Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2015-11-06T13:56:13Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 4206218 bytes, checksum: 1ab8811fdfb49e96c8403829a66a38e2 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-11-06T13:56:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 4206218 bytes, checksum: 1ab8811fdfb49e96c8403829a66a38e2 (MD5) Previous issue date: 2013-07-31 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Diante do contínuo aumento mundial de doenças como o câncer do tipo melanoma e infecções causadas por Staphylococus aureus resistentes à meticilina, a pesquisa por novos fármacos tem ganhado importância cada vez maior no mundo científico. O Brasil é um dos países com maior biodiversidade vegetal no mundo. Entretanto, muito pouco ainda se sabe sobre as propriedades terapêuticas desse patrimônio vegetal. O objetivo desse estudo foi avaliar, in vitro, o potencial citotóxico dos extratos hidroalcoólcios de Inga subnuda subsp. Luschnathiana (Benth.) T.D.Penn. (ingá) e Rollinia dolabripetala (Raddi) R.E. Fr. (araticum, marolo), dos flavonóides naringina e morina e de xantonas, sobre o câncer de pele do tipo melanoma, realizando um comparativo com a atividade do fármaco comercial 5-Fluoracil (5-FU). Os extratos também tiveram sua eficácia testada, in vitro, quanto ao seu potencial antioxidativo e potencial bactericida principalmente em cepas Gram-positivas. A avaliação da citotoxicidade foi baseada na linhagem B16F10 submetida ao ensaio colorimétrico do MTT. O extrato de I. subnuda apresentou ação bactericida contra todas as cepas bacterianas testadas, enquanto o extrato de R. dolabripetala apresentou atividade apenas contra S. aureus ATCC 29213. O extrato de I. subnuda desempenhou atividade antioxidante estatísticamente maior (p < 0,05) que os extratos de Gingko biloba (controle) e R. dolabripetala, tanto no teste do DPPH quanto no de peroxidação lipídica. No teste de citotoxicidade, a naringina foi considerada uma substância inativa para este tipo de câncerpatologia e a morina promoveu maior citotoxicidade no período de 72 horas (98,48% ± 0,71) com diferença significativa em relação ao controle (α < 0,05). Contudo, assim como a 1,7- dihidroxixantona, o potencial uso terapêutico da morina dificilmente será considerado devido a alta concentração necessária para desempenhar atividade citotóxica relevante (1,25x103 μg/mL). Assim, o extrato de ingá foi considerado o mais efetivo por, no tempo de 24, 48 e 72 horas, desencadear mais de 80% de citotoxicidade com a menor concentração (78,13 μg/mL). Os resultados indicam que ambos os extratos apresentam atividade antioxidante, antibacteriana e citotóxica, mas estudos posteriores são necessários para uma melhor compreensão das promissoras atividades biológicas dos extratos. / The increasing world-wide rates of deseases such as melanoma skin cancer and infections caused by methicillin-resistant strains of Staphylococcus aureus has historically attracted the attention of researchers about the development of new drugs. Brazil has one of the world's greatest biodiversity; nevertheless, the majority of plants with therapeutic potential still unclear. The aim of present study was to evaluate the in vitro antiproliferative activity of naringin, morin, xanthones and hydroalcoholic extracts of Inga subnuda subsp. Luschnathiana (Benth.) T.D.Penn. and Rollinia dolabripetala (Raddi) R.E. Fr., compared of Fluorouracil (5-FU). Both extracts were evalueted about their antioxidant capability and about their antimicrobial activity mainly against Gram- positive bacterias. The cytotoxicity test methodology was based on the MTT colorimetric assay and was performed on B16-F10 melanoma cells. The I. subnuda extract was effective against the three strains of bacteria, whereas the R. dolabripetala extract was effective just against S. aureus ATCC 29213. The I. subnuda extract performed a statistical higher antioxidant activity (p < 0,05) than the Gingko biloba (control) and R. dolabripetala extracts in both antioxidative tests. The naringin was considered as inactive substance against this cancer cell and the morin bring about the higher citotoxity in 72 hours (98,48% ± 0,71) with statistically significant difference compared to the control group (α < 0,05). On the other hand, as 1,7-dihydroxyxanthone, the therapeutic use of the morin for this porpose could be disregarded due the high concentration required for relevant citotoxity activity (1,25x10 3 μg/mL of both). Thus, the I. subnuda extract was regarded as the most effective tested substance by his up to 80% citotoxity capability under all treatment periodo (24, 48, 72 hours). Moreover, the citotoxity test of I. subnuda extract required the lowest concentration for a effective result (78,13 μg/mL). The experiments reported tha both extracts play a role as an antioxidant, an antibacterial and a cytotoxic agent. However, further studies are required for a better understanding about their biological activities.

A broca-da-cana Diatraeasaccharalis(Fabricius) é uma das pragas-alvo do milho geneticamente modificado que expressagene(s) que codifica(m) proteína(s) de BacillusthuringiensisBerliner(milho Bt) no Brasil. Para estabelecer estratégias proativas de manejo de resistência, os objetivos do presente trabalho foram (1)estabelecer linhas-básicas de suscetibilidade à proteína Cry1F de B. thuringiensisem populações de D. saccharalis coletadas nas principais regiões produtoras de milho no Brasil na safra de 2010/2011, (2) realizar monitoramentoda suscetibilidade de populações de D. saccharalis na safra 2011/2012 e (3) avaliar a atividade biológica do milho Bt (evento TC1507) em diferentes estádios fenológicos no controle de D. saccharalis em condições laboratoriais. Para a caracterização das linhas-básicas de suscetibilidade foram realizados bioensaios com a proteína purificada Cry1F aplicada superficialmente em dieta artificial.As CL50 de Cry1F estimadas variaram de 0,47 a 7,02 ng de Cry1F/ cm2 dieta artificial para as populações avaliadas (variação de ?15 vezes). Foi definida e validada a concentração diagnóstica de 112 ng de Cry1F/cm²,baseada na estimativa da CL99 das populações testadas para o monitoramento da suscetibilidade. A avaliação da atividade biológica de milho Bt (evento TC1507) foi realizada com dois híbridos (Pioneer 30F35 e Dow 2B688) nos estádios fenológicos V3, V6 e V9 e em duas épocas de plantio. Alta atividade de controle de D. saccharalis foi obtida para os dois híbridos de milho Bt nos diferentes estádios fenológicos e épocas de plantio. Portanto, verificou-se que a espécie D. saccharalis é altamente suscetível à proteína Cry1F. Contudo, a implementação de estratégias de manejo da resistência é de fundamental importância para preservar a vida útil da tecnologia de milho Bt como importante ferramenta em programas de MIP. / The sugarcane borer Diatraeasaccharalis (Fabricius) is one of the target pests of genetically modified maizeexpressinggenes that code for insecticidal proteins from Bacillus thuringiensis Berliner (Bt maize) in Brazil. To implement proactive resistance management strategies, we leaded studies (1) to establish baseline susceptibility to Cry1F protein from B. thuringiensis in populations of D. saccharalis collected from major maize production regions in Brazil during 2010/2011 growing season, (2) to leadsusceptibility monitoring in populations of D. saccharalis collected in 2011/2012 growing season, and (3) to assess the biological activity of Bt maize (event TC1507) at different growth stages forD. saccharaliscontrol under laboratory conditions. The baseline susceptibility wascharacterizedwith purified protein Cry1F applied superficially on artificial diet. The estimatesof LC50 of Cry1F ranged from 0.47 to 7.02 ng Cry1F/cm2of artificial diet for the populations evaluated (? 15-fold variation).A diagnostic concentration of 112 ng Cry1F/cm ² was defined and validated for monitoring the susceptibility based on estimation of CL99 of all tested populations. The biological activity of Bt maize (event TC1507) was assessed by using two hybrids (Pioneer 30F35 and Dow 2B688) at growth stages V3, V6 and V9 and two planting seasons. High level of D. saccharaliscontrol was obtained for the twoBt maize hybrids at different growth stages and planting seasons. Therefore, we conclude that D. saccharalis is highly susceptible to Cry1F protein. However, implementation of insect resistance management strategies is essentialin order to preserve the lifetime of Bttechnology as an important tool in IPM programs.

A broca-da-cana Diatraeasaccharalis(Fabricius) é uma das pragas-alvo do milho geneticamente modificado que expressagene(s) que codifica(m) proteína(s) de BacillusthuringiensisBerliner(milho Bt) no Brasil. Para estabelecer estratégias proativas de manejo de resistência, os objetivos do presente trabalho foram (1)estabelecer linhas-básicas de suscetibilidade à proteína Cry1F de B. thuringiensisem populações de D. saccharalis coletadas nas principais regiões produtoras de milho no Brasil na safra de 2010/2011, (2) realizar monitoramentoda suscetibilidade de populações de D. saccharalis na safra 2011/2012 e (3) avaliar a atividade biológica do milho Bt (evento TC1507) em diferentes estádios fenológicos no controle de D. saccharalis em condições laboratoriais. Para a caracterização das linhas-básicas de suscetibilidade foram realizados bioensaios com a proteína purificada Cry1F aplicada superficialmente em dieta artificial.As CL50 de Cry1F estimadas variaram de 0,47 a 7,02 ng de Cry1F/ cm2 dieta artificial para as populações avaliadas (variação de ?15 vezes). Foi definida e validada a concentração diagnóstica de 112 ng de Cry1F/cm²,baseada na estimativa da CL99 das populações testadas para o monitoramento da suscetibilidade. A avaliação da atividade biológica de milho Bt (evento TC1507) foi realizada com dois híbridos (Pioneer 30F35 e Dow 2B688) nos estádios fenológicos V3, V6 e V9 e em duas épocas de plantio. Alta atividade de controle de D. saccharalis foi obtida para os dois híbridos de milho Bt nos diferentes estádios fenológicos e épocas de plantio. Portanto, verificou-se que a espécie D. saccharalis é altamente suscetível à proteína Cry1F. Contudo, a implementação de estratégias de manejo da resistência é de fundamental importância para preservar a vida útil da tecnologia de milho Bt como importante ferramenta em programas de MIP. / The sugarcane borer Diatraeasaccharalis (Fabricius) is one of the target pests of genetically modified maizeexpressinggenes that code for insecticidal proteins from Bacillus thuringiensis Berliner (Bt maize) in Brazil. To implement proactive resistance management strategies, we leaded studies (1) to establish baseline susceptibility to Cry1F protein from B. thuringiensis in populations of D. saccharalis collected from major maize production regions in Brazil during 2010/2011 growing season, (2) to leadsusceptibility monitoring in populations of D. saccharalis collected in 2011/2012 growing season, and (3) to assess the biological activity of Bt maize (event TC1507) at different growth stages forD. saccharaliscontrol under laboratory conditions. The baseline susceptibility wascharacterizedwith purified protein Cry1F applied superficially on artificial diet. The estimatesof LC50 of Cry1F ranged from 0.47 to 7.02 ng Cry1F/cm2of artificial diet for the populations evaluated (? 15-fold variation).A diagnostic concentration of 112 ng Cry1F/cm ² was defined and validated for monitoring the susceptibility based on estimation of CL99 of all tested populations. The biological activity of Bt maize (event TC1507) was assessed by using two hybrids (Pioneer 30F35 and Dow 2B688) at growth stages V3, V6 and V9 and two planting seasons. High level of D. saccharaliscontrol was obtained for the twoBt maize hybrids at different growth stages and planting seasons. Therefore, we conclude that D. saccharalis is highly susceptible to Cry1F protein. However, implementation of insect resistance management strategies is essentialin order to preserve the lifetime of Bttechnology as an important tool in IPM programs.

Este estudo identificou a presença e a viabilidade de Streptococcus spp., Propionibacterium acnes e Enterococcus faecalis antes e após os procedimentos endodônticos, utilizando o método de reação de cadeia de polimerase (PCR) baseado em RNA ribossômico (rRNA) e seus respectivos genes (rDNA). Foram coletadas amostras de 20 dentes com infecção primária antes (S1) e após o preparo químico-cirúrgico (S2), e depois do emprego do Ca(OH)2 como medicação intracanal (S3). DNA e RNA foram extraídos da mesma amostra de canal radicular e utilizados como moldes para reação de PCR com iniciadores específicos para a região 16S rRNA das espécies analisadas. Streptococcus espécies foram detectados em 20% e 25% das amostras S1 utilizando os métodos baseados em rRNA e rDNA, respectivamente; enquanto P. acnes foi detectado apenas pela análise de rRNA, estando presente em 10% das amostras S1. Após o preparo químico-cirúrgico, Streptococcus spp. foram detectado em 10% das amostras S2 quando se utilizou rDNA, porém não foi detectado pelo método baseado em rRNA, indicando ausência de células viáveis. Por outro lado, P. acnes foi detectado por ambos os métodos nas amostras S2, com prevalência de 10% e 5% quando se utilizou rRNA e rDNA como molde para PCR, respectivamente. Nas amostras S3, P. acnes foi a única espécie detectada nos ensaios baseados em rRNA, presente em 10% dos casos, enquanto o método baseado em rDNA falhou em detectar essa espécie. Por sua vez, E. faecalis não foi detectado em nenhuma amostra pelos métodos utilizados. Portanto, concluise que a suscetibilidade bacteriana aos procedimentos endodônticos varia entre as espécies Gram-positivas. Enquanto Streptococcus spp. foram suscetíveis, P. acnes persistiu ativo em canais radiculares após o preparo químico-cirúrgico e medicação intracanal. Esses dados sugerem que há necessidade de novas estratégias para a eliminação de espécies resisitentes ao tratamento endodôntico. / This study identified the presence and viability of Streptococcus spp., Enterococcus faecalis and Propionibacterium acnes before and after endodontic procedures, using the polymerase chain reaction (PCR) based on ribosomal RNA (rRNA) and their genes (rDNA ). Samples of 20 teeth with primary infection were collected before (S1) and after chemical-surgical preparation (S2), and after Ca(OH)2 as temporary dressing (S3). DNA and RNA were extracted from the same root canal sample and used as templates for PCR with specific primers for 16S rRNA region of the analyzed species. Streptococcus species were detected in 20% and 25% of the S1 samples using methods based on rRNA and rDNA, respectively; while P. acnes was only detected by analysis of rRNA, present in 10% of the samples S1. After chemicalsurgical preparation, Streptococcus spp. were detected in 10% of S2 samples when using rDNA as template, but they were not detected by the method based on rRNA, indicating the absence of viable cells. Furthermore, P. acnes was detected by both methods in samples S2, with a prevalence of 10% and 5% when using as template rRNA and rDNA for PCR, respectively. In S3 samples, P. acnes was the only species detected in assays based on rRNA, present in 10% of cases, while the rDNA-based method failed to detect this species. E. faecalis was not detected in any sample by the methods used. Therefore, it is concluded that bacterial susceptibility to endodontic procedures may vary among Gram-positive species. While Streptococcus spp. were susceptible, P. acnes persisted active in root canals after chemicalsurgical preparation and dressing. These data suggest the need for new strategies to eliminate resisitant species to endodontic treatment.

A cana-de-açúcar (Saccharum officinarum L.) é uma das mais importantes culturas agrícolas. Cultivada em mais de 127 países, a cultura se apresenta como um dos alicerces para a socioeconomia e cultura de muitas regiões do Brasil e do mundo. Sua produtividade depende de diversos fatores, sendo esses atendidos pela intensa hibridação interespecífica visando principalmente à obtenção de cultivares mais produtivas, precoces e resistentes a diversos tipos de estresses. Entre os estresses, os causados por microorganismos são os mais relevantes e, dentre estes, destaca-se o agente causal da doença raquitismo da soqueira da cana-de-açúcar, a bactéria Leifsonia xyli subsp. xyli (Lxx). O estudo mais aprofundado sobre esta relação patógenohospedeiro é difícil, visto que Lxx é uma bactéria fastidiosa de difícil cultivo. O sequenciamento completo de seu genoma abriu a oportunidade de se entender às causas fisiológicas da dificuldade do seu cultivo. Assim, os objetivos deste trabalho foram otimizar um meio de cultura para Lxx com base em análise de vias metabólicas importantes e estudar a expressão diferencial de seus genes quando esta é cultivada na presença e ausência de metionina. Análises bioinformáticas do genoma de Lxx indicaram que esta está apta a utilizar diversas fontes de carbono, de vitaminas, de ferro e aminoácidos. De fato, dentre as fontes de carbono testadas verificou-se o crescimento de Lxx utilizando manose, frutose e galactose, embora em menor eficiência do que glicose. Observou-se também a utilização das vitaminas cobalamina, tiamina, biotina e complexo vitamínico de Nitsch, sendo que o acréscimo destes elementos resultou numa maior taxa de crescimento de Lxx. Verificou-se também que Lxx está apta a utilizar citrato, sulfato e cloreto de ferro como fontes deste metal, mas em menor eficiência que quando comparada a hemina bovina. Com estes resultados, verificamos que a adição do aminoácido metionina (1 g/L) e das vitaminas D-biotina (0,01 g/L) e cloreto de tiamina (0,01 g/L) obtém-se um desenvolvimento mais acelerado, em média 30%. Na análise da expressão gênica na presença da metionina, verificou-se uma regulação diferencial de 114 genes, sendo que destes 95 foram regulados positivamente e 19 negativamente. Os resultados indicam que Lxx necessita de metionina e que ela utiliza esse aminoácido como uma possível fonte de nitrogênio. Indicaram também que maior crescimento na presença de metionina está relacionado a uma regulação gênica positiva de genes do metabolismo central. / Sugarcane (Saccharum officinarum L.) is one of the most important tropical crops. Cultivated in more than 127 countries, it is of importance both for the social economy and culture of many regions of Brazil and of the world. Its productivity depends on diverse factors that are dealt with the intense interspecific hybridization aiming for more productive cultivars, that are resistant to diverse types of stress. Of these, stresses caused by microorganisms are the most relevant and among these the bacterium Leifsonia xyli subsp. xyli (Lxx), the causal agent of the ratoon stunting disease is one of the most important. The study of this patosystem, however, is very difficult, since Lxx is a fastidious bacterium. The availability of the complete genome sequence of Lxx made possible the understanding of the physiological causes of its fastidious behavior. Thus, the objectives of this work were to optimize the culture medium of Lxx by analyzing important pathways and to study gene expression when Lxx is cultivated in the presence and absence of methionine. Bioinformatic analyzes of the Lxx genome indicated that it is capable to use diverse sources of carbon, vitamins, metals, iron and amino acids. In fact Lxx was able to grow in the presence of mannose, fructose and galactose as the main sugar components of the medium, but not so efficiently as in glucose. It was also observed that the addition of the vitamins cobalamin, thiamin, biotin and the Nitsch´s vitamin complex resulted in a better Lxx growth. It was also verified that Lxx is capable to use iron citrate, iron sulphate and iron chloride as the main sources of iron, but less efficiently than when compared to hemin bovine chloride. With these results, it was verified that the addition of methionine (1 g/L) and of the vitamins D-biotin (0.01 g/L) and thiamine chloride (0.01 g/L) resulted in a faster growth of Lxx in vitro by as much as 30% on average compared to the standard medium. Gene expression analyses showed that the addition of methionine to the medium resulted in an alteration of expression levels of 114 genes, 95 of which were up regulated and 19 otherwise. This result indicated that Lxx needs an outside source of methionine and that it uses this amino acid a source of nitrogen. Also, it indicated that the improved growth in the presence of methionine is highly correlated with up regulation of genes of the central metabolism pathways.

Este estudo avaliou os efeitos de extratos de culturas líquidas de Leifsonia xyli subsp. xyli (Lxx) cultivada sob condições de estresse osmótico e na presença de inibidores da rota não-mevalonato (MEP/DOXP) de síntese de pigmentos isoprenóides, na germinação de sementes de alface. Também avaliou a relação entre o efeito tóxico dos extratos e a produção de pigmentos pela bactéria. Os extratos foram obtidos do sobrenadante de culturas de Lxx usando acetato de etila como solvente. Ensaios com sementes de alface embebidas nos extratos indicaram uma ação inibitória na germinação das sementes e no alongamento das radículas quando a bactéria foi cultivada na presença de 7% de PEG 6000 ou 100 mM de NaCl. O extrato foi submetido a vários tratamentos térmicos (temperatura ambiente; 30, 60 e 90oC em banho-maria e 121oC por autoclavagem) e sua ação inibitória em sementes mostrou-se termoestável. A presença de pigmentos isoprenóides de células cultivadas com PEG ou NaCl e de células incubadas sem estes agentes estressantes foi avaliada por espectrofotometria após extração dos pigmentos com metanol. Em células cultivadas na ausência de estresse, notou-se um pico de absorbância bem definido no comprimento de onda de 400 nm, ao passo que este pico foi sensivelmente reduzido em células cultivadas sob estresse. Esse efeito foi mais pronunciado na presença de PEG. Para confirmar a natureza isoprenóide do composto, Lxx foi cultivada na presença de fosmidomicina ou difenilamina, que são inibidores da rota metabólica não-mevalonato destes compostos em Microbacteriaceae. Ambas as substâncias reduziram o pico de absorbância no espectro em relação a células cultivadas sem adição destes antibióticos, confirmando a natureza do composto e sua via de síntese. No entanto, a redução foi mais acentuada no caso da fosmidomicina. Por fim, a fosmidomicina foi utilizada com a finalidade de verificar seu efeito na toxidez dos extratos. Foi observado que o efeito tóxico do extrato foi reduzido quando Lxx foi cultivada na presença do inibidor. Ao se avaliar o conteúdo das células, notou-se também redução expressiva no conteúdo relativo de compostos isoprenóides, como esperado. Os resultados indicaram que a bactéria secreta um produto cuja ação é similar à do ABA e que há uma correlação entre a produção do mesmo e a síntese de pigmentos isoprenóides. Em conjunto, o estudo dá suporte à hipótese levantada anteriormente por Monteiro- Vitorello et al. (2004) com base em análise in silico do genoma de Lxx, segundo a qual a bactéria estaria apta a secretar um composto análogo ao ácido abscísico (ABA). / This study evaluated the effects of extracts of liquid cultures of Leifsonia xyli subsp. xyli (Lxx) grown under osmotic stress and in the presence of inhibitors of the non-mevalonate pathway (MEP/DOXP) of synthesis of isoprenoid pigments on the germination of lettuce seeds. The relationship between the extracts toxic effect and the production of pigments was evaluated as well. The extracts were obtained from the supernatant of Lxx cultures using ethyl acetate as a solvent. Essays with lettuce seeds soaked in the extracts indicated an inhibitory action on germination and on the elongation of the radicles when the bacterium was cultivated in the presence of 7% PEG 6000 or 100 mM NaCl. The extract was submitted to different thermal treatments (room temperature; 30, 60 and 90oC water bath and 121oC autoclaving) and its inhibitory action was shown to be thermostable. The presence of isoprenoid pigments in cells cultivated with PEG, NaCl or in the absence of these stressing agents was evaluated by spectrophotometry after extracting the pigments with methanol. In cells incubated in the absence of stress, a well-defined absorbance peak at 400 nm wavelength was noted, whereas this peak was sensibly reduced in cells cultivated under stress. This effect was more pronounced in the presence of PEG. To confirm the isoprenoid nature of the compound, Lxx was incubated in the presence of fosmidomycin and diphenylamine, which are inhibitors of the nonmevalonate metabolic pathway of these compounds in Microbacteriaceae. Both substances reduced the absorbance peak in the spectrum compared to cells cultivated in the absence of these antibiotics, confirming the nature of the compound and its synthesis pathway. Moreover, the peak reduction was more accentuated in the presence of fosmidomycin. Lastly, fosmidomycin was used to evaluate its effect on the toxicity of the extracts. It was observed that the toxic effect of the extract was reduced when Lxx was cultivated in the presence of this inhibitor. When the cell content was evaluated, an expressive reduction on the relative content of carotenoid compounds has also been noticed, as expected. The results indicated that the bacterium secretes a compound whose action is similar to ABA and that there is a correlation between the production of this compound and the synthesis of isoprenoid pigments. The results support the hypothesis proposed earlier by Monteiro-Vitorello et al. (2004) based upon an in silico analysis of the genome of Lxx, according to which the bacterium would be able to secrete a compound analogous to abscisic acid (ABA)

Este estudo identificou a presença e a viabilidade de Streptococcus spp., Propionibacterium acnes e Enterococcus faecalis antes e após os procedimentos endodônticos, utilizando o método de reação de cadeia de polimerase (PCR) baseado em RNA ribossômico (rRNA) e seus respectivos genes (rDNA). Foram coletadas amostras de 20 dentes com infecção primária antes (S1) e após o preparo químico-cirúrgico (S2), e depois do emprego do Ca(OH)2 como medicação intracanal (S3). DNA e RNA foram extraídos da mesma amostra de canal radicular e utilizados como moldes para reação de PCR com iniciadores específicos para a região 16S rRNA das espécies analisadas. Streptococcus espécies foram detectados em 20% e 25% das amostras S1 utilizando os métodos baseados em rRNA e rDNA, respectivamente; enquanto P. acnes foi detectado apenas pela análise de rRNA, estando presente em 10% das amostras S1. Após o preparo químico-cirúrgico, Streptococcus spp. foram detectado em 10% das amostras S2 quando se utilizou rDNA, porém não foi detectado pelo método baseado em rRNA, indicando ausência de células viáveis. Por outro lado, P. acnes foi detectado por ambos os métodos nas amostras S2, com prevalência de 10% e 5% quando se utilizou rRNA e rDNA como molde para PCR, respectivamente. Nas amostras S3, P. acnes foi a única espécie detectada nos ensaios baseados em rRNA, presente em 10% dos casos, enquanto o método baseado em rDNA falhou em detectar essa espécie. Por sua vez, E. faecalis não foi detectado em nenhuma amostra pelos métodos utilizados. Portanto, concluise que a suscetibilidade bacteriana aos procedimentos endodônticos varia entre as espécies Gram-positivas. Enquanto Streptococcus spp. foram suscetíveis, P. acnes persistiu ativo em canais radiculares após o preparo químico-cirúrgico e medicação intracanal. Esses dados sugerem que há necessidade de novas estratégias para a eliminação de espécies resisitentes ao tratamento endodôntico. / This study identified the presence and viability of Streptococcus spp., Enterococcus faecalis and Propionibacterium acnes before and after endodontic procedures, using the polymerase chain reaction (PCR) based on ribosomal RNA (rRNA) and their genes (rDNA ). Samples of 20 teeth with primary infection were collected before (S1) and after chemical-surgical preparation (S2), and after Ca(OH)2 as temporary dressing (S3). DNA and RNA were extracted from the same root canal sample and used as templates for PCR with specific primers for 16S rRNA region of the analyzed species. Streptococcus species were detected in 20% and 25% of the S1 samples using methods based on rRNA and rDNA, respectively; while P. acnes was only detected by analysis of rRNA, present in 10% of the samples S1. After chemicalsurgical preparation, Streptococcus spp. were detected in 10% of S2 samples when using rDNA as template, but they were not detected by the method based on rRNA, indicating the absence of viable cells. Furthermore, P. acnes was detected by both methods in samples S2, with a prevalence of 10% and 5% when using as template rRNA and rDNA for PCR, respectively. In S3 samples, P. acnes was the only species detected in assays based on rRNA, present in 10% of cases, while the rDNA-based method failed to detect this species. E. faecalis was not detected in any sample by the methods used. Therefore, it is concluded that bacterial susceptibility to endodontic procedures may vary among Gram-positive species. While Streptococcus spp. were susceptible, P. acnes persisted active in root canals after chemicalsurgical preparation and dressing. These data suggest the need for new strategies to eliminate resisitant species to endodontic treatment.

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:50:35Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-08-31 / Objetivos: Descrever as principais diferenças clínicas, epidemiológicas e os fatores de risco para o óbito nos pacientes transplantados de órgãos sólidos com Infecções de Corrente Sanguínea (ISC) ocasionadas por bactérias Gram Negativas (GN) e Gram Positivas (GP). Métodos: Foi realizada uma análise retrospectiva de prontuários médicos, onde foram avaliados os pacientes submetidos a transplante de órgãos sólidos com ICS no período de janeiro de 2000 a 31 de janeiro de 2006 nos Hospitais São Paulo e do Rim e Hipertensão, além da análise dos fatores de risco para o óbito. Resultados: 195 pacientes foram incluídos neste estudo, tinham idade média de 43,3 (+ 0,90) anos e 114 (58,5%) eram do sexo masculino. 168 (86,2%) eram transplantes de rim, 16 (8,2%) rim-pâncreas, 5 (2,6%) cardíacos, 5 (2,6%) fígado e 1 (0,5%) fígado-rim. O tempo de internação médio foi de 34,2 (+ 62,7) dias. Foram ocasionados por GN 147 (75,4%) destes episódios, enquanto que 48 (24,6%) foram ocasionadas por GP. Nas ICS por GN o sítio de infecção mais comum foi o trato urinário em 68 (46,3%) casos, e nas ICS por GP foi a origem primária com 14 (29,1%) dos casos. A mortalidade geral dos pacientes com ICS por GN foi de 19,7% (29 casos) e nos pacientes com ICS por GP foi de 35,4% (17 casos) (p=0,03). Na análise de regressão logística múltipla, as variáveis que se associaram independentemente ao óbito nos pacientes com ICS por GN foram aqueles que evoluíram com insuficiência respiratória necessitando de ventilação mecânica OR 13,2 IC95=3,07-57,19 (p=0,001), além daqueles que apresentavam número maior o igual a duas co-morbidades OR 12,4 IC95=1,90-80,35 (p=0,008). Já na população com ICS por GP somente a insuficiência respiratória necessitando de ventilação mecânica OR 28,3 IC95=2,53-317,1 (p=0,007) foi associada independentemente ao óbito. Conclusões: Os pacientes com ICS por GN apresentaram a fonte urinária como principal sítio de infecção, enquanto que aqueles com ICS por GP, por sua vez, tiveram a fonte a primária. A presença de um número maior do que duas co-morbidades foi fator de risco para o óbito nos pacientes com ICS por GN. E a insuficiência respiratória foi fator de risco para o óbito tanto nos pacientes com ICS por GN, como naqueles com ICS por GP. / Objectives: To describe clinical and epidemiological differences, beyond clinical risk factors for death in solid organ transplant patients with Bloodstream Infections (BSI) caused by Gram Negative (GN) and Gram Positive (GP) bacteria. Methods: We performed a retrospective analysis of medical records, which were evaluated patients undergoing solid organ transplantation with BSI in the period from January 2000 to January 31, 2006 in the São Paulo and the Kidney and Hypertension Hospitals, São Paulo, Brazil. It was also performed the analysis of risk factors for death. Results: 195 patients were included in this study with a mean age of 43.3 (+ 0.90) years and 114 (58.5%) were male. 168 (86.2%) were kidney transplants, 16 (8.2%) kidney-pancreas, 5 (2.6%) heart, 5 (2.6%) liver and 1 (0.5%) liverkidney. The mean hospital stay was 34.2 (+ 62.7) days. Were caused by GN 147 (75.4%) of these episodes, whereas 48 (24.6%) were caused by GP. In the group with BSI by GN the most common site of infection was the urinary tract in 68 (46.3%) cases, and in the group with BSI by GP the most common was the primary source in 14 (29.1%) of the cases. The overall mortality of patients with BSI by GN was 19.7% (29 cases) and by BSI in patients with GP was 35.4% (17 cases) (p = 0.03). In multiple logistic regression analysis, the variables associated independently with death in patients with BSI by GN were those who developed respiratory failure requiring mechanical ventilation OR 13,2 IC95=3,07-57,19 (p=0,001), beyond those which had number equal to or greater than two co-morbidities OR 12,4 IC95=1,90-80,35 (p=0,008). In the population with BSI by GP only the respiratory failure requiring mechanical ventilation OR 28,3 IC95=2,53-317,1 (p=0,007) was independently associated with death. Conclusions: Patients with BSI by GN showed the urinary source as the main site of infection, while those with BSI by GP, had the primary source. The presence of more than two co-morbidities was a risk factor for death in patients with BSI by GN. And respiratory failure was a risk factor for death in patients with BSI by GN and GP. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Este estudo avaliou os efeitos de extratos de culturas líquidas de Leifsonia xyli subsp. xyli (Lxx) cultivada sob condições de estresse osmótico e na presença de inibidores da rota não-mevalonato (MEP/DOXP) de síntese de pigmentos isoprenóides, na germinação de sementes de alface. Também avaliou a relação entre o efeito tóxico dos extratos e a produção de pigmentos pela bactéria. Os extratos foram obtidos do sobrenadante de culturas de Lxx usando acetato de etila como solvente. Ensaios com sementes de alface embebidas nos extratos indicaram uma ação inibitória na germinação das sementes e no alongamento das radículas quando a bactéria foi cultivada na presença de 7% de PEG 6000 ou 100 mM de NaCl. O extrato foi submetido a vários tratamentos térmicos (temperatura ambiente; 30, 60 e 90oC em banho-maria e 121oC por autoclavagem) e sua ação inibitória em sementes mostrou-se termoestável. A presença de pigmentos isoprenóides de células cultivadas com PEG ou NaCl e de células incubadas sem estes agentes estressantes foi avaliada por espectrofotometria após extração dos pigmentos com metanol. Em células cultivadas na ausência de estresse, notou-se um pico de absorbância bem definido no comprimento de onda de 400 nm, ao passo que este pico foi sensivelmente reduzido em células cultivadas sob estresse. Esse efeito foi mais pronunciado na presença de PEG. Para confirmar a natureza isoprenóide do composto, Lxx foi cultivada na presença de fosmidomicina ou difenilamina, que são inibidores da rota metabólica não-mevalonato destes compostos em Microbacteriaceae. Ambas as substâncias reduziram o pico de absorbância no espectro em relação a células cultivadas sem adição destes antibióticos, confirmando a natureza do composto e sua via de síntese. No entanto, a redução foi mais acentuada no caso da fosmidomicina. Por fim, a fosmidomicina foi utilizada com a finalidade de verificar seu efeito na toxidez dos extratos. Foi observado que o efeito tóxico do extrato foi reduzido quando Lxx foi cultivada na presença do inibidor. Ao se avaliar o conteúdo das células, notou-se também redução expressiva no conteúdo relativo de compostos isoprenóides, como esperado. Os resultados indicaram que a bactéria secreta um produto cuja ação é similar à do ABA e que há uma correlação entre a produção do mesmo e a síntese de pigmentos isoprenóides. Em conjunto, o estudo dá suporte à hipótese levantada anteriormente por Monteiro- Vitorello et al. (2004) com base em análise in silico do genoma de Lxx, segundo a qual a bactéria estaria apta a secretar um composto análogo ao ácido abscísico (ABA). / This study evaluated the effects of extracts of liquid cultures of Leifsonia xyli subsp. xyli (Lxx) grown under osmotic stress and in the presence of inhibitors of the non-mevalonate pathway (MEP/DOXP) of synthesis of isoprenoid pigments on the germination of lettuce seeds. The relationship between the extracts toxic effect and the production of pigments was evaluated as well. The extracts were obtained from the supernatant of Lxx cultures using ethyl acetate as a solvent. Essays with lettuce seeds soaked in the extracts indicated an inhibitory action on germination and on the elongation of the radicles when the bacterium was cultivated in the presence of 7% PEG 6000 or 100 mM NaCl. The extract was submitted to different thermal treatments (room temperature; 30, 60 and 90oC water bath and 121oC autoclaving) and its inhibitory action was shown to be thermostable. The presence of isoprenoid pigments in cells cultivated with PEG, NaCl or in the absence of these stressing agents was evaluated by spectrophotometry after extracting the pigments with methanol. In cells incubated in the absence of stress, a well-defined absorbance peak at 400 nm wavelength was noted, whereas this peak was sensibly reduced in cells cultivated under stress. This effect was more pronounced in the presence of PEG. To confirm the isoprenoid nature of the compound, Lxx was incubated in the presence of fosmidomycin and diphenylamine, which are inhibitors of the nonmevalonate metabolic pathway of these compounds in Microbacteriaceae. Both substances reduced the absorbance peak in the spectrum compared to cells cultivated in the absence of these antibiotics, confirming the nature of the compound and its synthesis pathway. Moreover, the peak reduction was more accentuated in the presence of fosmidomycin. Lastly, fosmidomycin was used to evaluate its effect on the toxicity of the extracts. It was observed that the toxic effect of the extract was reduced when Lxx was cultivated in the presence of this inhibitor. When the cell content was evaluated, an expressive reduction on the relative content of carotenoid compounds has also been noticed, as expected. The results indicated that the bacterium secretes a compound whose action is similar to ABA and that there is a correlation between the production of this compound and the synthesis of isoprenoid pigments. The results support the hypothesis proposed earlier by Monteiro-Vitorello et al. (2004) based upon an in silico analysis of the genome of Lxx, according to which the bacterium would be able to secrete a compound analogous to abscisic acid (ABA)

A cana-de-açúcar (Saccharum officinarum L.) é uma das mais importantes culturas agrícolas. Cultivada em mais de 127 países, a cultura se apresenta como um dos alicerces para a socioeconomia e cultura de muitas regiões do Brasil e do mundo. Sua produtividade depende de diversos fatores, sendo esses atendidos pela intensa hibridação interespecífica visando principalmente à obtenção de cultivares mais produtivas, precoces e resistentes a diversos tipos de estresses. Entre os estresses, os causados por microorganismos são os mais relevantes e, dentre estes, destaca-se o agente causal da doença raquitismo da soqueira da cana-de-açúcar, a bactéria Leifsonia xyli subsp. xyli (Lxx). O estudo mais aprofundado sobre esta relação patógenohospedeiro é difícil, visto que Lxx é uma bactéria fastidiosa de difícil cultivo. O sequenciamento completo de seu genoma abriu a oportunidade de se entender às causas fisiológicas da dificuldade do seu cultivo. Assim, os objetivos deste trabalho foram otimizar um meio de cultura para Lxx com base em análise de vias metabólicas importantes e estudar a expressão diferencial de seus genes quando esta é cultivada na presença e ausência de metionina. Análises bioinformáticas do genoma de Lxx indicaram que esta está apta a utilizar diversas fontes de carbono, de vitaminas, de ferro e aminoácidos. De fato, dentre as fontes de carbono testadas verificou-se o crescimento de Lxx utilizando manose, frutose e galactose, embora em menor eficiência do que glicose. Observou-se também a utilização das vitaminas cobalamina, tiamina, biotina e complexo vitamínico de Nitsch, sendo que o acréscimo destes elementos resultou numa maior taxa de crescimento de Lxx. Verificou-se também que Lxx está apta a utilizar citrato, sulfato e cloreto de ferro como fontes deste metal, mas em menor eficiência que quando comparada a hemina bovina. Com estes resultados, verificamos que a adição do aminoácido metionina (1 g/L) e das vitaminas D-biotina (0,01 g/L) e cloreto de tiamina (0,01 g/L) obtém-se um desenvolvimento mais acelerado, em média 30%. Na análise da expressão gênica na presença da metionina, verificou-se uma regulação diferencial de 114 genes, sendo que destes 95 foram regulados positivamente e 19 negativamente. Os resultados indicam que Lxx necessita de metionina e que ela utiliza esse aminoácido como uma possível fonte de nitrogênio. Indicaram também que maior crescimento na presença de metionina está relacionado a uma regulação gênica positiva de genes do metabolismo central. / Sugarcane (Saccharum officinarum L.) is one of the most important tropical crops. Cultivated in more than 127 countries, it is of importance both for the social economy and culture of many regions of Brazil and of the world. Its productivity depends on diverse factors that are dealt with the intense interspecific hybridization aiming for more productive cultivars, that are resistant to diverse types of stress. Of these, stresses caused by microorganisms are the most relevant and among these the bacterium Leifsonia xyli subsp. xyli (Lxx), the causal agent of the ratoon stunting disease is one of the most important. The study of this patosystem, however, is very difficult, since Lxx is a fastidious bacterium. The availability of the complete genome sequence of Lxx made possible the understanding of the physiological causes of its fastidious behavior. Thus, the objectives of this work were to optimize the culture medium of Lxx by analyzing important pathways and to study gene expression when Lxx is cultivated in the presence and absence of methionine. Bioinformatic analyzes of the Lxx genome indicated that it is capable to use diverse sources of carbon, vitamins, metals, iron and amino acids. In fact Lxx was able to grow in the presence of mannose, fructose and galactose as the main sugar components of the medium, but not so efficiently as in glucose. It was also observed that the addition of the vitamins cobalamin, thiamin, biotin and the Nitsch´s vitamin complex resulted in a better Lxx growth. It was also verified that Lxx is capable to use iron citrate, iron sulphate and iron chloride as the main sources of iron, but less efficiently than when compared to hemin bovine chloride. With these results, it was verified that the addition of methionine (1 g/L) and of the vitamins D-biotin (0.01 g/L) and thiamine chloride (0.01 g/L) resulted in a faster growth of Lxx in vitro by as much as 30% on average compared to the standard medium. Gene expression analyses showed that the addition of methionine to the medium resulted in an alteration of expression levels of 114 genes, 95 of which were up regulated and 19 otherwise. This result indicated that Lxx needs an outside source of methionine and that it uses this amino acid a source of nitrogen. Also, it indicated that the improved growth in the presence of methionine is highly correlated with up regulation of genes of the central metabolism pathways.