Made available in DSpace on 2015-04-14T14:51:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 451789.pdf: 1080623 bytes, checksum: 53f3af2f0b9cc2bca520b792d55bcc75 (MD5) Previous issue date: 2013-03-27 / Somatotrophin or growth hormone (GH) is a hormone synthesized and secreted by the anterior pituitary gland in all animals and their secretion is controlled by two neuropeptides: the growth hormone releasing factor (GRF), which increases GH synthesis and secretion and somatostatin (SRIF), which inhibits GH secretion. bGH has galactopoietic effect, which is known since the thirties. The mechanism of action of bGH involves a series of orchestrated changes in the metabolism of body tissues so that more nutrients can be used for milk synthesis and these changes allow the animal to achieve an increased milk yield while remaining healthy. Long term studies (10 12 weeks) demonstrated increase in milk yield up to 40% with no adverse effects in the treated cows. E. coli is currently the largest platform for expression of heterologous proteins and high cell-density culture techniques for culturing E. coli are designed to increase productivity of proteins. This system is widely used for production of various recombinant proteins available in the market. In this work were performed bioreactor cultivations using fed batch techniques, testing different feeding strategies and different IPTG induction times. At the end of the experiments the biomass obtained was 32.4 g/L using a linear feeding strategy. Approximately 2.5 mg of bGH were obtained from 1 g of wet cell using a purification protocol with only one chromatographic column. / Somatotropina ou horm?nio de crescimento trata-se de um horm?nio natural secretado pela gl?ndula pituit?ria. Sua secre??o ? controlada por dois neuropept?deos secretados pelo hipot?lamo, o fator liberador de somatotropina, que aumenta a secre??o de horm?nio de crescimento e a somatostatina que inibe a sua secre??o. O horm?nio de crescimento bovino possui efeito galactopoi?tico, o que ? conhecido desde a d?cada de 30. Seu mecanismo de a??o envolve uma s?rie de mudan?as no metabolismo, direcionando mais nutrientes para a s?ntese de leite, sendo que o aumento na produ??o de leite ? alcan?ado sem prejudicar a sa?de do animal. Resultados de pesquisa demonstram que o horm?nio de crescimento bovino pode aumentar a produ??o de leite de 6% a 40% e a efici?ncia de utiliza??o de alimentos em bovinos. A produ??o de leite no Brasil aumentou cerca de 5 vezes desde 1975 at? 2011, e estima-se que existam 23 mil vacas leiteiras no pa?s, demonstrando o potencial mercado para o uso da somatrotopina bovina. E. coli ? atualmente a maior plataforma para express?o simples de prote?nas heter?logas, principalmente por ser um sistema bem caracterizado. Cultivos de alta densidade s?o desenvolvidos para aumentar a produtividade de prote?nas, sendo amplamente utilizados para produ??o de diversas prote?nas recombinantes dispon?veis no mercado. Neste trabalho foram realizados cultivos de E. coli em biorreator por meio de t?cnicas de batelada alimentada, testando diferentes estrat?gias de alimenta??o e tempos de indu??o com IPTG. Ao final dos experimentos a biomassa obtida foi de 32,4 g/L usando uma estrat?gia de alimenta??o linear. Aproximadamente 2,5 mg de bGH foram obtidas a partir de 1 g de c?lula ?mida usando um protocolo de purifica??o com apenas uma coluna cromatogr?fica.

Made available in DSpace on 2015-04-14T14:51:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 452675.pdf: 2946901 bytes, checksum: 590f01e37b62ebd8cf1981d8100e6dfc (MD5) Previous issue date: 2013-08-15 / Since its discovery, Isoniazid remains the main drug used to treat tuberculosis, which has the 2-trans-enoyl-ACP(CoA) reductase or InhA enzyme of Mycobacterium tuberculosis as pharmacological target. However, the increase in cases of tuberculosis resistant to Isoniazid motivated the pharmaceutical industry and research groups to investigate possible inhibitors to InhA, whether seeking for new compounds that display the inhibitory function, or as proposed in this work, modifying existing compounds. Thus, we believe that the IQG607 inorganic compound, also known as pentacyano(Isoniazid)ferrate (II) - developed in an attempt to find new, more potent and selective inhibitors of the InhA enzyme - is a promising candidate for the development of new anti-tuberculosis drugs. This work began with a literature review in order to understand the role of InhA enzyme in the process of fatty acid synthesis and what they represent in the process of formation of the cell envelope of mycobacteria. In addition, a survey was conducted regarding the published studies on the IQG607, which reported efforts engaged in researching and obtaining the compound. Based on these studies, it was proposed the design of new compounds by introducing structural modifications in the IQG607 molecule, with the aid of specific software. Intermolecular interactions of these compounds with the target protein were simulated and evaluated with the use of AutoDock and LigPlot. Twenty-seven models were designed, and for all of them, simulations were performed in silico. Three of these compounds were selected, and from those one was successfully synthesized. After synthesis, enzymatic assays were carried out to assess whether the new compound haddemonstrated inhibitory function as found in the original IQG607. Unfortunately, although the in silico simulations have led us to believe that the models designed could generate good compounds, early in the in vitro experiments we found that there was no variation in the enzyme s activity, indicating that the compound showed no inhibitor effect. In our attempt to lengthen the IQG607 compound - thus allowing a greater number of torsion angles for the molecule, and thereby promote a better fit of the ligand binding cavity in the substrate - we discovered that two important pieces of INH were separated, which caused the loss of activity of the compound. It appears that the changes which were introduced in the IQG607 compound have hindered the acyl radical formation and therefore the adduct ligand-NADH could not be formed. / Desde a sua descoberta, a Isoniazida continua sendo o principal f?rmaco empregado no tratamento da tuberculose, tendo como alvo farmacol?gico a enzima 2-trans-enoil- ACP(CoA) redutase ou InhA de Mycobacterium tuberculosis. Por?m, o aumento dos casos de tuberculose resistente ? Isoniazida motivaram a ind?stria farmac?utica e pesquisadores a investigar poss?veis inibidores da InhA, seja buscando novos compostos que apresentem a caracter?stica inibit?ria, ou como na proposta deste trabalho, modificando compostos j? existentes. Desta forma, acreditamos que o composto inorg?nico IQG607, tamb?m conhecido como pentaciano(isoniazida)ferrato (II), desenvolvido na tentativa de encontrar novos inibidores mais potentes e seletivos para a enzima InhA, ? um candidato promissor ao desenvolvimento de novas drogas anti-tuberculose. Este trabalho iniciou com uma pesquisa na literatura cient?fica buscando compreender o papel da enzima InhA no processo de s?ntese de ?cidos graxos e o que estes representam no processo de forma??o do envelope celular das micobact?rias. Al?m disso, foi realizado um levantamento a respeito dos estudos j? publicados sobre o IQG607, que relatam os esfor?os empenhados na pesquisa e obten??o do composto. Com base nestes estudos, foi proposto o desenho de novos compostos introduzindo modifica??es estruturais na mol?cula do IQG607 original, com o auxilio de software espec?fico. As intera??es intermoleculares desses compostos com a prote?na alvo foram simuladas e avaliadas, com o uso dos programas AutoDock e LigPlot. Vinte e sete modelos foram desenhados, e para todos eles foram realizadas as simula??es in silico. Tr?s desses compostos foram selecionados e, deles, um foi sintetizado com sucesso. Ap?s a s?ntese, ensaios enzim?ticos avaliaram se o novo composto mantinha a fun??o inibit?ria comprovadamente encontrada no IQG607 original, caracterizando a etapa in vitro deste trabalho. Infelizmente, embora as simula??es in silico tenham nos levado a crer que os modelos desenhados poderiam gerar bons compostos, j? no in?cio da etapa in vitro se descobriu que n?o havia varia??o na atividade da enzima, o que indica que o composto n?o apresentou o efeito inibit?rio esperado. Em nossa tentativa de alongar o composto IQG607, permitindo assim um n?mero maior de ?ngulos de tor??o para a mol?cula, e com isso, promover um melhor encaixe do ligante na cavidade de liga??o do substrato, descobrimos que dois grupamentos importantes da INH foram separados, o que provocou a perda de atividade do f?rmaco. Sup?e-se que as modifica??es introduzidas no composto IQG607 impediram a forma??o do radical acil e, portanto, o aduto com o NADH n?o p?de ser formado.

Made available in DSpace on 2015-04-14T14:51:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 456587.pdf: 4329153 bytes, checksum: 3b1fcb08380fd20462af2db313e93f52 (MD5) Previous issue date: 2014-02-28 / Oral squamous cell carcinoma is among the six most common cancers in the world. For half of the diagnosed cases, oral cancer is a fatal disease, and those who survive often are disfigured and life quality becomes highly compromised. In this sense, one of the main allies for possible pharmacological therapy testing is the animal model, in this case, the hamster buccal pouch carcinogenesis model. This experimental model has been used with great success over the last 60 years. However the different protocols found in the literature sometimes have incomplete information. Thus, in the first part of this work we conducted a review of the animal model over the last 60 years, analyzing important technical parameters, such as: 1 The hamster strains used; 2 - The gender of animals; 3 - The age of the animals at the beginning of the induction protocol; 4 - The buccal pouch that was used for induction; 5 The different types of carcinogens used; 6 The concentrations of these carcinogens; 7 The solvents used to dilute the carcinogen; 8 - The number of applications per week; 9 - The different applying systems; and 10 - The length of the exposure protocol used to induce carcinogenic lesions or cancer. After this study, we used a modified carcinogenic model to induce precancerous lesions in the hamster buccal pouch mucosa. In this experimental model we tested a novel pharmacological alternative used to treat different types of cancers. Sunitinib is a multiple tyrosine kinase inhibitor that acts on endothelial cells and pericytes inhibiting the process of angiogenesis which is essential for tumor growth. The second study evaluated qualitatively and quantitatively the morphological effects that sunitinib had in precancerous lesions induced by DMBA in the hamster buccal pouch mucosa. Moreover we evaluate different clinical parameters of these animals. Our main results with respect to the second study were: 1 - Sunitinib was not able to reverse the decrease in body weight gain induced by DMBA; - 2 Sunitinib was able to inhibit tumor growth and ulceration induced by DMBA; 3 - Sunitinib was able to reverse the increase in epithelial rete ridges induced by DMBA. Thus, sunitinib can be considered an effective agent for chemoprevention, being an interesting alternative for further studies in a more advanced stage of oral cancer in the hamster buccal pouch or similar model. / O c?ncer bucal de c?lulas escamosas est? entre os seis c?nceres mais comuns no mundo. Para metade dos casos diagnosticados, o c?ncer bucal ? uma doen?a fatal, e para aqueles que sobrevivem geralmente trata-se de uma patologia mutiladora, na qual a qualidade de vida torna-se bastante comprometida. Neste sentido, um dos principais aliados para o teste de poss?veis terapias farmacol?gicas para o tratamento desta patologia ? o uso de modelos animais, destacando-se o modelo de indu??o de c?ncer bucal na mucosa da bolsa jugal de hamster s?rio dourado. Este modelo experimental tem sido utilizado com bastante sucesso ao longo dos ?ltimos 60 anos. Contudo os diferentes protocolos encontrados na literatura cient?fica apresentam informa??es muitas vezes incompletas. Deste modo, na primeira parte deste trabalho realizamos uma revis?o deste modelo animal ao longo dos ?ltimos 60 anos, analisando importantes par?metros t?cnicos deste modelo, como por exemplo: 1 - As linhagens de hamsters utilizadas; 2 - O g?nero dos animais utilizados; 3 - A idade dos animais no in?cio do tratamento com agente carcinog?nico; 4 - A hemiface do animal que ? predominantemente utilizada para a indu??o de c?ncer bucal; 5 - Os diferentes tipos de agentes carcinog?nicos utilizados neste modelo experimental; 6 - As diferentes concentra??es destes agentes carcinog?nicos; 7 - Os solventes utilizados para dilui??o dos agentes carcinog?nicos; 8 - O n?mero de aplica??es por semana; 9 - Os diferentes sistemas de aplica??o do agente carcinog?nico; e 10 - A determina??o da extens?o do per?odo de exposi??o ao carcin?geno, que ? respons?vel pela produ??o de les?es canceriz?veis ou indu??o tumoral. Ap?s esta revis?o de metodologia sistem?tica, utilizamos um modelo experimental modificado para a indu??o de les?es canceriz?veis. Neste modelo experimental testamos uma nova alternativa farmacol?gica utilizada para o tratamento de diferentes tipos de c?nceres, o sunitinib, um inibidor m?ltiplo de tirosina quinase, que age nas c?lulas endoteliais e nos pericitos inibindo o processo de angiog?nese que ? essencial para o crescimento tumoral. Neste segundo estudo avaliamos qualitativamente e quantitativamente os efeitos morfol?gicos do sunitinib nas les?es canceriz?veis induzidas por DMBA na mucosa da bolsa jugal de hamster s?rio dourado. Ademais avaliamos diferentes par?metros cl?nicos destes animais. Nossos principais achados relativos ao segundo estudo foram: 1 - O sunitinib n?o foi capaz de reverter o decr?scimo de ganho de peso corp?reo, induzido por DMBA; 2 - O sunitinib foi capaz de inibir o crescimento tumoral e a presen?a de ulcera??es induzidas pelo DMBA; 3 - O sunitinib foi capaz de reverter o aumento de cristas epiteliais induzido por DMBA. Deste modo, o sunitinib pode ser considerado um agente efetivo para a quimiopreven??o destes tumores, constituindo uma alternativa interessante para novos estudos, em est?gios mais avan?ados desta patologia, utilizando o modelo de c?ncer bucal em bolsa jugal de hamster ou modelos similares.

Made available in DSpace on 2015-04-14T14:51:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 389154.pdf: 376076 bytes, checksum: 42625af3d28cd5491852ff5969f589f9 (MD5) Previous issue date: 2007-03-02 / A esquizofrenia ? uma doen?a neuropsiqui?trica grave que atinge aproximadamente 1% da popula??o mundial. Gera um enorme custo social direto (hospitaliza??es, atendimentos, medica??es) e indireto (improdutividade, repercuss?es familiares). A esquizofrenia ? uma doen?a complexa e multifatorial, com alta herdabilidade (cerca de 80%). Nas d?cadas passadas, v?rias pesquisas realizadas com familiares demonstraram uma correla??o linear e direta entre o grau de parentesco e os riscos de surgimento da esquizofrenia. A mitoc?ndria ? o maior s?tio de produ??o de energia na c?lula e, por esta raz?o, muta??es no DNAmt (dele??es e/ou polimorfismos) podem causar altera??es no metabolismo mitocondrial, ocasionando danos aos tecidos. Altera??es na produ??o de energia podem implicar em muitas doen?as neurodegenerativas, como, por exemplo, o Mal de Parkinson, Alzheimer e a Esclerose Amiotr?fica Lateral. Algumas muta??es no DNAmt diminuem a atividade da citocromo c oxidase e podem estar relacionadas com o aumento do risco para esquizofrenia na popula??o. No presente trabalho, foi investigada a preval?ncia de alelos em dois polimorfismos no DNAmt de pacientes esquizofr?nicos e de controles. Foram analisados os polimorfismos C6489A e C7028T presentes no gene CO1 que codifica para a citocromo c oxidase. Foram utilizados oligonucleot?deos espec?ficos com o objetivo de amplificar as regi?es polim?rficas. Os produtos de PCR foram purificados e seq?enciados (MegaBACE 1000 / GE Helthcare TM), e as seq??ncias geradas analisadas, utilizando o programa Chromas vers?o 2.31. Foram analisados 80 pacientes esquizofr?nicos e 80 controles. Na an?lise estat?stica, foramutilizados o teste Q quadrado e Teste T de Student de uma via. Foram considerados significantes somente os resultados com p<0,05. N?o foi encontrado o alelo mutante A, na regi?o mutada C6489A. Em rela??o ao polimorfismo C7028T, dos 80 pacientes, 64% apresentam o alelo mutante T e, entre os controles, este alelo est? presente em 55% indiv?duos. Foi encontrada significativa associa??o entre o alelo T e o risco para desenvolver esquizofrenia. Veri ficou-se que o alelo T pode ser considerado um fator de risco para esquizofrenia, j? que, na compara??o com o alelo C, ele ? mais de tr?s vezes prevalente no grupo de pacientes esquizofr?nicos. Dessa forma, demonstrou-se uma forte associa??o entre a esquizofrenia e o alelo mutante T

Made available in DSpace on 2015-04-14T14:51:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 457610.pdf: 991749 bytes, checksum: d91843d27688e0357561bae1a127e7a1 (MD5) Previous issue date: 2014-02-28 / This study investigated whether the spinal or systemic treatment with the lipid resolution mediators resolvin D1 (RvD1), aspirin-triggered resolvin D1 (AT-RvD1) and resolvin D2 (RvD2) might interfere with behavioral and neurochemical changes in the mouse fibromyalgia-like model induced by reserpine. Acute administration of AT-RvD1 and RvD2 produced a significant inhibition of mechanical allodynia and thermal sensitization in reserpine-treated mice, whereas RvD1 was devoid of effects. A similar antinociceptive effect was obtained by acutely treating animals with the reference drug pregabalin. Noteworthy, the repeated administration of AT-RvD1 and RvD2 also prevented the depressive-like behavior in reserpine-treated animals, according to assessment of immobility time, although the chronic administration of pregabalin failed to affect this parameter. The induction of fibromyalgia by reserpine triggered a marked decrease of dopamine and serotonin (5-HT) levels, as examined in total brain, spinal cord, cortex and thalamus. Reserpine also elicited a reduction of glutamate levels in total brain, and a significant increase in the spinal cord and thalamus. Chronic treatment with RvD2 prevented 5-HT reduction in total brain, and reversed the glutamate increases in total brain and spinal cord. Otherwise, AT-RvD1 led to a recovery of dopamine levels in cortex, and 5-HT in thalamus, whilst it diminished brain glutamate contents. Concerning pregabalin, this drug prevented dopamine reduction in total brain, and inhibited glutamate increase in brain and spinal cord of reserpine-treated animals. Our data provide novel evidence, showing the ability of D-series resolvins AT-RvD1, and mainly RvD2, in reducing painful and depressive symptoms allied to fibromyalgia in mice. / O presente estudo investigou o poss?vel efeito do tratamento central ou sist?mico com os mediadores lip?dicos de resolu??o da inflama??o, Resolvina D1 (RvD1), RvD1 ativada pela aspirina (AT-RvD1) e Resolvina D2 (RvD2) sobre mudan?as comportamentais e neuroqu?micas em um model de fibromialgia induzido por reserpina em camundongos. A administra??o aguda de AT-RvD1 e RvD2 produziu um efeito inibit?rio significativo sobre a alod?nia mec?nica e a hipersensibiliza??o t?rmica nos animais tratados com reserpina, sendo que nenhum efeito foi observado quando os animais foram tratados com RvD1. A administra??o aguda de pregabalina, f?rmaco de refer?ncia para o tratamento da fibromialgia, apresentou um efeito antinociceptivo similar ?quele observado para AT-RvD1 e RvD2. Interessante, a administra??o repetida e sist?mica de AT-RvD1 e RvD2 tamb?m preveniu o comportamento depressivo nos animais que receberam reserpina, de acordo com a avalia??o do tempo de imobilidade, enquanto que a administra??o cr?nica de pregabalina n?o apresentou efeito sobre esse par?metro. A indu??o de fibromialgia pela reserpina produziu uma redu??o marcante dos n?veis de dopamina e serotonina (5-HT), quando avaliados no c?rebro total, medula espinhal, c?rtex e t?lamo. A reserpina tamb?m promoveu uma redu??o nos n?veis de glutamato no c?rebro total e, um aumento significativo na medula espinhal e no t?lamo. O tratamento cr?nico com RvD2 preveniu a redu??o de 5-HT no c?rebro total e, reverteu o aumento do glutamato no c?rebro total e medula espinhal. Por outro lado, AT-RvD1 restaurou os n?veis de dopamina no c?rtex e de 5-HT no t?lamo, ao mesmo tempo em que, reduziu os n?veis de glutamato no c?rebro. Em rela??o ? pregabalina, ela preveniu a redu??o de dopamina no c?rebro total e inibiu o aumento do glutamato no c?rebro e na medula espinhal dos animais tratados com reserpina. Nossos resultados fornecem novas evid?ncias quanto aos efeitos da AT-RvD1 e, principalmente RvD2 na redu??o da dor e, ainda, da depress?o, no modelo de fibromialgia induzida por em camundongos.

Made available in DSpace on 2015-04-14T14:51:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 458139.pdf: 1285140 bytes, checksum: 007aa44c0f4f5b63ed16f382d6a0b0a9 (MD5) Previous issue date: 2014-03-31 / Persistence is an antimicrobial tolerance phenotype with an unclear molecular background. Such tolerant cells (called persisters) correspond to small portions of the bacterial population and are capable of surviving excessive concentrations of the drug, even though they do not possess any specific resistance mechanism. The clinical impact of persisters lies on their capacity to resume multiplication and reestablish the infection after the concentration of the drug diminishes in the infection site, possibly being responsible for the re-incidence and for the chronic aspect of certain infectious diseases. This survival phenotype has been observed in several species; however reports involving A. baumannii are scarce. Therefore, this work aimed to evaluate the persistence phenotype to antimicrobial drugs in nosocomial isolates of A. baumannii, as well as verifying the possible contribution of the sodB gene, which is involved in the control of oxidative stress, and the pmrC gene, a determinant of polymyxins resistance, in persister cells formed upon polymyxin B exposure. In order to do so, clinical isolates of A. baumannii were exposed to high concentration of tobramycin and polymyxin B for 6 h and the number of surviving cells were estimated every 1.5 h. In addition, the gene expressions at transcription level of two isolates were evaluated after the exposure to polymyxin B for 5 h. A high heterogeneity in the ability to form persister cells was observed among the isolates, presenting no correlation between the fractions of persisters after tobramycin and polymyxin B treatments. These data may indicate genetic or epigenetic variations that are determinant to the development of this characteristic, and that are not related among drugs of different classes. Moreover, the preliminary results of the gene expression assays may suggest that the mechanism involved in the polymyxin B resistance phenotype does not directly participate in persistence to polymyxin B, nor indicate the participation of sodB in this phenotype. In conclusion, the molecular mechanisms for persistence are still to be determined, and this characterization is highly important to assist in the development of new therapeutic options. / A persist?ncia ? um fen?tipo de toler?ncia a f?rmacos antimicrobianos com bases moleculares pouco entendidas. Tais c?lulas tolerantes (chamadas de persisters) correspondem a pequenas parcelas da popula??o bacteriana e s?o capazes de sobreviver a concentra??es elevadas do f?rmaco, mesmo sem possuir mecanismos de resist?ncia espec?ficos. O impacto cl?nico das c?lulas persisters se d? pela capacidade destas c?lulas de retomar seu crescimento e restabelecer a infec??o ap?s os n?veis do f?rmaco diminu?rem no s?tio da infec??o, podendo ser respons?veis pela reincid?ncia e pelo aspecto cr?nico de certas doen?as infecciosas. Este fen?tipo de sobreviv?ncia j? foi observado em in?meras esp?cies, por?m relatos envolvendo o A. baumannii s?o escassos. Portanto, este trabalho teve por objetivo avaliar o fen?tipo de persist?ncia a drogas antimicrobianas em isolados nosocomiais de A. baumannii, bem como verificar a poss?vel participa??o do gene sodB envolvido no controle do estresse oxidativo e do gene pmrC, determinante de resist?ncia ?s polimixinas, em c?lulas persisters formadas a partir da exposi??o ? polimixina B. Para tal, isolados cl?nicos de A. baumannii foram expostos a concentra??es elevadas de tobramicina e polimixina B por 6 h e o n?mero de c?lulas sobreviventes foi averiguado em intervalos de 1,5 h. Al?m disso, as express?es g?nicas a n?vel de transcri??o de dois isolados foram avaliadas ap?s a exposi??o ? polimixina B por 5 h. Uma grande heterogeneidade na capacidade de forma??o de c?lulas persisters foi observada dentre os isolados, n?o havendo correla??o entre a fra??o de persisters ap?s o tratamento com tobramicina e polimixina B. Estes dados podem indicar varia??es gen?ticas ou epigen?ticas determinantes para o desenvolvimento desta caracter?stica, as quais n?o s?o relacionadas entre drogas de diferentes classes. Al?m disso, os resultados preliminares dos ensaios de express?o g?nica podem sugerir que o mecanismo de resist?ncia ?s polimixinas n?o participa diretamente na persist?ncia ? polimixina B, e que n?o h? a participa??o de sodB no desenvolvimento e manuten??o deste fen?tipo nas condi??es testadas. O estudo desta caracter?stica e de seus determinantes moleculares s?o de suma import?ncia para o desenvolvimento de novas op??es terap?uticas.

Made available in DSpace on 2015-04-14T14:51:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 458474.pdf: 1757493 bytes, checksum: c5379d3dddf546f5888748177b083560 (MD5) Previous issue date: 2014-03-07 / Acute viral bronchiolitis is the most common respiratory illness in children in the first years of life and at least half of patients are diagnosed with respiratory tract infection by viruses such as Respiratory Syncytial Virus (RSV). Because RSV is extremely common disease it generates large number of hospitalizations and large costs to health systems. The RSV Fusion (F) Protein is essential for the infective cycle of the virus. Neutrophils and their products are present in the airways of RSV-infected patients who developed increased lung disease due to viral infection. Neutrophil Extracellular Traps (NETs) are formed by the release of the inner content of neutrophils (proteins from granules and DNA) in the extracellular space in response to different stimuli. They are essential to prevent the spread of microorganisms, which are killed by antimicrobial proteins that are anchored in networks of DNA, such as elastase and myeloperoxidase. The objective of this work is to characterize the effect of the RSV F protein on the generation of NETs. The F protein was capable of inducing the formation of NETs in vitro in a dose-dependent way with co-expression of neutrophil elastase and myeloperoxidase. The production of NETs in response to F protein was mediated by the TLR-4-receptor and was dependent on ROS production, p38 and ERK MAPK. Together, these data provide evidence that support the activation of specific signaling pathways by the F protein to induce the production of NETs. Excessive production of NETs can aggravate the inflammatory symptoms induced by infection with RSV. / A bronquiolite viral aguda ? a doen?a respirat?ria mais frequente em crian?as nos primeiros anos de vida, sendo que ao menos a metade dos pacientes ? diagnosticado com infec??o respirat?ria por v?rus como o V?rus Sincicial Respirat?rio (RSV). Por ser uma doen?a extremamente comum gera grande n?mero de interna??es e grandes custos aos sistemas de sa?de. A prote?na de fus?o (F) do RSV ? essencial para o ciclo infectivo do v?rus. Neutr?filos e seus produtos est?o presentes nas vias a?reas de pacientes infectados por RSV que desenvolveram doen?a pulmonar aumentada devido a infec??o viral. As Redes Extracelulares de Neutr?filos (NETs) s?o formadas pela libera??o do conte?do nuclear dos neutr?filos no espa?o extracelular em resposta a diferentes est?mulos, sejam patog?nicos ou n?o. Elas s?o fundamentais para impedir a dissemina??o de microrganismos, que s?o mortos pelas prote?nas antimicrobianas que ficam ancoradas nas redes de DNA, como elastase e mieloperoxidase. O objetivo desta disserta??o ? caracterizar o efeito da prote?na F do RSV sobre a gera??o de NETs. A prote?na F foi capaz de induzir a forma??o de NETs in vitro de forma dose-dependente e com a co-express?o de elastase neutrof?lica e mieloperoxidase. A produ??o de NETs pela prote?na F foi mediada pelo TLR-4, e dependente da produ??o de ROS e de ERK-p38 MAPK. Juntos, estes dados fornecem evid?ncias que suportam a ativa??o de vias de sinaliza??o espec?ficas pela prote?na F para induzir a produ??o de NETs. A produ??o excessiva de NETs pode agravar os sintomas inflamat?rios induzidos pela infec??o com RSV.

Made available in DSpace on 2015-04-14T14:51:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 459166.pdf: 2547388 bytes, checksum: 27814fb2b5f7b670424cdc2d80523d6f (MD5) Previous issue date: 2014-03-06 / Disturbances in glutamatergic signaling have been proposed as the cause of many diseases of the nervous system. The zebrafish has been considered as an efficient model in the investigation of the neurochemical basis of various disorders, such as schizophrenia and epilepsy. Several neurotransmitter systems have been characterized in zebrafish, including the glutamatergic system. Moreover, a vast repertoire of behavioral responses to drugs has been characterized in particular in adults. However, little information is available about the ability to generate response to classic drugs of glutamatergic action in the early stages of development in zebrafish. Throughout development, ionotropic glutamate receptors have an orderly variability between the subunits that compose them, giving them different pharmacokinetic properties and degree of affinity for their ligands. In this way, we analyzed the locomotor/behavioral profile of zebrafish in response to the glutamate receptor antagonist, MK-801, in different doses in 30, 60, 120 days post-fertilization (dpf) and 2 years post-fertilization animals, as well the effect of caffeine pre-exposure on MK-801 action. Additionally, we analyzed the expression profile of subunits that comprise the NMDA receptor in whole brain of zebrafish during development. Locomotor/behavioral response to kainic acid (KA) was evaluated in different doses at ages 7, 15 and 30 dpf. Also, the pre-exposure to kainic acid in 24 hours post-fertilization (hpf) and 7 and 15 dpf animals was challenged by a second exposure to kainic acid at 2 months post-fertilization The results demonstrated that zebrafish has an age-dependent response to MK-801 and kainic acid, at least on the locomotor/behavior aspects. The peak of locomotor response to MK-801 occurred at 60-120 days post-fertilization, which was partially prevented by caffeine and able to alter the time on upper zone of aquarium as a measure of anxiety. Analysis of gene expression of NMDA receptor subunits in zebrafish brain demonstrated that NR2C and NR2D subunits have later expression in comparison to subunits NR1, NR2A and NR2B. The animals that were exposed to KA showed alterations in locomotor activity without displaying classic convulsive characteristics. However, pre- exposure to 7dpf KA was able to partially prevent the seizure events in response to KA injection (6 mg / K) at 2 months post- fertilization. / Dist?rbios na sinaliza??o glutamat?rgica s?o propostos como a causa de in?meras patologias do sistema nervoso. O peixe-zebra tem sido considerado um eficiente modelo na investiga??o das bases neuroqu?micas de diversos transtornos, tais como a esquizofrenia e a epilepsia. Diversos sistemas de neurotransmiss?o j? foram caracterizados em peixe-zebra, incluindo o sistema glutamat?rgico. Al?m disto, um vasto repert?rio de respostas comportamentais a f?rmacos j? foram caracterizados em especial em indiv?duos adultos. Entretanto, pouca informa??o ? dispon?vel a cerca da capacidade de gerar resposta a cl?ssicas drogas de a??o glutamat?rgica em fases iniciais do desenvolvimento em peixe-zebra. Ao longo do desenvolvimento, os receptores glutamat?rgicos apresentam uma ordenada variabilidade entre as subunidades que os comp?em, o que lhes confere diferentes propriedades farmacocin?ticas e grau de afinidade por seus ligantes. Desta forma, neste trabalho foi analisado o perfil de resposta locomotora/comportamental do peixe-zebra ao antagonista glutamat?rgico MK-801 em diferentes doses nas idades de 30, 60, 120 dias p?s-fertiliza??o (dpf) e 2 anos p?s-fertiliza??o(apf), bem como o efeito da pr?-exposi??o ? cafe?na sobre os efeitos do MK-801. Adicionalmente, foi analisado o perfil de express?o das subunidades que comp?em o receptor NMDA em c?rebro total de peixe-zebra ao longo do desenvolvimento. A resposta locomotora ao ?cido ca?nico (KA) tamb?m foi avaliada em diferentes doses nas idades de 7, 15 e 30 dpf. A pr?-exposi??o ao ?cido ca?nico em animais de 24 horas p?s-fertiliza??o (hpf) e 7 e 15 dpf foi confrontada pela exposi??o ao ?cido ca?nico aos 2 meses de vida do peixe-zebra. Os resultados encontrados neste trabalho demonstram haver uma resposta idade-dependente na atividade locomotora do peixe-zebra, tanto para MK-801 quanto para ?cido ca?nico. O pico de resposta locomotora ao MK-801 foi entre 60 e 120 dpf, o qual foi parcialmente prevenido pela pr?-exposi??o ? cafe?na e foi capaz de alterar de forma idade-dependente o tempo no topo do aqu?rio, utilizado como uma medida de ansiedade. A an?lise de express?o das subunidades dos receptores NMDA em c?rebro de peixe-zebra demonstrou que as subunidades NR2C e NR2D possuem express?o tardia em rela??o ?s subunidades NR1, NR2A e NR2B. Os animais que foram expostos ao KA apresentaram altera??o na atividade locomotora sem exibir caracter?sticas convulsivas cl?ssicas. Entretanto, a pr?-exposi??o ao KA aos 7dpf foi capaz de prevenir parcialmente os eventos convulsivos em resposta ? inje??o de KA (6 mg/Kg, i.p) aos 2 meses p?s-fertiliza??o.

Made available in DSpace on 2015-04-14T14:51:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 459170.pdf: 2176701 bytes, checksum: a35f9eb08768c0d90b70f0dca32cbe46 (MD5) Previous issue date: 2014-03-31 / The mycobacterial DNA-binding protein 2 (MDP2) of Mycobacterium tuberculosis is a small, basic protein known to bind to DNA in a non-specific manner and to anchor the nucleoid to the plasma membrane, promoting its unpacking. Motivated by a prior intrinsic disorder pre-diction in silico, we have used a complementary set of techniques to characterize this pro-tein, such as heat and chemical stability, gel filtration, limited proteolysis and electrophoret-ic mobility. Our results suggest that the MDP2 is structurally disordered, since it (1) was pre-dicted to be an IDP, having 86 % of its structure disordered; (2) resisted to denaturation in-duced by boiling temperature and to the chemical thrichloroacetic acid (TCA); (3) migrated anomalously on SDS-PAGE, appearing to be 1.4-fold higher its calculated molecular weight; and (4) was highly sensitive to proteolysis performed by proteinase K in comparison to glob-ular proteins. We also accomplished two experiments to determine the quaternary structure of the MDP2, such as gel-filtration and glutaraldehyde crosslinking. These two experiments showed that the protein has a tendency of self-aggregation, forming large clusters of pro-tein. We also performed the site-directed mutagenesis by allelic exchange in the hns gene, in order to develop a M. tuberculosis strain lacking the protein MDP2. The result of this knock-out showed that the hns gene is not essential for the survival of the mycobacteria, confirm-ing previous results performed by transposon mutagenesis. Combined with previous results related to MDP2 from other works, we speculate that this protein uses its highly disorder N-terminal region to bind to DNA through its KAAK and PAKK sequences in a non-specific man-ner. Thereby the MDP2 may act as a promiscuous protein inside the cell, binding to different regions of nucleoid by forming large clusters of proteins, in order to perform the DNA un-packing and to regulate several genes of the mycobacteria. We hope this work may contrib-ute to a better understanding of the mycobacterial metabolism, since the M. tuberculosis still stands a major global threat. / A prote?na micobacteriana ligadora de DNA 2 (MDP2) de Mycobacterium tuberculosis ? uma prote?na pequena e de car?ter b?sico, conhecida por se ligar ao DNA de uma forma n?o es-pec?fica e de ancorar o nucle?ide ? membrana plasm?tica promovendo o seu desempacota-mento. Motivados por uma predi??o de desordem intr?nseca in silico pr?via, n?s usamos um conjunto de t?cnicas complementares para caracterizar esta prote?na, tais como determina-??o da estabilidade ao calor e a desnaturantes qu?micos, gel filtra??o, prote?lise limitada e mobilidade eletrofor?tica. Nossos resultados sugerem que a MDP2 ? estruturalmente de-sordenada, uma vez que ela (1) foi predita por ser uma prote?na intrinsecamente desorde-nada (IDP), possuindo 86 % da sua estrutura desordenada; resistiu ? desnatura??o induzida por temperatura de fervura e pela a??o qu?mica do ?cido tricloroac?tico (TCA); (3) migrou anomalamente em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE), aparentando ser 1,4 vezes maior que o seu peso molecular calculado; e (4) foi altamente sens?vel ? prote?lise realizada pela protei-nase K, em compara??o ?s prote?nas globulares. N?s tamb?m realizamos dois experimentos para determinar a estrutura quatern?ria da prote?na, como a gel filtra??o e o crosslinking por glutaralde?do. Estes dois experimentos mostraram que a prote?na tem uma tend?ncia a auto agrega??o, formando grandes aglomerados em solu??o. Tamb?m foi realizada a muta-g?nese s?tio-dirigida por troca al?lica no gene hns, com o intuito de desenvolver uma cepa de M. tuberculosis sem a prote?na MDP2. O resultado deste nocaute mostrou que o gene hns n?o ? essencial para a sobreviv?ncia da micobact?ria. Combinado com resultados pr?vios de outros trabalhos relacionados ? MDP2, n?s especulamos que esta prote?na usa sua regi?o N-terminal altamente desordenada para se ligar ao DNA por meio das suas sequ?ncias repetiti-vas KAAK e PAKK de uma forma n?o espec?fica. Desta forma, a MDP2 deve atuar como uma prote?na prom?scua dentro da c?lula, ligando-se a diferentes regi?es do nucle?ide pela for-ma??o de grandes aglomerados de prote?na, com o objetivo de realizar o desempacotamen-to do DNA e de regular diversos genes micobacterianos. N?s esperamos que este trabalho possa contribuir para um melhor entendimento do metabolismo micobacteriano, uma vez que o M. tuberculosis ainda ? uma grande amea?a global.

Made available in DSpace on 2015-04-14T14:51:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 459291.pdf: 2043101 bytes, checksum: 4e24ba48e0e78b22fe2b62461eb9b386 (MD5) Previous issue date: 2014-03-24 / Genotyping of polymorphic short tandem repeats (STRs) loci is widely used in forensic DNA analysis. STR loci eventually present tri-allelic pattern as a genotyping irregularity and, in that situation, the doubt about the tri-allele locus calculation can reduce the analysis strength. Alleles at the TPOX STR locus have 6 14 different numbers of a four-nucleotide (AATG) repeat motif arranged in tandem. Although tri-allelic genotypes are generally rare, the TPOX tri-allelic pattern has a higher frequency, varying widely among populations. Despite this, there are few accurate reports to disclose the nature of the TPOX third allele. In this work we performed two studies: In the first one we present data obtained from 45 individuals belonging to the same pedigree, in which there were cases of tri-allelic TPOX genotypes. The subjects were apparently healthy with a normal biological development. We noticed six tri-allelic cases in this family, and all of them were women. Karyotype analysis showed no occurrence of partial 2p trisomy. All the tri-allelic cases had the genotype 8 10 11, probably due to three copies of the TPOX STR sequence in all cells (Type 2 tri-allelic pattern). Based on previous data we assumed an allele 10 as the TPOX third allele. The pedigree analyses show evidence that the TPOX extra allele was an allele 10, it is placed far from the main TPOX locus, and that there is a potential linkage of the TPOX extra-allele-10 with one marker on Xq. This was the first study that included a large pedigree analysis in order to understand the nature TPOX tri-allelic pattern. In the second study, we investigate whether there is a single third-extra allele in the TPOX tri-allelic pattern, what it is, and where it is. We looked for TPOX tri-allelic subjects in 75,113 Brazilian families. Considering only the parental generation (mother+father) we had 150,226 unrelated subjects evaluated. From this total, we found 88 unrelated subjects with tri-allelic pattern in the TPOX locus (0.06%; 88/150,226). Seventeen percent of these subjects (15/88) presented heterozygosis with peak imbalance, which we describe as a derived category to Clayton s Type 2 tri-allelic pattern (a higher peak of double dose homozygote plus a regular sized peak). In this paper we presented detailed data from 66 trios (mother+father+child; with true biological relationships) where the tri-allelic pattern was observed in the mother or in the father. In 39 of these families (39/66; 59%) the third-extra TPOX allele was transmitted either from the mother or from the father to the child. Our evidence indicated an allele 10 as the thirdextra TPOX allele, and it is on the X chromosome. The present data, which support the previous hypothesis, improve the knowledge about tri-allelic pattern of TPOX CODIS' locus allowing the use of TPOX profile in forensic analyses even when with tri-allelic pattern. This evaluation is now available for different forensic applications / A genotipagem de short tanden repeats ( STRs ) ? amplamente utilizada na an?lise de DNA forense, contudo eventuais ocorr?ncias de trialelias podem reduzir o poder da an?lise. Alelos do l?cus de STR TPOX tem de 6-14 n?meros diferentes do motivo de repeti??o em tandem de quatro nucleot?deos (AATG). Apesar dos gen?tipos tri-al?licos sejam geralmente raro, o padr?o tri-al?lico do TPOX tem uma alta freq??ncia, variando amplamente entre as popula??es. Apesar disso, h? poucos relatos precisos para divulgar a natureza do terceiro alelo do TPOX. Neste trabalho n?s realizamos dois estudos: No primeiro, apresentamos os dados obtidos a partir de 45 indiv?duos pertencentes ? mesma linhagem, em que houve casos de gen?tipos tri-al?licos do TPOX. Os indiv?duos foram aparentemente saud?vel, com um desenvolvimento biol?gico normal. Percebemos seis casos tri-al?licos nesta fam?lia, e todos eles foram em mulheres. A an?lise do cari?tipo mostrou nenhuma ocorr?ncia de trissomia parcial 2p. Todos os casos trial?licos tinham o gen?tipo 8-10-11, provavelmente devido a tr?s c?pias da seq??ncia do STR TPOX em todas as c?lulas (Padr?o tri-al?lico tipo 2). Com base nos dados anteriores, assumimos o alelo 10 como sendo o terceiro alelo do TPOX. As an?lises do pedigree mostraram evid?ncias de que o alelo extra do TPOX foi o alelo 10, ? localizado distante do l?cus principal do TPOX, e que existe um potencial de liga??o entre o alelo- extra-10 do TPOX com um marcador em Xq. Este foi o primeiro estudo que incluiu uma grande an?lise do pedigree, a fim de compreender a natureza do padr?o tri-al?lico do TPOX. No segundo estudo, investigamos se h? um ?nico terceiro extra-alelo no padr?o tri-al?lico do TPOX, o que ? ele, e onde est?. N?s pesquisamos por indiv?duos tri-al?licos no l?cus TPOX em 75.113 fam?lias brasileiras. Considerando apenas a gera??o parental (m?e + pai) tivemos 150.226 indiv?duos n?o relacionados avaliados. Desse total, encontramos 88 indiv?duos n?o relacionados com o padr?o tri-al?lico no l?cus TPOX (0,06%, 88/150, 226). Dezessete por cento destes indiv?duos (15/88) apresentaram heterozigoses com desbalan?o de picos, que descrevemos como uma categoria derivada do padr?o tri-al?lico de Clayton Tipo 2 (um pico mais alto de homozigoto dose dupla, mais um pico de tamanho regular). Neste trabalho, apresentamos dados detalhados de 66 trios (m?e + pai + filho; com verdadeiras rela??es biol?gicas) onde o padr?o tri-al?lico foi observado na m?e ou no pai. Em 39 destas fam?lias (39/66; 59%) o terceiro alelo-extra do TPOX foi transmitido tanto a partir da m?e ou do pai para a crian?a. Nossas evid?ncias indicaram o alelo 10 como sendo o terceiro alelo-extra do TPOX, e ele est? no cromossoma X. Os dados apresentados, os quais suportam as hip?teses anteriores, melhoram o entedimento sobre o padr?o tri-al?lico do l?cus TPOX do CODIS permitindo o uso do perfil TPOX em an?lises forense, mesmo quando com o padr?o tri-al?lico. Essa avalia??o est? agora dispon?vel para diferentes aplica??es forenses