L’arille de Momordica cochinchinensis (gac), un fruit de la famille des Cucurbitacées, est la source végétale la plus riche en lycopène et β-carotène. Ces deux composés ont, respectivement, un rôle de puissant antioxydant et de provitamine A, intéressant les compléments santé. Tout d'abord, un procédé d’extraction fractionnée douce a été développé pour extraire ces caroténoïdes naturels en gardant leur qualité originale. Puis, le lycopène et le β-carotène extraits ont été caractérisés et analysés. Au moins 95 % des extraits sont composés de l’isomère all-trans. Ils ne sont pas dégradés pendant le traitement thermique représentant les procédés de formulation. Leur stéréo-mutation thermique a été évaluée. Le lycopène est plus antioxydant et donc plus rapidement isomérisé que le β-carotène à haute température. L’isomérisation augmente leur activité antioxydante, qui a été évalué par test chimique TEAC et sur l’hémolyse des cellules sanguines (KRL) in vitro. Les deux caroténoïdes de l’arille de gac sont beaucoup plus antioxydants que le Trolox contre l’hémolyse. En comparant avec d’autres sources de β-carotène, les caroténoïdes extraits de gac dans ces conditions douces restent antioxydants même à des concentrations plus élevées contrairement à ceux extraits dans des conditions classiques qui deviennent prooxydants. Ces résultats permettent de discuter la bioactivité des caroténoïdes d'après leur qualité et de leur origine, c’est à dire leur source et leur procédé d’extraction. D’un point de vue applicatif, outre le procédé de fractionnement qui est industrialisable, le traitement thermique appliqué permet de contrôler la fonctionnalité des produits riches en caroténoïdes. / The aril of Momordica cochinchinensis (gac), plant from the Cucurbitaceae family, is the richest source of lycopene and β-carotene, which are a strong antioxidant and a pro-vitamin A, respectively, interesting for health-complements. First, a process of soft extraction-fractionation was developed for extracting effectively the natural carotenoids from gac without loss of their original quality. Then, the lycopene and β-carotene extracted from gac were analyzed and characterized. At least 95% of the extracts were composed of the all-trans isomer. They were not degraded during the heat-treatment mimicking formulation processing. Their thermal stereo-mutation was evaluated. Lycopene is more antioxidant, it is thus isomerized more rapidly than β-carotene at high temperature. The isomerization of carotenoids increases their antioxidant activity that was evaluated by the chemical test TEAC and through the hemolysis of red blood cells (KRL) in vitro. The lycopene and β-carotene from gac are notably more antioxidant than Trolox. By comparing with other sources of β-carotene, carotenoids extracted from gac in these soft conditions keep their antioxidant properties, even at high concentration, contrasting with extracts obtained in classical conditions that become prooxidant. From these results, the bioactivity of carotenoids is discussed from their quality and their origin that is their source and extraction process. For application, in addition to the fractionation process which is easily transferable to the industry scale, the heat-treatment used in this study is interesting for controlling products rich in functional carotenoids

Ce travail a pour objectif de mettre au point un procédé d’oligomérisation de rutine et d’esculine par la laccase de Trametes versicolor. Un procédé de synthèse en parallèle et d’analyse en ligne par SEC-UV et par MALDI-TOF a été mis au point. L’analyse par MALDI-TOF a révélé la formation d’un simple pontage, allant jusqu’au degré d’oligomérisation 6 pour la rutine et 9 pour l’esculine. Un pontage par liaison éther a été observé par FTIR dans le cas des oligorutines. L’analyse par RMN a démontré la mise en place de liaisons tant C-C que C-O localisées sur la partie phénolique et la partie sucre des monomères. De faibles pH et températures favorisent l’allongement de la chaîne, alors que l’augmentation de la constante diélectrique du solvant ou de la température augmente la production des oligomères de rutine. La limitation de la masse de ces oligomères serait due à une inhibition de l’enzyme, provoquée par les capacités chélatantes des oligomères. Une diminution du pouvoir antioxydant et une augmentation du pouvoir inhibiteur de la xanthine oxydase ont pu être observées lors de l’accroissement de la masse des oligomères de rutine. Ces deux activités sont améliorées lors de l’accroissement de la masse des oligomères d’esculine. Pour ces deux types d’oligomères, la solubilité dans l’eau est fortement accrue. Dans le cas des oligorutines, cette forte augmentation a été corrélée à la mise en place d’un réseau dense de liaisons hydrogène observé par modélisation moléculaire. Globalement, l’approche par modélisation moléculaire dans le vide et dans le solvant a permis de dégager des relations structure-activité, reliant notamment le nombre de liaisons hydrogène à la solubilité / The aim of this work is the elaboration of rutin and esculin oligomerization process by the laccase from Trametes versicolor. A parallel synthesis process and on-line analysis of reaction media by SEC-UV and MALDI-TOF have been elaborated. The MALDI-TOF analysis has revealed the formation of simple bridges between rutin and esculin units, up to degree of oligomerization of 6 and 9 respectively. An ether bond has been observed by FTIR spectrometry for the rutin oligomers. Finally, the NMR analysis has revealed the formation of C-C and C-O bridges both on phenolic and the sugar parts of the flavonoids. At low pH and temperature, the elongation of the chain is favored, whereas increasing the dielectric constant of the solvent or the temperature favors the production of rutin oligomers. The limitation of oligomers mass is explained by the inhibition of the enzyme, probably due to the highest chelation properties of oligomers. In the case of oligorutin, a decrease of antiradical activity and an increase of xanthine oxidase inhibitory activity have been observed when the oligomers molecular mass increases. In the case of esculin oligomers, these two activities increase with the increase of the oligomers mass. For these two types of oligomers, the water solubility is considerably increased. For the oligorutins, this augmentation has been correlated to a dense network of H-bonds, which has been demonstrated by molecular modeling. Globally, the molecular modeling approach in vacuum and in solvent has allowed to establish structure-activity relationship

Dans un contexte de démarche écoresponsable et pour répondre aux exigences de biocompatibilité notamment dans les applications cosmétiques et biomédicales, nous avons développé de nouveaux hydrogels à base de polysaccharides neutres et anioniques en utilisant deux voies originales. La 1ère approche est biomimétique et a consisté à mimer un phénomène d’élaboration naturelle d’hydrogels que l’on retrouve chez certains végétaux pour lesquels une enzyme, la laccase, permet de créer des liens de réticulation par dimérisation des composés phénoliques (en l’occurrence de l’acide férulique FA) présents sur les arabinoxylanes des mucilages des graines de céréales par exemple. Notre travail a ainsi consisté à greffer de l’acide férulique via deux chimies différentes de type imidazole et carbodiimide respectivement pour des polysaccharides neutres ou anioniques. Nous avons ainsi fonctionnalisé trois polysaccharides : le pullulane ou PUL (neutre modèle), le carboxyméthylpullulane ou CMP (anionique modèle) et l’acide hyaluronique ou HA (anionique d’intérêt). Des taux de greffage compris entre 2 et 25% ont été obtenus. L’étude physicochimique en régimes dilué et semi-dilué a permis de mettre en évidence un comportement associatif lié au caractère amphiphile des polysaccharides fonctionnalisés. La réticulation en présence de laccase, suivie in situ en rhéologie, a été réalisée avec succès sur les différents systèmes envisagés avec des contrôles possibles de la cinétique, des propriétés mécaniques finales ou encore du gonflement des hydrogels en fonction du caractère neutre ou chargé des polysaccharides, du degré de substitution en acide férulique, de la concentration en polymère ou de l’activité enzymatique fixée. Les dérivés synthétisés ont globalement démontré des activités biologiques (antioxydante et cytocompatible) intéressantes. La deuxième approche repose sur la photoréticulation possible de polysaccharides (PUL, CMP et HA) fonctionnalisés par le greffage d’amine/acide gras mono ou polyinsaturé (oleylamine, acide oléique et linoléique) via la chimie des imidazoles. Si le pullulane modifié par l’acide linoléique à 2% s’est avéré non hydrosoluble en raison de son caractère neutre, tous les autres dérivés avec des taux de greffages de 3 et 10% ont démontré une bonne solubilité dans l’eau. Les études physicochimiques mettent en évidence un très fort caractère associatif de ces dérivés amphiphiles avec la formation de gels physiques en régime semi-dilué. La photoréticulation a été démontrée en rhéologie sous irradiation UV in situ en présence d’un photoamorceur de type Darocur 1173®. Les résultats préliminaires obtenus selon cette approche en photoréticulation ouvrent ainsi des perspectives intéressantes. / In the framework of an eco-responsible context and to take advantage of biocompatibility, notably in cosmetic and biomedical applications, we have developed new hydrogels based on neutral and anionic polysaccharides using two original routes. The first approach is biomimetic and consists of mimicking a natural development of hydrogels that is found in certain plants for which an enzyme, laccase, allows to create crosslinks by dimerization of phenolic compounds, in occurrence of ferulic acid (FA) present on arabinoxylans mucilage of cereal seeds for example. Thus, our work consisted in grafting ferulic acid via two different chemical ways that means imidazole and carbodiimide respectively for neutral or anionic polysaccharides. We functionalized three polysaccharides: pullulan or PUL (neutral model), carboxymethylpullulane or CMP (model anionic) and hyaluronic acid or HA (anionic of interest) with grafting rates of between 2 and 25%. The physicochemical study in diluted and semi-diluted regimes evidenced an associative behavior due to the amphiphilic character of the functionalized polysaccharides. The crosslinking in the presence of laccase, followed in situ thanks to rheology, has been successfully performed on the various envisaged systems with possible controls of kinetics, the final mechanical properties or the swelling of the hydrogels as a function of the neutral or charged nature of the polysaccharides, the degree of substitution in FA, the polymer concentration or the enzymatic activity. The synthesized derivatives have generally demonstrated interesting biological activities (antioxidant and cytocompatibility). The second approach is based on the possible photocrosslinking of polysaccharides (PUL, CMP and HA) functionalized by the grafting of mono or polyunsaturated fatty amine/acid (oleylamine, oleic acid and linoleic acid) via imidazole chemistry. If pullulan grafted with 2% of linoleic acid was found to be water-insoluble due to its neutral character, all other derivatives (i.e. anionic ones) with grafting rates of 3 and 10% showed good solubility in water. The physicochemical studies show a very strong associative character of these amphiphilic derivatives with the formation of physical gels in semi-diluted regime. Photocrosslinking has been demonstrated in situ thanks to rheology/UV irradiation in the presence of a Darocur 1173® photoinitiator. The preliminary results according to this photocrosslinking approach thus open interesting perspectives.

Les propriétés antioxydantes du resvératrol sont d’un grand intérêt pour contrer la dysfonction endothéliale où la contribution du stress oxydant est majeure. Cette dysfonction endothéliale est d’ailleurs bien caractérisée en hypertrophie ventriculaire gauche (HVG). Cette étude vise à explorer les effets thérapeutiques du resvératrol sur la dysfonction endothéliale des artères coronaires épicardiques associée à l’HVG. L’HVG est induite suite à un cerclage aortique (CA) sur des porcelets de 2 mois. Le resvératrol est ensuite administré à 20 mg/kg/jour per os aux animaux répertoriés dans différents groupes. Le groupe 1 comprend les animaux contrôles sans CA alors que le groupe 2 représente les porcelets ayant subit le CA sans traitement. Le groupe 3 comprend les animaux traités pendant les 60 jours après la chirurgie alors que le groupe 4 est traité seulement à partir du 30ème jour jusqu’au jour 60. Des analyses échocardiographiques et histologiques ont été effectuées afin de déterminer le degré d’hypertrophie et l’impact du resvératrol sur la progression de l’HVG alors que la réactivité vasculaire a été évaluée par des expériences de chambres d’organes. La dysfonction endothéliale a été étudiée in vitro par quantification des métabolites nitriques et des niveaux de GMPc tandis que le stress oxydant est décrit par les niveaux d’angiotensine II (Ang II) et de protéines carbonylées. Les courbes dose-réponse à la sérotonine du groupe 3 traité pendant les 60 jours au resvératrol ont démontré une relaxation vasculaire significativement améliorée comparé au groupe 2 non-traité (p<0,05). Le pourcentage de changement du rapport de la masse du ventricule gauche sur la masse corporelle (LVmass/BW) a démontré une inhibition du développement de l’HVG dans le groupe 3 alors que le groupe 4 n’a pas eu d’effets bénéfiques des 30 jours de traitement au resvératrol. La biodisponibilité du NO représentée par la mesure de ses métabolites en circulation (398,71±21,74 ; 151,04±14,95 ; 241,86±15,53 ; 208,17±26,52 uM pour les groupes 1, 2, 3 et 4 respectivement, p<0,001 pour groupe 1 et 3 vs groupe 2) et par le niveau de GMPc a été augmentée avec l’administration du polyphénol (2,54±0,63 ; 0,67±0,45 ; 1,71±0,25 ; 1,98±0,29 pmol/ml pour les groupes 1, 2, 3 et 4 respectivement, p<0,05 pour groupe 1, 3 et 4 vs groupe 2). Le rôle antioxydant du resvératrol a été confirmé avec une réduction des niveaux de protéines carbonylées chez le groupe 3 comparé aux valeurs du groupe 2 (0,14±0,05 vs 0,33±0,03 nmol/mg respectivement) sans diminution des niveaux d’Ang II. Le resvératrol a aussi réduit l’hypertrophie des cardiomyocytes et la fibrose interstitielle. Ainsi, le resvératrol peut effectivement réduire la dysfonction endothéliale des artères coronaires épicardiques et limiter l’occurrence de remodelage myocardique associé à l’HVG, principalement à travers l’activation de la signalisation dépendante du NO. / Antioxidant properties of resveratrol are of great interest regarding endothelial dysfunction in which oxidative stress has a major causative role. This dysfunction is well characterized in left ventricular hypertrophy (LVH). The current study was designed to explore the effects of resveratrol as a treatment for the coronary endothelial dysfunction associated with LVH. An aortic banding (AB) was performed on swine to induce LVH on two-month-old swine for 60 days. Resveratrol was administered at 20 mg/kg/d per os to different groups. Group 1 represented healthy controls while group 2 was not treated. After AB, group 3 received resveratrol from day 1 to 60 post-surgery whereas group 4 was treated from day 30 to 60 only. Echocardiographic and histological studies were performed to evaluate the degree of LVH. Vascular reactivity of epicardial coronary arteries was assessed in organ chamber experiments. Endothelial dysfunction was evaluated in vitro by nitric oxide (NO) metabolites and cyclic guanosine-3,5-monophosphate (cGMP) while angiotensin II (Ang II) levels and protein carbonylation evaluated Oxidative stress. After treatment, the LVmass/body weight ratio was improved in group 3 associated with reduced cardiomyocyte hypertrophy and interstitial fibrosis (p<0.05). Dose-response curves to serotonin for the resveratrol treated group 3 demonstrated a greater vascular relaxation compared to LVH untreated group 2 (p<0.05). Bioavailability of NO measured by its circulating metabolites (398,71±21,74; 151,04±14,95 ; 241,86±15,53 ; 208,17±26,52 uM for groups 1, 2, 3 and 4 respectively, p<0,001 for groups 1 and 3 vs group 2) and by vascular cGMP (2,54±0,63 ; 0,67±0,45 ; 1,71±0,25 ; 1,98±0,29 pmol/ml for groups 1, 2, 3 and 4 respectively, p<0,05 for group 1,3 and 4 vs group 2) was increased. The antioxidant effect of the polyphenol was confirmed by decreased protein carbonylation with the 60 days treatment (0,14±0,05 vs 0,33±0,03 nmol/mg for group 3 vs 2) associated to unchanged Ang II levels. Therefore, resveratrol effectively reduces epicardial coronary endothelial dysfunction and limits the occurrence of cardiac remodelling associated with LVH, mainly through an NO-dependent pathway.

La dysfonction de l’endothélium vasculaire, associée à une diminution de ses propriétés vasorelaxantes et anti-thrombogéniques, survient avec le vieillissement mais également chez de plus jeunes patients athérosclérotiques présentant plusieurs facteurs de risque cardiovasculaire. Au niveau cellulaire, le vieillissement des cellules endothéliales (CE) mène à un état irréversible de non division cellulaire appelé sénescence. Ces cellules sénescentes présentent des changements spécifiques au niveau de leur morphologie et de l’expression génique, menant à leur dysfonction. La sénescence dite réplicative est déclenchée par le raccourcissement des télomères survenant à chaque division cellulaire, mais peut également être induite prématurément par le stress oxydant (SIPS). L’objectif principal de cette étude est de caractériser la sénescence de CE vasculaires isolées à partir de patients athérosclérotiques, et d’observer l’impact des facteurs de risque sur cette sénescence. Afin de confirmer la contribution des deux principales voies de la sénescence, nous avons par la suite étudié conjointement ou séparément, l’impact d’un traitement chronique avec un antioxydant sur la sénescence de CE, et d’une surexpression de la sous-unité catalytique de la télomérase (hTERT), une enzyme responsable de l’allongement des télomères. Nous avons isolé et cultivé des CE provenant d’artères mammaires internes prélevées lors de pontages coronariens. Selon les études, les cellules ont été infectées ou non avec un lentivirus surexprimant la hTERT, et cultivées in vitro jusqu’à sénescence, en présence ou en absence de l’antioxydant N-acétyl-L-cystéine (NAC). Différents marqueurs des deux principales voies de la sénescence (réplicative ou SIPS) ont été quantifiés. La sénescence cellulaire se développe exponentiellement avec le temps et est associée à une réduction de la viabilité et de la prolifération cellulaires. Chez les patients athérosclérotiques, le vieillissement des CE passe par les deux principales voies de la sénescence : des télomères courts initialement en culture et la durée d’exposition in vivo aux facteurs de risque cardiovasculaire prédisent une apparition prématurée de la sénescence. Toutefois, chez les fumeurs, la sénescence est exclusivement du type SIPS. Ces facteurs de risque cardiovasculaire et principalement l’hypertension, semblent accélèrer le vieillissement biologique et favoriser la dysfonction des CE. Lorsque traitées chroniquement avec le NAC, les CE présentant initialement de moindres dommages cellulaires et moléculaires ainsi qu’une meilleure défense antioxydante développent une sénescence retardée. Lorsque le NAC est combiné à une surexpression de la hTERT, les deux voies de la sénescence sont bloquées et une immortalisation cellulaire est observée. À l’inverse, dans les CE les plus endommagées par les ROS in vivo, le NAC n’a aucun effet sur le développement de la sénescence, la hTERT, seule ou en combinaison avec le NAC, retarde légèrement la sénescence mais aucune immortalisation n’est observée lorsque ces traitements sont combinés. En conclusion, nos études démontrent que l’exposition chronique au stress oxydant associé aux facteurs de risque cardiovasculaire accélère le développement de la sénescence de CE vasculaires, contribuant potentiellement à l’athérogénèse. Dans les cellules de patients athérosclérotiques, il semble exister un seuil de dommages cellulaires et moléculaires subis in vivo au-delà duquel, aucun traitement (antioxydant ou hTERT) ne peut être bénéfique. / Vascular aging is associated with a decrease in endothelial dilatory and antithrombotic functions. This typical endothelial dysfunction, however, is also present in younger patients with cardiovascular diseases (CVD). At the cellular level, aging of healthy vascular endothelial cells (EC) leads to senescence, a state of permanent growth arrest. Senescence is characterized by specific changes in cell morphology and gene expression, which reduce EC function and thus are proposed to be pro-atherogenic. Age-associated telomere shortening leads to replicative senescence of human endothelial cells, but senescence can also be induced prematurely by oxidative stress (SIPS). Our aim was to characterize senescence of EC isolated from atherosclerotic patients and look at the influence of risk factors for CVD on the onset of senescence. To confirm the contribution of each of the two mains pathways triggering senescence, we then looked at the impact on senescence of a chronic treatment with an antioxidant combined or not with an overexpression of the catalytic subunit of telomerase (hTERT), a reverse transcriptase involved in telomere elongation. We used EC isolated from internal mammary arteries discarded during coronary bypass graft surgery. Depending on the study, EC were infected or not with a lentivirus overexpressing hTERT, and cells were cultured in vitro until senescence, in the presence or the absence of the antioxidant N-acetyl-L-cysteine (NAC). Different markers of the two main pathways of senescence (replicative ou SIS) were quantified. Senescence develops exponentially with time in culture and is associated with a decrease in cell viability and proliferation. In atherosclerotic patients, cellular aging displays an overlap between replicative and stress-induced senescence: short initial telomere length in vitro and a long exposure to risk factors for CVD in vivo predict the onset of a premature senescence. However, in smoking patients, premature senescence is exclusively induced by oxidative stress. Risk factors for CVD seem to accelerate the biological aging leading to EC dysfunction. When treated chronically with NAC, EC presenting initially lower levels of damage and a better endogenous antioxidant capacity develop a delayed senescence, probably due to a slight hTERT activation. When NAC is combined with an overexpression of hTERT, both pathways triggerring senescence are blocked and cellular immortalization is observed. In contrast, in EC presenting higher levels of damage undergone in vivo, NAC has no effect by itself on the onset of senescence, hTERT delays the onset of senescence in combination or not with NAC, but no cellular immortalization was observed in NAC-hTERT cells. In conclusion, our studies show that a chronic in vivo exposition to oxidative stress associated with risk factors for CVD accelerates the onset of vascular endothelial cells senescence that could potentially contribute to atherogenesis. EC having strong antioxidant defense capacity and DNA repair mechanisms may be rescued from replicative and stress-induced senescence unless EC have undergone an insurmountable cellular and molecular damage possibly due to uncontrolled free radical production associated with risk factors for CVD.

Les flavonoïdes glycosylés sont des métabolites secondaires d’origine végétale, qui présentent de nombreuses propriétés physico-chimiques et biologiques intéressantes pour des applications industrielles. La glycosylation accroît généralement la solubilité de ces flavonoïdes mais leurs faibles niveaux de production dans les plantes limitent leur disponibilité. Ces travaux de thèse portent donc sur le développement de nouvelles voies de gluco-diversification des flavonoïdes naturels, en mettant à profit l’ingénierie des protéines. Deux transglucosylases recombinantes, structurellement et biochimiquement caractérisées, l'amylosaccharase de Neisseria polysaccharea et la glucane-saccharase de branchement α-(1→2), forme tronquée de la dextran-saccharase de L. Mesenteroides NRRL B-1299, ont été sélectionnées pour la biosynthèse de nouveaux flavonoïdes, possédant des motifs originaux d’α-glycosylation, et potentiellement une solubilité accrue dans l'eau. Dans un premier temps, une librairie de petite taille de mutants de l’amylosaccharase, ciblée sur le site de liaison à l’accepteur, à été criblée en présence de saccharose (donneur d’unité glycosyl) et de lutéoline comme accepteur. Une méthode de screening a donc été développée, et a permis d’isoler des mutants améliorés pour la synthèse de nouveaux glucosides de lutéoline, jusqu’à 17000 fois plus soluble dans l’eau que la lutéoline aglycon. Afin de glucosyler d’autres flavonoïdes, la glucane-saccharase de branchement α-(1→2), a été préférentiellement sélectionnée. Des plans expérimentaux alliés à une méthodologie en surface de réponse ont été réalisés pour optimiser la production de l’enzyme sous forme soluble et éviter la formation de corps d’inclusion. Cinq paramètres ont été ainsi analysés : le temps de culture, la température, et les concentrations en glycérol, lactose (inducteur) et glucose (répresseur). En appliquant les conditions optimales prédites, 5740 U.L-1 de culture d’enzyme soluble ont été produites en microplaques, alors qu’aucune activité n’était retrouvée dans la fraction soluble, lors de l’utilisation de la méthode de production précédemment utilisée. Finalement, Une approche de modélisation moléculaire, structurellement guidés par l’arrimage de flavonoïdes monoglucosylés dans le site actif de l’enzyme, a permis d’identifier des cibles de mutagenèse et de générer des libraries de quelques milliers de variants. Une méthode rapide de criblage sur milieu solide, basée sur la visualisation colorimétrique d’un changement de pH, a été mise au point. Les mutants encore actifs sur saccharose ont été sélectionnés puis analysés sur leur capacités à glucosyler la quercétine et la diosmétine. Une petite série de 23 mutants a ainsi été retenue comme plate-forme d’enzymes améliorées dédiées à la glucosylation de flavonoïdes et a été évalués pour la glycosylation de six flavonoïdes distincts. La promiscuité, remarquablement générée dans cette plateforme, à permis d’isoler quelques mutants beaucoup plus efficaces que l’enzyme sauvage, produisant des motifs de glucosylation différents et fournissant des informations intéressante pour le design et l’amélioration des outils enzymatiques de glucosylation des flavonoïdes. / Flavonoid glycosides are natural plant secondary metabolites exhibiting many physicochemical and biological properties. Glycosylation usually improves flavonoid solubility but access to flavonoid glycosides is limited by their low production levels in plants. In this thesis work, the focus was placed on the development of new glucodiversification routes of natural flavonoids by taking advantage of protein engineering. Two biochemically and structurally characterized recombinant transglucosylases, the amylosucrase from Neisseria polysaccharea and the α-(1→2) branching sucrase, a truncated form of the dextransucrase from L. Mesenteroides NRRL B-1299, were selected to attempt glucosylation of different flavonoids, synthesize new α-glucoside derivatives with original patterns of glucosylation and hopefully improved their water-solubility. First, a small-size library of amylosucrase variants showing mutations in their acceptor binding site was screened in the presence of sucrose (glucosyl donor) and luteolin acceptor. A screening procedure was developed. It allowed isolating several mutants improved for luteolin glucosylation and synthesizing of novel luteolin glucosides, which exhibited up to a 17,000-fold increase of solubility in water. To attempt glucosylation of other types of flavonoids, the α-(1→2) branching sucrase, naturally designed for acceptor reaction, was preferred. Experimental design and Response Surface Methodology were first used to optimize the production of soluble enzyme and avoid inclusion body formation. Five parameters were included in the design: culture duration, temperature and concentrations of glycerol, lactose inducer and glucose repressor. Using the predicted optimal conditions, 5740 U. L-1of culture of soluble enzyme were obtained in microtiter plates, while no activity was obtained in the soluble fraction when using the previously reported method of production. A structurally-guided approach, based on flavonoids monoglucosides docking in the enzyme active site, was then applied to identify mutagenesis targets and generate libraries of several thousand variants. They were screened using a rapid pH-based screening assay, implemented for this purpose. This allowed sorting out mutants still active on sucrose that were subsequently assayed for both quercetin and diosmetin glucosylation. A small set of 23 variants, constituting a platform of enzymes improved for the glucosylation of these two flavonoids was retained and evaluated for the glucosylation of a six distinct flavonoids. Remarkably, the promiscuity generated in this platform allowed isolating several variants much more efficient than the wild-type enzyme. They produced different glucosylation patterns, and provided valuable information to further design and improve flavonoid glucosylation enzymatic tools.

L'objectif de ce travail était de sélectionner de manière rationnelle une bactérie probiotique par la mise en place d'un crible ainsi que d'étudier et de comprendre l'impact du potentiel d'oxydoréduction (Eh) et du bullage de gaz sur la survie de Bifidobacterium bifidum dans un produit laitier fermenté. Nous avons tout d'abord développé des techniques de sélection des bactéries sur des critères de viabilité / vitalité (analyse par cytométrie en flux) ainsi que sur des critères de fonctionnalité (pouvoir antioxydant). Nous avons pu sélectionner des souches d'intérêt industriel ainsi qu'une souche d'étude académique, Bifidobacterium bifidum.Nous avons ensuite étudié l'effet de la modification du Eh par bullage de gaz sur la survie de B. bifidum dans un produit laitier fermenté. Les laits fermentés conditionnés sous atmosphère anaérobie (Azote) et/ou réductrice (Azote-Hydrogène) permettent une meilleure survie de la souche au cours du stockage (28 jours - 4 °C) par rapport au Contrôle. Puis, nous avons analysé l'effet d'une croissance sous différents Eh sur la viabilité en milieu modèle et la fonctionnalité de B. bifidum. Une croissance en condition anaérobie et/ou réductrice permet d'améliorer à la fois la résistance aux stress (stress oxydant d'ordre physiologique, stress aux sels biliaires et stress côlon), le pouvoir réducteur (sels de tétrazolium), le pouvoir antioxydant (test KRL et test des comètes) et l'adhérence par rapport au Contrôle. Une modulation des propriétés biochimiques membranaires sous Azote et sous Azote-Hydrogène pourraient expliquer ces phénomènes. L'augmentation des composés thiols exofaciaux et l'augmentation des acides gras insaturés à longues chaines est observée pour des cellules produites sous conditions Azote et Azote-Hydrogène. Ainsi ces conditions de croissance présentent une amélioration majeure de l'effet probiotique de B. bifidum, à la fois d'un point de vue de sa résistance aux stress que d'un point de vue de sa fonctionnalité

La dysfonction de l’endothélium vasculaire, associée à une diminution de ses propriétés vasorelaxantes et anti-thrombogéniques, survient avec le vieillissement mais également chez de plus jeunes patients athérosclérotiques présentant plusieurs facteurs de risque cardiovasculaire. Au niveau cellulaire, le vieillissement des cellules endothéliales (CE) mène à un état irréversible de non division cellulaire appelé sénescence. Ces cellules sénescentes présentent des changements spécifiques au niveau de leur morphologie et de l’expression génique, menant à leur dysfonction. La sénescence dite réplicative est déclenchée par le raccourcissement des télomères survenant à chaque division cellulaire, mais peut également être induite prématurément par le stress oxydant (SIPS). L’objectif principal de cette étude est de caractériser la sénescence de CE vasculaires isolées à partir de patients athérosclérotiques, et d’observer l’impact des facteurs de risque sur cette sénescence. Afin de confirmer la contribution des deux principales voies de la sénescence, nous avons par la suite étudié conjointement ou séparément, l’impact d’un traitement chronique avec un antioxydant sur la sénescence de CE, et d’une surexpression de la sous-unité catalytique de la télomérase (hTERT), une enzyme responsable de l’allongement des télomères. Nous avons isolé et cultivé des CE provenant d’artères mammaires internes prélevées lors de pontages coronariens. Selon les études, les cellules ont été infectées ou non avec un lentivirus surexprimant la hTERT, et cultivées in vitro jusqu’à sénescence, en présence ou en absence de l’antioxydant N-acétyl-L-cystéine (NAC). Différents marqueurs des deux principales voies de la sénescence (réplicative ou SIPS) ont été quantifiés. La sénescence cellulaire se développe exponentiellement avec le temps et est associée à une réduction de la viabilité et de la prolifération cellulaires. Chez les patients athérosclérotiques, le vieillissement des CE passe par les deux principales voies de la sénescence : des télomères courts initialement en culture et la durée d’exposition in vivo aux facteurs de risque cardiovasculaire prédisent une apparition prématurée de la sénescence. Toutefois, chez les fumeurs, la sénescence est exclusivement du type SIPS. Ces facteurs de risque cardiovasculaire et principalement l’hypertension, semblent accélèrer le vieillissement biologique et favoriser la dysfonction des CE. Lorsque traitées chroniquement avec le NAC, les CE présentant initialement de moindres dommages cellulaires et moléculaires ainsi qu’une meilleure défense antioxydante développent une sénescence retardée. Lorsque le NAC est combiné à une surexpression de la hTERT, les deux voies de la sénescence sont bloquées et une immortalisation cellulaire est observée. À l’inverse, dans les CE les plus endommagées par les ROS in vivo, le NAC n’a aucun effet sur le développement de la sénescence, la hTERT, seule ou en combinaison avec le NAC, retarde légèrement la sénescence mais aucune immortalisation n’est observée lorsque ces traitements sont combinés. En conclusion, nos études démontrent que l’exposition chronique au stress oxydant associé aux facteurs de risque cardiovasculaire accélère le développement de la sénescence de CE vasculaires, contribuant potentiellement à l’athérogénèse. Dans les cellules de patients athérosclérotiques, il semble exister un seuil de dommages cellulaires et moléculaires subis in vivo au-delà duquel, aucun traitement (antioxydant ou hTERT) ne peut être bénéfique. / Vascular aging is associated with a decrease in endothelial dilatory and antithrombotic functions. This typical endothelial dysfunction, however, is also present in younger patients with cardiovascular diseases (CVD). At the cellular level, aging of healthy vascular endothelial cells (EC) leads to senescence, a state of permanent growth arrest. Senescence is characterized by specific changes in cell morphology and gene expression, which reduce EC function and thus are proposed to be pro-atherogenic. Age-associated telomere shortening leads to replicative senescence of human endothelial cells, but senescence can also be induced prematurely by oxidative stress (SIPS). Our aim was to characterize senescence of EC isolated from atherosclerotic patients and look at the influence of risk factors for CVD on the onset of senescence. To confirm the contribution of each of the two mains pathways triggering senescence, we then looked at the impact on senescence of a chronic treatment with an antioxidant combined or not with an overexpression of the catalytic subunit of telomerase (hTERT), a reverse transcriptase involved in telomere elongation. We used EC isolated from internal mammary arteries discarded during coronary bypass graft surgery. Depending on the study, EC were infected or not with a lentivirus overexpressing hTERT, and cells were cultured in vitro until senescence, in the presence or the absence of the antioxidant N-acetyl-L-cysteine (NAC). Different markers of the two main pathways of senescence (replicative ou SIS) were quantified. Senescence develops exponentially with time in culture and is associated with a decrease in cell viability and proliferation. In atherosclerotic patients, cellular aging displays an overlap between replicative and stress-induced senescence: short initial telomere length in vitro and a long exposure to risk factors for CVD in vivo predict the onset of a premature senescence. However, in smoking patients, premature senescence is exclusively induced by oxidative stress. Risk factors for CVD seem to accelerate the biological aging leading to EC dysfunction. When treated chronically with NAC, EC presenting initially lower levels of damage and a better endogenous antioxidant capacity develop a delayed senescence, probably due to a slight hTERT activation. When NAC is combined with an overexpression of hTERT, both pathways triggerring senescence are blocked and cellular immortalization is observed. In contrast, in EC presenting higher levels of damage undergone in vivo, NAC has no effect by itself on the onset of senescence, hTERT delays the onset of senescence in combination or not with NAC, but no cellular immortalization was observed in NAC-hTERT cells. In conclusion, our studies show that a chronic in vivo exposition to oxidative stress associated with risk factors for CVD accelerates the onset of vascular endothelial cells senescence that could potentially contribute to atherogenesis. EC having strong antioxidant defense capacity and DNA repair mechanisms may be rescued from replicative and stress-induced senescence unless EC have undergone an insurmountable cellular and molecular damage possibly due to uncontrolled free radical production associated with risk factors for CVD.

L'étude phytochimique d'Armeria maritima et d'Helichrysum stoechas a permis d'isoler pour la première fois 31 molécules dans le genre Armeria dont 4 nouveaux flavonols diglycosylés, ainsi que le développement d'une stratégie de déréplication pour l'étude d'H. stoechas. Dans les deux espèces, nous avons relevé une richesse en polyphénols, qui pourraient être extraits par des techniques respectueuses de l'environnement comme la SFE. En parallèle, ces deux halophytes ont montré un fort potentiel biologique avec des extraits et des molécules dotés d'activités anti-oxydante, anti-collagénase, anti-inflammatoire ou encore cicatrisante. De plus, nous avons initié pour la première fois des suspensions cellulaires d'A. maritima et identifié des éliciteurs comme le méthyl jasmonate permettant d’augmenter dans les cellules d'H. stoechas la teneur en acide 3,5-dicaféoylquinique, un bio-marqueur de l'activité anti-inflammatoire. La production de molécules bioactives dans des cultures végétales in vitro pourrait par la suite être transposée à plus grande échelle, afin d’amplifier le potentiel de valorisation de ces deux halophytes en dermo-cosmétique. / The phytochemical study of Armeria maritima and Helichrysum stoechas led to the isolation of 31 molecules never reported before in the genus Armeria, 4 of which being new flavonol diglycosides, and to the development of a dereplication strategy for the study of H. stoechas. In both species, an abundance of polyphenols was observed, which could be extracted with eco-friendly methods like SFE. Both halophytes showed a strong biological potential as their extracts and molecules demonstrated antioxidant, anti-collagenase, anti-inflammatory and wound healing activities. Moreover, we initiated for the first time cell suspensions of A. maritima, and identified elicitors, such as methyl-jasmonate, which led to H. stoechas cell suspensions with an increased content in 3,5-dicaffeoylquinic acid, a bio-marker of anti-inflammatory activity. The production of bioactive molecules in "plant cell factories" could be scaled-up to enhance the valorization potential of both halophytes in dermocosmetics.

Les plantes aromatiques font parties des richesses naturelles du patrimoine de la région Midi-Pyrénées mais apparaissent cependant de moins en moins valorisées. Dans le cadre de la recherche de nouveaux aromatisants naturels de type WONF, nous avons choisi d'adopter la voie de valorisation des plantes aromatiques médiévales de cette région car elles ont toujours fait l'objet de cueillette à l'état sauvage sans jamais être cultivées. Dans une première étape, une étude bibliographique a été réalisée, à partir d'anciens ouvrages botaniques et de bases de données scientifiques, afin d'identifier les plantes régionales traditionnellement utilisées par nos ancêtres pour leurs activités aromatisantes, culinaires ou médicinales. Nous avons sélectionné cinq plantes aromatiques : Achillea millefolium, Calamintha grandiflora, Tanacetum balsamita, Myrrhis odorata et Monarda didyma. Dans une deuxième étape, des études physico-chimiques, sensorielles et biologiques des fractions volatiles et non volatiles, obtenues après extractions des plantes médiévales sélectionnées, ont été réalisées pour juger de leurs activités aromatiques, antioxydantes et antibactériennes ainsi que de leur intérêt dans le cadre de nouvelles réglementations européennes. Les résultats de ces travaux montrent des activités odorantes, antioxydantes et antibactériennes significatives pour l'ensemble des plantes sélectionnées. Dans une troisième étape, du fait de la rareté du végétal étudié, nous nous sommes intéressés à deux voies analytiques d'évaluation rapide de la composition de l'huile essentielle native de ces plantes aromatiques ; premièrement au moyen d'un échantillonnage classique couplé à un détecteur à forte sensibilité comme la chromatographie bidimensionnelle et deuxièmement par un échantillonnage spécifique couplé à un détecteur classique pour lequel nous avons développé un appareillage novateur dénommé "Crushing Finger Device" (CFD). Ce dernier permet de mimer instrumentalement l'écrasement de la feuille entre les doigts et de piéger les composés volatils odorants émis en vue de leur analyse chromatographique ultérieure. Enfin, pour une application pré-industrielle, afin d'élargir le champ d'application de ces plantes aromatiques, des études d'infusion des plantes et d'aromatisation des huiles végétales par les huiles essentielles ont été mises en place. Durant le processus d'aromatisation de l'huile végétale, les volatils émis par la plante ou par l'huile essentielle donnent un goût et une saveur spécifique tout en délivrant une activité biologique notable. / Midi-Pyrenees region has a rich and unvalorized wild vegetal heritage, especially for aromatic plants. In the framework of the search for new natural flavorings e.g. WONF, we chose to adopt the way of valorization of the medieval aromatic plants of this region, because they have been always picked in a wild state without being ever grown. In a first step, a global bibliographical survey study based on historical books, library archived documents and computerized data banks, was made in order to identify regional plants which were used by our ancestors for their odorous, culinary or medicinal activities. We selected five aromatic plants, e.g. Achillea millefolium, Calamintha grandiflora, Tanacetum balsamita, Myrrhis odorata and Monarda didyma. In a second step, physico-chemical, sensory and biological studies of volatiles and non volatiles fractions, obtained by extractions of the selected medieval plants were carried out, to judge their aromatic, antioxidant and antibacterial activities and their interest within the framework of new european regulations. Theses results show a significant odorous, antioxidant and antimicrobial activities for all selected plants. In a third step, such plants were rare or their harvesting problematic, inducing a limited sampling. We decided to investigate two strategic approaches to perform a rapid evaluation of native essential oil, based either on a classic sampling with a specific/ultra sensitive detection such as Comprehensive GC, nor the use of a specific/high effective sampling system with a classic detection. This last methodology was based on a self designed apparatus “Crushing Finger Device” (CFD), allowing to copy the crushing of leaves between fingers and to trap the volatiles emitted to their later chromatographic analysis. Finally, in the aim to expand the use of aromatic plants, also to enlarge the assortment of oil products, a pre-industrial application were carried out. Infusion of plants and flavoring of vegetable oil by essential oil were studied. During processing of aromatized vegetable oil, volatiles from added aromatic plants or essential oil migrate to oil to give a specific aroma and a significant biological activity. Plantes aromatiques oubliées, Huile essentielle, Antioxydant, Antibactérien, Simulateur de froissement, Composés d’arômes, Achillea millefolium, Calamintha grandiflora, Tanacetum balsamita, Myrrhis odorata, Monarda didyma.