The genetic mechanisms by which natural populations maintain abundant phenotypic variation and adapt to their local environments remains a controversial topic in evolutionary biology. An intriguing mechanism involving highly mutable microsatellites follows the “tuning knob” model which proposes that stepwise changes in microsatellite allele lengths reciprocally generate phenotypic variation in a stepwise manner. In this study, I explored the predictions of the tuning knob model focusing specifically on transcribed microsatellites within and among natural populations of common sunflower (Helianthus annuus L.) transecting a latitudinal cline. An RNA-Seq experiment was conducted on 95 individuals from Kansas and Oklahoma grown in a common garden. To explore the potential role that microsatellites play in gene expression divergence in common sunflower, enrichment of microsatellites within differentially expressed (DE) genes was assessed. The results showed that A and AG repeat-containing microsatellites are enriched within DE genes and that 83.5% of these microsatellites are located within untranslated regions (UTRs). This finding is consistent with a role for transcribed microsatellites in gene expression divergence. RNA-Seq data were then used to assess microsatellite allele length effects on gene expression. Of all the microsatellites characterized in a reference transcriptome, 3,325 were consistently genotyped. The study identified 479 microsatellites at which allele length significantly correlated with gene expression (eSTRs). When irregular allele sizes were removed from the analysis, the number of eSTRs rose to 2379. eSTRs were most abundant within UTRs (70.4%) which suggests that they are well-positioned as cis-regulatory elements. A population genetic study conducted with 672 individuals across 17 sunflower populations from Saskatchewan to Oklahoma revealed strong signatures of directional selection acting on 13 eSTRs compared to 19 anonymous microsatellites assumed to evolve in a neutral fashion. This demonstrates that longer or shorter alleles may be favored in more extreme environments to that considered in the focal study. A second common garden experiment conducted with populations further north and south of focal populations revealed consistent patterns of correlation between microsatellite allele length and gene expression at some eSTRs. This study provides evidence that a substantial number of transcribed microsatellites function as “tuning knobs” of adaptation in common sunflower by modulating gene expression in a stepwise manner. These findings imply that the genomes of natural populations may include hundreds of active tuning knobs that can facilitate rapid evolution.

Vernonia sensu lato é um dos maiores e mais complexos gêneros da tribo Vernonineae. A tribo pertence a família Asteraceae, a qual representa cerca de 10% da flora mundial e é considerada uma das maiores famílias dentre as plantas superiores. As espécies da tribo Vernonineae apresentam distribuição pantropical e são caracterizadas pela presença de lactonas sesquiterpênicas e flavonoides (principalmente flavonas e flavonóis). Ao longo dos anos, diversas classificações têm sido propostas para o gênero Vernonia s.l., porém ainda não há um consenso entre os pesquisadores. Nas classificações mais antigas, o gênero Vernonia s.l. inclui cerca de 1000 espécies (sensu Baker), distribuídas em seções e subseções; em uma divisão mais atual, essas espécies foram segregadas em vários novos gêneros e o gênero Vernonia, nas Américas, foi consideravelmente reduzido (sensu Robinson), ficando restrito a espécies distribuídas principalmente na América do Norte. Neste estudo, foram realizadas análises metabolômicas e estatísticas de espécies do gênero Vernonia s.l., pertencentes às subtribos Vernoniinae, Lepidaploinae e Rolandrinae, com o intuito de verificar se a abordagem metabolômica pode ser utilizada como uma ferramenta quimiotaxonômica e auxiliar nas classificações taxonômicas do gênero. A partir das impressões digitais metabólicas obtidas por UHPLC-UV-MS, foram realizadas análises estatísticas não-supervisionadas (HCA e PCA) e supervisionadas (OPLS-DA). A análise por HCA permitiu a identificação de quatro grupos principais, os quais sugerem que as espécies apresentaram tendência em se agruparem de acordo com os gêneros criados por Robinson. Além disso, observou-se que as espécies dos gêneros Stenocephalum, Stilpnopappus e Rolandra (Grupo 1) estão relacionadas às espécies do gênero Vernonanthura (Grupo 2), enquanto que as espécies dos gêneros Chrysolaena, Cyrtocymura e Echinocoryne (Grupo 3) estão relacionadas às espécies dos gêneros Lessingianthus e Lepidaploa (Grupo 4), indicando que as subtribos Vernoniinae e Lepidaploinae são parafiléticas. Diversos metabólitos foram identificados nas espécies analisadas, destacando-se os ácidos clorogênicos, os flavonoides e as lactonas sesquiterpênicas. Através da análise por OPLS-DA foi possível determinar os metabólitos responsáveis pela separação entre os grupos obtidos na análise por HCA. As espécies do Grupo 1 foram caracterizadas pela ausência de ácido 3-O-cafeoilquínico e 3,5-di-O-cafeoilquínico; o Grupo 2 foi caracterizado pela ausência de quercetina e presença de kaempherol 3-O-rutinosídeo; o Grupo 3 foi o único grupo no qual não foi identificado o flavonoide 7,3?,5?-trihidroxi- 4?-metoxi-3-O-glicosilflavona e as espécies do Grupo 4 caracterizaram-se por apresentarem baixa prevalência de flavonas. Dessa maneira, as análises metabolômicas em conjunto com análises estatísticas multivariadas auxiliaram no esclarecimento da classificação taxonômica das espécies do gênero Vernonia s.l. e permitiram a identificação de potenciais marcadores quimiotaxonômicos / Vernonia sensu lato is one of the largest and more complex genus of the tribe Vernonineae. The tribe belongs to Asteraceae, one of the largest families of flowering plants. Vernonineae is distributed widely in tropical and subtropical regions of America, Africa and Asia and it is chemically characterized by the presence of sesquiterpene lactones and flavonoids (flavones and flavonols). Over the years, several taxonomic classifications have been proposed for the genus Vernonia s.l., however there has been no consensus among the researches. According to the traditional classification, the genus Vernonia s.l. comprises more than 1000 species and it is divided into sections and subsections (sensu Baker). In a recent classification, these species have been segregated into new genera, while the genus Vernonia sensu stricto was restricted to 22 species distributed mainly in North America (sensu Robinson). In this study, species belonging to the subtribes Vernoniinea, Lepidaploinae and Rolandrinae were analysed, employing UHPLC-UV(DAD)-MS(Orbitrap), followed by multivariate analyses. Data mining was performed using unsupervised (HCA and PCA) and supervised statistical analysis (OPLS-DA). The HCA showed segregation into four main groups. Comparing the HCA with the taxonomical classifications, we observed that the groups of the dendogram were in accordance with the genera created by Robinson. The species of the genera Stenocephalum, Stilpnopappus and Rolandra (Group 1) are more related with the species of the genus Vernonanthura (Group 2), while the genera Cyrtocymura, Chrysolaena and Echinocoryne (Group 3) are chemically more similar to the genera Lessingianthus and Lepidaploa (Group 4). These findings indicate that the subtribes Vernoniinae and Lepidaploinae are paraphyletic groups. Several metabolites were identified, highlighting chlorogenic acids, flavonoids and sesquiterpene lactones. ). According to OPLS-DA loading plot, it was possible to determine which variables are important for the discrimination among the groups. The species of the Group 1 were characterized by the absence of 3-O-caffeoylquinic acid and 3,5-di-O-caffeoylquinic acid. Group 2 was characterized by the absence of quercetin (flavonol with free OH) and by the presence of kaempherol 3-O-rutinoside. Group 3 was the only group that do not show the flavonoid 7,3?,5?-trihydroxy-4?- methoxy-3-O-glycosylflavone. The species of the Group 4, especially the species of the genus Lessingianthus, were characterized by the low prevalence of flavones. Therefore, untarget metabolomic approach associated with mutivariate analysis allowed the identification of potential chemotaxonomic markers, helping in the taxonomical classifications

A flavoenzima diidroorotato desidrogenase (DHODH) catalisa a quarta reação da via de novo de biossíntese de pirimidinas, se destacando como alvo molecular chave para parasitos causadores de Doenças Negligenciadas (DNs). Tendo em vista a demanda por novas alternativas terapêuticas para estas doenças, o objetivo deste trabalho foi a triagem in vitro de inibidores da enzima DHODH de Leishmania major (LmDHODH) em Asteraceae. Esta triagem foi acompanhada por abordagem metabolômica em UHPLC-ESI-HRFTMS para os extratos vegetais e estudos de QSAR (Quantitative Structure-Activity Relationships) para as substâncias isoladas. As etapas experimentais realizadas e os resultados obtidos foram: 1) Ensaios enzimáticos: os valores de IC50 foram determinados para 59 extratos (?IC50: 148,0 ?g.mL-1 a 9,4 mg.mL-1) e 57 substâncias isoladas (?IC50: 27,0 ?M a 2,6 mM). As substâncias mais ativas frente à LmDHODH apresentaram seletividade, ao exercer inibição irrelevante sobre DHODH humana. Adicionalmente, estudos de termoestabilidade confirmaram que as lactonas sesquiterpênicas (STLs) são, de fato, capazes de se ligar a esta enzima; 2) Estudos metabolômicos: as impressões digitais metabólicas por LC-MS foram obtidas com sucesso para os 59 extratos e o processamento dos dados forneceu 3.694 substâncias. A desreplicação por meio de uma biblioteca de padrões identificou com segurança 49 metabólitos secundários. Por meio da correlação in silico com os dados de inibição enzimática, foram determinados com êxito os principais biomarcadores dos extratos e obteve-se um modelo de regressão confiável para predição do potencial de inibição de novos extratos provindos de espécies ainda não testadas frente à LmDHODH, classificando-os como ativos ou inativos com base exclusivamente na sua impressão digital por UHPLC-ESI-HRFTMS; 3) Estudos de QSAR com 21 STLs: o modelo de QSAR baseado em descritores moleculares apresentou robustez e confiabilidade (R2 / Q2 / P2 > 0,6 e RMSE < 0,3), revelando que uma maior inibição desta enzima requer a distribuição balanceada das regiões hidrofóbicas através da superfície molecular, maior largura das moléculas e menor hidrofobicidade. O modelo 3D baseado em descritores farmacofóricos também foi útil (R2: 0,79; Q2: 0,55) e confirmou a importância da orientação adequada dos ligantes, propriedades superficiais e formato das moléculas, refletindo propriedades de um possível sítio de ligação para as STLs na enzima. Portanto, alguns dos produtos naturais testados nesta triagem in vitro são, de fato, capazes de inibir seletivamente a enzima LmDHODH, tratando-se de uma descoberta relevante, visto que uma infinidade de metabólitos secundários leishmanicidas já foram descritos, porém, para a maioria deles, o mecanismo de ação segue desconhecido. Os resultados evidenciaram (1) as espécies de Asteraceae como importante fonte na busca por novos inibidores desta enzima e (2) as substâncias mais ativas como ponto de partida para novas estruturas guias (lead compounds) visando novos fármacos antiparasitários para o tratamento de DNs, especialmente a leishmaniose. / The flavoenzyme dihydroorotate dehydrogenase (DHODH) catalyzes the fourth reaction of the de novo pyrimidine biosynthetic pathway, standing out as a key molecular target for trypanosomatid parasites causing Neglected Diseases (NDs). In view of the global demand for new therapies for such diseases, this study aimed for the in vitro screening of inhibitors of Leishmania major DHODH (LmDHODH) in Asteraceae, accompanied by metabolomic approach with UHPLC-ESI-HRFTMS for plant extracts and QSAR studies (Quantitative Structure-Activity Relationships) for isolated compounds. The experimental steps performed and the results obtained were: 1) Enzymatic assays: the IC50 values were determined for 59 plant extracts (?IC50: 148.0 ?g.mL-1 a 9.4 mg.mL-1) and 57 natural compounds (?IC50: 27.0 ?M a 2.6 mM). The most active compounds showed selectivity against LmDHODH by exercising irrelevant inhibition of human DHODH. In addition, thermostability studies have confirmed that sesquiterpene lactones (STLs) are indeed capable of binding to this enzyme; 2) Metabolomic studies: the metabolic fingerprints by LC-MS were successfully obtained for the 59 extracts and 3,694 peaks/compounds were provided after data processing. The dereplication using a library of natural compounds has safely identified 49 secondary metabolites. By means of in silico correlation with the enzymatic inhibition data, the main biomarkers of the extracts were successfully determined and a reliable regression model was obtained to predict the inhibition potential of new extracts from species not yet tested against LmDHODH, classifying it as active or inactive based solely on their fingerprint by UHPLC-ESI-HRFTMS; 3) QSAR studies with 21 STLs: a reliable QSAR model based on molecular descriptors was obtained (R2 / Q2 / P2 > 0.6 and RMSE < 0.3), which indicated that stronger inhibition requires a balanced distribution of the hydrophobic regions across the molecular surface, as well as higher width and lower hydrophobicity of the molecules. A pharmacophore-based 3D-QSAR approach also afforded a useful model (R2: 0.79; Q2: 0.55), which confirmed the importance of proper orientation of the ligands, molecular surface features and shape for stronger inhibition, reflecting properties of a putative common binding site. Thus, some of the natural products tested in this in vitro screening are actually capable of selectively inhibiting LmDHODH. This constitutes a relevant finding, since an infinity of leishmanicidal compounds have been described, however, for most of them, the mechanism of action remains unknown. The results highlighted (1) Asteraceae species as important sources of new LmDHODH inhibitors and (2) the most active metabolites as promising starting points for new led compounds aiming new antiparasitc drugs for treatment of NDs caused by trypanosomatids, especially leishmaniasis.

O nitrogênio é um dos elementos mais limitantes no desenvolvimento de plantas. Vernonia herbacea (Vell.) Rusby, Asteraceae do cerrado, possui órgãos subterrâneos (rizóforos) que armazenam frutanos do tipo inulina. Estudos anteriores mostraram que o tratamento com solução nutritiva contendo 1,3 mmol L-1 NO3 - (Nlimitado) promoveu o acúmulo de frutanos nos rizóforos em detrimento do aumento de biomassa aérea e que o inverso ocorreu com plantas que receberam 10,7 mmol L-1 NO3 - (N-suficiente). Entretanto, não foram obtidas informações quanto às atividades das enzimas, em plantas sob esses tratamentos. Considerando a importância de estudos de nutrição mineral para a adequação de tratamentos de fertilização visando à produtividade de plantas de interesse econômico e em vista do teor elevado de frutanos em V. hebacea, este projeto teve como objetivos analisar o efeito do nitrogênio no crescimento e na alocação da biomassa, bem como no conteúdo e na composição de frutanos, nas atividades das enzimas de síntese (SST e FFT) e degradação (FEH e INV) de frutanos nos rizóforos e na atividade da redutase do nitrato (RN) e conteúdo de nitrato em folhas de V.herbacea. No presente trabalho, plantas de V. herbacea tratadas com baixo teor de nitrogênio (2,5 mmolL-1 de nitrato) apresentaram atividades de síntese (SST e FFT) superiores às tratadas com teor mais elevado de nitrogênio (11,9 mmol L-1 de nitrato), enquanto o inverso, ou seja, atividade elevada de despolimerização (FEH) ocorreu nas plantas que receberam 11,9 mmol L-1 de nitrato. O conteúdo de frutanos foi maior em plantas sob condições limitantes de nitrogênio, coerente com a maior atividade de síntese encontrada nestas plantas. Entretanto, maiores biomassas aérea e subterrânea foram encontradas nas plantas que receberam 2,5 mmolL-1 NO3 -, não sendo possível afirmar que baixos níveis de nitrato limitaram o seu crescimento. Dessa forma, para melhor compreensão do efeito do nitrato no crescimento, na alocação de biomassa e no metabolismo de frutanos em V. herbacea, foi conduzido um novo experimento que teve como objetivos analisar o efeito de diferentes concentrações de nitrato (0, 2,5, 5, 10 e 15 mM de KNO3) nos mesmos parâmetros analisados no experimento anterior em rizóforos e folhas de V. herbacea. Assim foi possível concluir que plantas tratadas com 10 mM apresentaram melhor eficiência no acúmulo total de biomassa e de frutanos nos rizóforos. Neste experimento, também foi demonstrado que plantas de V. herbacea, além dos frutanos, acumulam quantidades elevadas de nitrato nos rizóforos, mas assimilam preferencialmente esse mineral nas folhas. Uma vez que as plantas apresentaram maior massa seca aérea e subterrânea quando receberam soluções nutritivas enriquecidas com 10 mM de nitrato, foi realizado outro experimento para verificar a melhor fonte de nitrogênio no cultivo dessa espécie. As plantas foram submetidas ao cultivo com nitrato (KNO3), amônio ((NH4)2SO4) e a mistura de nitrato e amônio(NH4NO3), ambas na concentração de 10 mM, sendo possível verificar que esta espécie não apresentou preferência pela fonte nitrogenada, e sugerindo que o cultivo pode ser realizado em qualquer uma das fontes nitrogenadas estudadas. / Nitrogen is the most limiting element to plant development. Vernonia herbacea (Vell.) Rusby, Asteracea from the cerrado, bears underground organs (rhizophores) which accumulate inulin-type fructans. Previous studies showed that nutrient solution containing 1.3 mmol L-1 NO3 - (N-Limited treatment) promoted fructan accumulation in rhizophores and decrease of aerial biomass, while the opposite occurred in plants treated with nutrient solution containing 10.7 mmol L-1 NO3 - (N-sufficient treatment). However, as the activities of fructan metabolizing enzymes were not measured in these plants, new experiments were designed with this purpose. Thus, considering the importance of studies on mineral nutrition for the adjustment of the fertilization treatment, aiming at high contents of fructan and increase in plant productivity, the aim of this project was to analyse the effect of nitrogen on growth and biomass allocation, on fructan content and composition, on the activity of enzymes involved in fructan metabolism (SST, FFT, FEH and INV) in rhizophores, as well as on the activity of nitrate reductase (NR) and nitrogen content in leaves and rhizophores of V. herbacea. In the present work, plants treated with a low nitrogen concentration (2.5 mmol L-1 NO3 -) presented higher fructan biossynthetic activities than those treated with higher nitrogen concentration (11.9 mmol L-1 NO3 -). Oppositely, a higher mobilization activity occurred under high nitrogen concentration. Fructan content was higher in plants under low nitrogen concentration, in accordance with the higher biosynthetic activity in this treatment. However, higher aerial and underground biomass were detected in the 2.5 mmol L-1 NO3 - plants, indicating that growth was not limited under low levels of nitrate. Therefore, in order to improve the understanding of the effect of nitrate on growth, biomass allocation and fructan metabolism in V. herbacea, a new experiment was performed in which different concentrations of nitrate concentration (0, 2.5, 5.0, 10.0, 15.0 mM) were supplied in the same conditions mentioned above. The results showed that 10 mM nitrate was the most efficient concentration for total plant biomass and fructan accumulation in the rhizophore. It was also shown that, besides fructan, nitrate is accumulated in the rhizophores, but is preferably assimilated in leaves, where RN activity is higher. Considering results obtained with 10 mM nitrate, a third experiment was done in order to compare the effect of different nitrogen sources on growth of V. herbacea. The plants were treated with nutrient solutions containing ammoniun ((NH4)2SO4), nitrate(KNO3) and a mixture of nitrate and ammoniun (NH4NO3), both at a final concentration of 10 mM. No preference for the nitrogen source was observed when growth parameters were analysed. Therefore, the results suggest that plants of V. herbacea can be cultivated under any of the nitrogen sources used in this study.

Vernonia herbacea, Asteraceae, possui órgãos subterrâneos de reserva ramificados, os rizóforos, que acumulam frutanos do tipo inulina como carboidratos de reserva. Os frutanos são polímeros de frutose que são sintetizados pelas enzimas SST (sacarose: sacarose frutosiltransferase) e FFT (frutano:frutano frutosiltransferase) e despolimerizados pela FEH (frutano exohidrolase). Plantas desta espécie entram em dormência no final do outono, quando perdem os ramos aéreos e rebrotam na primavera seguinte; subseqüentemente ocorre a floração e o crescimento vegetativo no verão; ocorrem variações no teor e na composição dos frutanos durante o ciclo fenológico das plantas. O rizóforo apresenta crescimento geotrópico positivo, cujo ápice apresenta tecidos mais jovens em crescimento e a rebrota dos novos órgãos aéreos se dá pelo desenvolvimento das gemas situadas na região proximal do rizóforo, localizada próximo à superfície do solo. Considerando estas variações este trabalho visou à análise da distribuição espacial das atividades da SST, FFT, Invertase e FEH, bem do teor e composição dos frutanos nas regiões proximal, mediana e distal dos rizóforos de plantas de Vernonia herbacea, em diferentes fases de desenvolvimento e em plantas induzidas à brotação pela remoção dos órgãos aéreos. Também foram analisados esses parâmetros em plantas na fase vegetativa com os órgãos aéreos intactos ou excisados, mantidas em condições ambientais naturais ou em baixa temperatura. De maneira geral, as enzimas SST e FFT apresentaram atividades mais elevadas em plantas na fase vegetativa, enquanto a FEH apresentou atividade mais elevada em plantas na fase de brotação natural ou induzida e nos tratamentos sob baixa temperatura. Com relação à distribuição espacial das atividades enzimáticas, a SST e FFT apresentaram atividade mais elevada na região distal, que diminuiu no sentido proximal dos rizóforos. A FEH por sua vez apresentou atividade mais elevada na região proximal, diminuindo no sentido distal. Em geral, o conteúdo de fruto-oligossacarídeos foi mais elevado na região distal e diminuiu em direção à região proximal dos rizóforos. Os tratamentos com baixa temperatura levaram a uma maior proporção de frutooligossacarídeos, enquanto nas plantas induzidas à brotação, a proporção de fruto-polissacarídeos foi superior. Os menores valores de grau de polimerização médio (GP) das cadeias de frutanos foram detectados na região distal, sugerindo que as cadeias de frutanos nesses tecidos não apresentam o GP característico da espécie. Valores elevados de GP foram detectados na região proximal, e valores mais elevados ainda, em plantas na fase de brotação e sob baixa temperatura, coincidindo com atividades mais elevadas de FEH. Estes resultados sugerem que o mecanismo de ação da FEH em V. herbacea seja do tipo "single chain", pelo qual uma molécula da enzima se liga à cadeia de frutano degradando-a até a molécula de sacarose. Os experimentos realizados possibilitaram algumas deduções a respeito do mecanismo de ação das enzimas envolvidas no metabolismo de frutanos, e um maior conhecimento sobre a dinâmica de variação temporal e espacial destes carboidratos, em diferentes fases de desenvolvimento das plantas e em condições adversas ao desenvolvimento vegetal. / Vernonia herbacea, Asteraceae, bears branched underground reserve organs, rhizophores, that accumulate inulin-type fructans as reserve carbohydrates. Fructans are fructose polymers, that are synthesized by SST (sucrose: sucrose fructosyltransferase) and FFT (fructan:fructan frutosyltransferase) and mobilized by FEH (fructan exohydrolase). Plants of this species enter dormancy at the end of autumn, with senescence and abscission of the aerial organs and sprout in the following spring; flowering occurs subsequently followed by a period of vegetative growth in the summer. The concentration and composition of fructans vary during the phenological cycle of the plants. Considering this variation in fructans, and the positive geotropic growth of the rhizophores, with the apex presenting younger tissues (distal region) and the resprouting of the new aerial organs occurring in the opposite end of the organ (proximal region), close to the soil surface, the aim of this work was to analyze the spatial distribution of fructans and fructan metabolizing enzymes in the different regions of the rhizophores (distal, median and proximal) in plants of Vernonia herbacea in different developmental phases and plants induced to sprouting by the excision of the aerial organs. These parameters were also analyzed in intact plants in the vegetative phase and in excised plants, kept in natural environmental conditions or in low temperature. In general SST and FFT presented higher activities in plants in the vegetative phase, while FEH presented higher activity during sprouting, either under natural or induced sprouting and in plants under low temperature. Concerning the spatial distribution of the enzyme activities, SST and FFT presented higher activity in the distal region, decreasing towards the proximal region of the rhizophores. The FEH, on the other hand, presented higher activity in the proximal region, decreasing towards the distal region. In general, the content of fructo-oligosaccharides in the phenological phases studied was higher in the distal region and decreased towards the proximal region of the rhizophores. Low temperature led to a higher proportion of fructo-oligosaccharides, while in plants induced to sprouting the proportion of fructo-polysaccharides was higher. The lower values of average degree of polymerization (DP) of fructans chains were detected in the distal region. This indicates that fructan chain length in younger tissues is shorter then that characteristic of the species. Higher values of mean DP were detected in the proximal region and even higher DP was detected in this region in sprouting plants and in plants under low temperature, coinciding with the higher FEH activity detected in these conditions. These results suggest a mechanism of action for the FEH in V. herbacea of the "single chain" type, in which a molecule of the enzyme binds to the fructan chain degrading it completely before binding to the next fructan molecule. These studies allowed us to draw several conclusions regarding the mechanism of action of enzymes involved in the metabolism of fructans in Vernonia herbacea and regarding the dynamics of distribution of these carbohydrates and the related enzymes in different phases of development and in adverse conditions for plant development.

É apresentada aqui a revisão taxonômica das espécies de Viguiera Kunth que ocorrem no Brasil, com inclusão de descrições, ilustrações, mapas de distribuição e comentários. Também são providas chaves de identificação para grupos relacionados e para as espécies sul-americanas. O estudo da anatomia foliar forneceu novos subsídios para a delimitação de espécies ou grupo de espécies. As análises polínicas também apresentam informações parciais úteis à taxonomia. Foi elaborada uma investigação sobre Viguiera sensu lato, através de três análises envolvendo diferentes números de táxons terminais, com uso de dados morfológicos; a primeira visou o esclarecimento da real posição taxonômica de seus representantes e as duas últimas pleitearam uma melhor delimitação dos grupos de espécies no continente. A análise dos padrões de distribuição geográfica possibilitou a delimitação de dois grupos com características morfológicas distintas, além de um intermediário; o primeiro exclusivo da região dos Andes, o segundo extra-andino e o terceiro andino com pequenas intrusões em outras localidades. Os resultados também corroboram a hipótese de outros autores, de que a origem do gênero é recente no Brasil. Em relação às condições edáficas, existem dois grupos de espécies no Brasil; o primeiro encontrado em regiões com clima do tipo Cwa e o segundo no clima do tipo Aw, da classificação de Köpen; apenas 4 espécies ocorrem em clima Cfa, mas não são exclusivamente brasileiras. Não houve respaldo para a transferência das espécies sul-americanas para o gênero Rhysolepis. / This study presents a taxonomic review of the species Viguiera Kunth that occur in Brazil, and includes descriptions, illustrations, distribution maps and comments. Identification keys are also provided for related groups and to the South American species. The leaf anatomy study supplied new subsidies for the delimitation of the species or of species groups. The pollinic analysis either presents useful partial information in taxonomy. An investigation was elaborated on Viguiera sensu lato, through three analyses, involving different numbers of terminal taxa and using morphological data; the first one tried to explain the real taxonomic position of its representative members and the last two sought for a better delimitation of the groups of species in the Continent. The analysis of the patterns of geographic distribution made possible the delimitation of two groups with different morphological characteristics, and a intermediate one; the first group is exclusive from Andean region, the second not happens in the Andes, and the third do not occur in the Andes, with a few intrusions in other localities. The results also corroborate others author\'s hypothesis, that the origin of the genus is recent in Brazil. In relation of the edaphic conditions, there are two groups of species in Brazil: the first one is found in regions with climate of the type Cwa and the second in the climate of the type Aw, of the Köpen classification; only 4 species happen in climate Cfa, but they are not exclusively Brazilian. There was no support for the transfer of the South American species to the genus Rhysolepis.

Muitas substâncias das espécies de Lychnophorinae (Asteraceae) são relatadas como inibidoras da síntese de mediadores da cascata do processo inflamatório. Nesse processo, duas enzimas são essenciais e atuam no metabolismo do ácido araquidônico, formado em processos inflamatórios: ciclooxigenase (COX) e lipoxigenase (LOX). A análise de impressões digitais metabólicas é um método capaz de fornecer informações sobre o objeto de estudo através da utilização de ferramentas estatísticas, além de possibilitar a correlação desses dados com outros utilizando métodos in silico. O objetivo deste estudo foi analisar 26 espécies da subtribo Lychnophorinae quanto à atividade inibitória in vitro das vias COX- e LOX-dependentes e identificar as substâncias responsáveis por essa atividade através de análises in silico de correlação entre bioatividade e impressão digital metabólica. As impressões digitais metabólicas dos extratos hidrometanólicos das espécies de Lychnophorinae foram obtidas utilizando UHPLC-UV-(DAD)-MS (OrbitrapTM). Os ensaios de triagem de inibição das vias COX-1 e 5-LOX-dependentes revelaram que 20 espécies possuem atividade inibitória dupla para ambas as vias com valores de IC50 menores que 100 ?g.mL-1. Dentre essas, 11 espécies apresentaram valores de IC50 menores que 40 ?g.mL-1, e cinco apresentaram valores de IC50 menores que 10 ?g.mL-1. Utilizando-se as impressões digitais metabólicas e os resultados de inibição enzimática foram realizadas análises estatísticas multivariadas supervisionadas e não supervisionadas (PCA, PLS e OPLS) visando à identificação de substâncias discriminantes (ativas). Através das análises de correlação, obtiveram-se as prováveis substâncias que detém o potencial inibitório. As cinco substâncias com maior potencial discriminante foram identificadas por técnicas de desreplicação e são: a lactona sesquiterpênica (4,5-diidro-15-desoxigoyazensolido), dois flavonóides glicosilados (3-O-(acetil-hexosídeo)-quercetina e 7-O-(cumaroil-hexosídeo)-apigenina), e um hidroxinerolidol. Assim, este estudo revelou o ótimo potencial inibidor das enzimas COX-1 e 5-LOX dos extratos hidrometanólicos das espécies de Lychnophorinae. Além disso, indicou as substâncias mais discriminantes responsáveis por essa atividade, sendo as substâncias acima mencionadas as propostas como as principais responsáveis pela atividade inibidora das enzimas COX e LOX / Several compounds from Lychnophorinae species (Asteraceae) are reported as inhibitors of cascade mediators that elicits the inflammatory process. During this process, two enzymes are essential in the metabolism of the arachidonic acid: cyclooxygenase (COX) and lipoxygenase (LOX). The analysis of metabolic fingerprinting is a method that provides information about the object of study by using statistical tools, and enables the correlation of these data with others using in silico methods. This work therefore aimed to analyze 26 species of the Lychnophorinae subtribe for in vitro inhibition of COX-1 and 5-LOX and (to) identify the bioactive compounds responsible for this activity by in silico correlation analysis between bioactivity and metabolic fingerprint. The metabolomic analysis was carried out using UHPLC-DAD-ESI-Orbitrap and a metabolic fingerprint for each extract was obtained. The in vitro inhibition screening assays of COX-1 and 5-LOX revealed that 20 extracts presented dual inhibitory activity on both enzymes with IC50 values lower than 100 ?g.mL-1. Among them, 11 species showed IC50 values lower than 40 ?g.mL-1 and five lower than 10 ?g.mL-1. In order to identify discriminant substances (active), supervised and non-supervised multivariate statistical analysis (PCA, PLS e OPLS) were performed using the metabolic fingerprints and the results of enzyme inhibition. Through correlation analysis, it was possible to locate the substances most likely to be responsible for the pharmacological activity in both enzymes simultaneously; among them, five were chosen as the most likely. The substances were identified by dereplication as: a sesquiterpene lactone (4,5-dihydro-15-desoxygoyazensolide), two flavonoids (3-O-(acetil-hexoside)-quercetin and 7-O-(cumaroil-hexoside)-apigenine), and a hidroxynerolidol. In summary, in this work it was possible to reveal crude extracts with outstanding inhibitory potential of both, COX-1 and 5-LOX, enzymes as well as to propose the most probable compounds responsible for this action, and the compounds mentioned above were proposed as the main responsible for the inhibitory activity.

A química de produtos naturais sempre foi uma fonte importante de novas substâncias e de substâncias bioativas. No mundo moderno, o homem utiliza os produtos naturais para diversos fins: corantes, edulcorantes, essências, defensivos agrícolas e principalmente medicamentos. Com o desenvolvimento das técnicas de isolamento de substâncias, cresceu a necessidade de organizar as informações obtidas e também a criação de meios para a identificação mais rápida das substâncias isoladas. Esta foi uma das necessidades que fez surgir a Quimioinformática. Quimioinformática é uma disciplina que utiliza os métodos da informática para organizar dados químicos, analisar estes dados e gerar novas informações a partir destes dados. Esta ferramenta tem sido utilizada com sucesso em procura por novas drogas (QSAR/QSPR), elucidação estrutural automatizada de substâncias orgânicas e em cálculos e previsão de propriedades físico-químicas de diversas moléculas. Os objetivos do presente trabalho foram o estudo fitoquímico de espécies dos gêneros Dimerostemma e Ichthyothere com o intuito de isolar novas substâncias e o desenvolvimento de técnicas envolvendo quimioinformática com o intuito de auxiliar a elucidação estrutural de produtos naturais. Realizou-se a técnica de microamstragem de tricomas glandulares de diversas espécies pertencentes a gêneros da tribo Heliantheae (Viguiera, Tithonia, Dimerostemma). Através da microamostragem foi possível identificar diversas substâncias presentes nos tricomas glandulares das espécies analisadas. Das duas espécies de Dimerostemma investigadas (D. brasilianum e D. rotundifolium) foi possível identificar dois germacrolidos e dois eudesmanolidos, enquanto que de Ichthyothere terminalis foi possível a identificação de dois melampolidos, todos eles lactonas sesquiterpênicas. Foram treinadas redes neurais artificiais para a realização da identificação dos esqueletos carbônicos de determinadas substâncias a partir dos dados obtidos através dos espectros de RMN 13C, sendo que os resultados obtidos podem ser considerados satisfatórios. Foi desenvolvido um software para efetuar a identificação automática de substâncias através da comparação com uma biblioteca de padrões que possui dados cromatográficos de 51 lactonas sesquiterpênicas. Esse software, chamado de NAPROSYS, também é capaz de fazer comparação de dados de RMN de amostra com dados de RMN presentes em uma biblioteca de dados, tornando possível a identificação imediata de substâncias presentes na biblioteca e também auxiliar a elucidação estrutural de substâncias que não estão nela presentes. Para testar a eficiência do NAPROSYS, o programa foi utilizado com sucesso para identificar LSTs através da microamostragem de tricomas glandulares. A eficiência do NAPROSYS em identificar dados de RMN de substâncias presentes na biblioteca foi testada com substâncias isoladas do gênero Tithonia e Viguiera que possuem substâncias bem descritas na literatura e já isoladas no nosso laboratório, sendo que os resultados apresentados foram excelentes. Criou-se também dois modelos de redes neurais para prever tempos de retenção de lactonas sesquiterpênicas em cromatografia líquida (QSRR) com o objetivo de melhorar o desempenho do NAPROSYS em análises de dados cromatográficos. Os resultados para este caso, embora coerentes, precisam ser melhorados. Neste trabalho concluimos que o uso das técnicas clássicas juntamente com as novas técnicas de Quimoinformática pode se tornar uma ferramenta muito eficaz para a elucidação estrutural e busca de substâncias com determinadas propriedades químicas ou mesmo na bioprospecção de novas substâncias bioativas. / Natural products chemistry has always been an important source for new andbioactive compounds. In modern world, mankind uses natural products to do many tasks: colouring, as essences, as agricultural defensives and many as medicines. Within the development of compound isolation techniques, the need for information organisation has grown. The need for quickly identification of isolated compounds has also grown. This was one of the necessities that made Chemoinformatics emerge. Chemoinformatics is a discipline that uses informatics as a tool to organise, analise and to generate new knowledge from chemical data. This tool has been used with success in automate structure elucidation, drug development (QSAR/QSPR) and to predict chemical-physical data of many molecules. The aims of the present work were the phytochemical study of species of the genera Dimerostemma and Ichthyothere to isolate new compounds, and the development of chemoinformatics techniques to aid natural products structure elucidation. The glandular trichome microsampling was made for diverse species of genera from the tribe Heliantheae (Viguiera, Tithonia, Dimerostemma). Many compounds were identified through glandular trichome microsampling. Two germacrolides and two eudesmanolides were identified from Dimerostemma species (D. brasilianum and D. episcopale), while from Ichthyothere terminalis two melampolides were identified, all of them being sesquiterpene lactones. Artificial Neural Networks were trained to make skeleton identification from data obtained from 13C NMR and the obtained results can be considered satisfactory. A software was developed to make automatic compound identification through the comparation with a compound library that possesses data from 51 STLs. This software is called NAPROSYS is also able to compare the NMR data of the sample with the NMR data stored into a compound library, making the imediate identification of compounds present into library possible and also help the structure elucidation of unknown compounds. To test NAPROSYS\' efficience to identify NMR data of compunds sored into the library was made with compounds isolated from species of Tithonia and Viguiera genera, because these genera has well describe compounds in the literature and that has been isolated in our laboratory, and the obtained results are excellent. Two Artificial Neural Network models were created to predict the retention time of sesquiterpene lactones in liquid cromatography (QSRR) with the aim of improve NAPROSYS performance in cromatographic data analysis. The results for this case, although coherent, can be improved. The conclusion of this work is that the use of classical techniques with the new techniques of chemoinformatics can be a very efficient tool to make structure elucidation, search for compounds with certain chemical properties and even the search for new bioactive compounds.

A metabolômica vem se tornando uma abordagem eficaz para a avaliação abrangente de plantas medicinais, classificação de matérias-primas, além de estudos quimiotaxonômicos. Este trabalho demonstra a aplicabilidade da metabolômica, utilizando a subfamília Barnadesioideae (Asteraceae) como modelo de estudo, na avaliação da qualidade e classificação de espécies medicinais (espécies de Chuquiraga) e no estudo quimiotaxonômico dos principais gêneros de Barnadesioideae (Arnaldoa, Barnadesia, Chuquiraga, Dasyphyllum, Fulcaldea e Schlechtendalia). Em primeiro lugar, a análise dos perfis metabólicos por LC-MS dos membros de Barnadesioideae demonstrou que esta subfamília constitui um grupo quimicamente não explorado com uma diversidade complexa de substancias fenólicas, fenilpropanoides, alquilglicósidos e glicosídeos triterpenoides. As relações intergenéricas dentro da subfamília Barnadesioideae, baseadas na comparação dos seus perfis metabólicos por análises estatísticas multivariadas, mostraram semelhanças com as relações intergenéricas propostas pelo mais recente estudo filogenético com base em marcadores morfológicos e moleculares. Em segundo lugar, a aquisição dos perfis metabólicos de espécies de Chuquiraga (C. jussieui, C. spinosa e C. weberbaueri) por analises de LC-MS, levaram à identificação de uma variedade significativa de compostos fenólicos, fenilpropanoides, alquilglicosídeos e glicosídeos triterpenoides, assim como o estabelecimento de modelos de classificação geográfica e de espécies, além da identificação de metabólitos discriminantes por meio de análises estatísticas multivariadas exploratórias e supervisionadas. Terceiro, uma abordagem clássica foi realizada através da aquisição dos perfis cromatográficos por HPLC de espécies de Chuquiraga para o perfilhamento de compostos fenólicos e a classificação das espécies por meio de análises estatísticas multivariadas exploratórias e supervisionadas. Logo, os resultados revelam a metabolômica como uma valiosa ferramenta auxiliar no controle de qualidade e classificação de plantas medicinais, bem como em estudos de quimiotaxonômia / Metabolomics is emerging as an effective approach for the comprehensive evaluation of medicinal plants, classification of raw material, as well as chemotaxonomic studies. This work demonstrates the applicability of metabolomics, using the subfamily Barnadesioideae (Asteraceae) as a study model, for quality assessment and classification purposes of medicinal species (Chuquiraga genus) and a chemotaxonomy study of six Barnadesioideae genera (Arnaldoa, Barnadesia, Chuquiraga, Dasyphyllum, Fulcaldea and Schlechtendalia). First, the LC-MS metabolic profiles of Barnadesioideae demonstrated that this subfamily constitutes a chemically underinvestigated taxa with a complex diversity of phenolic compounds, phenylpropanoid derivatives, alkyl glycosides, and triterpenoid glycosides. The intergeneric relationships within Barnadesioideae genera, based on the comparison of their LC-MS metabolic profiles by exploratory and supervised analyses, displayed similarities to those of the intergeneric relationships obtained by the most recent phylogenetic study based on morphological and molecular markers. Second, the LC-MS metabolic profiles of three Chuquiraga species (C. jussieui, C. spinosa and C. weberbaueri) lead to the identification of a significant variety of phenolic compounds, phenylpropanoid derivatives, alkyl glycosides, and triterpenoid glycosides, as well as the establishment of prediction models for geographical origin and species classification, as well as the identification of discriminating metabolites by exploratory and supervised multivariate statistical analysis. Third, a classical approach was carried out by acquiring HPLC chromatographic profiles of three Chuquiraga species (C. jussieui, C. spinosa and C. weberbaueri) for profiling phenolic compounds and comparison by exploratory and supervised multivariate statistical analysis. Therefore, our results support metabolomics as a valuable tool in the quality control and classification of medicinal plants as well as in chemotaxonomy studies.

Orientadores: Angelo Pires do Prado, Thomas Michael Lewinsohn / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-09-11T21:19:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Braun_MarinaReiter_D.pdf: 4685052 bytes, checksum: 6fca81032502f6931c9f8333e10b544b (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: Na presente tese foram descritas dez novas espécies de Agromyzidae endófagos de capítulos de Asteraceae. Essas espécies estão distribuídas nas duas subfamílias representadas nos gêneros Melanagromyza, Ophyomyia (Agromyzinae), Calycomyza e Liriomyza (Phytomyzinae). No gênero Melanagromyza, segundo maior da família, foram descritas sete novas espécies. Pela primeira vez foi encontrada nos gêneros Calycomyza, Liriomyza e Ophyomyia a herbivoria de capítulos de asteráceas. Além de aumentar o conhecimento sobre a diversidade do grupo, outra contribuição desta tese é a avaliação da especialização alimentar do grupo, que mantém o padrão da família com uma baixa proporção de generalistas. A partir dos dados de interação desses endófagos construímos uma rede de interações entre quinze espécies de Melanagromyza e suas plantas hospedeiras com o objetivo de avaliar sua estrutura de interações. Esta rede foi testada para investigar a existência de aninhamento e compartimentalização dessas interações. Outras questões investigadas foram a relação entre afinidade morfológica dos herbívoros e sua utilização de recursos, além do parentesco das plantas hospedeiras utilizadas pelas espécies de herbívoros. A estrutura de interações dessa rede possui um padrão bastante compartimentalizado, o que era esperado em interações de herbivoria entre insetos que apresentam alta especialização alimentar. Quanto aos efeitos do parentesco na estruturação da rede de interações, verificamos resultados diferentes para os insetos e as plantas. A classificação das espécies de Melanagromyza conforme sua morfologia genital não teve relação com o grupamento dos herbívoros análise de agrupamento bidirecional. Por outro lado, para as plantas, observamos grande concordância entre a classificação taxonômica das espécies e os grupos formados a partir da análise de agrupamento bidirecional / Abstract: This study describes ten new species of endophagous Agromyzidae of Asteraceae flower-heads. Those species belong to genera of the two subfamilies, respectively Melanagromyza, Ophyomyia (Agromyzinae), Calycomyza and Liriomyza (Phytomyzinae). In Melanagromyza, the second largest genus in the family, seven new species were described. Herbivory of Asteraceae flower-heads was recorded for the first time in Calycomyza, Liriomyza and Ophyomyia. Besides increasing the knowledge of agromyzid diversity, this study contributes to the evaluation of host range patterns in the family, which confirms that most agromyzids are specialized on a plant genus or tribe, with a small percentage of generalistic species. From the feeding records between endophages and their host plants we built an interaction matrix, in order to evaluate their interaction structure. The network shows both a nested and a compartmented pattern, suggesting a compound structure. The structure of the analyzed network has both a nested and a compartmented pattern. Compartmentation is expected for interactions between herbivore insects with such specialized feeding habits. In addition, other issues were investigated in this study: Do morphologically similar herbivore species use the same plants? Are plants used by the same herbivore species phylogenetically related? Regarding the family relationship based on the interactions structure, we found divergent results for insects and for plants. The categorization of Melanagromyza species based on their male genital morphology showed no relation with the herbivore groups based on their host use in a bidirectional cluster analysis. On the other hand, plants showed strong agreement between the taxonomic affinities of the species and the groups based on their shared herbivores in the bidirectional analysis / Doutorado / Ecologia / Doutor em Ecologia