Background Broth microdilution (BMD) is a gold-standard reference method to determine minimum inhibitory concentration (MIC) of antibiotics. For this, a standardized concentration of bacterial inoculum (2e5–8e5 colony-forming units, CFU/ml) is added to progressively higher concentrations of antibiotics. Bacteria stop growing at a particular antibiotic concentration termed MIC. Like other assays, various biological and/or technical factors can affect BMD results.   Aims To investigate the effects of inoculum concentration (5e4–5e6 CFU/ml), growth-medium concentration (cation-adjusted Mueller-Hinton Broth (CAMHB)), ranging 0.5x to 2x (1x as standard)) and age (<6-months or >1-year old) of fastidious medium on MIC results. And to compare BMD results using 5 different brands of CAMHBs and 1 cation-non-adjusted MH-broth (non-CAMHB).   Methods 12 isolates of bacteria (gram-positive (n=3), gram-negative(n=5), fastidious isolates (n=7)) and custom-made antibiotics-containing plates for gram-positive (11 antibiotics) or gram-negative bacteria (10 antibiotics) were used. Overnight-grown colonies were used to prepare BMD solutions (MH-broth + inoculum +/- fastidious) which were plated on antibiotic-plates as well as diluted prior to plating on agar-plates. Antibiotic- and agar-plates were incubated (18–20hr, 35°C) and used to determine MICs (following European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing instructions) and actual number of viable bacteria in BMD solutions, respectively.   Results Increasing inoculum concentration increased MICs of all antibiotics except cefoxitin. Piperacillin–tazobactam, levofloxacin, benzylpenicillin and ampicillin were especially sensitive to increase in inoculum and showed a 4-fold increase in >50% isolates. MICs for tobramycin, tigecycline and gentamicin increased by 2-fold in >50% isolates every time MH-broth concentration increased. Age of fastidious medium had no decipherable pattern of effects on MIC. All MH-broths gave similar results except when testing daptomycin which gave higher MICs with non-CAMHB compared to CAMHB.    Conclusion This research reveals some technical factors affecting MIC results. These results could help define parameters for automated BMD-performing-systems. However, this research shows only trends as more replicates are needed to determine statistically significant results.

L’anti-microbio-gouvernance apparaît comme un ensemble de politiques, de standards et d’avis judicieux visant à responsabiliser les pratiques à l’égard des conséquences d’une technologie – l’antibiotique. Si l’antibiotique améliore à court terme l’offre de soins (la cure pharmaceutique), il est aussi à la source de nouveaux risques anthropiques et écologiques à long terme pour la santé, la productivité et la biodiversité, en raison de l’émergence de gènes de résistance réduisant l’efficacité des traitements et faisant pression sur les communautés bactériennes – humaines, urbaines, édaphiques, etc. L’appréciation de ce dilemme (cure / risque), puis la performance de sa gestion, reposent sur la qualité des politiques et du processus d’antimicrobiogouvernance ainsi que des réflexions en amont intégrant les valeurs (éthiques), les savoirs (scientifiques) et l’expérience. La vision globale de Van Rensselaer Potter pour la bioéthique ouvre la perspective vers la philosophie et la pratique d’Aldo Leopold, dont une technique d’aménagement adaptatif des écosystèmes co-construite, par communauté, sur la base d’une bio-éthique globale (techno-socio-écologique) des pratiques et de l’environnement. En effet, comment responsabiliser tout un chacun face à une cure, à un risque et à l’incertitude ? En prenant la perspective de la sociologie des organisations, cette thèse explore une piste étudiée en science, technologie et société : comment concerter l’humain et le non-humain (les technologies et la Nature) par la voie de systèmes (communication, collaboration et éducation) pour anticiper l’émergence de problèmes ? L’objectif de cette thèse est de proposer une approche en éthique pour coconstruire la gouvernance des relations se tissant entre les secteurs et les disciplines bâtis sur les valeurs de la santé, de la productivité et de la biodiversité. À sa racine, ce cadre de gouvernance vise à dynamiser l’arbitrage de l’accès et de la protection des données – et conséquemment le trajet de l’information, des connaissances et des applications technologiques, pratiques et politiques – sans briser la confiance des acteurs impliqués. L’arbitrage des données, à la source de la production des connaissances techniques, est la clé pour orienter les systèmes de communication et de politiques conduisant à des conseils et à des régulations. Cette nouvelle approche en éthique cherche à avancer la vision d’un projet commun sans altérer l’intégrité des actions spécifiques à la médecine, à l’agriculture et à l’écologie. Cette thèse théorise et applique le procédé d’une bioéthique expérimentale combinant les façons de faire empirique, réflexive et multisite. Elle s’inspire de méthodes en anthropologie, en sociologie et en gestion, et de la réflexivité balancée. Quatre unités épistémiques sont articulées in fine selon une logique précise pour éviter un biais cognitif auquel le raisonnement d’une bio-éthique s’expose (le sophisme naturaliste) : le descriptif, une prise de conscience (partie I) ; l’appréciatif, une théorie de travail (partie II) ; le normatif, la préparation du terrain (partie III) ; et l’évaluatif, les outils de bioéthique (partie IV). Ultimement, le produit de l’approche est un cadre de gouvernance coconstruit avec plusieurs collaborateurs dont les initiatives sont susceptibles de provoquer des changements politiques et scientifiques. À titre de bioéthicien, l’intention est d’aider les personnes et les institutions ayant le leadership de projets de société à développer des outils capables d’encapaciter (ang., empowerment) les communautés à gouverner les changements à venir qui les concernent. / Anti-microbial governance can be understood as a set of policies, standards and judicious guidance aimed at making practices more responsible for the consequences of a technology – the antibiotic. While in the short-term antibiotics improve the quality of care (the pharmaceutical cure), they also create new long-term risks to anthropical and environmental health, productivity and biodiversity, due to the emergence of resistance genes that reduce the effectiveness of treatments and put pressure on bacterial communities – human, urban, edaphic, etc. The appreciation of this cure / risk dilemma, and the performance of its management, rely on the quality of the antimicrobial policy and governance processes as well as on upstream reflections integrating (ethical) values, (scientific) knowledge and experience. Van Rensselaer Potter’s global vision for bioethics opens the perspective towards Aldo Leopold’s philosophy and practice, namely an adaptive management technique of ecosystems co-constructed, per community, based on a global (techno-socio-ecological) bio-ethics of practices and the environment. Indeed, how can we make everyone responsible in the face of a cure, risk and uncertainty? By taking the perspective of the sociology of organizations, this thesis explores a path studied in Science, Technology and Society: how to bring together the human and the non-human (technologies and Nature) through (communication, collaboration and education) systems to anticipate the emergence of problems? This thesis will propose an approach in ethics to co-construct the governance of relationships between sectors and disciplines built on the values of health, productivity and biodiversity. At its root, this governance framework aims to energize the arbitration of access to and protection of data – and consequently the paths of information, knowledge and technological, practical and political applications – without breaking the trust of the actors involved. Data arbitration, at the source of technical knowledge production, is the key to guiding communication and policy systems toward guidelines and regulations. This new approach to ethics proposes the vision of a common project without altering the integrity of specific actions in medicine, agriculture and ecology. This thesis theorizes and applies the practice of an experimental bioethics combining empirical, reflexive, and multisite ways of thinking. It draws on methods in anthropology, sociology, and management, and uses the reflexive balancing process. Four epistemic units are articulated in fine according to a precise logic in order to avoid a cognitive bias to which the reasoning of a bioethics is exposed (the naturalistic fallacy): the descriptive, a raising of awareness (part I); the appreciative, a working theory (part II); the normative, the preparation of the terrain (part III); and the evaluative, the tools of bioethics (part IV). Ultimately, the product of this approach is a governance framework co-constructed with several collaborators whose initiatives have the potential to bring about policy and scientific changes. As a bioethicist, the intention is to help individual and institutional leaders of socio-technical projects to develop tools capable of empowering communities to prospectively govern the changes that concern them.

Över - eller felanvänd antibiotika leder till ökad risk för antimikrobiell resistens. När en bakterie har blivit resistent så har det skapats en motståndskraft, vilket gör antibiotikan verkningslös. Antibiotika är ett livsnödvändigt läkemedel, då det används rutinmässigt vid kirurgiska ingrepp och för att bekämpa bakteriella infektioner. Det finns inget alternativt läkemedel, vilket innebär att om antibiotika blir verkningslös är de globala konsekvenserna katastrofala. Den negativa utvecklingen har resulterat i att EU - kommissionen klassificerar antimikrobiell resistens (AMR) som ett av de tre största hälsohoten i världen. Internationella organisationer har presenterat krav och rekommendationer för hur länder ska hantera antibiotika och dess resistens, vilket har implementerats olika väl. Sverige har en av de lägsta frekvenserna av resistenta bakterier inom EU, medan Italien har en av de högsta. Hypotesen är att de nämnda ländernas resistensgrad har ett samband med hur väl man implementerat strukturer, regleringar och strategier på antibiotikamarknaden. Hypotesen undersöks genom en marknadsanalys baserat på en anpassad SCP - modell där Sveriges och Italiens respektive utfall värderas.  I utfallen framgår det att Sveriges antibiotikamarknad är mer kontrollerad än den italienska. En mer styrd marknad skapar möjligheten att kontrollera antibiotikakonsumtionen, vilket i sin tur bestämmer resistensgraden. Å andra sidan innebär en mer kontrollerad marknad att läkemedelsföretagens vinstgaranti försvinner, dessa kan tvingas lämna marknaden vilket leder till brist på antibiotika. En mindre styrd marknad gynnar däremot läkemedelsföretagen då det finns en vinstgaranti och en större konsumtion. Nackdelen är att resistensgraden ökar. I marknadsanalysen presenterades även att länderna skiljer sig i ansvarsfördelning, då hälso - och sjukvård är mer decentraliserad i Italien jämfört med Sverige. Strukturer, regleringar och strategier för att hantera AMR implementerades nationellt i Sverige, medan det i Italien är upp till varje region att agera. Italiens ansvarsfördelning resulterar i att resistensgraden skiljer mellan det södra och norra regionerna, då regionernas styren skiljer i kvalitet.  Slutligen lämnas förslag på förändringar för respektive land. Sverige behöver erbjuda en vinstgaranti för läkemedelsföretagen för att kunna säkerställa tillgången till antibiotika. Det råder brist idag, vilket medför att marknaden behöver bli mer attraktiv för företagen. Italien behöver förändra ansvarsfördelningen och införa nationella strukturer, regleringar och strategier. Det kommer öka möjligheten för mer påkostade åtgärder som gäller för alla regioner, vilket hanterar AMR mer effektivt. / An excessive or incorrect use of antibiotics can result in an increased prevalence of antimicrobial resistance. When a bacterium has become resistant, resilience against antibiotics is created, which makes the drug ineffective. Antibiotics are vital drugs, as they are routinely used in surgical procedures and combat bacterial infections. Often, there is no alternative medicine, which means that when an antibiotic becomes ineffective, the consequences are catastrophic for the global population. The global increase in resistance has forced the European Commission to classify antimicrobial resistance (AMR) as the world's third largest public health threat. International organizations have presented requirements and recommendations for how countries should handle antibiotics and their resistance. However, it has been the nation’s responsibility to implement these changes. Sweden has one of the lowest prevalence of antibiotic resistant bacteria in the EU, while Italy has one of the highest. The essay hypothesizes that the mentioned countries' degree of resistance can be explained by how well structures, regulations, and strategies are implemented. The hypothesis is evaluated through a market analysis where a reconstructed SCP - model is applied where Sweden’s and Italy’s respective performance is presented. The essay found that the Swedish antibiotic market is more regulated than the Italian. A more regulated market creates the opportunity to control antibiotic consumption, which further controls the degree of resistance. On the other hand, an over - regulated market means that there is no guarantee of profit for the pharmaceutical companies which often forces the companies to leave the market. A less regulated market benefits pharmaceutical companies as there is a guarantee of profit and larger consumption. The disadvantage is that the degree of resistance increases. In the market analysis, it is also presented that the countries differ in the distribution of responsibilities, as healthcare is more decentralized in Italy compared to Sweden. The structures, regulations, and strategies to manage AMR were implemented nationally in Sweden, while in Italy it is up to each region to act. Italy's division of responsibility results in that the degree of resistance differs between the southern and northern regions, as the regions' governments differ in quality. Finally, the essay presents proposals for changes for each country. Sweden should offer a profit guarantee for pharmaceutical companies, as they need access to a broad selection of antibiotics. The existing shortage should be dealt with, which is why the market needs to be more attractive for companies. Italy needs to change the distribution of responsibilities and introduce national structures, regulations, and strategies. This will increase the possibility of more costly measures that apply to all regions, which will manage AMR more effectively.

[ES] La amenaza para la prevención y tratamiento de las infecciones bacterianas provocada por la resistencia a los antibióticos es cada vez mayor. En este trabajo hemos estudiado distintos tipos de agua, a fin de obtener información integrada de la contaminación y los patrones locales de resistencia a antibióticos de bacterias indicadoras, con el objetivo de determinar el potencial de estos sistemas acuáticos para actuar como medios de dispersión de determinantes de resistencias a antibióticos en el ambiente, dentro de la perspectiva "One Health". Nuestro objetivo era obtener información acerca del nivel de contaminación por bacterias resistentes a antibióticos (ARB) y la presencia de genes determinantes de resistencias (ARG) en distintos tipos de aguas ambientales, evaluando el origen de esta resistencia, relacionando los patrones de resistencia presentes, valorando los posibles riesgos para la población y proponiendo medidas para combatir el problema. En las muestras de agua recogidas en diversas localizaciones realizamos recuentos bacterianos selectivos de bacterias consideradas indicadores de contaminación fecal, tales como los coliformes totales, Escherichia coli y Enterococcus spp. (enterococos), seleccionados dependiendo del origen de la muestra, con el fin de conocer su calidad higiénico-sanitaria. Empleando E. coli como microorganismo monitor de la resistencia en todos los tipos de agua, junto con Enterococcus spp. en el caso de aguas continentales y marinas, seleccionamos y aislamos un número significativo de cepas, valorando su concentración mínima inhibitoria (CMI) frente a antibióticos de uso frecuente para el tratamiento de infecciones en humanos. Por último, verificamos mediante PCR la presencia o ausencia de diferentes genes de resistencia, tanto en el medio acuático como en las cepas seleccionadas. Los resultados obtenidos reflejan que la calidad higiénico-sanitaria de las aguas procedentes de los efluentes de dos EDAR, aguas de mar y aguas continentales, están dentro de los estándares de calidad establecidos por la normativa española. No ocurre lo mismo con las aguas de riego y las aguas de una de las EDAR, las cuales estaban muy por encima de esos límites. Mediante recuento en medios selectivos adicionados con distintos antibióticos, se observó que un elevado porcentaje de las cepas provenientes de EDAR y aguas de riego eran resistentes a ampicilina, eritromicina, y sulfametoxazol, siendo la resistencia a la ampicilina la más prevalente. Estos resultados fueron confirmados por la CMI en los aislados de E. coli, los cuales mostraron un patrón global de resistencia independientemente del origen de la muestra, siendo la resistencia a ampicilina la más prevalente, seguida de tetraciclina y sulfametoxazol, con un porcentaje muy alto de cepas multirresistentes, especialmente en EDAR y aguas de riego. La mayoría de las cepas presentaron resistencia a los antibióticos betalactámicos, sulfonamidas y tetraciclinas, siendo los perfiles predominantes de multirresistencia similares en todos los tipos de agua. En el caso de Enterococcus spp., el número de cepas resistentes y multirresistentes fue escaso, siendo las resistencias a la eritromicina y tetraciclina las más prevalentes. La determinación por PCR de la presencia de diversos genes de resistencia confirmó que su dispersión en el medio acuático es muy elevada, encontrándose casi todos ellos en todas las muestras de agua, aunque en un menor porcentaje en el agua de mar. Se pudo determinar la existencia de un patrón genómico homogéneo de resistencias en las cepas de E. coli en esta área geográfica. La elevada prevalencia de determinantes de resistencia a los antibióticos encontrados en los distintos tipos de agua supone un riesgo elevado de transferencia horizontal de genes a otras bacterias, y contribuye de forma determinante a su llegada al ser humano. / [CA] L'amenaça per a la prevenció i el tractament de les infeccions bacterianes provocada per la resistència als antibiòtics és cada vegada més gran. En aquest treball hem estudiat diferents tipus d'aigua per obtenir informació integrada de la contaminació i els patrons locals de resistència a antibiòtics de bacteris indicadors, amb l'objectiu de determinar el potencial d'aquests sistemes aquàtics per actuar com a mitjans de dispersió de determinants de resistències a antibiòtics a l'ambient, dins de la perspectiva "One Health". El nostre objectiu era obtenir informació sobre el nivell de contaminació per bacteris resistents a antibiòtics (ARB) i la presència de gens determinants de resistències (ARG) en diferents tipus d'aigües ambientals, avaluant l'origen d'aquesta resistència, relacionant els patrons de resistència presents, valorant els possibles riscos per a la població i proposant mesures per combatre el problema. A les mostres d'aigua recollides en diverses localitzacions realitzem recomptes bacterians selectius de bacteris considerats indicadors de contaminació fecal, com ara els coliformes totals, Escherichia coli i Enterococcus spp. (enterococs), seleccionats depenent de l'origen de la mostra, per tal de conèixer-ne la qualitat higienicosanitària, i valorem el nivell de resistències d'aquests microorganismes davant de diferents antibiòtics d'ús freqüent, mitjançant recomptes en plaques amb medi selectiu a les quals s'havia afegit concentracions estàndard dels mateixos. Emprant E. coli com a microorganisme monitor de la resistència en tots els tipus d'aigua, juntament amb Enterococcus spp. en el cas d'aigües continentals i marines, seleccionem i aïllem un nombre significatiu de ceps, valorant-ne la concentració mínima inhibitòria (CMI) davant d'antibiòtics d'ús freqüent per al tractament d'infeccions en humans. Finalment, verifiquem mitjançant PCR la presència o absència de diferents gens de resistència, tant al medi aquàtic com als ceps seleccionats. Els resultats obtinguts reflecteixen que la qualitat higienicosanitària de les aigües procedents dels efluents de dues EDAR, aigües de mar i aigües continentals, estan dins dels estàndards de qualitat establerts. No passa el mateix amb les aigües de reg i les aigües d'una de les EDAR, que estaven molt per sobre d'aquests límits. Mitjançant recompte en mitjans selectius addicionats de diferents antibiòtics, es va observar que un elevat percentatge dels ceps provinents d'EDAR i aigües de reg eren resistents a ampicil·lina, eritromicina, i sulfametoxazol, sent la resistència a l'ampicil·lina la més prevalent. Aquests resultats van ser confirmats per la CMI als aïllats d' E. coli, els quals van mostrar un patró global de resistència independentment de l'origen de la mostra, sent la resistència a l'ampicil·lina la més prevalent, seguida de tetraciclina i sulfametoxazol, amb un percentatge molt alt de ceps multiresistents, especialment a EDAR i aigües de reg. La majoria de les ceps van presentar resistència als antibiòtics betalactàmics, sulfonamides i tetraciclines, sent els perfils predominants de multiresistència similars en tots els tipus d'aigua. En el cas d' Enterococcus spp., el nombre de ceps resistents i multiresistents va ser escàs, sent les resistències a l'eritromicina i tetraciclina les més prevalents. La determinació per PCR de la presència de diversos gens de resistència va confirmar que la seva dispersió en el medi aquàtic és molt elevada, i gairebé tots es troben en totes les mostres d'aigua, encara que en un menor percentatge a l'aigua de mar. Es va poder determinar l'existència d'un patró genòmic homogeni de resistències als ceps d' E. coli en aquesta àrea geogràfica. L'elevada prevalença de determinants de resistència als antibiòtics trobats en els diferents tipus d'aigua suposa un risc elevat de transferència horitzontal de gens a altres bacteris, i contribueix de manera determinant a l'arribada a l'ésser humà. / [EN] The threat to prevention and treatment of bacterial infections caused by antibiotic resistance is increasing. In this work we have studied different types of water, in order to obtain integrated information on pollution and local antibiotic resistance patterns of indicator bacteria, with the aim of determining the potential of these aquatic systems to act as means of dispersion of determinants of antibiotic resistance in the environment, within the "One Health" perspective. Our objective was to obtain information about the level of contamination by antibiotic-resistant bacteria (ARB) and the presence of resistance-determining genes (ARG) in different types of environmental waters, evaluating the origin of this resistance, relating the present resistance patterns, assessing the possible risks for the population and proposing measures to combat the problem. In water samples collected at various locations, we performed selective bacterial counts of bacteria considered indicators of fecal contamination, such as total coliforms, Escherichia coli and Enterococcus spp. (enterococci), selected depending on the origin of the sample, in order to know its hygienic-sanitary quality, and we assess the level of resistance of these microorganisms against different frequently used antibiotics, through counts on plates with selective medium to which standard concentrations of them had been added. Using E. coli as a monitoring microorganism of resistance in all types of water, together with Enterococcus spp. in the case of continental and marine waters, we selected and isolated a significant number of strains, assessing their minimum inhibitory concentration (MIC) against antibiotics frequently used for the treatment of infections in humans. Finally, we verified by PCR the presence or absence of different resistance genes, both in the aquatic environment and in the selected strains. The results obtained reflect that the hygienic-sanitary quality of the waters from the effluents of two WWTPs, sea waters and continental waters, are within the quality standards established by the Spanish. The same does not occur with irrigation water and water from one of the WWTPs, which were well above those limits. By counting in selective media added with different antibiotics, it was observed that a high percentage of the strains from WWTP and irrigation water were resistant to ampicillin, erythromycin, and sulfamethoxazole, with resistance to ampicillin being the most prevalent. These results were confirmed by the MIC in the E. coli isolates, which showed a global pattern of resistance regardless of the origin of the sample, with resistance to ampicillin being the most prevalent, followed by tetracycline and sulfamethoxazole, with a very high percentage. of multi-resistant strains, especially in WWTP and irrigation water. Most strains presented resistance to beta-lactam antibiotics, sulfonamides and tetracyclines, with the predominant multiresistance profiles being similar in all types of water. In the case of Enterococcus spp., the number of resistant and multiresistant strains was low, with resistance to erythromycin and tetracycline being the most prevalent. The determination by PCR of the presence of various resistance genes confirmed that their dispersion in the aquatic environment is very high, almost all of them were found in all water samples, although in a lower percentage in seawater. It was possible to determine the existence of a homogeneous genomic pattern of resistance in E. coli strains in this geographical area. The high prevalence of antibiotic resistance determinants found in different types of water represents a high risk of horizontal gene transfer to other bacteria, and contributes decisively to their arrival in humans. / Dasí Camaró, DM. (2024). Estudio del agua como fuente de entrada y dispersión de determinantes de resistencia a antibióticos al medio ambiente en el área metropolitana de Valencia y alrededores [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/210135