The most problematic infectious pathogens which are currently resilient to most unrelated antibiotic classes and in the verge of pan-resistance have been defined ‘ESKAPE’ bacteria, a mnemonic for Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa and Enterobacteriaceae. The world-wide spread of aminoglycoside resistance to current clinical standards, such as tobramycin, amikacin and gentamicin, ranges from 20 to 60% of clinical isolates. Hence, the contemporary 4,6-disubstituted-2-deoxystreptamine aminoglycosides are currently inadequate as broad-spectrum anti-infective therapies. The 4,5-disubstituted class of aminoglycosides are a challenging framework for medicinal chemistry, which includes butirosin, neomycin and paromomycin. Exploring the potential of these alternatives, colleagues in the Hanessian group and collaborators of Achaogen Inc. have demonstrated that paromomycin and neomycin analogs modified by deoxygenation of positions 3' and 4', as well as N1-substituted analogs possesing the α hydroxy-γ-aminobutyryl amide (HABA) chain of butirosin, could produce promising antibiotics. Chapter 4 of this dissertation features the conception and development of an expedient semi-synthetic strategy to access novel aminoglycosides of the 4,5 disubstituted class, inspired from biosynthetic modifications of the sisomicin subfamily, that surmount the wide-spread bacterial resistance mechanisms. This synthetic methodology relies on a novel Tsuji palladium-catalyzed hydrogenolysis developed on model monosaccharides, which was applied to generate a library of aminoglycosides comprising ring A hybrids of the neomycin and sisomicin families. The structure-activity relationships of this new class were assessed against a panel of 26 bacterial strains expressing modifying enzymes and efflux systems to provide an overview of ESKAPE pathogens. Two novel hybrid aminoglycoside analogs exhibited excellent antibacterial coverage, and may be promising candidates for preclinical development. Aminoglycoside therapy is also invariably associated with a probability of nephrotoxic complications. Aminoglycoside toxicity has been largely correlated with the number of amino groups, and more loosely with the extent of deoxygenation. A long standing hypothesis in the field states that because the foremost interactions are effected by ammonium group salts, the tuning of pKa parameters could provide a higher target dissociation rate, more effective clearance and overall less nephrotoxic analogs. Chapter 5 in this dissertation features the conception and asymmetric synthesis of isosteric β substituted N1 HABA chains, modified by mono- and bis-fluorination. These chains covering a range of γ-N pKa values from 10 to 7.5 were applied to advanced tetra-deoxygenated neomycin antibiotics. In spite of the important reduction in γ N pKa, broad spectrum antimicrobial activity was not significantly disrupted for isosteric fluorinated analogs. Furthermore, structure-toxicity relationships, assessed by Achaogen’s proprietary luciferase-coupled apoptosis assay, revealed that the novel β,β difluoro-N1-HABA chain is less harmful in a Human Kidney 2 cell-line model and promising for the development as new generation neomycin antibiotics with improved therapeutic properties. The final chapter in this dissertation features the proposal and validation of the concise biomimetic synthesis and self-assembly of aminoglycoside 66-40C, a remarkable C2-symmetric 16 membered macrocyclic bis-imine dimer. The proposed structure was spectroscopically characterized as an anti-parallel s-trans-bis-azadiene macrocyclic system. Calculations indicate the anomeric effect of the α glycosidic bond between rings A and B is important for pre-organization of the monomeric sisomicin 6' aldehyde and favors the observed macrocycle product. Self-assembly in aqueous solutions was studied through the dimerization of three diverse analogs and cross-over experiments, which demonstrated the generality and stability of the macrocyclic motif of aminoglycoside 66-40C.

Plusieurs aminoglycosides font partie d’une famille d’antibiotiques à large spectre d’action. Les aminoglycosides ayant une activité antibiotique viennent interférer dans la synthèse protéique effectuée par les bactéries. Les protéines mal codées entraineront la mort cellulaire. Au fil des années, de nombreux cas de résistance ont émergé après une utilisation soutenue des aminoglycosides. De nombreux aminoglycosides semi-synthétiques ont été synthétisés avec comme objectif de restaurer leur activité antimicrobienne. Parmi les modifications ayant connu du succès, notons la didésoxygénation d’un diol et l’introduction de la chaine latérale HABA. Des études précédentes ont montré l’efficacité de ces modifications sur les aminoglycosides. Les présents travaux portent sur l’installation de la chaine latérale HABA et la didésoxygénation d’un diol sur la paromomycine et la néomycine. La didésoxygénation sélective des diols a été effectuée en utilisant la méthodologie développée par Garegg et Samuelsson, une variation de la réaction de Tipson-Cohen. Cette méthode a permis l’obtention du motif didésoxygéné sur les cycles A et D dans des rendements jamais égalés pour ce motif synthétique. La chaîne latérale a été introduite en tirant profit de la réactivité et de la sélectivité d’un carbamate cyclique. Ces méthodes combinées ont permis la synthèse efficace de nombreux analogues semi-synthétiques nouveaux. La 3',4'-didéhydro-N-1-HABA-néomycine et la 3',4',3''',4'''-tétradésoxy-N-1-HABA-néomycine montrent une activité impressionnante contre des souches de bactéries résistantes aux aminoglycosides. Des tests de toxicité effectués en collaboration avec Achaogen Inc. ont démontré que ces composés sont relativement toxiques sur les cellules rénales de type H2K, ce qui réduit de façon importante leur index thérapeutique. Afin d’abaisser la toxicité des composés, la relation entre toxicité et basicité a été explorée. Des substitutions de l’amine en 6''' ont été effectuées afin d’abaisser la basicité de l’amine. Les résultats de toxicité et d’activité antimicrobienne démontrent une corrélation importante entre la basicité des amines et la toxicité/activité des aminoglycosides antibiotiques. L’effet d’une modulation du pKa a aussi été exploré en installant des chaines fluorées sur l’amine en 6''' de la paromomycine et de la néomycine. Une séquence synthtétique pour isoler l’amine en 6''' de la néomycine a aussi été développée. / Some aminoglycosides are part of a broad-spectrum family of antibiotics used in the clinic. They interfere in protein synthesis in bacterium cell by interfering with the transcription of proteins leading to cellular death. After an intense usage of aminoglycosides in the clinic, numerous cases of resistance have been encountered which render aminoglycosides less effective. Semi-synthetic aminoglycosides have been synthesized with the objective of restoring their original antimicrobial activity. Deoxygenation of the diol on ring A and introduction of the lateral chain HABA at N-1 had a significant impact on their antimicrobial activity against resistant strains. The present work will focus on deoxygenation of the diol at 3', 4' and on the introduction of the lateral HABA chain on aminoglycoside, more specificaly on paromomycin and neomycin. The selective dideoxygenation of the A ring diol was done using a methodology developed by Garegg and Samuelsson, which is a modification of the original Tipson-Cohen reaction. This method allows the dideoxygenation on ring A and D with unprecedented yields. The lateral HABA chain was introduced via the ring opening of a cyclic carbamate. These methods were combined to produce very potent analogs such as 3',4'-didehydro-N-1-HABA-neomycin and 3',4',3''',4'''-tetradeoxy-N-1-HABA-neomycin. Toxicity tests done in collaboration with Achaogen Inc. showed that these analogs were toxic to H2K renal cells, which reduced significantly their therapeutic index. In order to lower the toxicity of those compounds, the relation between toxicity and basicity was explored. Substitution of the amine at 6''' was done in order to lower the basicity of this amine. The results showed a strong correlation beetween the basicity of this amine and toxicity/activity. The pKa of this amine was modulated by installing fluorinated alkyl chain on the amine at 6''' in order to see the effect of the pKa on the activity/toxicity on paromomycin and neomycin. A synthetic sequence was also developed to allow the 6''' amine on neomycin to be modified selectively.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

L’arthrite septique chez les bovins est une affection le plus souvent d’origine bactérienne qui est une cause de boiterie fréquente associée à des pertes économiques importantes. Le traitement, qui doit être initié le plus rapidement possible, s’appuie sur l’utilisation combinée d’anti-inflammatoires non stéroïdiens, d’un ou de plusieurs lavages articulaires ainsi que d’antibiotiques administrés de façon systémique pour un minimum de 3 semaines. Cette durée d’administration constitue une difficulté pour les élevages dits biologiques pour lesquels un cahier des charges strict limite un recours prolongé aux antibiotiques. Ainsi le traitement efficace de diverses conditions infectieuses et celui de l’arthrite septique en particulier dans ces élevages peut être compromis. L’objectif de ce travail est de s’appuyer sur les propriétés antimicrobiennes des solutions de saline hypertonique (SSH) pour limiter l’utilisation des antibiotiques dans les cas d’arthrite septique chez les veaux en intégrant ces solutions pour le lavage des articulations infectées. Notre première étude a consisté à déterminer la sécurité d’emploi de deux concentrations de SSH (une commerciale à 7.2% et une maison à 15%) dans des articulations supposées saines chez le veau. Une synovite sévère associée à des signes cliniques caractéristiques d’atteintes articulaires a été observé lors de l’utilisation de SSH 15%. Son utilisation clinique comme solution de lavage articulaire est par conséquent déconseillée. Concernant la SSH 7.2%, malgré une synovite d’intensité variable, nous n’avons pas noté des signes cliniques caractéristiques d’atteintes articulaires. Son utilisation dans un contexte expérimental d’infection articulaire nous a paru réaliste. Notre seconde étude a permis d’évaluer les effets du lavage articulaire avec de la SSH 7.2% dans un modèle expérimental d’infection à Escherichia coli. Trois groupes de traitement ont été constitués. Dans le premier groupe (traitement standard), un lavage était effectué avec du lactate de Ringer (LRS) et les veaux recevaient une administration biquotidienne de ceftiofur par voie intraveineuse pour 21 jours. Dans le deuxième groupe (LRS), un lavage était effectué avec du LRS et aucun antibiotique n’était administré. Enfin dans le troisième groupe (SSH), un lavage était effectué avec de la SSH 7.2% sans qu’aucun antibiotique ne soit administré. Tous les veaux ont reçu du kétoprofen quotidiennement pendant 3 jours. L’inoculation s’est fait au jour 1 et les traitements ont débuté au jour 2. L’efficacité des traitements a été établie sur des critères cliniques, bactériologiques et cytologiques. Dans le modèle que nous avons utilisé, les trois groupes de traitements ont conduits à une guérison clinique et bactériologique satisfaisante (absence de boiterie, de douleur et de croissance bactérienne dans le liquide articulaire en fin d’étude). La guérison cytologique n’a quant à elle pas été jugée satisfaisante avec des moyennes de comptage et de pourcentage en neutrophiles tout groupe confondu bien supérieures aux valeurs normales (11.39x109/l de neutrophiles représentant 74.73% des leucocytes en fin d’étude). Le traitement avec la SSH 7.2% s’est révélé être significativement plus traumatique et pas plus efficace dans l’élimination de l’infection comparativement au traitement LRS. D’autre part, le lavage articulaire au LRS s’est révélé être aussi efficace et sécuritaire que le traitement standard de l’arthrite septique qui incluait 21 jours de ceftiofur administré par voie intraveineuse. Ainsi, bien que le lavage avec de la SSH 7.2% n’est pas démontré de résultats satisfaisants qui permettrait de limiter le recours aux antibiotiques dans les filières biologiques, l’association d’un lavage au LRS avec le ketoprofen s’est révélée être une alternative possible. De nouvelles études sont requises pour confirmer ses résultats et pour déterminer le rôle respectif du lavage articulaire et du ketoprofen dans la guérison lors d’arthrite septique. / Septic arthritis in cattle is mainly an infectious bacteriological disease that is a frequent cause of lameness and is associated with great economic losses. Treatment must be prompt and includes non steroidal anti-inflammatory drugs with one or several joint lavage along with systemic antibiotics for at least 3 weeks. This long course of administration is unachievable for organic production systems where the use of antibiotics is strictly regulated. Thus the treatment of infectious disease with septic arthritis in particular may be jeopardized in these herds. The objectives of this work is to use antimicrobial properties of hypertonic saline solution (HSS) to limit the use of antibiotics in septic arthritis cases in calves, using HSS for joint lavage. In our first study, we assessed the safety of two HSS of different concentrations (commercial 7.2% and home-made 15%) in healthy calves joint. A severe synovitis associated with typical clinical signs of joint lesions was observed when HSS 15% was used. Therefore this solution cannot be recommended for joint lavage in calves. A synovitis of variable degree was observed when HSS 7.2% was used. However no clinical signs or joint lesions were noted. Based on these results, we felt that HSS 7.2% could be tested in an experimental setting of joint infection. In our second study, we evaluate the effects of joint lavage with HSS 7.2% in an experimental infection model with Escherichia coli. Three treatment groups were formed. In the first group, the joint lavage was realized with Lactated Ringer’s Solution (LRS) and calves also received ceftiofur intravenously two times a day for 21 days. In the second group, the joint lavage was realized with LRS and saline was used instead of ceftiofur. In the last group, the joint lavage was realized with HSS 7.2% and saline was used instead of ceftiofur. All calves in this study received ketoprofen once a day for 3 days intravenously. Inoculation of bacteria took place on day 1 and all treatments started on day 2. Treatment’s effectiveness was established upon clinical, bacteriological and cytological criteria. In our model, all treatment groups led to clinical and bacteriological recovery (no lameness, pain or positive culture in the synovial fluid at the end of the experiment). Whatever the treatment group, cytological recovery was no achieved at the end of the study with mean number and percentage of neutrophils far superior when compared to usual values (11.39x109/l of neutrophils representating 74.73% of total leucocytes at the end of the experiment). Joint lavage with HSS 7.2% combined with ketoprofen successfully treat septic arthritis in this model but was significantly more harmful compared to joint lavage with LRS combined with ketoprofen. On the other hand, joint lavage with LRS combined with ketoprofen was found as efficient and safe than the standard treatment of septic arthritis which includes a 21 day administration of intravenous ceftiofur. Therefore, even if HSS 7.2% joint lavage cannot be a good choice to treat septic with the restriction of use of antibiotics in organic herds, the combination of a LRS joint lavage with ketoprofen showed promising results. Further studies are warranted to confirm these latter results and to determine specific effects of the lavage and of ketoprofen.