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Generation of Endoplasmic Reticulum Protein 28 (ERp28) Knock Out Mice, and Structural and Functional Analysis of its Drosophila Homologue, Wind / Herstellung von Knock-out-Mäusen für das endoplasmatische Retikulumprotein 28 (ERp28) und Struktur- und Funktionsanalyse seines Drosophila Homologs WindGuo, Chaoshe 06 November 2003 (has links)
Meine Arbeit umfasst zwei Teile: (1) die Erstellung von knock-out Mäusen für Erp28, ein Gen, welches für ein Chaperone des Endoplasmatischen Reticulums kodiert, (2) die strukturelle und funktionelle Analyse von Wind, das ERp28-Homolog von Drosophila. Um eine ERp28 Knock-out Maus zu erstellen, musste zuerst die Genstruktur (Exonverteilung) von ERp28 etabliert werden. Danach wurde eine genomische Bibliothek von Mäusen mit 32P-markierten cDNA-Fragmenten gescreent, und zwei positive Klone, die den Genlokus von ERp28 enthalten, isoliert. Eine Restriktions karte vom Genlokus wurde erstellt. Das Gen für ERp28 hat eine einfache Struktur mit nur drei Exons. Das erste Exon enthält das Start codon ATG und das dritte das Stopcodon TGA. Fast die gesamte D-Domäne, die einzigartig für die Unterfamilie von PDI-D Proteinen ist, wird vom dritten Exon kodiert. Bei der RT-PCR für die Klonierung der cDNA von ERp78, habe ich möglicherweise eine alternative splice form von ERp28 entdeckt, in welcher das zweite Exon ausgeschnitten ist. Diese cDNA konnte auch bei Mensch und Ratte gefunden werden, nicht aber bei Drosophila, was auf eine limitierte Verbreitung bei verschiedenen Species hindeutet. Weitere Studien müssen aber gemacht werden, um die Existenz dieser alternativen splice Form zu bestätigen und zu charakterisieren. Auf der Basis der Genstruktur und des Restriktionsverdaus des ERp28- Locus, wurde ein knock-out (KO) Vektor erstellt und in ES-Zellen transfiziert. Drei positive Rekombinanten wurden durch Selektion mit Antibiotika und PCR-Screening erhalten. Chimere Mäuse wurden nach Microinjektion von zwei dieser 3 Klone in Mausblastocysten generiert. Heterozygote Mäuse wurden dann durch Paarung von männliche Chimeren und weiblichen C57BL6N Wildtypmäusen erstellt.Homozygoten wurden dann durch erneute Kreuzung von Heterozygoten erstellt. Durch Genotypiserung in PCR-Analysen und/oder Southern Blot wurden Chimeren, Heterozygoten und Homozygoten charakterisiert. Zur Zeit habe ich auch keinen auffälligen Phenotyp von -/- Homozygoten entdeckt. Deswegen werden, um die Funktion von ERp28 zu klären, detailierte Analysen gemacht. Immunologische Studien zeigen, dass obwohl ERp28 in verschieden Geweben und Organen exprimiert wird, es in E12 embryos in einigen spezifischen Geweben und Zellen relativ stärkes exprimiert wird, zum Beispiel in Glialzellen im Gehirn, im plexüs choreoideüs der weiterer Ventrikel und im Heren. Diese Beobachtungen stellen wichtige Informationen für eine genaüere phänotypische Analyse dar.Im 2. Teil meiner Arbeit sollte das PDI-Dß-Protein Wind kristallisiert werden. Da eine Kristallisation von Erp28 bisher nicht möglich war, konzentrierte ich mich auf sein Homolog Wind. Wind spielt eine wichtige Rolle in der Dorsoventral-Entwicklung in Drosophila Embryonen. Kürzlich wurde gezeigt, dass es für die richtige Lokalisation von Pipe, einem Schlüsselfaktor in der Dorsoventral-Entwicklung, essentiell ist. Die Kristallisation dieses Proteins wurde in Zusammenarbeit mit der Abteilung für Strukturchemie der Universität Göttingen ( Prof. Dr. Sheldrick) durchgeführt. Das Wind-Protein konnte bei einer Auflösung von 1,9 Ả kristallisiert werden. Wie sich zeigte, liegt es als Homodimer vor. Jedes Monomer besteht aus 2 unterschiedlichen Domänen: einer N-terminalen Domäne mit Ähnlichkeit zu Thioredoxin und einer C-terminal gelegenen D-Domäne. Das Dimer wird allein durch die Beteiligung der Thioredoxin-ähnlichen Domäne gebildet. In der N-terminalen Domäne liegt ein charakteristisches Strukturelement vor bestehend aus ßaßaßaßßa, welches dem Thioredoxinfold zugeordnet wird. Die D-Domäne hingegen besteht nur aus 5 a-Helices. Durch die Homodimerisierung entsteht ein tiefer, negativ geladener Dimerspalt, in welchem kleiner Peptide gebunden werden könnten. Auf der Oberfläche von Wind gibt es konservierte Aminosäuren. Ergebnisse aus Strukturanalyse, biochemischen Experimenten sowie Mutagenesestudien lassen auf eine mögliche Substrat-Bindestelle um Y55 in der Thioredoxin-Domäne herum schliessen, (Ma et al., 2003).Durch Insulin Reduktionsexperimente und Mutagenese konnten wir zeigen, dass das vorhandene CTGC-Motiv in der N-terminalen Domäne von Wind redox-inaktiv und nicht für den Transport von Pipe vom ER zum Golgi erforderlich ist. Daraus kann man folgern, dass es sich bei Wind um ein redox-unabhängiges Chaperon/ Escortprotein handelt. Weiterhin konnten wir zeigen, dass obwohl die b- und die D-Domäne für die Funktion von Wind wichtig sind die D-Domäne von Wind durch die seines Maus-Homologs Erp28 ersetzt werden konnte, ohne den Transport von Pipe zu beeinflussen. Dieses lässt auf eine ähnliche oder sogar gleiche Funktion der D-Domäne schliessen.Die Ergebnisse aus den Wind-Studien gaben wichtige Informationen zur Funktion von Erp28. Weiterhin sei betont, dass es sich bei der Kristallisierung von Wind um die erste Kristallstruktur eines PDI-verwandten Proteins im ER handelt. Die Struktur und die mögliche Substrat-Bindestelle, die in dieser Arbeit aufgeklärt wurden, können wichtige Hinweise geben für die Funktionen anderer PDI-Proteine.
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Thunderbolt in biogeochemistry: galvanic effects of lightning as another source for metal remobilizationSchaller, Jörg, Weiske, Arndt, Berger, Frank 06 February 2014 (has links)
Iron and manganese are relevant constituents of the earth's crust and both show increasing mobility when reduced by free electrons. This reduction is known to be controlled by microbial dissimilation processes. Alternative sources of free electrons in nature are cloud-to-ground lightning events with thermal and galvanic effects. Where thermal effects of lightning events are well described, less is known about the impact of galvanic lightning effects on metal mobilization. Here we show that a significant mobilization of manganese occurs due to galvanic effects of both positive and negative lightning, where iron seems to be unaffected with manganese being abundant in oxic forms in soils/sediments. A mean of 0.025 mmol manganese (negative lightning) or 0.08 mmol manganese (positive lightning) mobilization may occur. We suggest that lightning possibly influences biogeochemical cycles of redox sensitive elements in continental parts of the tropics/subtropics on a regional/local scale.
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Untersuchungen zur Wechselwirkung von Interleukin-10 mit Glykosaminoglykanen mittels NMR-SpektroskopieKünze, Georg 04 August 2015 (has links)
Das Zytokin Interleukin-10 (IL-10) ist ein Schlüsselspieler in der Regulation des Immunsystems mit pro- und anti-inflammatorischen Funktionen. Es spielt eine wichtige Rolle bei der Terminierung und Unterdrückung einer Entzündungsantwort, die ansonsten zu einer bleibenden Schädigung des Gewebes führen kann. Eine Dysregulation von IL-10 ist mit verschiedenen Krankheitsbildern wie chronischen Entzündungen, Autoimmunerkrankungen und Krebs assoziiert. IL-10 wird von einem breiten Spektrum von Zelltypen, darunter hauptsächlich hämatopoetische Zellen, aber auch epitheliale und mesenchymale Zellen, gebildet und in den extrazellulären Raum freigesetzt, wo es mit Komponenten der extrazellulären Matrix in Kontakt kommt. Es ist bekannt, dass IL-10 an Glykosaminoglykane (GAGs) binden kann und dass diese Interaktion seine biologische Aktivität beeinflusst. GAGs sind eine Klasse linearer Polysaccharide der extrazellulären Matrix. Sie bestehen aus wiederholenden Disaccharideinheiten und haben einen hoch negativ geladenen Charakter, welcher durch einen hohen Grad an Sulfatierung in der Zuckerkette zustandekommt. Sie binden eine Vielzahl an Signalproteinen und regulieren deren biologische Funktionen, etwa indem sie Einfluss auf die Rezeptorbindung oder die räumliche Verteilung des Proteins im Gewebe nehmen. Die molekularen Mechanismen, wodurch GAGs die biologische Aktivität von IL-10 beeinflussen, sind bisher unbekannt. Insbesondere ist nichts über die strukturellen Grundlagen der Interaktion bekannt, die Voraussetzung für ihr funktionelles Verständnis sind. In dieser Arbeit wurden daher die Bindungseigenschaften von IL-10 und GAGs sowie der strukturelle Aufbau ihres molekularen Komplexes unter Verwendung von NMR-Spektroskopie in Lösung charakterisiert. Es wurde eine definierte GAG-Bindungsstelle in IL-10 identifiziert und die Bindungsepitope und Bindungsaffinitäten von GAGs bestimmt. Die Ergebnisse dieser Arbeit weisen auf eine wichtige Rolle, die GAGs in der Biologie von IL-10 spielen können, hin – etwa für seine Speicherung im Gewebe oder für die IL-10-Rezeptorbindung.
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Structure and functional dynamics of the KdpFABC P-type ATPase from Escherichia coliHeitkamp, Thomas 17 April 2009 (has links)
The KdpFABC complex from E. coli functions as a high affinity K uptake system and belongs to the superfamily of P-type ATPases. So far, no information is available about the orientation of the subunits within the complex as well as its oligomeric state. By chemical crosslinking, gel filtration, electron transmission microscopy and single particle FRET analysis this study shows that the KdpFABC complex occurs as a homodimer with a dissociation constant between 30 to 50 nM. Furthermore, by means of single particle analysis of transmission electron micrographs, the solution structure of the complex at 1.9 nm resolution could be solved, thus providing the first structural analysis resolving all subunits of the holoenzyme. Based on crystal structures, it is generally assumed that P-type ATPases undergo large domain movements during catalysis. However, these conformational changes have never been shown directly. By use of single molecule FRET with alternating laser excitation, distance changes could be measured directly within KdpB during ATP hydrolysis. With this technique, distances and dwell times were determined for three conformational states in the working enzyme as well as in the orthovanadate- and the OCS-inhibited state.
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Mutagenesestudien an F-ATPasen aus E. coli : Auswirkungen zentraler Blockaden der elastischen Rotoreinheit gamma und Visualisierung der Relativrotation unter ATP SynthesebedingungenAhlbrink, Stephanie 16 January 2007 (has links)
1. Aufgrund der Resultate mit der Mutante MM10, die trotz Disulfidbrücke noch unverminderte Aktivität und Rotation zeigte, wurde der Frage nachgegangen, ob der EF1-Komplex in der Lage ist, die Rotation durch einen Bruch der alpha-helikalen Struktur von gamma oder durch Rotation um eine Einfachbindung der Disulfidbrücke aufrechtzuerhalten. Quervernetzungen vom Hexagon mit gamma in der Mitte und am unteren Ende konnten das Enzym blockieren. Von den vier betrachteten Mutanten KG11, MM26, MM25 und MM24 fiel der MM26 bereits nach der Isolierung raus. Der MM25 wies nicht mehr als 70% Quervernetzung auf. Bei dem KG11 und dem MM24 konnte jedoch eine 99%-ige Quervernetzung nachgewiesen werden. Mit diesen zwei Cystein-Doppelmutanten wurden weitere Quervernetzungen gefunden, die ebenso wie der MM10 aktiv nach Oxidation sind, aber tiefer im Enzym liegen und die ATP-Hydrolyse trotz Blockade durch Quervernetzung aufrecht erhalten. Es konnte gezeigt werden, dass eine Rotation um die Einzelbindungen innerhalb der Disulfidbrücke unwahrscheinlich ist, und daher die Aktivität des quervernetzten Enzyms nur durch eine Aufwindung der gamma-Helix erklärt werden kann. 2. Die Voraussetzung für ein EFOF1-Kostrukt zum optischen Nachweis der Relativrotation unter Synthesebedingungen war der Einbau von zwei verschiedenen Tags zur spezifischen Bindung. Von den vier Mutanten SE3, SE4, SW7 und WH1 zeigten die beiden SE-Mutanten keine Stabilität bei der Isolierung im Bezug auf die Kopplung zwischen FO- und F1-Teil. Mit dem SW7-EFOF1 wurde eine Mutante gefunden, die mit einer guten Aktivitäts- und Rotationsausbeute nach einer Aufreinigung mittels Streptactin-Affinitätchromatographie durch ihre Stabilität als Ausgangspunkt für das Rotationsexperiment unter ATP-Synthese dienen kann. Der WH1, dessen atp-Operon dem des SW7 gleicht, brachte trotz seines veränderten Vektorursprungs keine Verbesserung.
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Nové materiály pro podporu výuky biochemie na SŠ / New educational materials for education in biochemistry at secondary schoolsStránský, Jaroslav January 2021 (has links)
Biochemistry is usually the last taught discipline of chemistry. In the Czech Republic, grammar school students study biochemistry during the third or fourth grade. This can sometimes cause problems because there is often little time left for biochemistry when compared to other chemical disciplines. The content of the biochemical curriculum is often limited only to memorization of the most important facts and there is no time enough to point out the important relationships of biochemistry to everyday life. In the last year of study, many students have already decided whether or not to study chemistry in the future and it is then difficult to find some topics that would attract the attention of those who do not want to continue studying chemistry. This thesis is focused on the solving this situation. The first part gives an overview on the theoretical background, which forms the framework for the following parts - Analysis of selected textbooks, which was done to map the current state of teaching biochemistry in Czech schools, and Creation of new didactic materials that can complement current textbooks and help teachers explain the basics of biochemistry more clearly and in the context of contemporary everyday life. The last part of this diploma thesis summarizes the experiences with use of the...
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Entwicklung und Charakterisierung von Komplexen aus Cetrorelix und biophilen TrägermaterialienRattei, Thomas 12 August 2002 (has links)
Die Dissertation beschreibt Arbeiten zur Herstellung neuer Cetrorelixkomplexe, zur Kinetik der dynamischen Liberation, zur Struktur von Aggregaten und Komplexen von Cetrorelix und zur Berechnung von Komplexeigenschaften mit Molecular Modeling. / Presented are results about new complexes of cetrorelix, the kinetics of dynamical liberations, the structure of Cetrorelix aggregates and complexes and the computation of properties of complexes by molecular modeling.
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Wie ein einzelnes Neuron das Überleben eines Fadenwurmes sichertSinner, Marina, Busack, Inka, Bringmann, Henrik 06 November 2024 (has links)
Sleep is a vital behavioral and physiological state. It is controlled by conserved genes and neuronal circuit mechanisms. In the round worm Caenorhabditis elegans, one single neuron called RIS is essential for sleep. During sleep, RIS activates to shut down behavior and to support survival. Here, we summarize how stress leads to the activation of RIS signaling through immunity and longevity signaling pathways and how the single RIS neuron becomes crucial for the round worm to survive. / Circa acht Stunden täglich, also ein Drittel unseres Lebens, verbringen wir Menschen schlafend. Dabei opfern wir dem Schlaf nicht nur sehr viel Zeit, sondern nehmen sogar in Kauf, währenddessen durch stark eingeschränktes Bewusstsein besonders vulnerabel zu sein. Und nicht nur wir Menschen gehen dieses Risiko ein, sondern jedes bekannte Lebewesen mit Nervensystem. Angesichts all dessen lässt sich erahnen, dass Schlaf für uns absolut unentbehrliche Vorteile bringt. In der Tat ist chronischer Schlafmangel
mit gesundheitlichen Schäden assoziiert, z. B. einem erhöhten Infektionsrisiko, Krebs, Depressionen und vielen mehr. Die molekularen und zellulären Mechanismen hinter den Zusammenhängen zwischen Schlaf und Gesundheit sind bis heute aber kaum verstanden.
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Biochemical and structural characterization of the ATP-dependent maturation factor of acetyl-CoA synthaseGregg, Christina Maria 21 March 2018 (has links)
Acetyl-CoA Synthase (ACS) katalysiert die Reaktion eines Methylkations, Kohlenstoffmonoxid und CoA zu Acetyl-CoA. Das aktive Zentrum von ACS ist ein Ni,Ni-[4Fe4S]-Cluster (A-cluster), in dem zwei Nickel-Ionen mit einem kubanen [4Fe4S]-Cluster verbrückt sind. An der Biosynthese von komplexen Metallclustern sind in der Regel mehrere akzessorische Proteine, auch Maturationsfaktoren genannt, beteiligt. Die Biosynthese des A-Clusters wurde bisher noch nicht genauer untersucht und es war nicht bekannt welche Proteine die Biosynthese des A-Clusters katalysieren. In dieser Arbeit wurde das Protein AcsF als Maturationsfaktor der ACS identifiziert und seine biochemischen und strukturellen Eigenschaften wurden charakterisiert.
AcsF und apoACS aus Carboxydothermus hydrogenoformans bilden einen stabilen Komplex, der zwei Nickel-Ionen binden kann. ApoACS hingegen kann unter den gleichen Bedingungen im Durchschnitt nur weniger als ein Nickel-Ion binden. Der Ni-ACS-AcsF Komplex, an dem zwei Nickel-Ionen gebunden sind, ist katalytisch jedoch nicht aktiv. Erst durch Zugabe von Mg-ATP kann die inaktive Spezies in eine aktive Form überführt werden.
AcsF-Proteine gehören zur gleichen Protein-Familie wie CooC-Proteine, die Maturationsfaktoren der Kohlenstoffmonoxid Dehydrogenase. Ein Sequenzähnlichkeitsnetzwerk konnte zeigen, dass AcsF- und CooC-Proteine jeweils eine eigene Untergruppe in dieser Familie bilden. Die AcsF-Proteine von C. hydrogenoformans und Archaeoglobus fulgidus wurden kristallisiert und deren Kristallstrukturen gelöst. Durch einen Vergleich der Strukturen von AcsF mit den Strukturen von zwei CooC-Proteinen konnte aufgedeckt werden, dass die größten strukturellen Unterschiede zwischen AcsF- und CooC-Proteinen zwischem dem Switch I Motif und dem CXC Motif zu finden sind. / Acetyl-CoA synthase (ACS) catalyzes the reaction of a methyl cation, carbon monoxide and CoA to acetyl-CoA. The active site of ACS is a Ni,Ni-[4Fe4S] cluster (A-cluster), in which two nickel ions are bridged to a cubane-type [4Fe4S] cluster. Usually, several accessory proteins are involved in the biosynthesis of such complex metal clusters. However, the biosynthesis of the A-cluster had not yet been investigated and it was not known which accessory proteins take part in its assembly. In this work, the protein AcsF was identified as a maturation factor of ACS, and its biochemical and structural properties were characterized.
AcsF and apoACS from Carboxydothermus hydrogenoformans form a stabile complex, that can bind two nickel ions. ApoACS alone, on the other hand, binds on average only less than one nickel ion under the same conditions. The Ni-ACS-AcsF complex, that contains two nickel ions, is not active, but the addition of Mg-ATP converts the inactive species into an active form.
AcsF proteins belong to the same protein family as CooC proteins, the maturation factors of carbon monoxide dehydrogenase. A sequence similarity network showed that AcsF and CooC proteins each form their own subgroup within this family. The AcsF proteins from C. hydrogenoformans and Archaeobglobus fulgidus were crystallized and their crystal structures were solved. A comparison of the crystal structures of AcsF proteins with the structures of two CooC proteins revealed that the main structural differences between AcsF and CooC proteins can be found between the switch I motif and the CXC motif.
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Using modern microscopy and image analysis methods to study dosage compensation in C. elegansBreimann, Laura 17 February 2022 (has links)
Condensine sind essentiell für die Faltung von Chromatin und wurden auch mit der Transkriptionsregulation in Verbindung gebracht. Der zugrunde liegende Mechanismus für die Transkriptionsregulation ist jedoch unklar. Condensin DC in C. elegans ist ein gutes Modell zur Erforschung der Transkriptionsregulation durch Condensine, da es spezifisch für die Dosiskompensation der Gene auf dem X Chromosom benutzt wird. Condensin DC bindet an beide X Chromosome in C. elegans Hermaphroditen und reduziert deren Transkription um die Hälfte. In meiner Dissertation habe ich untersucht, welche Rolle ein dynamisches Binden von Condensin DC an Chromatin spielt und wie dies die Transkription während der Embryogenese reguliert.
Condensine binden dynamisch an Chromatin, um es zu komprimieren und durch Bildung von Schlaufen die Transkription zu regulieren. Mit Hilfe von „fluorescence recovery after photobleaching“ (FRAP) habe ich in adulten Darmzellen von C. elegans untersucht, welche Faktoren das dynamische Binden von Condensin DC an die X Chromosomen beeinflussen. Meine Daten zeigen, dass sowohl die ATPase-Domäne von Condensin DC, als auch eine nicht-katalytische Aktivität einer Histon-Demethylase die Bindedynamik von Condensin DC beeinflussen und damit Transkription regulieren.
Zusätzlich habe ich mit einem Mikroskopieansatz, der auf dem Nachweis von einzelnen RNA Molekülen beruht (smFISH), die Transkription von mehreren Genen untersucht, die durch Condensin DC während der Embryonalentwicklung reguliert werden. Die aus diesen Daten ermittelten Transkriptionskinetiken deuten darauf hin, dass Condensin DC vorrangig die Häufigkeit der Transkriptionsinitiation reguliert.
Zusammenfassend liefert meine Forschung neue Einblicke in die Transkriptionsregulation durch Condensine und kann als Basis für detailliertere, mechanistische Studien der Rolle von Condensinen in der Transkriptionsregulation in C. elegans und auch in anderen Organismen dienen. / Condensins are essential for chromosome compaction and have been implicated in transcription regulation. The mechanistic foundation of this regulatory function is poorly understood. A clear paradigm to address this question is the X-specific condensin DC in C. elegans, which specifically binds to and transcriptionally represses X chromosomes in XX hermaphrodites by 2-fold. In my thesis, I studied condensin DC binding dynamics to the X chromosome and how condensin DC affects transcription kinetics in single embryos.
The binding of condensins to chromatin has been described in recent microscopy-based studies as dynamic in processes including loop formation, chromatin compaction and transcription regulation. To study the dynamics of condensin DC binding, I established fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) in C. elegans adult intestinal cells. With this method, I studied how the ATPase domain and different histone modifiers regulate the dynamic binding of condensin DC. I found that the ATPase domain is critical for binding of the complex and that the noncatalytic activity of a histone demethylase increases the dynamics of condensin DC binding, which is crucial for its role in transcription regulation.
To further study the mechanism of condensin DC in transcription regulation, I used an imaging approach based on widefield single-molecule RNA fluorescence in situ hybridization (smFISH). I obtained thousands of smFISH images for a set of condensin DC-regulated genes and extracted mature and nascent RNA counts in 3D, which I used to determine transcription burst characteristics throughout embryonic development. My data show that condensin DC regulates the frequency of transcription initiation to down-regulate X-chromosomal genes.
Taken together, my results provide new insight into condensin-mediated transcription regulation, which can be used to inform future studies on the mechanism of condensins in transcription regulation in C. elegans and other organisms.
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