Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Os biossurfactantes tem ganhado destaque nos últimos anos em relação aos surfactantes químicos devido às suas vantagens em termos ambientais e toxicidade. A biodegradabilidade e o uso de coprodutos agroindustriais para sua produção são alguns dos seus principais benefícios. O melaço de soja é um coproduto gerado durante o processamento da soja que possui alta produção e baixo valor comercial. Seu uso tem grande potencial em processos fermentativos devido à alta concentração de carboidratos, lipídeos e proteínas. O presente trabalho estudou a utilização de Pseudomonas aeruginosa para produzir biossurfactantes em um meio fermentativo de melaço de soja. Foram realizados testes preliminares para determinar as melhores condições de produção. Nestes testes as culturas bacterianas analisadas foram: Pseudomonas aeruginosa 9027, Pseudomonas aeruginosa 10145 e Pseudomonas aeruginosa proveniente de Landfarming. Dentre elas, a que apresentou melhores resultados foi a Pseudomonas aeruginosa 10145. Em relação ao meio fermentativo de melaço de soja foram testadas três concentrações (50, 100 e 250 g/L) sendo que, para os fatores que mais influenciaram na avaliação da eficiência de um surfactante (índices de emulsificação e de tensão superficial), os melhores resultados foram obtidos para as concentrações de 50 e 100 g/L. O pH do meio foi ajustado para 7,0. Após a determinação das melhores condições foi elaborado um planejamento composto central (PCC) com duas variáveis e três réplicas no ponto central para otimizar a produção de biossurfactantes. A variável concentração inicial de melaço de soja teve como faixa os valores entre 29,3 e 170,7 g/L e a concentração inicial de microrganismo variou entre 0,2 e 5,8 g/L. Todos os experimentos foram realizados em duplicata, em uma mesa agitadora a 30,0 ± 1,0 ºC e 120 rpm, por 72 horas com amostras coletadas a cada 12 horas. Desta forma, para validar os experimentos foram utilizados os valores de 120 g/L para a concentração de melaço de soja e de 4 g/L para a concentração inicial de microrganismo. Como resposta foram obtidos os seguintes valores para 48 horas de fermentação: tensão superficial de 31,9 mN/m, índice de emulsificação de 97,4%, biomassa de 11,5 g/L, concentração de raminose de 6,8 g/L e concentração de biossurfactante de 11,7 g/L. Foi realizada ainda a análise de concentração micelar crítica (CMC) que obteve um valor de aproximadamente 80 mg/L. Os resultados obtidos apontam potencial da produção de biossurfactante utilizando como substrato o melaço de soja e bactérias do gênero Pseudomonas aeruginosa. / Biosurfactants has excelled in the past years when compared to chemical surfactants due to its advantages related to environmental and toxicity. Some of the benefits of the biosurfactants is that it can be produced from agroindustrial product co and is biodegradable. The soy molasses is a product co generated during soybean processing that has high production and low commercial value. Its use has great potential in fermentative processes due to the high concentration of carbohydrates, lipids and proteins. This study investigated the use of Pseudomonas aeruginosa to produce biosurfactants in a soy molasses-based fermentation medium. Preliminary tests were performed to determine the best conditions of production. In these tests the bacterial cultures analyzed were: Pseudomonas aeruginosa 9027, Pseudomonas aeruginosa 10145 and Pseudomonas aeruginosa from Landfarming. Among them, with the best results was Pseudomonas aeruginosa 10145. In relation to the soy molasses-based fermentation medium three concentrations were tested (50,100 and 250 g/L) and for the factors that influences the most on the evaluation of the efficiency of a surfactant (emulsifying and surface tension index) the best results were obtained for the concentrations of 50 and 100 g/L. In addition, the pH was adjusted to 7.0. After determining the best conditions it was developed a Central Composite Design (CCD) with two variables and three replicates at the central point to optimize the production of biosurfactant. The concentration of soy molasses has values between 29.3 and 170.7 g/L and the initial concentration of microorganism varies between 0.2 and 5.8 g/L. All the experiments were performed in duplicate on a shaker table to 30.0 ± 1.0 °C and 120 rpm during 72 hours with samples taken every 12 hours. Thus, to validate the experiments were used the values of 120 g/L for the initial concentration of soy molasses and 4 g/L for the initial concentration of microorganisms. In response the following values were obtained at 48 hours of fermentation: surface tension of 31.9 mN/m, emulsification rate of 97.4%, biomass concentration of 11.5 g/L, rhamnose concentration of 6.9 g/L and concentration of biosurfactant of 11.7 g/L. Further analysis was carried out for critical micelle concentration (CMC) in which it was obtained approximately 80 mg/L. These values show a great potential for biosurfactant production using soybean molasses as substrate and the bacteria of the genus Pseudomonas aeruginosa. / Dissertação (Mestrado)

Introdução: As polimixinas são consideradas as opções terapêuticas de resgate para o tratamento das infecções de corrente sanguínea (ICS) por bacilos Gram-negativos (BGN) com resistência aos carbapenens (CR) e a combinação com outro antimicrobiano tem sido utilizada apesar da falta de evidência clínica para esta prática. Objetivo: Avaliar o uso de polimixina B intravenosa em monoterapia e em combinação com outro antimicrobiano para ICS por BGN CR. Pacientes e Métodos: Foi um estudo de coorte retrospectivo em um hospital terciário, incluindo 99 pacientes. A comparação dos tipos terapias foi através do propensity score. Resultados: A mortalidade global em 30 dias foi de 43,4%: 40,7% (24 de 59) e 47,5% (19 de 40), p=0,51, em pacientes que receberam combinação e monoterapia, respectivamente. A sepse grave/choque séptico no dia da ICS, alta pontuação do escore de bacteremia de Pitt e a presença de neoplasia como doença de base foram, independentemente, associados a maior mortalidade em 30 dias no modelo de regressão de Cox. A terapia combinada não foi significativamente associada a este resultado (hazard ratio, 0,70; intervalo de confiança de 95%, 0,36-1,36); p=0,29). Apesar de não ser significativa, houve uma tendência a um efeito benéfico da associação em pacientes com ICS por BGN CR da família Enterobacteriaceae. Não houve diferença no desenvolvimento de insuficiência renal aguda em pacientes que receberam terapia de combinação comparado com os que receberam monoterapia. Conclusão: Não houve diferença na mortalidade em 30 dias em pacientes com ICS por BGN CR tratados com polimixina B em combinação com outro antimicrobiano ou em monoterapia. A prática rotineira de combinar um segundo antibiótico em esquemas baseados em polimixinas, especialmente, se a bactéria apresenta resistência in vitro ao carbapenem, ainda necessita estudos clínicos adicionais. / Background: Polymyxins are usually the last resort therapy for carbapenem-resistant Gram-negative bacteria (CR GNB) bloodstream infections (BSIs), combination with another antimicrobial has been used despite the lack of clinical evidence supporting such practice. Objetive: We aimed to assess the use of intravenous polymyxin B in combination with another antimicrobial in comparison with polymyxin B as a single drug for CR GNB BSIs, adjusting for a propensity score for indication of combination therapy. Patient and methods: We compared combination versus monotherapy with polymyxin B for CR GNB BSIs, adjusting for a propensity score for indication of combination therapy. It was a retrospective cohort study at a tertiary-hospital including 99 patients. Results: The overall 30-day mortality was 43.4%: 40.7% (24 of 59) and 47.5% (19 of 40), P=0.51, in patients receiving combination and monotherapy, respectively. Severe sepsis/ septic shock at BSI onset higher Pitt bacteremia score and neoplasia were independently associated with higher 30-day mortality in a Cox-regression model. Combination therapy was not significantly associated with this outcome (Hazard Ratio, 0.70; 95% confidence interval, 0.36-1.36); P=0.29). Although not significant, there was a tendency to a beneficial effect of combination in patients with Enterobacteriaceae CR GNB BSIs. There was no difference in development of AKI in patients receiving combination therapy compared to those receiving monotherapy. Conclusions: There was no difference in 30-day mortality in patients with CR GNB BSIs treated with polymyxin B in combination with another antimicrobial compared with polymyxin B alone. The routine practice of combining a second antibiotic in polymyxins-based regimes, especially if the bacteria present in vitro resistance to the agent, still lacks support from clinical studies.

Introdução: a infecção hospitalar tem se tornado um problema de saúde pública, no Brasil e na maioria dos países do mundo, sobretudo devido ao aumento gradativo da resistência dos microrganismos aos antimicrobianos. Nos pacientes que apresentam deficiências no sistema imunológigo como os indivíduos que vivem com o vírus da imunodeficiência humana (HIV) ou com a síndrome da imunodeficiência adquirida (aids) o quadro clínico dessas infecções pode se tornar extremamente grave, aumentando a morbimortalidade. Objetivo: determinar a prevalência de microorganismos gram-negativos em indivíduos com HIV/aids internados num hospital escola do interior paulista. Material e Método: trata-se de um estudo de corte transversal, aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Escola de Enfermagem de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo. No período de 01 agosto de 2011 a 28 de fevereiro de 2013, foram abordados 365 indivíduos internados em duas unidades especializadas de um hospital escola público do interior paulista, sendo a população do presente estudo composta por 220 sujeitos. Os dados sociodemográficos, clínicos e hábitos de saúde foram obtidos por meio de entrevista individual e consulta aos prontuários. Coletou-se também amostras de saliva e swab nasal nas primeiras 24 horas de internação, as quais foram processadas pelo Laboratório de Microbiologia do referido hospital. Os dados foram inicialmente digitados em planilha do Microsoft Office Excel for Windows 2011, realizada dupla digitação e validação dos dados, a fim de identificar possíveis erros de digitação. Posteriormente, a planilha definitva foi transportada para o programa Statistical Package for the Social Science (SPSS), versão 17.0 for Windows, onde foi estruturado o banco de dados e realizada análise estatística. Resultados: a prevalência de microorganismos gram negativos nos indivíduos com HIV/aids foi de 15,4% independente do sítio onde foi isolado. Pseudomonas aeruginosa foi o micoorganismo mais frequentemente isolado tanto na saliva (50%), quanto no swab nasal (37,5%), seguida por Klebsiella pneumoniae (30,7%) isolada somente na saliva. Em relação aos aspectos clínicos 29,4% dos indivíduos com amostras positivas para microorganismos gram negativos tinham carga viral acima de 1000.000 cópias,ml, CD4 menor que 200 céluas/mm3 (50%), tiveram internações prévias (52,9%), estavam em uso de antimicrobiano (64,7%), não usavam antirretrovirais (52,9%) e tinham algum procedimento invasivo no momento da coleta (67,6%). Nenhum microorganismo apresentou resistência aos antimicrobianos. Conclusão: a prevalência de microorganismos gram-negativos foi maior na saliva (11,8%) que no swab nasal (3,6%), indicando que coletar amostras de mais de um sítio pode favorecer a identificação de indivíduos colonizados e ou infectados / Introduction: the hospital infection has become a public health problem in Brazil and in most countries of the world, mainly due to the gradual increase of resistance of microorganisms to antibiotics. In patients who have deficiencies in the immune system such as individuals living with human immunodeficiency virus (HIV) or acquired immunodeficiency syndrome (AIDS), the clinical picture of these infections can become very serious, increasing morbidity and mortality. Objective: to determine the prevalence of gram-negative microorganisms in individuals with HIV/AIDS hospitalized at a teaching hospital in the interior of São Paulo state. Material and Method: this is a cross-sectional study, approved by the Ethics Research Committee of the University of São Paulo at Ribeirão Preto College of Nursing. In the period from August 01, 2011 to February 28, 2013, 365 individuals hospitalized in two specialized units of a public teaching hospital in the interior of São Paulo state were approached, and the study population was comprised of 220 subjects. The sociodemographic and clinical data and health habits were obtained through individual interviews and medical records. Saliva samples and nasal swabs were collected in the first 24 hours of admission, which were processed by the Microbiology Laboratory of the hospital. The instrument variables were coded and cataloged in a dictionary (codebook). The data were initially recorded in a Microsoft Office Excel spreadsheet for Windows 2011, performed a double entry and data validation in order to identify possible typing errors. Subsequently, the final worksheet was transported to the Statistical Package for Social Science (SPSS), version 17.0 for Windows, in which database was structured and statistical analysis was performed. Results: the prevalence of gram-negative microorganisms in individuals with HIV/AIDS was 15.4% regardless of where it was isolated. Pseudomonas aeruginosa is the most frequently isolated microorganisms both in saliva (50%) and in nasal swabs (37.5%), followed by Klebsiella pneumoniae (30.7%) isolated only in saliva. In regard to clinical aspects, 29.4% of individuals with positive samples for gram-negative microorganisms had viral load above 1000,000 copies/ml, CD4 less than 200 cells/mm3 (50%), had previous hospitalizations (52.9%), were using antimicrobials (64.7%), did not use antiretroviral drugs (52.9%) and had some invasive procedure at the time of collection (67.6%). No microorganism was resistant to antimicrobials. Conclusion: the prevalence of gram-negative microorganisms was higher in saliva (11.8%) than in nasal swabs (3.6%), indicating that collecting samples from more than one location may facilitate the identification of individuals colonized and/or infected

Introdução: As polimixinas são consideradas as opções terapêuticas de resgate para o tratamento das infecções de corrente sanguínea (ICS) por bacilos Gram-negativos (BGN) com resistência aos carbapenens (CR) e a combinação com outro antimicrobiano tem sido utilizada apesar da falta de evidência clínica para esta prática. Objetivo: Avaliar o uso de polimixina B intravenosa em monoterapia e em combinação com outro antimicrobiano para ICS por BGN CR. Pacientes e Métodos: Foi um estudo de coorte retrospectivo em um hospital terciário, incluindo 99 pacientes. A comparação dos tipos terapias foi através do propensity score. Resultados: A mortalidade global em 30 dias foi de 43,4%: 40,7% (24 de 59) e 47,5% (19 de 40), p=0,51, em pacientes que receberam combinação e monoterapia, respectivamente. A sepse grave/choque séptico no dia da ICS, alta pontuação do escore de bacteremia de Pitt e a presença de neoplasia como doença de base foram, independentemente, associados a maior mortalidade em 30 dias no modelo de regressão de Cox. A terapia combinada não foi significativamente associada a este resultado (hazard ratio, 0,70; intervalo de confiança de 95%, 0,36-1,36); p=0,29). Apesar de não ser significativa, houve uma tendência a um efeito benéfico da associação em pacientes com ICS por BGN CR da família Enterobacteriaceae. Não houve diferença no desenvolvimento de insuficiência renal aguda em pacientes que receberam terapia de combinação comparado com os que receberam monoterapia. Conclusão: Não houve diferença na mortalidade em 30 dias em pacientes com ICS por BGN CR tratados com polimixina B em combinação com outro antimicrobiano ou em monoterapia. A prática rotineira de combinar um segundo antibiótico em esquemas baseados em polimixinas, especialmente, se a bactéria apresenta resistência in vitro ao carbapenem, ainda necessita estudos clínicos adicionais. / Background: Polymyxins are usually the last resort therapy for carbapenem-resistant Gram-negative bacteria (CR GNB) bloodstream infections (BSIs), combination with another antimicrobial has been used despite the lack of clinical evidence supporting such practice. Objetive: We aimed to assess the use of intravenous polymyxin B in combination with another antimicrobial in comparison with polymyxin B as a single drug for CR GNB BSIs, adjusting for a propensity score for indication of combination therapy. Patient and methods: We compared combination versus monotherapy with polymyxin B for CR GNB BSIs, adjusting for a propensity score for indication of combination therapy. It was a retrospective cohort study at a tertiary-hospital including 99 patients. Results: The overall 30-day mortality was 43.4%: 40.7% (24 of 59) and 47.5% (19 of 40), P=0.51, in patients receiving combination and monotherapy, respectively. Severe sepsis/ septic shock at BSI onset higher Pitt bacteremia score and neoplasia were independently associated with higher 30-day mortality in a Cox-regression model. Combination therapy was not significantly associated with this outcome (Hazard Ratio, 0.70; 95% confidence interval, 0.36-1.36); P=0.29). Although not significant, there was a tendency to a beneficial effect of combination in patients with Enterobacteriaceae CR GNB BSIs. There was no difference in development of AKI in patients receiving combination therapy compared to those receiving monotherapy. Conclusions: There was no difference in 30-day mortality in patients with CR GNB BSIs treated with polymyxin B in combination with another antimicrobial compared with polymyxin B alone. The routine practice of combining a second antibiotic in polymyxins-based regimes, especially if the bacteria present in vitro resistance to the agent, still lacks support from clinical studies.

Os aminoglicosídeos permanecem sendo um dos principais antibióticos no tratamento de infecções causadas por bactérias gram-negativas, apesar do surgimento de novos antibióticos. Na Unidade de Endoscopia Digestiva do Hospital de Clínicas de Porto Alegre os aminoglicosídeos, combinados com antibióticos ß-lactâmicos, têm sido utilizados no tratamento de infecções das vias biliares e como antibiótico profilático em procedimento como a colangiopancreatografia endoscópica retrógrada. O objetivo do presente estudo foi comparar a eficácia terapêutica da dose única total diária com dose fracionada diária de gentamicina no tratamento da infecção das vias biliares, baseando-se na concentração biliar de gentamicina obtida nesses dois regimes terapêuticos e sua relação com a concentração inibitória mínima das principais bactérias isoladas na bile de pacientes com infecção do trato biliar. Os pacientes selecionados foram randomizados para tratamento com gentamicina na dose de 4mg/kg de peso por meio intravenoso sendo divididos em 2 grupos: grupo 1 recebeu dose única diária dividida em 3 horários (8 / 8 horas) e o grupo 2 recebeu o fármaco como dose única total diária. Os resultados do estudo evidenciaram que os níveis biliares de gentamicina nos pacientes tratados com dose única diária de gentamicina (grupo 2) ultrapassaram de 3 a 6 vezes as concentrações inibitórias mínimas das bactérias gram-negativas isoladas, enquanto que os níveis de gentamicina à nível biliar nos pacientes tratados com dose fracionada de gentamicina (grupo 1) conseguiram igualar ou ultrapassar no máximo e 3 vezes, dependendo da bactéria gram-negativa testada, as concentrações inibitórias. Além disto, os níveis biliares de gentamicina dos pacientes tratados com dose única diária permaneceram por intervalo superior a 14 horas acima das concentrações inibitórias mínimas destas bactérias, reforçando ainda mais o efeito pós-antibiótico obtido no intervalo de tempo onde não são detectados mais níveis de gentamicina na bile. Baseado nos efeitos bactericida dependente da concentração e efeito pós-antibiótico dos aminoglicosídeos,os resultados deste estudo sugerem que a dosagem única diária de gentamicina apresenta maior eficácia terapêutica que a dosagem fracionada diária no tratamento da infecção das vias biliares.

As Stenotrophomonas são comumente encontradas no trato respiratório de pacientes com doenças pulmonares crônicas e também na rizosfera de plantas. Esse gênero apresenta resistência a diversos antibióticos, promove o crescimento de plantas e algumas espécies apresentam a capacidade de fixar o nitrogênio atmosférico. O Multi Locus Sequence Analysis (MLSA) é uma metodologia baseada em genes constitutivos para definição e alocação taxonômica de novas espécies. O objetivo geral do presente trabalho foi caracterizar taxonomicamente uma coleção ampla de Stenotrophomonas composta por isolados endófitos, linhagens-tipo e de referência. Para tanto, foi estabelecido um sistema de classificação e identificação de Stenotrophomonas por meio de MLSA. Foi possível através da metodologia de MLSA definir 9 novas espécies, detectar a presença de um novo gênero e estabelecer um sistema online de taxonomia para Stenotrophomonas. / The genus Stenotrophomonas is found in the respiratory treatment of patients with chronic pulmonary and also in the rizhosfera of plants. It presents resistance to several antibiotics, promotes the growth of plants and some species present the ability to fix atmospheric nitrogen. The Multi Locus Sequence Analysis (MLSA) is a methodology based on constitutive genes for definition and taxonomic allocation of new species. The general objective of the present work was to characterize a wide collection constituted by Stenotrophomonas from isolated endophytic, type and reference strains. In such a way, a system of classification and identification of Stenotrophomonas by means of MLSA was established. It was possible through the MLSA methodology to define 9 new species, to detect the presence of a new genus and to establish an online system for Stenotrophomonas taxonomy.

O gênero Methylobacterium é composto por bactérias de coloração rósea, metilotróficas facultativas (PPFM - pink-pigmented facultative methylotrophic), que podem fixar nitrogênio, nodular a planta hospedeira, produzir o fitohormônio citocinina e as enzimas pectinase e celulase, podendo dessa forma promover o crescimento vegetal devido à disponibilidade de nitrogênio e à indução de resistência sistêmica. Methylobacterium spp. têm sido descritas como endófitos ou epífitas em diferentes plantas hospedeiras, onde a sua colonização e distribuição no hospedeiro podem ser influenciadas pelo genótipo da planta ou por interações com outros microrganismos associados ao hospedeiro. Neste contexto, poucos trabalhos têm sido desenvolvidos visando um melhor entendimento da interação Methylobacterium-planta e da diversidade deste gênero bacteriano que tem sido isolado de diferentes plantas hospedeiras, exercendo diferentes funções ainda pouco conhecidas. Portanto, este trabalho tem como objetivo estudar a diversidade genética de Methylobacterium spp., por meio do seqüenciamento parcial dos genes 16S rRNA e mxaF; analisar os genes de responsáveis pela interação da Methylobacterium com a planta hospedeira e analisar os genes envolvidos na interação Methylobacterium (endófito)- Xylella fastidiosa (patógeno). Os resultados mostraram que existe uma resposta adaptativa de Methylobacterium spp. específica para cada planta hospedeira. Da mesma forma, foi observado que esta adaptação específica da bactéria à planta, também pode levar à seleção de genótipos específicos para cada planta hospedeira, embora eventos aleatórios também possam ser responsáveis pela diversidade de Methylobacterium na planta hospedeira. Na análise de expressão gênica da interação Methylobacterium-planta, foi observado que o gene relacionado ao metabolismo do metanol (mxaF) não apresentou mudança no padrão de expressão. Genes relacionados a estresse crtI (estresse sentido pela bactéria) e acdS (estresse sentido pela planta), tiveram suas expressões reduzidas na presença da planta, mostrando que a presença de exsudados das plantas não representou um estresse ao desenvolvimento bacteriano. Os genes relacionados à patogenicidade patatin e phoU não foram alterados, confirmando que Methylobacterium é um endófito, e possuem expressão induzida de tais genes quando interagindo com a planta hospedeira. Os resultados permitem concluir que nas condições avaliadas os exsudados das plantas não causam estresse à bactéria (SR1.6/6). Por meio da análise de expressão gênica in vitro de X. fastidiosa em co-cultivo com M. mesophilicum, foi observado que este fitopatógeno vascular apresentou diminuição do crescimento e da formação de biofilme. Os resultados aqui apresentados mostram que a diversidade deste grupo de endófitos é parcialmente determinada pela planta hospedeira, onde tais bactérias interagem tanto com a planta como com outros grupos, como fitopatógenos presentes neste nicho. / The genus Methylobacterium, constituted by PPFMs - pink-pigmented facultative methylotrophic, are able to fix nitrogen, nodule the host plant, produce cytokines and enzymes involved in induction of systemic resistance such as pectinase and cellulase, inducing plant growth. Methylobacterium sp. has been described as endophyte or epiphyte in different host plants, where the colonization and distribution on the host can be influenced by plant genotype or by interaction with other microorganisms associated to the host. In this context, few studies aims the better understanding of the diversity of this genus in different host, the interaction Methylobacterium-plant, and the interaction Methylobacterium-other bacteria. Therefore, this study aims to study the genetic diversity of Methylobacterium spp., by sequencing the 16S rRNA and mxaF gene; to analyze the genes responsible for the Methylobacterium-plant host interaction and to analyze the genes involved in Methylobacterium (endophyte) - Xylella fastidiosa (pathogen) interaction. Results show differential adaptive responses of Methylobacterium spp. in distinct plant species. However, the clustering according to the host plant was observed for a subset of isolates, suggesting that this diversity could be driven by stochastic events, although plant genotype may contribute to this diversity. Analyzing the Methylobacterium-plant interaction gene expression it was observed that genes related to metabolism of methanol (mxaF) was not amended. The genes related to stress such as crtI (stress sensed by the bacteria) and acdS (stress sensed by the plant) had its expression reduced with the plant showing that the plant exudates did not represent a stress to the bacteria development. The genes related to pathogenicity like patatin and phoU were not amended, confirming that Methylobacterium is an endophyte that do not induce when the bacteria interacts with the plant host. Using a genetic expression analyses of X. fastidiosa in vitro in co-cultive with M. mesophilicum, it was seen that this phytopathogen presented the growth and biofilm formation reduction. These results show that the diversity of this endophyte group is partially determinate by the plant host, where this bacterium interacts with the plant and with other groups, such as phytopathogen present in this niche.

Methylobacterium mesophilicum SR1.6/6 é uma bactéria endofítica isolada de ramo de citros previamente esterilizado superficialmente. Esta bactéria possui a capacidade de associar-se com uma ampla variedade de espécies e tecidos de plantas, principalmente nas raízes, mediado pela formação de biofilme e superfícies do hipocótilo de plântulas in vitro. Este trabalho teve como objetivo o desenvolvimento e a aplicação de um modelo para o estudo in vitro da associação entre esta bactéria e plântulas de soja. Metodologias de genômica e transcriptômica foram aplicadas para a obtenção do draft genômico desta bactéria e de um amplo perfil de sequências expressas, obtidas em dois tratamentos distintos; i) células de biofilme células bacterianas aderidas às raízes das plântulas removidas por sonicação, e ii) células planctônicas células bacterianas em suspensão (i.e. interagindo somente com exsudados radiculares). Os dados genômicos obtidos por 454-pirosequenciamento resultaram em uma cobertura de 37 vezes o tamanho do genoma e geraram 242 contigs. Entre estes, 187 contigs grandes representaram 96% do genoma (tamanho estimado de 6.8 Mb), com um conteúdo GC de 69.5%. Considerando a análise da expressão gênica, um procedimento para monitorar a aderência das células bacterianas às raízes das plântulas foi realizado por meio de microscopia eletrônica de varredura de amostras de raízes coletadas durante o experimento (i.e. 24, 48 e 72h após a inoculação). As células bacterianas obtidas em cada tratamento foram inicialmente submetidas à extração de RNA total, seguida de um processo de enriquecimento de mRNA e sequenciamento por meio da tecnologia de 454-pirosequenciamento (RNA-Seq). O amplo perfil de expressão gênica obtido foi mapeado no draft genômico, resultando em um total de 1.930 clusters gênicos. Posteriormente, estes clusters foram filtrados de acordo com sua abundância e ocorrência diferencial em cada tratamento, resultando em 280 genes diferencialmente expressos. Funções relacionadas ao metabolismo de etanol/metanol, divisão celular, resposta ao estresse oxidativo, produção de sideróforos, biossíntese de peptidoglicanos e hopanóides foram induzidas nas células bacterianas aderidas às raízes das plântulas, enquanto que genes relacionados ao metabolismo essencial das células foram observados principalmente nos tratamentos controle e planctônico. Estes dados fornecem uma base para estudos relacionados a mecanismos moduladores da interação bactériaplanta, distinguindo significativamente os tratamentos biofilme e planctônico, mostrando assim que o contato físico é essencial para o sucesso da interação em estudo. Por fim, estas análises permitiram uma ampla visualização de perfis de expressão gênica desta bactéria, utilizando o draft genômico primeiramente obtido como base para o estudo desta interação com a planta hospedeira. Estudos futuros podem ser desenvolvidos visando caracterizar os mecanismos adaptativos desta bactéria, como seu metabolismo metilotrófico e outros metabolismos específicos, os quais podem dar suporte ao comportamento endofítico deste organismo. / Methylobacterium mesophilicum strain SR1.6/6 is an endophytic bacterium, which has originally been isolated from surface-sterilized healthy citrus branch. This bacterium is able to associate with a range of plant species, rather in the roots, mediated by a biofilm structure, and in hypocotyl surfaces of in vitro seedlings. The aim of the present study was the development and application of a model to study in vitro the association between this bacterium and soybean seedlings. Genomic and transcriptomic approaches were applied resulting a draft of this bacterium genome and a broad profile of mapped mRNA sequences obtained in two different treatments; i) biofilm cells root adhered bacterial cells were removed by sonication, and ii) planktonic cells bacteria cells in suspension (i.e. interacting only with root exudates). Genomic data, obtained by 454-pyrosequencing have had an average depth of 37-fold coverage of the genome and yielded 242 contigs. Among these, 187 large contigs represented 96% of the genome sequence (estimate size of 6.8 Mb) with a GC content of 69.5%. Concerning the gene expression survey, the process to monitor the adherence of bacteria cells to the roots was performed by scanning electron microscopy of roots collected along the experiment (i.e. 24, 48 and 72 hours after inoculation). Bacterial cells obtained in each treatment were firstly submitted to RNA extraction, followed by mRNA enrichment and RNA-Seq using 454-pyrosequencing technology. The broad gene expression profile obtained was mapped into the drafted genome, resulting in a total of 1.930 gene clusters. After that, these clusters were filtered according to their abundance and differential occurrence in each treatment resulting in 280 differential expressed genes. Functions related to methanol/etanol metabolism, cell division, oxidative stress response, siderophore production, peptidoglycan and hopanoid biosynthesis were induced in bacterial cells adhered to plant roots, while genes related to essential cell metabolism were observed mostly in control and planktonic treatment. Also, these data provide insights into the mechanisms modulating plant microbe-interaction, significantly distinguishing biofilm and planktonic treatment, showing that the physical contact is a crucial step on plant-microbe interactions. In conclusion, results allowed a strongly supported analysis of gene expression, based on the genome draft of an endophytic bacterium interacting with the host plant. Further studies should focus on the adaptive mechanisms present in this bacterium, like the methylotrophic lifestyle and other specific metabolisms which might support its behavior as an endophytic bacterium.

A bacteria Pectobacterium carotovora causa danos a diferentes hospedeiros por meio da produção de enzimas pectinolíticas que degradam o pectato de cálcio da lamela media próximo a parede celular, causando extravasamento do conteúdo celular, sintomas da podridão mole. Bactérias do gênero Burkholderia tem se mostrado capazes em controlar a podridão mole em orquídeas, no entanto, os aspectos moleculares envolvidos neste controle ainda não foram estudados. Neste trabalho, foram avaliados 602 transformantes quanto a sua habilidade em inibir os sintomas da podridão mole, onde foram observados 16 mutantes defectivos no controle da doença. Destes, foram identificados sete diferentes genes inativados pelo transposon Tn5, e estes genes podem estar envolvidos em processos de síntese de aleloquímicos, competição por nutrientes, adaptação a condições ambientais, e na interação com o hospedeiro e/ou entre microrganismos. No entanto, o envolvimento destes genes na perda da capacidade em controlar a podridão mole deve ser melhor estudado. / The bacterium Pectobacterium carotovora cause damage to different hosts and by production of pectic enzymes that degrade calcium pectate of the middle lamella near of the cell wall, causing overflow of cell content and consequently the soft rot. Burkholderia genus has proven able to control the soft rot in Orchids, however, the molecular aspects involved in the control have not been studied. In this work, 602 transformants were characterized for their ability to inhibit soft rot caused by P. carotovora. We identified 16 mutants showing shifts in inhibition pattern or lost of the ablitity to inhibit soft rot symptoms. Among these mutants, we identified 7 genes related to disease inhibition,and this genes may be involved in process of allelochemicals synthesis, competition for nutrients, adapting to environmental conditions, and interaction between the host and microorganisms. However, the involvement of these genes in loss of ability to control the soft rot disease is being further studied in details.

INTRODUÇÃO: As infecções osteoarticulares permanecem como um grande desafio para os profissionais de saúde envolvidos no seu manejo, a despeito do sucesso obtido com a introdução dos antimicrobianos para o tratamento das doenças infectocontagiosas no final da década de 1930. O Staphylococcus aureus (S. aureus) é o agente mais frequentemente encontrado nestas infecções e também é o agente mais estudado, porém possuímos poucas informações disponíveis na literatura médica a respeito das osteomielites por bacilos Gram-negativos (BGN). OBJETIVOS: A caracterização clínica e microbiológica dos episódios de osteomielite causadas por bacilos Gram-negativos. A determinação das diferenças evolutivas e dos fatores de risco para a ocorrência de osteomielite por bacilos Gram-negativos, quando comparadas à osteomielite causada por S. aureus. MÉTODOS: Análise retrospectiva dos casos de osteomielite causadas por bacilos Gram-negativos atendidos no Instituto de Ortopedia e Traumatologia do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo no período de janeiro de 2007 a janeiro de 2009. Apenas amostras de osso ou aspirado de canal medular foram consideradas válidas. RESULTADOS: Foram incluídos 89 pacientes no grupo S. aureus e 101 pacientes no grupo BGN. Os pacientes do grupo BGN eram predominantemente do sexo masculino (63%), com mediana de 42 anos de idade. Apresentaram-se com osteomielite crônica (43%) e osteomielite aguda associada à fratura exposta (32%), nos membros inferiores (71%), cuja principal sintomatologia inicial foi a fistulização (69%). Quando comparado ao grupo S. aureus, o grupo BGN estava estatisticamente associado com o antecedente de fratura exposta (35% vs. 18%; p=0,0064), apresentando ainda um maior tempo de internação hospitalar (mediana 41 vs. 24 dias; p=0,0114), maior tempo para a obtenção da primeira cultura positiva (mediana 10 vs. 6,5 dias; p=0,0042), antibioticoterapia mais prolongada (mediana 40 vs. 24 dias; p=0,0329), maior número de procedimentos cirúrgicos (média 3,41 vs. 2,47; p=0,0173) e maior uso de reparo do revestimento cutâneo (31% vs. 9%; p=0,0005). O grupo S. aureus estava estatisticamente associado com as osteomielites da coluna vertebral (23,6% vs. 6,9%; p=0,0008). Foram isolados 121 agentes Gram-negativos de 101 amostras clínicas e os agentes mais frequentes foram Enterobacter spp. (24,7%), Acinetobacter baumannii (21,4%), Pseudomonas aeruginosa (19,8%) e Klebsiella pneumoniae (8,2%). CONCLUSÕES: Os 101 pacientes portadores de osteomielite por BGN eram na sua maioria jovens, do sexo masculino, vítimas de traumas nos membros inferiores e que desenvolveram osteomielite aguda e crônica associadas a fraturas expostas. Os pacientes do grupo BGN necessitaram de um número maior de procedimentos cirúrgicos, maior uso de reparo do revestimento cutâneo, permaneceram internados por mais tempo, necessitaram de um número de dias maior para o isolamento do agente infeccioso e utilizaram antibioticoterapia mais prolongada, quando comparados aos pacientes do grupo S. aureus. O antecedente de fratura exposta foi o principal fator de risco para o desenvolvimento de osteomielite por um BGN, quando comparado ao grupo S. aureus / INTRODUCTION: Bone and joint infection remains a serious therapeutic challenge, despite the high success rate observed with antibiotic therapy in most bacterial disease since the end of 1930 decade. Staphylococcus aureus (S. aureus) is the most studied and the most frequently isolated pathogen, but there is insufficient information in medical literature regarding Gram- negative bacilli (GNB) osteomyelitis. OBJECTIVES: Describe clinical and microbiological characteristics of Gram-negative bacilli osteomyelitis. Establish evolving differences and risk factors for the occurrence of GNB osteomyelitis, compared to S. aureus osteomyelitis. METHODS: Retrospective analysis of all patients with GNB osteomyelitis treated at Institute of Orthopedics and Traumatology, Hospital das Clínicas - School of Medicine, Universidade de São Paulo from january 2007 to january 2009. Only bone or bone marrow aspirate samples were included. RESULTS: 89 patients were included in S. aureus group and 101 patients were included in GNB group. Patients in GNB group were mostly male (63%), with median age of 42 years. At presentation, they had chronic osteomyelitis (43%) and acute open-fracture associated osteomyelitis (32%), in the lower limbs (71%), with a discharging sinus as the main clinical sign (69%). When compared to S. aureus group, GNB group was statistically associated with a previous history of open-fracture (35% vs. 18%; p=0.0064), showed a longer length of hospital stay (median 41 vs. 24 days; p=0.0114), a higher number of days to isolate the infective bacteria (median 10 vs. 6,5 days; p=0.0042), a longer use of antibiotics (median 40 vs. 24 days; p=0.0329), a higher number of surgical procedures (mean 3,41 vs. 2,47; p=0.0173) and a higher rate of soft- tissue reconstruction (31% vs. 9%; p=0.0005). S. aureus group was statistically associated with spine osteomyelitis (23,6% vs. 6.9%; p=0.0008). 121 Gram-negative pathogens were isolated from 101 clinical samples and the most frequent agents were Enterobacter spp. (24.7%), Acinetobacter baumannii (21.4%), Pseudomonas aeruginosa (19.8%) and Klebsiella pneumoniae (8.2%). CONCLUSIONS: Patients with GNB osteomyelitis were mainly young, male, with lower limb trauma and developed chronic and open- fracture associated osteomyelitis. Patients in GNB group had a higher number of surgical procedures, a higher rate of soft-tissue reconstruction, a longer length of hospitalization, a longer time to isolate the infective bacteria and a prolonged use of antibiotics, when compared to patients in S. aureus group. A previous history of open-fracture was the main risk factor to development of GNB osteomyelitis, compared to S. aureus group