Tese de Mestrado Integrado. Bioengenharia (Área de Especialização de Engenharia Biológica). Faculdade de Engenharia. Universidade do Porto. 2012

Made available in DSpace on 2013-08-07T18:42:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000449081-Texto+Completo-0.pdf: 619736 bytes, checksum: f49f3ff20314e610e563f984cfead299 (MD5) Previous issue date: 2013 / Salmonella Enteritidis is the most prevalent serotype isolated in Brazil, mainly associated with poultry products, which have been primarily involved in foodborne disease outbreaks. The high prevalence of reduced susceptibility to antimicrobial agents in various Salmonella serotypes isolated from samples related to livestock animal, animal foods and human has been reported worldwide. Therefore, has increased the interest in investigating the genetic mechanisms involved in resistance to antimicrobial agents, especially genetic elements capable of carrying resistance genes cassettes, which could be the origin of multi-resistant strains. Besides the genetically determined antimicrobial resistance, bacteria can also exhibit resistance by the ability to form biofilm, which protects bacteria from environmental stresses, favoring the colonization and persistence of these microorganisms in the environment. Thus, the aim of this study was to determine the antimicrobial susceptibility of S. Enteritidis strains and investigate the genes involved in the main resistance determined, as well as evaluate the ability of these strains in to produce biofilm. Forty-seven S. Enteritidis strains isolated from human, poultry, swine, and food were analyzed. Sixteen isolates (34%) were phenotypically resistant to at least one antibiotic tested. Of these, four isolates harbored class 1 integron. All strains resistant to sulfonamide had concomitantly genes sul1 and sul2. The genes strA, strB, aadA and aadB were identified in the majority of the aminoglycosides resistant isolates, whereas 92. 9% showed strA, 71. 4% strB, 7. 1% aadA and 50% aadB. The tetB gene was detected in two of the three strains resistant to tetracycline, and tetC in one. In the three strains resistant to ampicillin the blaTEM gene was detected. Overall, among the 47 S. Enteritidis tested, 89. 4% strains were able to form biofilm on polystyrene plates. Among these, 42. 4% were considered weak biofilm producers, 14. 9% moderate producers and 34% strong producers. It has been demonstrated that the majority of the S. Enteritidis strains that showed resistance to at least one antimicrobial agent were able to form biofilm, which increases concerns about food contamination, especially by the possibility of persistence of bacteria resistant to antibiotics on the environment and the subsequently dissemination of these strains to human. / A Salmonella Enteritidis tem sido o sorotipo mais prevalente no Brasil, principalmente associado a produtos de origem avícola, que têm sido prioritariamente envolvidos em surtos de doenças transmitidas por alimentos. A alta prevalência de suscetibilidade reduzida a antimicrobianos em diversos sorotipos de Salmonella isolados de amostras relacionadas a animais de produção, a humanos e a alimentos de origem animal vem sendo relatada no mundo inteiro. Com isto, tem aumentado o interesse em investigar os mecanismos genéticos envolvidos na resistência a antimicrobianos, especialmente elementos genéticos capazes de carrear cassetes de genes de resistência, o que pode constituir a origem de cepas multi-resistentes. Além da resistência a antimicrobianos determinada geneticamente, as bactérias também podem apresentar resistência pela habilidade de formar biofilme, protegendo-as de estresses ambientais, favorecendo a colonização e persistência desses microrganismos no ambiente. Deste modo, o objetivo deste estudo foi determinar a suscetibilidade a antimicrobianos de cepas de S. Enteritidis e investigar os genes envolvidos nas principais resistências determinadas, bem como avaliar a capacidade de formação de biofilme destas cepas. Para tanto, foram analisadas 47 cepas de S. Enteritidis isoladas de humanos, aves, suínos e alimentos. Dezesseis isolados (34%) se mostraram fenotipicamente resistentes a pelo menos um antimicrobiano testado. Destes, quatro apresentaram integron de classe 1. Todas as cepas resistentes à sulfonamida apresentaram concomitantemente os genes sul1 e sul2. Os genes strA, strB, aadA e aadB foram identificados na maioria dos isolados que apresentaram resistência a aminoglicosídeos, sendo que 92,9% apresentaram o gene strA, 71,4% strB, 7,1% aadA e 50% aadB. O gene tetB foi detectado em duas das três cepas resistentes à tetraciclina e o tetC em uma. Já as três cepas resistentes à ampicilina apresentaram o gene blaTEM. No total, dentre as 47 cepas de S. Enteritidis testadas, 89,4% foram capazes de formar biofilme em placas de poliestireno. Dentre estas, 42,4% foram consideradas fracas produtoras de biofilme, 14,9% produtoras moderadas e 34% fortes produtoras. Foi demonstrado que a maioria das cepas que mostraram resistência a pelo menos um antimicrobiano foram capazes de formar biofilme, o que aumenta a preocupação a respeito da contaminação de alimentos, especialmente pela possibilidade de persistência de microrganismos resistentes a antimicrobianos no ambiente e a subsequente disseminação destas cepas para humanos.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:52Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2002-12-03Bitstream added on 2014-06-13T18:44:26Z : No. of bitstreams: 1 lago_ncmr_dr_jabo.pdf: 311083 bytes, checksum: d37d23bdb294492d8a23bb6c6424608b (MD5) / O Bacillus cereus é um microrganismo ubíquo encontrado freqüentemente em produtos lácteos. As perdas econômicas e o risco que traz à saúde pública são alarmantes. Os objetivos deste trabalho foram pesquisar o Bacillus cereus em leite, verificar a sua capacidade enterotoxigênica e o risco que provoca à saúde pública e comparar diferentes técnicas utilizadas para detecção de toxinas. Para tal, foram analisadas 120 amostras de leite (30 de leite cru, 30 de leite pasteurizado, 30 de leite em pó e 30 de UAT). Para a pesquisa de enterotoxinas, foram utilizadas três técnicas. Encontraram-se contaminadas 15 (50,0%), 29 (96,7%), 22 (73,3%) e 4 (13,3%) amostras de leite cru, pasteurizado, em pó e UAT, respectivamente. Para a detecção de enterotoxinas pela técnica da alça ligada em coelhos, foram positivas, respectivamente, 1 (7,1%), 10 (35,7%) e 3 (13,6%) cepas das amostras de leite cru, pasteurizado e em pó. Para o teste de aumento de permeabilidade vascular dérmica, apresentaram-se enterotoxigênicas, respectivamente, 1 (7,1%), 1 (3,6%), 2 (9,1%) e 1 (4,0%) cepas isoladas de leite cru, pasteurizado, em pó e UAT. Para a detecção de enterotoxinas pela prova de aglutinação passiva em látex, apresentaram-se positivas 7 (63,6%), 4 (30,8%), 3 (33,3%) e 8 (80,0%) cepas isoladas, respectivamente, de leite cru, pasteurizado, em pó e UAT. Conclui-se que as amostras de leite analisadas, principalmente as amostras já processadas termicamente, deixam a desejar quanto a sua qualidade, colocando em risco a saúde dos consumidores. Conclui-se também que a técnica de aglutinação é a mais indicada para a detecção da enterotoxina produzida pelo Bacillus cereus. / Bacillus cereus is a ubiquitous microorganism frequently found in milk products. The economic losses and the damage to public health they cause are enormous. The objectives of this work were to search for Bacillus cereus in milk, their enterotoxigenic activity to estimate the risks the use of this product may produce and to compare different techniques used to detection of enterotoxins. For that, 120 samples of milk were examined (30 of raw milk, 30 of pasteurized milk, 30 of milk powder and 30 of UHT milk). To test the enterotoxigenicity, three techniques were used. Bacillus cereus was present in 15 (50,0%), 29 (96,7%), 22 (73,0%) and 4 (13,3%) samples of raw milk, pasteurized milk, milk powder and UHT milk, respectively. For the enterotoxigenicity detection using the assay in the rabbit ileal loop, 1 (7,1%), 10 (35,7%) and 3 (13,6%) strains from raw milk, pasteurized milk and milk powder were positive. For the enterotoxigenicity detection using the assay for vascular permeability activity, 1 (7,1%), 1 (3,6%), 2 (9,1%) and 1 (4,0%) strains from raw milk, pasteurized milk, milk powder and UHT milk were positive, respectively. Using the reversed passive latex agglutination, diarrheal toxin production was shown to be 7 (63,6%), 4 (30,8%), 3 (33,3%) and 8 (80,0%) strains respectively isolated from raw milk, pasteurized milk, milk powder, and UHT milk. It was concluded that the milk samples analyzed didn't present good quality and may put in risk the health of consumers of such products. We also concluded that the reversed passive latex agglutination is the best technique to determine the enterotoxins produced from Bacillus cereus.

Orientador: Ederio Dino Bidoia / Banca: José Carlos Marconato / Banca: Antonio Sérgio Spanó Seixas / Resumo: O tratamento adequado da água nas redes de abastecimento é de grande importância, para que doenças sejam evitadas. O processo tradicional mais utilizado para desinfecção de água é a cloração, porém esta vem causando sérios problemas, já que subprodutos são formados. Entre eles estão os trihalometanos, prejudiciais à saúde humana, por serem cancerígenos e mutagênicos. Busca-se então, métodos alternativos de desinfecção da água para abastecimento público. Processos Oxidativos Avançados (POAs) são as chamadas "tecnologias limpas" e vêm sendo estudados para este fim, pois consistem na produção de radicais altamente oxidantes, que provocam a morte de microrganismos, sem deixar resíduos na água. Dentre os POAs estão os processos fotocatalíticos, que através de luz UV e um eletrodo semicondutor, produzem radicais hidroxila, capazes de inativar uma série de microrganismos. No presente trabalho testamos o processo fotocatalítico, utilizando luz UV-A e eletrodos de TiO2 para verificar a eficiência da fotocatálise sobre a inativação das bactérias Escherichia coli e Staphylococcus aureus. Foi verificado que o processo é eficaz, sendo que sua eficiência pode ser significativamente melhorada quando o eletrodo é dopado com íons prata (aceptor de elétrons), promovendo a desinfecção total da água / Abstract: The disinfection of water has great importance because illnesses transmitted by water are prevented by killing of pathogenic microorganisms. The traditional process used for water disinfection is the chlorination. However, the chlorination produces some problems when chlorine reacts with organic matters forming trialomethanes. They are harmful to the health human and are carcinogenic and mutagenic. Thus, alternative methods for water disinfection such as: the advanced oxidative processes (AOP), such as the photocatalytic can be considered a "clean technology" because it consists of the highly oxidative substances like the hydroxyl radicals that provoke the death of microorganisms without leaving chemicals residues in the water. In the present work we tested the photocatalytic process using thermal TiO2 electrodes that works a semiconductor surface to producing hydroxyl radicals when UV light incises on the surface. The radical are capable to inactivate many kinds of microorganisms. We tested two bacteria, Staphylococcus aureus and Escherichia coli. It was verified that the process is efficient to kill bacteria and its efficiency can significantly be improved when the electrode was doped with silver ions (aceptor of electrons) promoting a total disinfection of water / Mestre

Orientador: Ricardo Andrade Reis / Coorientador: Juliana Duarte Messana / Banca: Marcia Helena Machado da Rocha Fernandes / Banca: Giovani Fiorentini / Banca: Thiago Fernandes Bernardes / Banca: Odilon Gomes Pereira / Resumo: Objetivou-se neste trabalho avaliar os efeitos de dietas contendo silagem inoculada com Lactobacillus plantarum e Bacillus subtilis e suplementadas ou não com amilase sobre a digestibilidade aparente, fermentação ruminal e síntese de proteína microbiana em carneiros, assim como o desempenho e qualidade de carne de cordeiros. Para tanto, dois estudos foram conduzidos, no quais os animais receberam um dos quatro tratamentos (dietas): 1) silagem de milho não inoculada sem adição de amilase na mistura total da ração (MTR); 2) silagem de milho não inoculada e amilase adicionada na MRT; 3) silagem de milho inoculada com 1 × 105 UFC de L. plantarum e 1 × 105 UFC de B. subtilis, sem adição de amilase; 4) silagem de milho inoculada com 1 × 105 UFC de L. plantarum e 1 × 105 UFC de B. subtilis e amilase adicionada na MRT. A enzima utilizada foi a amilase numa taxa de aplicação de 2 g de produto / kg de matéria seca (MS) da dieta (602 unidade dextrinizante (UD) / kg de MS da dieta). A suplementação com amilase em dietas contendo silagem não inoculada aumentou (P=0,045) o consumo de matéria seca dos carneiros quando comparados com aqueles alimentados com silagem não inoculada sem suplementação com amilase (1,311 vs. 1,066 g/d), mas não diferiu dos outros tratamentos. A digestibilidade aparente da MS, MO, PB, FDN e EB aumentou (P<0,01) nos carneiros alimentos com silagem inoculada ou suplementados com amilase, sem interações entre os tratamentos. Os animais alimentados com dietas contendo ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Objetivou-se neste trabalho avaliar os efeitos de dietas contendo silagem inoculada com Lactobacillus plantarum e Bacillus subtilis e suplementadas ou não com amilase sobre a digestibilidade aparente, fermentação ruminal e síntese de proteína microbiana em carneiros, assim como o desempenho e qualidade de carne de cordeiros. Para tanto, dois estudos foram conduzidos, no quais os animais receberam um dos quatro tratamentos (dietas): 1) silagem de milho não inoculada sem adição de amilase na mistura total da ração (MTR); 2) silagem de milho não inoculada e amilase adicionada na MRT; 3) silagem de milho inoculada com 1 × 105 UFC de L. plantarum e 1 × 105 UFC de B. subtilis, sem adição de amilase; 4) silagem de milho inoculada com 1 × 105 UFC de L. plantarum e 1 × 105 UFC de B. subtilis e amilase adicionada na MRT. A enzima utilizada foi a amilase numa taxa de aplicação de 2 g de produto / kg de matéria seca (MS) da dieta (602 unidade dextrinizante (UD) / kg de MS da dieta). A suplementação com amilase em dietas contendo silagem não inoculada aumentou (P=0,045) o consumo de matéria seca dos carneiros quando comparados com aqueles alimentados com silagem não inoculada sem suplementação com amilase (1,311 vs. 1,066 g/d), mas não diferiu dos outros tratamentos. A digestibilidade aparente da MS, MO, PB, FDN e EB aumentou (P<0,01) nos carneiros alimentos com silagem inoculada ou suplementados com amilase, sem interações entre os tratamentos. Os animais alimentados com dietas contendo silagem não inoculada e suplementados com amilase apresentaram alta proporção de ácido propiônico e baixa de ácido acético, e consequentemente baixa relação de aceitoc:propiônico. A síntese de proteína microbiana tendeu a ser maior (P=0,097) nos carneiros alimentados com silagem não inoculada e suplementados com a... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Orientador: Alessandro de Mello Varani / Coorientador: Lucia Maria Carareto Alves / Banca: Victor Satler Pylro / Banca: Jackson Antonio Marcondes de Souza / Resumo: A indústria sucroalcooleira gera elevado número de resíduos de origem da biomassa lignocelulósica que apresentam grande potencial para produção de biocombustíveis, em particular o etanol de segunda geração. Uma das formas promissoras para a desconstrução da biomassa lignocelulósica é através da utilização de consórcios bacterianos que produzem enzimas altamente específicas com a capacidade de quebrar a estrutura da lignocelulose. Porém, para a otimização desse processo é importante entender as funções metabólicas presentes nesses consórcios degradadores de biomassa. Portanto, esse estudo objetivou identificar e classificar a composição de uma comunidade bacteriana proveniente de consórcio oriundo de solo contendo bagaço de cana-de-açúcar em decomposição e avaliar sua capacidade metabólica através de sequenciamento genômico de alto rendimento e análises de bioinformática. Esse consórcio foi cultivado durante vinte semanas, sendo que amostras de DNA foram extraídas para sequenciamento a cada sete dias. O sequenciamento da subunidade 16S do operon ribossomal (16S rRNA) foi realizado utilizando a plataforma Ion PGM™, enquanto que o sequenciamento do DNA total foi realizado na plataforma HiSeq 2500, Illumina®. Os resultados do sequenciamento do 16S rRNA indicam 5 diferentes famílias bacterianas ao longo das 20 semanas, sendo Burkholderiaceae (73%) e Rhodanobacteraceae (24%) as mais abundantes. Análises do potencial funcional do consórcio realizadas através dos programas PICRUSt e ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The sugarcane ethanol industry generates a number of residues related to the lignocellulosic biomass which exhibit potential for the production of biofuels, in particular second generation ethanol. One of the promising ways for the deconstruction of lignocellulosic biomass to valuable products is through the use of bacterial consortia. These consortia encode a specific set of enzymes capable to metabolize and decompose the lignocellulose structure. However, to optimize this process, the metabolic functions present in a biomass-degrading consortia must be well known. Therefore, this study aimed to unravel the taxonomic composition, and to evaluate the metabolic profile of a bacterial consortium from a sugar-cane derived soil containing decomposing straw, through high-throughput genomic sequencing and bioinformatics analyzes. The selected consortium was cultivated in laboratory for twenty weeks, and DNA samples were extracted for sequencing every seven days. The 16S subunit of the ribosomal operon (16S rRNA) and total DNA sequencing were performed through the Ion PGM™ (Thermo Fischer) and HiSeq 2500 (Illumina) platforms, respectively. The 16S rRNA sequencing indicate at least 5 different bacterial families during the 20 weeks of cultivation. The Burkholderiaceae (73%) and Rhodanobacteraceae (24%) are the most abundant. Functional analyses, indicate an enrichment of the transporter-related function, including ABC-transporters mainly in the first week of cultivation, suggesting a probable role related with the decomposing of the lignocellulolytic material. The whole metagenome sequencing uncover the genomic sequence of one of the most abundant organisms present in the consortium (abundance ~24% of the sequenced reads). This genome was finished and circularized, exhibiting 4,758,639 bp, GC% of 65.25, a... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária, 2008. / Submitted by Diogo Trindade Fóis (diogo_fois@hotmail.com) on 2009-09-22T12:44:33Z No. of bitstreams: 1 2008_RafaelRochaAndrade.pdf: 735842 bytes, checksum: ce0a24e259ccfd7d09f8b75a7e097554 (MD5) / Approved for entry into archive by Gomes Neide(nagomes2005@gmail.com) on 2010-02-08T17:25:04Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2008_RafaelRochaAndrade.pdf: 735842 bytes, checksum: ce0a24e259ccfd7d09f8b75a7e097554 (MD5) / Made available in DSpace on 2010-02-08T17:25:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2008_RafaelRochaAndrade.pdf: 735842 bytes, checksum: ce0a24e259ccfd7d09f8b75a7e097554 (MD5) Previous issue date: 2008 / O objetivo deste trabalho foi verificar a ocorrência e identificar, por análise bioquímica e RFLPPCR do gene 23S rRNA, as espécies de Listeria spp. presentes em amostras de salsichas tipo hot dog a granel e carne bovina homogeneizada a granel comercializadas no Distrito Federal. A metodologia usada para a realização do isolamento bacteriano, bem como a diferenciação bioquímica foi a preconizada pela Instrução Normativa n° 40, de 16 de dezembro de 2005 do Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento do Brasil (MAPA), e, para a RFLP PCR foi utilizada a metodologia descrita por Paillard et al., (2003). Um total de 162 amostras, sendo 127 salsichas tipo hot dog e 35 amostras de carne bovina homogeneizada foram testadas. Das 127 amostras de salsichas tipo hot dog analisadas, 26 foram positivas para Listeria spp.. e, destas amostras positivas, 18 foram identificadas como Listeria innocua e 09 como Listeria monocytogenes, tanto na identificação por testes bioquímicos como por RFLP-PCR. Das 35 amostras de carne bovina homogeneizada testadas, 16 foram positivas para Listeria spp., destas, 12 foram identificadas como Listeria innocua e 04 como Listeria monocytogenes. Os resultados deste trabalho demonstram que as bactérias Listeria monocytogenes e Listeria innocua estão presentes em amostras de salsichas tipo hot dog a granel e em carne bovina homogeneizada a granel de estabelecimentos comerciais no Distrito Federal e a metodologia RFLP-PCR permitiu diferenciar as cepas isoladas neste tipo de alimento. ___________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / The objective of this work was to verify the occurrence and identify, by biochemical analysis and (RFLP-PCR) of the 23S rRNA gene, the species of Listeria spp. in hot dog sausages and minced bovine meat sold in bulk commercialized in Distrito Federal, Brazil. The methodology used for this bacteriological isolation and biochemical tests for identification of the strains was used according to the Instrução Normativa n° 40, from December 16 2005, of the Ministry of Agriculture, Cattle Breeding and Supply of Brazil (MAPA), and, to the identification using RFLP-PCR according to Paillard et al., (2003). A total of 162 samples, being 127 hot dog sausages and 35 samples of minced bovine meat were tested. From the 127 samples of hot dog sausages analyzed, 26 were positive to Listeria spp. and, from these, 18 were identified as Listeria innocua and 09 as Listeria monocytogenes, in both identifications by biochemical tests and RFLP-PCR. From the 35 samples of minced bovine meat tested, 16 were positive to Listeria spp., from these, 12 were identified as Listeria innocua and 04 as Listeria moncytogenes. The results of this work show that the bacteria Listeria monocytogenes and Listeria innocua are found in hot dog sausages and bovine minced meat sold in bulk from commercial grocery stores in Distrito Federal and the RFLP-PCR methodology allowed the identification of the strains isolated in this kind of food.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2008. / Submitted by Jaqueline Oliveira (jaqueoliveiram@gmail.com) on 2008-12-03T15:55:33Z No. of bitstreams: 1 DISSERTACAO_2008_HugoDeAlmeidaSilva.pdf: 1378682 bytes, checksum: 3890c0001da50032e86de35c261d77c5 (MD5) / Approved for entry into archive by Georgia Fernandes(georgia@bce.unb.br) on 2009-02-16T14:52:48Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DISSERTACAO_2008_HugoDeAlmeidaSilva.pdf: 1378682 bytes, checksum: 3890c0001da50032e86de35c261d77c5 (MD5) / Made available in DSpace on 2009-02-16T14:52:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DISSERTACAO_2008_HugoDeAlmeidaSilva.pdf: 1378682 bytes, checksum: 3890c0001da50032e86de35c261d77c5 (MD5) / Uma varredura em busca de atividades proteolíticas em bactérias patogênicas e não-patogênicas do gênero Leptospira identificou a presença de atividade aminopeptidolítica apenas nas primeiras. Visando a esclarecer este achado, o presente trabalho propôs caracterizar bioquímicamente a enzima potencialmente responsável pela atividade leucil-aminopeptidásica presente apenas em sorovares patogênicos de Leptospira. Por meio da clonagem do gene pepA, que codifica uma provável leucilaminopeptidase (LAP) citossólica, obtivemos a forma recombinante ativa da enzima, que possui características filogenética e bioquímica semelhantes àquelas enzimas da família M17 das metalopeptidases. Assim como outras enzimas dessa família, essa LAP recombinante demonstrou atividade catalítica sobre o substrato L-Leu-AMC, com uma atividade ótima em pH 8,5, e termofilia com temperatura ótima de 50 °C. Além disso, a enzima exibiu comportamento típico de cinética clássica de Michaelis-Menten. É inibida irreversivelmente por EDTA, apesar de outras LAPs serem reativadas por cofatores iônicos. Aparentemente, a enzima forma um oligômero de 320 kDa, apresentando dependência dessa forma para sua atividade sobre o substrato L-Leu-AMC, em gel de eletroforese. Adicionalmente, foi produzido soro -HaLAP em camundongos isogênicos, demonstrando a antigenicidade da enzima e possibilitando a posterior utilização de anticorpos em outros estudos sobre a expressão diferenciada dessa peptidase durante infecções. Esse trabalho abre caminho para a elucidação de novos mecanismos operando exclusivamente em membros patogênicos de bactérias do gênero Leptospira. _________________________________________________________________ ABSTRACT / Screening proteolytic activities in non-pathogenic and as well in pathogenic bacteria of the genus Leptospira, we identified the presence of aminopeptydolitic activity in the latter only. Aiming at clarification of this finding, this work led to the biochemical characterization of the enzyme which appears to be responsible for the leucyl-aminopeptydase activity present in pathogenic Leptospira serotypes. By the cloning og the pepA gene coding a putative cytosolic leucyl-aminopeptidase (LAP), we obtained the active recombinant enzyme, showing phylogenetic and biochemical features similar to those present in the M17 metallopeptidase enzymes family. Like other enzymes belonging to this family, recombinant LAP revealed catalytic activity upon L-Leu-AMC substrate, with optimal activity at pH 8.5, and a slight termophilic behavior, with its optimal temperature at 50 °C. Besides, the enzyme presented typical Michaelis-Menten kynetics. It is irreversibly inhibited by EDTA, although other LAPs shows reactivation towards ionic cofactors. Apparently, the enzyme forms a 320 kDa oligomer, structure which the activity on the L-Leu-AMC substrate in eletrophoresis gel seems to be dependent. In adittion, the antiserum against -HaLAP produced in isogenic mice showed its high antigenicty. This finding suggests that the enzyme could be employed to produce specific antibody, which could be useful in clarifying the differential expression of the peptidase in the course of severe infections. This work opens a new avenue that may lead to elucidation of novel mechanisms exclusively associated with pathogenic species within the genus Leptospira.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Microbiana, 2015. / Submitted by Fernanda Percia França (fernandafranca@bce.unb.br) on 2016-02-29T16:53:19Z No. of bitstreams: 1 2015_FláviaPortoCarreiroAraújoBezerra.pdf: 4160441 bytes, checksum: 05cc8a02394f7c51e1842e9e9457b250 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2016-03-04T11:45:10Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_FláviaPortoCarreiroAraújoBezerra.pdf: 4160441 bytes, checksum: 05cc8a02394f7c51e1842e9e9457b250 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-03-04T11:45:10Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_FláviaPortoCarreiroAraújoBezerra.pdf: 4160441 bytes, checksum: 05cc8a02394f7c51e1842e9e9457b250 (MD5) / Bactérias aeróbias formadoras de endósporos (Bafes) possuem a capacidade de se diferenciarem em esporos notavelmente resistentes e apresentarem grande diversidade fisiológica, características que conferem importância ambiental, biotecnológica e sanitária, entre outras. A Coleção de Bafes (CBafes) compreende 154 linhagens (SDF) selvagens de Bafes isoladas do solo do Distrito Federal, Brasil, analisadas segundo abordagem polifásica, que envolve a caracterização fenotípica, genotípica, complementada por análises filogenética. Pela capacidade de resolução em nível de espécies, a espectrometria de massa MALDI-TOF (matrix assisted laser desorption/ionization - time of flight mass spectrometry) foi, recentemente, adotada pelo Laboratório de Bafes (LaBafes) como técnica adicional na identificação e comparação de linhagens SDF. O presente projeto foi desenvolvido com a finalidade de estabelecer bases organizacionais e metodológicas, abalizadas em um sistema de Qualidade, para a construção de um banco de dados de perfis moleculares (biblioteca) suplementar à plataforma padrão de microrganismos do programa MALDI–Biotyper (Bruker Daltonics). A construção da biblioteca foi motivada pelos resultados iniciais da análise de doze estirpes por MALDI–TOF IC (do inglês: intact cell) MS e MALDI–Biotyper, que não apresentaram segura identificação em nível de espécie. A obtenção dos perfis de massa molecular foi realizado utilizando o extrato proteico de 55 linhagens, incluindo as doze iniciais. Apesar de ter ocorrido uma falha na aquisição dos perfis moleculares de dez estirpes, para a maioria obteve–se uniformidade de cultivos e boa reprodutibilidade dos espectros. Foram encontrados 30 picos correspondentes entre os perfis de massa de sete estirpes obtidos por ambas as técnicas. O objetivo de adquirir 24 espectros com elevação da linha de base inferior a 30%, para o cálculo do espectro principal, não foi alcançado para nenhuma das estirpes, contudo, as variáveis interferentes foram identificas. De 46 estirpes SDF analisadas pelo MALDI-Biotyper, 26 foram identificadas como pertencentes ao gênero Bacillus, Lysinibacillus, Brevibacillus ou Paenibacillus. Os resultados foram corroborados por resultados obtidos em paralelo por nosso grupo, tais como aqueles baseados em sequências de rDNA 16S de estirpes SDF. Porém, as análises fenotípicas, incluindo estudos da ultraestrutura de esporos, revelam maior diversidade intraespecífica. As etapas pré-analíticas foram estabelecidas, embora ainda necessitem de pequenos ajustes e estudos adicionais, que serão implementados, futuramente, para possibilitar a resolução de estirpes estreitamente relacionadas por MALDI–TOF MS. / Aerobic endospore-forming bacteria (AEFB) are capable of differentiating into remarkably resilient spores and have great physiological diversity, which provides environmental, biotechnology and health importance. The AEFB Collection (AEFBC) comprises 154 wild-type lineages isolated from soil of the Federal District, Brazil, which are being inspected on polyphasic approach involving phenotypic, genotypic, and phylogenetic characterization. For the resolution capability at species level, MALDI-TOF (matrix assisted laser desorption / ionization - time of flight mass spectrometry) was recently adopted by Aerobic endospore-forming bacteria Laboratory (LaBafes) as an additional technique in identification and comparison between SDF strains. This project was developed in order to establish organizational and methodological bases authoritative in a Quality Assurance System, for the construction of a supplementary molecular profiles database (library) to the standard platform of microorganisms of MALDI-Biotyper program containing about 6,000 species of microorganisms (Bruker Daltonics), motivated by the initial results of twelve strains analyzed by IC (intact cell) MALDI-TOF MS and MALDI-Biotyper, with no secure identification at the species level. The attainment of the molecular weight profiles of the library was performed using the protein extract 55 strains, including the initial twelve strains. However, no molecular profiles for ten strains could be obtained. However, it was obtained uniformity of crops and reproducible spectra for most of the strains. Thirty peaks, obtained by both techniques, were found among the mass profiles of seven strains. The goal of obtaining 24 spectrums with elevated baseline less than 30% relative intensity has not been reached for any of the strains. Nevertheless, interfering variables were identified. From 46 SDF strains analyzed by MALDI-Biotyper, 26 were identified as belonging to the genus Bacillus, Lysinibacillus, Brevibacillus, or Paenibacillus. These results were corroborated by our results based on 16S rDNA sequences of SDF strains. However, the phenotypic analyzes, including spores ultrastructure studies reveal greater intraspecific diversity. The pre-analytical steps of this study were established, requiring minor adjustments. Further studies will be implemented to enable the resolution of closely related strains by MALDI-TOF MS for future approaches.

O Parque Estadual de Itapuã, RS, Brasil, é considerado um dos últimos refúgios da Mata Atlântica ainda preservados na região metropolitana de Porto Alegre, local escolhido para as coletas de bromélias. O objetivo deste trabalho foi realizar um levantamento da diversidade de bactérias, tanto endofíticas quanto daquelas presentes na água das cisternas de bromélias. Foram coletadas 38 amostras de folhas e 26 amostras de água das cisternas de sete espécies de bromélias em vários locais do Parque, no período de março de 2006 a maio de 2007. As amostras foram cultivadas após diluições seriadas em ágar para contagem. Os isolados foram identificados através da análise da morfologia colonial, celular, comportamento bioquímico e fisiológico. Das folhas foram isoladas 76 bactérias endofíticas e da água das cisternas 124 bactérias com predomínio dos gêneros Bacillus, Burkolderia, Staphylococcus e Streptomyces. As bactérias Gram positivas apresentaram um maior número de cepas produtoras de enzimas extracelulares comparadas às Gram negativas. As Gram positivas isoladas das folhas foram melhores produtoras de celulase, pectinase e lipase, enquanto que as isoladas da água de cisterna foram melhores produtoras para celulase, amilase e protease. Pôde se observar que a maioria das bactérias endofíticas isoladas das bromélias produz algum tipo de promotor de crescimento. Com exceção da fixação de nitrogênio, que foi detectada somente entre as bactérias Gram negativas, pode-se observar que a produção desses promotores está amplamente disseminada entre as bactérias endofíticas. A análise da biodiversidade foi realizada através do índice de Shannon-Weaver, onde foi encontrado nas folhas (H=3,070) e nas cisternas (H=3,449) evidenciando que as cisternas abrigam uma biodiversidade um pouco mais elevada em relação ao interior da planta. / The State Park of Itapuã, RS, Brazil, is considered one of the latest refuges of the Atlantic Forest still preserved in the metropolitan area of Porto Alegre, where seven bromeliads samples were colected. The objectives of this study were carry out a survey on the diversity of the endophytic bacteria and those present in the water tanks of bromeliads. Thirty eight samples of leaves and 26 samples of water from the water tanks of bromeliads were collected from many places of the Park, between the period of March, 2006 and May, 2007. Samples were cultivated in plate count agar after serial decimal dilutions. Bacteria were identified through analysis of their colonial and cellular morphology, physiological and biochemical characteristics. From leaves it was obtained 76 strains of endophytic bacteria and from water tanks it was obtained 124 strains, with the predominance of Bacillus, Burkolderia, Staphylococcus and Streptomyces genera. The Gram positive bacteria presented a great number of strains producing extra-cellular enzymes compared to Gram negative strains. The Gram positive strains isolated from the leaves were better in the production of cellulase, pectinase and lipase, and those isolated form water tanks were better in the production cellulase, amylase and protease. It was observed that the majority of the endophytic strains produce one kind of promoting growth. With the exception of fixing nitrogen, observed only with Gram negative strains, it was observed that the production of promoting growth substance is disseminated between endophytic bacteria. The analysis of biodiversity was carried out with the Shannon-Weaver index, that demonstrated (H=3.449) and (H=3.070). These results showed that there are a little higher biodiversity in the water tanks than in the leaves.