Submitted by Setor de Tratamento da Informa??o - BC/PUCRS (tede2@pucrs.br) on 2016-10-24T15:48:35Z No. of bitstreams: 1 DIS_CALINO_FERREIRA_PACHECO_NETO_COMPLETO.pdf: 463906 bytes, checksum: b8097cd7556014c152e145a0681d517a (MD5) / Made available in DSpace on 2016-10-24T15:48:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DIS_CALINO_FERREIRA_PACHECO_NETO_COMPLETO.pdf: 463906 bytes, checksum: b8097cd7556014c152e145a0681d517a (MD5) Previous issue date: 2014-03-31 / Rhizoctonia solani is a pathogenic ubiquitous fungus in Solanum tuberosum cultures, causing severe losses in production. Plant resistance can be induced by molecules that promote natural plant defense system. In the present study, the efficiency of the inducers Acibenzolar-Smethyl (BION?), Ceratocystis fimbriata extract and Xanthomonas axonopodis extract against the pathogenic fungus Rhizoctonia solani in potato plants was evaluated. Plants treated with the inducer XTH were resistant to the pathogen at 21 dpi. The biotic inducer XTH was more efficient than Bion? and CTS on promoting plant resistance. The highest activity of POX was observed at 9 dpi on the XTH treatment. Inoculation of R. solani caused a progressive increase in the PPO activity in XTH- and control-plants. Both inducers CTS and Bion? caused a reduction on PPO activity over time. Levels of phenolics compounds and flavonoids were similar among all treatments. Plants were more susceptible to R. solani when induced with CTS or Bion?. XTH did not show a negative effect on plant resistance. XTH presented a good potential as inducer, delaying disease progression and promoting plant resistance against R. solani. / Apesar da batata ser um dos alimentos mais consumidos do mundo, a sua produ??o apresenta s?rias dificuldades devido a doen?as causadas por fungos, bact?rias e v?rus, reduzindo a produtividade e aumentando os custos de produ??o. Assim, este trabalho teve por objetivo analisar os mecanismos envolvidos na defesa cruzada de Solanum tuberosum cv. ?gata, atrav?s a a??o de indutores bi?ticos no metabolismo de fenilpropan?ides. Plantas jovens de S. tuberosum mantidas em casa de vegeta??o foram aspergidas com indutores de defesa: extratos autoclavados de Xanthomonas axonopodis e de Ceratocystis fimbriata, al?m do indutor sint?tico Bion?. Ap?s cinco dias do tratamento, as plantas foram desafiadas com o fungo patog?nico Rhizoctonia solani, sendo analisados o progresso da doen?a e os par?metros bioqu?micos: compostos fen?licos totais, flavon?ides quercet?nicos e atividade das enzimas polifenoloxidase e peroxidases. As plantas tratadas com o indutor XTH foram resistentes ao pat?geno at? 21 dpi. O indutor bi?tico XTH foi mais eficiente que o Bion? e CTS na promo??o da resist?ncia vegetal. A atividade mais elevada da POX foi observada em 9 dpi com o tratamento XTH. A inocula??o de R. solani causou o aumento progressivo da atividade da PPO nas plantas dos tratamentos XTH e controle. Os indutores CTS e Bion? causaram a diminui??o da atividade de PPO ao longo do experimento. Os n?veis dos compostos fen?licos e dos flavonoides foram similares entre todos os tratamentos. As plantas foram mais suscet?veis ao pat?geno R. solani quando aspergidas previamente com CTS ou Bion?. O XTH apresenta um bom potencial de utiliza??o como indutor de resist?ncia, retardando o progresso da doen?a e promovendo a resist?ncia contra R. solani.

Submitted by Setor de Tratamento da Informa??o - BC/PUCRS (tede2@pucrs.br) on 2016-12-06T16:15:51Z No. of bitstreams: 1 DIS_BRUNO_SILVEIRA_ADAMI_COMPLETO.pdf: 3612629 bytes, checksum: 63b867a36eb597783caf8d145a728bfe (MD5) / Made available in DSpace on 2016-12-06T16:15:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DIS_BRUNO_SILVEIRA_ADAMI_COMPLETO.pdf: 3612629 bytes, checksum: 63b867a36eb597783caf8d145a728bfe (MD5) Previous issue date: 2016-02-29 / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior - CAPES / The number on the citations of resveratrol has been increased over the last decade. This increase is directly related to the versatility of compound, commonly known by the benefits of wine. Contiguous to resveratrol, another growing issue in the scientific community is the microbiota and its possible modulation by compounds with prebiotic action. It is well know that resveratrol does not have a consolidated mechanism of action, and large amounts of the compound are retained in the gastrointestinal tract, we analyze the influence of resveratrol ingestion and their metabolite in populations of specific bacteria. For the induction of intestinal dysbiosis, we used experimental model of type 1 diabetes in rats. The treatment with resveratrol was performed during thirty days with daily doses of 5, 10 and 20 mg.kg-1. The quantification of the metabolite and resveratrol was accomplished through UPLC-MS/MS (Ultra-Performance Liquid Chromatography-Electrospray Tandem Mass Spectrometry). Quantification of A. muciniphila, Bacteroidetes and Prevotella was carried out by qPCR (Polymerase Chain Reaction). The study demonstrated increased population of A. muciniphila, Bacteroidetes and Prevotella in both normal and diabetic rats trated with resveratrol. This increase presented nonlinear response. The metabolite production was dose-dependent, however, a significant increase was observed in healthy animals compared to diabetic rats. We also observed significantIt is also observed correlation between different bacteria and resveratrol metabolite in healthy and diabetic animals. In conclusion, our study show that treatment with resveratrol promote changes in the microbiota. Data also reveled an increase in bacterial populations very important for intestinal health, such as: A. muciniphila, Bacteroidetes in healthy and diabetic Wistar rats in nonlinear manner. / Os estudos sobre resveratrol t?m aumentado de forma not?vel nos ?ltimos anos. Este aumento est? diretamente relacionado com a versatilidade do composto, popularmente conhecido em decorr?ncia aos benef?cios do vinho. Contiguo ao resveratrol, outro assunto crescente na comunidade cient?fica ? a microbiota e sua poss?vel modula??o atrav?s de compostos com a??o prebi?tica. Sabendo-se que o resveratrol ainda n?o tem um mecanismo de a??o consolidado e, que grande quantidade do composto fica retida no trato gastrointestinal. O presente trabalho avaliou a influ?ncia da ingest?o de resveratrol e, seu metab?lito, dihidroresveratrol, em popula??es bact?rianas especificas. Para a indu??o da disbiose intestinal, foi utilizado um modelo experimental de diabetes tipo 1 em ratos. O tratamento com resveratrol foi realizado durante trinta dias, com doses di?rias de 5, 10 e 20 mg.kg-1. A quantifica??o dos metab?litos de resveratrol foi realizada atrav?s de UPLC-MS / MS (Ultra-Performance Liquid Chromatography-lectrospray Tandem Mass Spectrometry). A quantifica??o da A. muciniphila, Bacteroidetes e Prevotella ocorreu atrav?s de qPCR (Reaction Polimerase Chain). O estudo demonstrou aumento na popula??o de A. muciniphila, Bacteroidetes e Prevotella tanto em ratos normais, quanto em animais diab?ticos trados com resveratrol. Este aumento demonstrou uma resposta n?o linear. O metab?lito apresentou uma produ??o dependente da dose, no entanto, foi observado um aumento significativo nos animais saud?veis em rela??o aos ratos diab?ticos. Observaram-se tamb?m diferentes correla??es entre as Bact?rias e o metabolito do resveratrol em animais saud?veis e diab?ticos. Em suma, o presente estudo demonstra que o tratamento com resveratrol promove altera??es na microbiota. Foi observado aumento de popula??es bacterianas importantes para a sa?de intestinal, como: A. muciniphila, Bacteroidetes, em ratos Wistar saud?veis e diab?ticos, de maneira n?o linear.

Made available in DSpace on 2015-04-14T14:51:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 449081.pdf: 619736 bytes, checksum: f49f3ff20314e610e563f984cfead299 (MD5) Previous issue date: 2013-04-30 / Salmonella Enteritidis is the most prevalent serotype isolated in Brazil, mainly associated with poultry products, which have been primarily involved in foodborne disease outbreaks. The high prevalence of reduced susceptibility to antimicrobial agents in various Salmonella serotypes isolated from samples related to livestock animal, animal foods and human has been reported worldwide. Therefore, has increased the interest in investigating the genetic mechanisms involved in resistance to antimicrobial agents, especially genetic elements capable of carrying resistance genes cassettes, which could be the origin of multi-resistant strains. Besides the genetically determined antimicrobial resistance, bacteria can also exhibit resistance by the ability to form biofilm, which protects bacteria from environmental stresses, favoring the colonization and persistence of these microorganisms in the environment. Thus, the aim of this study was to determine the antimicrobial susceptibility of S. Enteritidis strains and investigate the genes involved in the main resistance determined, as well as evaluate the ability of these strains in to produce biofilm. Forty-seven S. Enteritidis strains isolated from human, poultry, swine, and food were analyzed. Sixteen isolates (34%) were phenotypically resistant to at least one antibiotic tested. Of these, four isolates harbored class 1 integron. All strains resistant to sulfonamide had concomitantly genes sul1 and sul2. The genes strA, strB, aadA and aadB were identified in the majority of the aminoglycosides resistant isolates, whereas 92.9% showed strA, 71.4% strB, 7.1% aadA and 50% aadB. The tetB gene was detected in two of the three strains resistant to tetracycline, and tetC in one. In the three strains resistant to ampicillin the blaTEM gene was detected. Overall, among the 47 S. Enteritidis tested, 89.4% strains were able to form biofilm on polystyrene plates. Among these, 42.4% were considered weak biofilm producers, 14.9% moderate producers and 34% strong producers. It has been demonstrated that the majority of the S. Enteritidis strains that showed resistance to at least one antimicrobial agent were able to form biofilm, which increases concerns about food contamination, especially by the possibility of persistence of bacteria resistant to antibiotics on the environment and the subsequently dissemination of these strains to human. / A Salmonella Enteritidis tem sido o sorotipo mais prevalente no Brasil, principalmente associado a produtos de origem av?cola, que t?m sido prioritariamente envolvidos em surtos de doen?as transmitidas por alimentos. A alta preval?ncia de suscetibilidade reduzida a antimicrobianos em diversos sorotipos de Salmonella isolados de amostras relacionadas a animais de produ??o, a humanos e a alimentos de origem animal vem sendo relatada no mundo inteiro. Com isto, tem aumentado o interesse em investigar os mecanismos gen?ticos envolvidos na resist?ncia a antimicrobianos, especialmente elementos gen?ticos capazes de carrear cassetes de genes de resist?ncia, o que pode constituir a origem de cepas multi-resistentes. Al?m da resist?ncia a antimicrobianos determinada geneticamente, as bact?rias tamb?m podem apresentar resist?ncia pela habilidade de formar biofilme, protegendo-as de estresses ambientais, favorecendo a coloniza??o e persist?ncia desses microrganismos no ambiente. Deste modo, o objetivo deste estudo foi determinar a suscetibilidade a antimicrobianos de cepas de S. Enteritidis e investigar os genes envolvidos nas principais resist?ncias determinadas, bem como avaliar a capacidade de forma??o de biofilme destas cepas. Para tanto, foram analisadas 47 cepas de S. Enteritidis isoladas de humanos, aves, su?nos e alimentos. Dezesseis isolados (34%) se mostraram fenotipicamente resistentes a pelo menos um antimicrobiano testado. Destes, quatro apresentaram integron de classe 1. Todas as cepas resistentes ? sulfonamida apresentaram concomitantemente os genes sul1 e sul2. Os genes strA, strB, aadA e aadB foram identificados na maioria dos isolados que apresentaram resist?ncia a aminoglicos?deos, sendo que 92,9% apresentaram o gene strA, 71,4% strB, 7,1% aadA e 50% aadB. O gene tetB foi detectado em duas das tr?s cepas resistentes ? tetraciclina e o tetC em uma. J? as tr?s cepas resistentes ? ampicilina apresentaram o gene blaTEM. No total, dentre as 47 cepas de S. Enteritidis testadas, 89,4% foram capazes de formar biofilme em placas de poliestireno. Dentre estas, 42,4% foram consideradas fracas produtoras de biofilme, 14,9% produtoras moderadas e 34% fortes produtoras. Foi demonstrado que a maioria das cepas que mostraram resist?ncia a pelo menos um antimicrobiano foram capazes de formar biofilme, o que aumenta a preocupa??o a respeito da contamina??o de alimentos, especialmente pela possibilidade de persist?ncia de microrganismos resistentes a antimicrobianos no ambiente e a subsequente dissemina??o destas cepas para humanos.

Made available in DSpace on 2015-04-14T14:51:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 449167.pdf: 7073688 bytes, checksum: 13ee832fb2876ff096e89bb359eef9f8 (MD5) Previous issue date: 2013-03-22 / Psychosocial stress has important role in activating endocrine, immune and central nervous systems. Stress exacerbates many chronic inflammatory conditions and is an important risk factor for several mood disorders. Early exposure to stress can be even more detrimental as it may lead to alterations in stress reactivity/responsivity later in life. Several studies have shown important neuroimmune changes associated with the pathophysiology of mood disorders. Previous studies from our group and others reported a pro‐inflammatory profile and increased cellular activation in patients with bipolar disorder (BD). The objectives of the thesis are: 1) to analyze the stress effects on development using animal model of early life stress (maternal separation); 2) to analyze the neuroimmunendocrine responses to acute stress exposure (Trier Social Stress Test) in BD patients. Data presented here suggests that early life stress results in immune activation, characterized by increased pro‐inflammatory serum levels (specifically IL1‐β). As a consequence of this inflammation, a reduction of parvalbumin containing interneurons, substantial for serotonergic branches development, was also observed. Peripheral inflammation is a biological marker of neuronal damage observed, as interleukin‐10 (IL‐10, main anti‐inflammatory cytokine) central administration overturned the neuronal damages as well as peripheral inflammation per se. In the second study, patients with BD showed blunted sympathetic and neuroendocrine (cortisol) stress responses following acute stress compared to healthy controls. Basal data corroborates the presence of increased cellular activation in BD patients as observed by reduced T regulatory (Treg) cells, increased activated T cells (CD4+CD25+) as well as increased intracellular signaling through increased ERK1/2 and NF‐κB phosphorylation. Furthermore, an inability in reducing immune activation in response to stress was observed as increased percentage of activated T cells and concomitantly reduction in regulatory T cells in BD patients. Such inability in controlling immune response after stress exposure may be explained not only by reduced cortisol levels but also by reduced glucocorticoid sensitivity observed in BD patients. Given that, we conclude that BD patients have important HPA axis alterations that may lead to reduced endocrine reactivity to stress as well as inability to duly modulate immune responses. / O estresse psicossocial ? um importante mecanismo de ativa??o dos sistemas nervoso, end?crino e imune muitas vezes levando ? exacerba??o de diversas doen?as inflamat?rias cr?nicas, assim como ? um fator de risco importante para diversos transtornos de humor. A exposi??o ao estresse pode ser mais danosa quando esta ocorre cedo no desenvolvimento e pode resultar em altera??es na reatividade/responsividade ao estresse na vida adulta. Diversos estudos v?m demonstrando altera??es neuroimunoend?crinas importantes na patofisiologia dos transtornos de humor. Estudos pr?vios do nosso grupo e outros t?m observado um perfil pr?‐inflamat?rio perif?rico e uma maior ativa??o linfocit?ria em pacientes com transtorno bipolar (TB). Os objetivos da tese s?o: 1) analisar os efeitos do estresse no desenvolvimento atrav?s do protocolo de separa??o materna em modelo animal; 2) analisar par?metros neuroimunoend?crinos em resposta ao estresse em pacientes com TB tipo 1 eut?micos, utilizando‐se um protocolo de estresse laboratorial, o Trier Social Stress Test (TSST). Dados do presente trabalho demonstram que a exposi??o ao estresse na inf?ncia (em modelo animal) resulta em ativa??o imune, caracterizada por aumento nos n?veis plasm?ticos de citocinas pr?‐inflamat?rias (interleucina 1‐β) perifericamente. Uma poss?vel consequ?ncia dessa ativa??o imune ? a perda de neur?nios contendo parvalbumina, importantes para o desenvolvimento de comunica??o serotonin?rgica. A inflama??o perif?rica serviu como marcador para os danos neuronais observados, pois quando houve a administra??o de interleucina‐10 (IL‐10, principal citocina anti‐inflamat?ria) foi poss?vel reverter os danos neuronais e a inflama??o perif?rica. Neste trabalho, os pacientes com TB apresentaram respostas simp?ticas e neuroend?crinas (cortisol) muito reduzidas ap?s o estresse agudo quando comparados aos controles saud?veis. Ao n?vel basal, os pacientes com TB apresentaram uma redu??o na porcentagem de c?lulas T regulat?rias (Treg), aumento na porcentagem das c?lulas T ativadas (CD4+CD25+) e aumento na sinaliza??o celular atrav?s de uma maior fosforila??o de ERK1/2 e NF‐κB corroborando para um estado de ativa??o celular. Al?m disso, observamos uma incapacidade em reduzir a ativa??o imune em resposta ao estresse, caracterizada pelo aumento ainda maior na porcentagem de c?lulas T ativadas e concomitante redu??o nas c?lulas Treg em pacientes TB. Tal incapacidade em controlar a resposta imune ao estresse pode ser explicada n?o apenas pelos baixos n?veis de cortisol secretado, mas tamb?m a uma maior insensibilidade aos glicocorticoides no TB. Conclu?mos que os indiv?duos com TB possuem altera??es no eixo HPA que resultam em reduzida reatividade end?crina ao estresse assim como incapacidade de modular corretamente as respostas imunes.

Made available in DSpace on 2015-04-14T14:51:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 450693.pdf: 903446 bytes, checksum: 6805922c966dfb108b00594643df2744 (MD5) Previous issue date: 2013-03-27 / The elderly population, characterized as people over 60 years old, has grown rapidly in recent years in Brazil, and with this increase in life expectancy, age-related changes appear, for example, immunosenescence. Some studies have shown that there are differences in the immunological profile of the elderly, often related to the numbers of T cells. The immune risk profile (IRP) has been defined as CD4/CD8 T-cell ratio <1 and positivity for serum anti-cytomegalovirus (CMV) antibodies. In this study, we investigated patterns of activation and differentiation of T lymphocytes by flow cytometry in an elderly population in IRP, compared with elderly people without risk profile (non-IRP), seeking to identify additional markers for this risk profile immune. For this study we recruited 60 elderly SUS patients in Porto Alegre, aged 60 years, 30 IRP and 30 non-IRP. Lymphocytes were isolated and stimulated in vitro to evaluate the production of cytokines and the expression of transcription factors. The subpopulations of T lymphocytes found were consistent with previous studies in which IRP patients had fewer naive and central memory T cells, as well as an increase was observed in the percentage of T cells CD8 + CD28-T cells and CD8 + PD-1 + in the IRP individuals. Furthermore, there was a reduction in mean fluorescence intensity (MFI) of transcription factors to canonical subtypes of T cell help (CD4 +) in IRP patients when compared to patients without IRP. The percentages of the different subtypes (TH1, TH2, TH17; Treg) of these cells were not different between the two groups. After stimulation with anti-CD3/anti-CD28 antibodies in culture for 24 hours, the concentration of cytokines in culture supernatants increased, but no significant differences between the two groups were found, except for IL-10, which was higher in IRP patients before stimulation. These results suggested that transcriptional mechanisms important in the differentiation of helper T cells are altered in IRP patients, which may affect the immune response of these individuals. / A popula??o de idosos, caracterizada como pessoas com mais de 60 anos, vem aumentando muito nos ?ltimos anos no Brasil, e com esse aumento da expectativa de vida surgem altera??es relacionadas com a idade, por exemplo, a imunossenesc?ncia. Alguns estudos t?m demonstrado que existem diferen?as no perfil imunol?gico dos idosos, frequentemente relacionadas ao n?mero de c?lulas T. O perfil de risco imune (IRP) tem sido definido como taxa de c?lulas T CD4/CD8<1 e soro positividade para citomegalov?rus (CMV). Neste estudo, n?s investigamos padr?es de ativa??o e diferencia??o de linf?citos T, por citometria de fluxo, em uma popula??o idosa IRP, comparando com a popula??o idosa sem perfil de risco (n?o-IRP), buscando identificar marcadores adicionais para esse perfil de risco imune. Foram recrutados para esse estudo 60 idosos da rede SUS (sistema ?nico de sa?de) de Porto Alegre, com idade superior a 60 anos, sendo 30 IRP e 30 n?o-IRP. Linf?citos foram isolados e estimulados in vitro para avaliar a produ??o de citocinas e a express?o de fatores de transcri??o. As subpopula??es de linf?citos T encontradas foram condizentes com estudos anteriores em que os pacientes IRP possu?am menos c?lulas T naive e de mem?ria central, assim como foi observado um aumento nas porcentagens das c?lulas T CD8+CD28- e das c?lulas T CD8+PD-1+. Al?m disso, foi observada uma redu??o na m?dia de intensidade de fluoresc?ncia (MFI) dos fatores de transcri??o can?nicos para subtipos de c?lulas T de ajuda (CD4+) em pacientes IRP quando comparados com pacientes n?o-IRP. As porcentagens dos diferentes subtipos (TH1; TH2; TH17; Treg) dessas c?lulas n?o foram diferentes entre os dois grupos. Ap?s estimula??o com anticorpos anti-CD3/anti-CD28 em cultura por 24h, a concentra??o de citocinas no sobrenadante das culturas aumentou, mas n?o houve diferen?a significativa entre os dois grupos em rela??o ? concentra??o das citocinas em geral, exceto na IL-10 antes da estimula??o, que foi maior em pacientes IRP. Esses resultados sugerem que mecanismos transcricionais importantes para a diferencia??o de c?lulas T de ajuda est?o alterados em pacientes IRP, o que pode afetar a resposta imune desses indiv?duos.

Made available in DSpace on 2015-04-14T14:51:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 451400.pdf: 16861193 bytes, checksum: 8e59e1dc262f6d66b6ff62e7eca281b9 (MD5) Previous issue date: 2013-07-30 / Human tuberculosis (TB) is a major global health threat. The disease s increasing prevalence, coupled with the emergence of drug-resistant strains and the devastating effects of co-infection with human immunodeficiency virus (HIV) indicate an urgent need for the development of new and more efficient drugs to combat the disease's causative agent, Mycobacterium tuberculosis. Global health authorities have also begun to recognize the need for drugs that can kill the mycobacteria in its different physiological states including but not limited to latent TB infection. A more comprehensive understanding of the bacilli's nucleotide metabolic pathways, in particular purine and pyrimidine salvage pathways, could aid in the development of new therapeutic strategies to reduce the incidence of TB worldwide. Nucleoside hydrolase catalyzes the irreversible hydrolysis of N-glycosidic bond of ribonucleosides, forming &#945;-D-ribose and the corresponding base. This work describes the amplification, cloning, expression and purification of the iunH-encoding purine nucleoside hydrolase from M. tuberculosis (MtIAGU-NH). Results from steadystate kinetic experiments indicate that MtIAGU-NH has broad substrate specificity, accepting inosine, adenosine, guanosine, and uridine as substrates. Kinetics analysis utilizing fluorescence spectroscopy of ribose binding to MtIAGU-NH suggests that prior to ligand association there are two pre-existing forms of the enzyme. We determined the intracellular concentrations of inosine, uridine, hypoxanthine, and uracil as well as the reaction s thermodynamic parameters. Thermodynamic activation parameters (Ea, &#916;G#, &#916;S#, &#916;H#) for the MtIAGU-NH-catalyzed chemical reaction, along with results from mass spectrometry, isothermal titration calorimetry (ITC), pH-rate profile experiments, multiple sequence alignment, and molecular docking experiments are also presented. Knockout experiments of the iunH gene indicate that this gene is not essential for the growth of M. tuberculosis H37Rv underutilized experimental conditions. The data presented here contribute to our understanding of MtIAGU-NH, providing a solid basis for the development of efficient prophylactic and therapeutic strategies to reduce the global incidence of TB. / A tuberculose humana (TB) ? considerada uma amea?a ? sa?de global. O aumento na preval?ncia da doen?a, a emerg?ncia de cepas resistentes e a coinfec??o com o v?rus da imunodefici?ncia humana levaram ? urgente necessidade do desenvolvimento de novas drogas mais eficientes para o combate do agente causativo da TB, Mycobacterium tuberculosis. Al?m disso, h? a necessidade de novas drogas contra a micobact?ria nos seus diferentes estados fisiol?gicos, incluindo a TB latente. Um maior entendimento sobre as vias metab?licas de nucleot?deos do bacilo da TB, em particular as vias de salvamento de purinas e pirimidinas, levariam ao desenvolvimento de novas estrat?gias terap?uticas para controlar a incid?ncia global de TB. A hidrolase de nucleos?deos catalisa a hidr?lise irrevers?vel da liga??o N-glicos?dica de ribonucleos?deos, dando origem ? &#945;-D-ribose e sua base livre correspondente. Este trabalho descreve a amplifica??o e clonagem do gene iunH, e a express?o e purifica??o da enzima recombinante hidrolase de nucleos?deos pur?nicos de M. tuberculosis (MtIAGU-NH). Os resultados de cin?tica no estado estacion?rio mostram que a MtIAGU-NH possui uma ampla especificidade pelos substratos, utilizando inosina, adenosina, guanosina e uridina como substratos. As medidas cin?ticas da liga??o da ribose ? MtIAGU-NH por espectroscopia fluorim?trica sugerem a exist?ncia de duas formas da enzima em equil?brio, relacionadas ? associa??o ao ligante. As concentra??es intracelulares de inosina, uridina, hipoxantina e uracil foram determinadas e os par?metros termodin?micos, estimados. Os par?metros termodin?micos de ativa??o (Ea, &#916;G#, &#916;S#, &#916;H#) para a rea??o qu?mica catalisada pela MtIAGU-NH, al?m dos resultados de espectrometria de massa, calorimetria de titula??o isot?rmica, experimento de perfil de pH, alinhamento de m?ltiplas sequ?ncias e experimentos de docagem molecular tamb?m s?o apresentados neste trabalho. O nocaute do gene iunH mostrou que este n?o ? essencial para o crescimento do bacilo M. tuberculosis H37Rv nas condi??es experimentais empregadas. Os resultados aqui descritos dever?o ser ?teis para um melhor entendimento sobre a enzima MtIAGU-NH, fornecendo bases s?lidas para o desenvolvimento de estrat?gias terap?uticas e preventivas para diminuir a incid?ncia global da TB.

Made available in DSpace on 2015-04-14T14:51:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 451454.pdf: 6697842 bytes, checksum: 890c954db41088b36538c3133a7c2606 (MD5) Previous issue date: 2013-09-27 / Epilepsy, characterized by the occurrence of spontaneous and recurrent seizures, is one of the main chronic neurological diseases, affecting around 1% of the world's population. Adenosine is an endogenous modulator of neuronal excitability and has anticonvulsant properties. Thus, the modulation of adenosinergic signalling pathway may presents important effects on epilepsy. In this study we characterize different aspects of the adenosinergic signaling in a model of seizures induced by pentylenetetrazole (PTZ) in zebrafish. In this study we also analyzed the effect of different modulators of adenosinergic signaling on controlling the development of seizures. Our results showed that the activation of type A1 adenosine receptors has an important role in controlling seizures in zebrafish. Furthermore, we observed that ecto-5?-nucleotidase and ADA enzymes, in addition to nucleoside transporters, are directly involved in controlling extracellular adenosine levels and, consequently, in controlling the development of seizures in this teleost. In addition, we clarified the occurrence of controversial data related to the mTOR signaling pathway in oxidative stress. Previous studies have suggested the activation of this pathway in oxidative stress based on the misinterpretation of the phosphorylation of RSK and MSK proteins through the antibody anti-phospho-Thr389-S6K, in addition to protein S6 phosphorylation, regulated by the MAPK signaling pathway in this case. Therefore, these findings might contribute for a better understanding about the signaling pathways involved in the mechanisms of seizure control and represents na alternative for the development of antiepileptic drugs, increasing the therapeutic options in epilepsia. Our results may also contribute to future studies on the characterization and modulation of TOR signaling pathway in zebrafish. / A epilepsia, caracterizada pela ocorr?ncia de crises convulsivas espont?neas e recorrentes, ? umas das principais doen?as neurol?gicas cr?nicas, afetando em torno de 1% da popula??o mundial. A adenosina ? um modulador end?geno da excitabilidade neuronal e apresenta propriedades anticonvulsivantes. Sendo assim, a modula??o da via de sinaliza??o adenosin?rgica pode apresentar um efeito importante na epilepsia. Neste estudo, n?s caracterizamos diferentes aspectos da sinaliza??o adenosin?rgica em modelo de crise convulsiva induzida por pentilenotetrazol (PTZ) em peixe-zebra. Nossos resultados demonstram um aumento nas atividades da adenosina desaminase (ADA), respons?vel pela desamina??o de adenosina em inosina, logo ap?s uma crise convulsiva. Al?m disso, foi observado que os f?rmacos antiepil?pticos gabapentina, fenito?na e ?cido valpr?ico preveniram o efeito estimulat?rio promovido pelo PTZ sobre as atividades da adenosina desaminase. Neste estudo, tamb?m analisamos o efeito de diferentes moduladores da sinaliza??o adenosin?rgica no controle do desenvolvimento de convuls?es induzidas por PTZ. Nossos resultados demonstraram que a ativa??o de receptores de adenosina do tipo A1 tem importante participa??o no controle de crises convulsivas em peixe-zebra. Al?m disso, observamos que as enzimas ecto-5?-nucleotidase e ADA, al?m dos transportadores de nucleos?deos est?o diretamente envolvidos no controle dos n?veis extracelulares de adenosina e, consequentemente, no controle do desenvolvimento de crises convulsivas neste tele?steo. Al?m disso, esclarecemos a ocorr?ncia de dados controversos relacionados ? via de sinaliza??o mTOR em estresse oxidativo. Estudos sugeriram a ativa??o desta via em estresse oxidativo baseados na interpreta??o equivocada da fosforila??o das prote?nas RSK e MSK pelo anticorpo anti-fosfo-Thr389-S6K, al?m da fosforila??o da prote?na S6, regulada neste caso pela via de sinaliza??o MAPK. Este estudo pode contribuir para um maior entendimento das vias de sinaliza??o envolvidas nos mecanismos de controle de crises convulsivas e representar uma alternativa para o desenvolvimento de f?rmacos antiepil?pticos, aumentando as op??es terap?uticas em epilepsia. Nossos resultados tamb?m podem contribuir para futuros estudos referentes ? caracteriza??o e modula??o da via de sinaliza??o TOR em peixe-zebra.

Made available in DSpace on 2015-04-14T14:51:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 451624.pdf: 961299 bytes, checksum: 1cc816e2a5732637ef64d561c9f1cccc (MD5) Previous issue date: 2013-09-24 / Introduction : Oxaliplatin is an antineoplastic agent widely used in the treatment of some tumors. It is a third-generation platinum compound developed with the purpose of overcoming the limitations of toxicity, tumor resistance and poor oral bioavailability associated to cisplatin administration. Oxaliplatin-associated neurotoxicity represents the main dose limiting and there is not suitable treatment. Increasing doses of oxaliplatin can leed to the development of mechanical allodynia, cold sensitivity and peripheral sensory neuropathy, with increase of symptoms. Furthermore, despite its usefulness, chemotherapy with oxaliplatin increases the rate of developing hepatic damages together with inflammatory activity. This might be termed chemotherapy-associated steatohepatitis (CASH), a most severe form of non-alcoholic fatty liver disease. Therefore, in the presentstudy, we aimed to compare the effect of antioxidant compounds on simultaneous development of oxaliplatin-induced hepato and neurotoxicity in mice. Methods : The Balb/c mice were treated with doses of oxaliplatin (OXA) for 6 weeks, 10 mg/kg, intraperitoneally (i.p), resulting in mechanical allodynia, and hepatic steatosis. We administered antioxidants compounds such as rutin (RUT) (20 mg/Kg/d), resveratrol (RVS) (100 mg/Kg/d), quercetin (QT) (20 mg/Kg/d) and nanoquerecetin (NQT) (20 mg/Kg/d) daily by gavageto Balb/c. N-acetyl-cysteine was used as control. Euthanasiaoccurred onday 43after treatment. We evaluated mechanical nociceptive threshold, ALT/AST, histopathological analysisand MPOactivity. Statistical analyses were made one way ANOVA, followed by Bonferroni post hoc test. Results : The treatments with RSV, RUT or NQT were able to prevent mechanical allodynia when compared to OXA group. Regarding the effect on steatohepatitis, resveratrol, quercetin and quercetin nanoemulsion almost completely reversed the mean liver weight increase by OXA. In accordance with these previous data, histological evaluation depicted attenuation all features of hepatic steatosis evaluated in resveratrol, rutin, quercetin and quercetin nanoemulsion groups. On the other hand, only quercetin and quercetin nanoemulsion treatments were able to reduce neutrophils migration measured by MPO activity. Conclusion : These results suggest that the use of compounds such as resveratrol, rutin, quercetin and quercetin nanoemulsion can beeffective to avoid oxaliplatin-inducing hepato and neurotoxicity in a rodent model. / Introdu??o : A oxaliplatina ? um agente antineopl?sico e tem sido amplamenteutilizado no tratamento de v?rios tumores. ? um composto derivado da platina de terceira gera??o desenvolvido com o prop?sito de ultrapassar as limita??es da toxicidade, a resist?ncia do tumor e a fraca biodisponibilidade oral associada ? administra??o decisplatina. Sintomas de neurotoxicidade est?o associados ao uso da oxaliplatina e n?o existe tratamento adequado. Doses crescentes de oxaliplatina podem levar ao desenvolvimento de sensibilidade a frio e neuropatia sensorial perif?rica, e a um aumento da intensidade dos sintomas. Al?m disso, apesar da sua utilidade, a quimioterapia aumenta a taxa de desenvolvimento de danos hep?ticos com atividade inflamat?ria. Esta manifesta??o pode ser chamada de esteato-hepatite associada ? quimioterapia (CASH), uma forma mais grave da doen?a hep?tica gordurosa n?o alco?lica. Deste modo, o presente estudo, objetivou comparar o efeito de alguns compostos antioxidantes no desenvolvimento simult?neo da hepato e neurotoxicidade induzida pela oxaliplatina em camundungos. M?todos : Os camundongos Balb/c foram tratados intraperitonealmente (i.p.), com doses de 10 mg/kg de oxaliplatina durante 6 semanas, resultando em anodinia mec?nica, e indu??o de esteatose hep?tica. Os compostos rutina (RUT) (20 mg/Kg/d), resveratrol (RSV) (100 mg/Kg/dia), quercetina (QT) (20 mg/Kg/dia) e nanoquerecetina (NQT) (20 mg/Kg/dia), foram administrados diariamente por gavagem aos camundongos. N-acetilciste?na foi utilizada como controle. A eutan?sia ocorreu no 43? dia ap?s o tratamento. Foram analisadas a nocicep??o mec?nica, as aminotransferases ALT/AST, foi realizada avalia??o histopatol?gica e da atividade da mieloperoxidase. A an?lise estat?stica foi realizada por ANOVA de uma via seguida do teste de Bonferroni. Resultados : Os tratamentos comresveratrol, rutinaouquercetina em nanoemuls?oforam capazes de impedira alodiniamec?nica, quandocomparados com o grupotratado com oxaliplatina. Em rela??o aoefeito sobre aesteato-hepatite, os tratamentos com resveratrol, quercetina e quercetina em nanoemuls?oreverteramsignificativamenteoaumento depeso m?dio do f?gadoinduzido pela oxaliplatina. Corroborando com estes dados, a avalia??ohistol?gicamostrou uma atenua??o em todas as caracter?sticas deesteatose hep?tica avaliados nos grupostratados com resveratrol, rutina, quercetina e quercetina em nanoemuls?o, apresentando caracter?sticas semelhantes ao controle positivo com N-acetilciste?na. Por outrolado,apenasos tratamentoscom quercetina e quercetina em nanoemuls?o foram capazes dereduzir a migra??ode neutr?filosmedidapela atividadede mieloperoxidase. Conclus?o : Os resultados sugerem que o uso dos compostos resveratrol, rutina, quercetina e quercetina em nanoemuls?opodem se alternativas efetivas para o tratamento

Made available in DSpace on 2015-04-14T14:51:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 451784.pdf: 974193 bytes, checksum: b53f42e8acb1653e7c655d1d1345a38b (MD5) Previous issue date: 2013-03-27 / Annexin V is an endogenous human protein Ca+2 dependent, with a molecular weight of 35.8 kDa, widely distributed intracellularly, with very high concentrations in the placenta and lower concentrations in endothelial cells, kidneys, myocardium, skeletal muscle, skin, red cells, platelets and monocytes. Annexin V binds preferably to phosphatidylserine, a phospholipid commonly present on inner leaflet of lipid bilayer, which during cell apoptosis is translocated to outer leaflet of cell membrane. Despite of Annexin V is a relatively large protein, it was shown early on that the protein can be internalized at sites of ischemic injury both in the heart and in the brain and cross the intact blood-brain barrier, being increasingly used as a tool to detect apoptosis in several diseases such as Alzheimer and Ischemia and in drug. Therefore, production of recombinant human Annexin V using recombinant DNA technique along with High Cell Density Culture and protein purification becomes applicable to commercialize it in Brazil, increasing and facilitating the access of pharmaceutical industries and research laboratories in purchase product. We developed a protocol to produce recombinant human annexin V in large scale, in which approximately 20 mg of recombinant protein was yielded from 3 g of E. coliBL21(DE3) wet cells. N-terminal amino acid sequencing and massspectrometry analysis provided evidence for the identity and purity of therecombinant protein, as well as an apoptosis/necrosis in vitro detectionkit produced performed similarities with an imported commercialized kit in Brazil. / A Anexina V ? uma prote?na humana end?gena dependente de Ca+2, com peso molecular de 35,8 kDa, amplamente distribu?da intracelularmente em altas concentra??es na placenta e em concentra??es mais baixas nas c?lulas endoteliais, renais, mioc?rdicas, epiteliais, esquel?ticas musculares, eritr?citos, plaquetas e mon?citos. Apresenta como principal caracter?stica a capacidade de se ligar ? fosfatidilserina, um fosfolip?deo presente na camada interna da bicamada lip?dica, que durante a apoptose celular ? translocada para a camada externa da membrana celular. Apesar de ser uma prote?na de tamanho relativamente grande, a Anexina V apresentou a capacidade de penetrar em s?tios de inj?ria isqu?mica tanto mioc?rdica quanto cerebral, atravessando a Barreira Hemato-Encef?lica, sendo cada vez mais utilizada para dete??o de apoptose em diversas doen?as como Alzheimer e Isquemia e em monitoramento de drogas antic?ncer. Por esses motivos, se torna relevante a produ??o da prote?na Anexina V humana atrav?s da t?cnica do DNA recombinante em larga escala para que possa ser comercializada no Brasil, aumentando e facilitando o acesso de laborat?rios de pesquisa e ind?strias farmac?uticas na aquisi??o deste produto. Desenvolvemos um protocolo para cultivoem biorreator de grandes quantidades de Anexina V recombinante, no qual aproximadamente 20 mg de prote?na recombinante podem ser obtidos a partir de 3 g de c?lula ?mida de E. coli BL21(DE3). As an?lises porsequenciamento N-terminal de amino?cidos e espectrometria de massas proveram evid?ncias para a identidade e pureza da prote?na recombinante, assim como um desenvolvimento de um kit para marca??o de apoptose in vitro apresentou muita semelhan?a com outro kit importado j? comercializado no Brasil.

Made available in DSpace on 2015-04-14T14:51:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 451788.pdf: 1287455 bytes, checksum: d1990d71c198ca3db981a675db0e192b (MD5) Previous issue date: 2013-03-27 / The granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF) is a major hematopoietic cytokine involved in the immune defense against infectious agents, stimulating and regulating the proliferation, survival and differentiation of neutrophils precursor cells in the bone marrow. The G-CSF molecule has a 174 amino acids sequence, with a molecular weight of approximately 18.8 kDa. As a strategy for neutropenia prevention, G-CSF (or filgrastim) has been successfully used in cancer patients whose treatment requires high doses of chemotherapy, in both adults and children. Moreover, this biopharmaceutical may be used to strengthen the immune system in patients with HIV, pneumonia, infections resulting from diabetes, leukemia and febrile neutropenia. Currently, filgrastim is not produced in Brazil, which obligates the government to import this medicine. Due to its wide clinical application, the large scale production of G-CSF is required to supply the demand of national market. In this work, a protocol to obtain this protein was developed using overexpression and cultivation in a bioreactor, solubilization and purification of recombinant G-CSF. The protein was expressed in Escherichia coli host cells C41(DE3) cultures grown in bioreactor using a fed-batch strategy. The expression of the recombinant protein was induced by IPTG. A linear ascending feeding strategy permitted high plasmid stability, low accumulation of acetate in the culture medium, a biomass of approximately 31 g/ L and high expression levels of the protein in the form of inclusion bodies which were solubilized using 2 M urea and alkaline pH. The recombinant protein was purified and yielded approximately 1.22 mg of homogeneous recombinant protein per gram of wet cells, corresponding to a volumetric yield of 151.5 mg of rhG-CSF per liter of culture medium. A mass spectrometry analysis was performed, confirming the identity of the recombinant protein. Our work shows a simple and effective strategy to obtain recombinant hG-CSF, stimulating and encouraging a future production of a national biosimilar. / O fator estimulador de col?nias de granul?citos (G-CSF) ? uma das principais citocinas hematopoi?ticas envolvidas na defesa do sistema imune contra agentes infecciosos, estimulando e regulando a prolifera??o, sobreviv?ncia e diferencia??o das c?lulas precursoras de neutr?filos na medula ?ssea. ? uma mol?cula que possui uma sequ?ncia de 174 amino?cidos, com peso molecular de aproximadamente 18,8 kDa. Como estrat?gia de preven??o da neutropenia, o G-CSF (ou filgrastima) ? utilizado clinicamente com sucesso em pacientes com c?ncer, cujo tratamento requer altas doses de quimioterapia, tanto em adultos como em crian?as. Al?m disso, o G-CSF pode ser utilizado para refor?ar o sistema imunol?gico em pacientes com HIV, pneumonia, infec??es decorrentes da diabetes, leucemia e neutropenia febril. Atualmente, a filgrastima n?o ? produzida no Brasil, consequentemente, todo medicamento adquirido pelo governo ? importado. Tendo em vista sua ampla aplica??o cl?nica, a produ??o em larga escala do G-CSF se faz necess?ria para suprir a demanda do mercado nacional e diminuir os custos com importa??o desse biof?rmaco. Neste trabalho um protocolo para a produ??o desta prote?na foi desenvolvido, utilizando t?cnicas de DNA recombinante por meio de experimentos de superexpress?o e cultivo em biorreator, solubiliza??o e purifica??o da G-CSF recombinante. A prote?na foi expressa em c?lulas Escherichia coli C41(DE3) em cultivos de batelada alimentada em biorreactor, utilizando indu??o com IPTG e uma estrat?gia de alimenta??o linear ascendente, que nos permitiu obter um alto percentual de estabilidade plasmidial, baixo ac?mulo de acetato no meio de cultivo, uma biomassa de aproximadamente 31 g/ L e elevados n?veis de express?o da prote?na em forma de corpos de inclus?o, que foram solubilizados utilizando ureia 2 M e pH alcalino. A prote?na recombinante foi purificada obtendo-se aproximadamente 1,22 mg de prote?na recombinante homog?nea por grama de c?lulas ?mida, correspondendo a um rendimento volum?trico de 151,5 mg de rhG-CSF por litro de meio de cultura. Uma an?lise por espectrometria de massa tamb?m foi realizada, confirmando a identidade da prote?na recombinante. Nosso trabalho mostra uma estrat?gia simples e eficaz para obter hG-CSF recombinante, contribuindo e estimulando a futura produ??o de um biossimilar nacional.