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Clonagem e expressão de uma α-amilase de Cryptococcus flavus e sua aplicação na degradação do amido.

Galdino, Alexsandro Sobreira 02 1900 (has links)
Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2008. / Submitted by Kelly Marques (pereira.kelly@gmail.com) on 2009-11-03T18:29:13Z No. of bitstreams: 1 TESE DE DOUTORADO.pdf: 9729892 bytes, checksum: 86dc32db2bd0d4bbddc8a4764a79ab08 (MD5) / Approved for entry into archive by Gomes Neide(nagomes2005@gmail.com) on 2010-10-27T14:40:11Z (GMT) No. of bitstreams: 1 TESE DE DOUTORADO.pdf: 9729892 bytes, checksum: 86dc32db2bd0d4bbddc8a4764a79ab08 (MD5) / Made available in DSpace on 2010-10-27T14:40:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TESE DE DOUTORADO.pdf: 9729892 bytes, checksum: 86dc32db2bd0d4bbddc8a4764a79ab08 (MD5) Previous issue date: 2008-02 / α-Amilases têm aplicações nas indústrias de processamento do amido, produção de álcool, têxtil e outras. Na busca por fontes de amilases na biodiversidade do cerrado, uma levedura foi isolada e classificada como Cryptococcus flavus. Embora esta levedura seja capaz de metabolizar amido, ela não pode ser usada na indústria por não possuir status GRAS. Por outro lado, S. cerevisiae, amplamente utilizada na indústria de etanol, não é capaz de degradar amido para produzir açúcares fermentescíveis, sendo necessária a clonagem e expressão heteróloga de enzimas amilolíticas nesse microrganismo. Neste trabalho, o gene da amilase de C. flavus (AMY1) codificando uma amilase extracelular foi clonado e expresso com sucesso em S. cerevisiae. A seqüência de nucleotídeos do cDNA revelou uma ORF de 1896 pb codificando uma cadeia polipeptídica de 631 aminoácidos apresentando uma homologia (97%) com a amilase da levedura Cryptococcus sp S-2. A presença das quatro regiões conservadas, (I) 144DVVVNH149, (II) 235GLRIDSLQQ243, (III) 263GEVFN267 e (IV) 327FLENQD332 classificou essa enzima na família 13 das glicosil hidrolases (G13). A cinética de produção da amilase recombinante alcançou a atividade amilolítica máxima (3,93 U/mL) em 60 horas de cultivo. A proteína recombinante apresentou uma massa molecular similar a amilase nativa (~ 67 kDa), parte devido à N-glicosilação. Além disso, a amilase recombinante foi caracterizada bioquimicamente apresentando um pH ótimo de 5,5, temperatura ótima de 60 °C e Km= 0,37 mg/mL para o amido. Com o objetivo de desenvolver uma cepa de S. cerevisiae capaz de degradar o amido de forma mais eficiente, o gene da glicoamilase de Aspergillus awamori foi clonado no vetor YEp352-PGK para co-expressão com o gene da amilase de C. flavus, clonado previamente no vetor YEp351-PGK. O clone de S. cerevisiae expressando as duas enzimas foi capaz de crescer em meio contendo amido como única fonte de carbono. Dados preliminares de fermentação em frasco mostraram que esse clone é capaz de produzir 116 g de ethanol/L durante 120 horas de cultivo. _____________________________________________________________________________ ABSTRACT / α-Amylases have applications in starch processing, alcohol production, textile and others industries. On screening for amylolytic yeasts in the Brazilian Cearrado, a yeast was isolated and classified as Cryptococcus flavus. Although C. flavus is able to metabolize starch, it cannot be used in industry because it does not possess GRAS status. On the other hand, S. cerevisiae, which is widely used in ethanol industry, cannot degrade starch to fermentable sugars, requiring for that the cloning and heterologous expression of amylolytic enzymes from other microrganisms. In this work, a C. flavus α-amylase gene (AMY1) encoding an extracelullar α-amylase has been cloned and successfully expressed in S. cerevisiae. The nucleotide sequence of the cDNA revealed an ORF of 1896 pb coding for a 631 amino acid polypeptide with high identity (97%) to a homologous protein isolated from Cryptococcus sp S-2. The presence of four conserved regions, (I) 144DVVVNH149, (II) 235GLRIDSLQQ243, (III) 263GEVFN267 and (IV) 327FLENQD332, places the enzyme in the GH13 α-amylase family. The assessment of the time course of amylase secretion in S. cerevisiae revealed a maximal extracellular amylolytic activity (3.93 U/mL) at 60 hours of incubation. The recombinant protein had an apparent molecular mass similar to the native enzyme (~67 kDa), part of which was due to N-glycosylation. On further characterization it was found that the recombinant amylase has optimal activity on pH 5.5 at 60 °C. Its for starch is Km= 0.37 mg/mL . In order to develop a S. cerevisiae strain able to degrade starch more efficiently, the Aspergillus awamori glucoamylase gene was cloned into the YEp352-PGK vector with a view to co-expression with the C. flavus α-amylase gene, previously cloned into YEp351-PGK. This new strain expressing both enzymes was able to grow in medium containg starch as sole carbon source. Preliminary data of flask fermentation suggest that this strain is able to produce 116g ethanol/L in 120 h of incubation.
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Estudos moleculares dos genes XYL1 e XYL2 de Candida tropicalis visando à produção de xilitol

Lima, Luanne Helena Augusto 03 1900 (has links)
Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2006. / Submitted by Fernanda Weschenfelder (nandaweschenfelder@gmail.com) on 2009-11-04T19:05:14Z No. of bitstreams: 1 Luanne Helena Augusto Lima.pdf: 4097968 bytes, checksum: 43f9433dc99c32e4ca8fd6528811bb0b (MD5) / Approved for entry into archive by Gomes Neide(nagomes2005@gmail.com) on 2010-10-27T14:45:16Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Luanne Helena Augusto Lima.pdf: 4097968 bytes, checksum: 43f9433dc99c32e4ca8fd6528811bb0b (MD5) / Made available in DSpace on 2010-10-27T14:45:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Luanne Helena Augusto Lima.pdf: 4097968 bytes, checksum: 43f9433dc99c32e4ca8fd6528811bb0b (MD5) Previous issue date: 2006-03 / O xilitol é um adoçante natural, anticariostático, utilizado principalmente na indústria de alimentos, com consumo anual estimado em 500.000 toneladas. O seu valor econômico, aliado a suas diversas aplicações, impulsionam pesquisas biotecnológicas para aumentar sua produção. A Candida guilliermondii FTI 20037 é uma das mais promissoras leveduras para produção de xilitol com rendimento acima de 0,5 g/Lh. Além disso, é capaz de produzir xilitol a partir de hidrolisado hemicelulósico de diversos resíduos agrícolas. A partir do seqüenciamento de regiões do DNA ribossômico de C. guilliermondii FTI 20037 foi demonstrado que esta levedura deve ser re-classificada como Candida tropicalis. O presente estudo representa uma das primeiras iniciativas para se desenvolver um sistema que permita a transformação genética de C. tropicalis com a finalidade de potencializar a produção de xilitol através da manipulação dos genes XYL1 (xilose redutase) e XYL2 (xilitol desidrogenase). Estes genes foram clonados e suas seqüências analisadas. O gene XYL2 por não ter sido ainda caracterizado, foi objeto de estudos mais detalhados. XYL2 é representado por uma ORF (open reading frame) de 1092 pb, que potencialmente codifica um polipeptídeo de 364 resíduos de aminoácidos, com ~40 kDa. XYL2 não possui íntrons, apresenta-se em única cópia no genoma de C. tropicalis e é controlado em nível transcricional pela presença de xilose. A seqüência primária da ORF XYL2 é idêntica à publicada no projeto genoma de C. tropicalis. Estudos de modelagem molecular demonstraram que a proteína Xyl2 pertence à família MDR (medium chain alcohol dehydrogenase) contendo sítios para ligação a zinco e NAD+. Para demonstrar sua funcionalidade, os genes XYL1 e XYL2 foram expressos com sucesso em S. cerevisiae. Visando o estabelecimento de um sistema de transformação para espécies de Candida um gene sintético (ZeoCan) que confere resistência a zeocina foi desenvolvido com o codon preferencial de C. tropicalis. Todavia, os resultados de transformação mostraram que a resistência a zeocina não é indicada como marca de seleção para C. tropicalis uma vez que esta levedura deve possuir mecanismos genéticos para anular o efeito do antibiótico. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Xylitol is a natural sweetener mainly used in the food industry with an annual estimated consumption of 500.000 tons. The high ecomonic value of xylitol together with its multiple applications have driven many biotechnological studies in order to improve its production. The Candida guilliermondii FTI 20037 is one of the most promising yeast of xilitol production with yields over 0.5 g/Lh. In addition, it is capable of producing xylitol from hemicellulosic hydrolysate derived from several raw materials. From the sequencing of ribossomal DNA regions from C. guilliermondii FTI 20037 we have shown that this yeast should be re-classified as Candida tropicalis. The present work represents one of the first initiatives towards the development of a system which would allow the genetic transformation of C. tropicalis with the goal of improving xylitol production through the manipulation of the genes XYL1 (xylose reductase) and XYL2 (xylitol dehydrogenase). These genes were cloned and the sequences were analyzed. Since XYL2 had not yet been characterized it was the focus of more detailed studies. XYL2 is represented by a 1092 pb open reading frame which potentially codes for a 364 residues polypeptide with ~40 kDa. XYL2 does not have introns, it is present as a single copy in the C. tropicalis genome and is controlled at the transcriptional level by the presence of xylose. The primary sequence of the XYL2 ORF is identical to the published sequence from the C. tropicalis genome project. Molecular modeling studies showed that the Xyl2 protein belongs to the MDR (medium chain alcohol dehydrogenase) family containing binding sites for zinc and NAD+. In order to functionally analyze the cloned genes, XYL1 and XYL2 were successfully expressed in S. cerevisiae. In order to establish a transformation system for Candida species a synthetic gene (ZeoCan) which confers zeocin resistance was developed with the C. tropicalis codon usage. However, the results from transformation experiments showed that the zeocin resistance gene should not be employed as selective marker in C. tropicalis since this yeast must display genetic mechanisms to counteract the effects the antibody.
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Análise estrutural e de expressão do gene pacC de Paracoccidioides brasiliensis

Aguiar, Sérgio Martin January 2006 (has links)
Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2006. / Submitted by Priscilla Brito Oliveira (priscilla.b.oliveira@gmail.com) on 2009-11-19T11:34:30Z No. of bitstreams: 1 Dissertacao Sergio Martin Aguiar.pdf: 2193468 bytes, checksum: 73f83e8b2ee3cc21959b2170c65029ec (MD5) / Approved for entry into archive by Carolina Campos(carolinacamposmaia@gmail.com) on 2010-02-04T16:25:02Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertacao Sergio Martin Aguiar.pdf: 2193468 bytes, checksum: 73f83e8b2ee3cc21959b2170c65029ec (MD5) / Made available in DSpace on 2010-02-04T16:25:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao Sergio Martin Aguiar.pdf: 2193468 bytes, checksum: 73f83e8b2ee3cc21959b2170c65029ec (MD5) Previous issue date: 2006 / O pH ambiental desempenha um papel importante na fisiologia de inúmeros microrganismos, determinando níveis de transcrição de genes cujos produtos funcionam na fronteira celular ou em seu exterior. Na adaptação de Aspergillus nidulans a diferentes valores de pH o fator transcricional PacC tem um papel importante, sendo ativado por uma via de treansdução de sinal em respsta a pH neutro/básico. Homólogos ao gene pacC foram isolados em diversos outros fungos. Em fungos como a Candida albicans e Fusarium oxysporum, foi demonstrado que PacC está envolvido em mecanismos de patogenicidade. Paracoccidioides brasiliensis é um fungo dimórfico, endêmico na América Latina, podendo provocar severa micose sistêmica em humanos. No presente trabalho foi isolado e seqüenciado um gene de P. brasiliensis ortólogo ao pacC de A. nidulans. A seqüência obtida foi avaliada, in silico, quanto a sua organização estrutural. O gene apresenta 2837 nucleotídeos e quatro íntrons. A proteína predita é composta de 676 resíduos de aminoácidos, possuindo massa molecular de aproximadamente 72,4 kDa. Foi demonstrado que a proteína predita a partir do gene em estudo possui regiões conservadas presentes na maioria das seqüências orólogas já descritas na literatura científica, apresentando maior identidade com a proteína de Trichophyton rubrum (50,2%). O perfil de expressão do gene pacC após crescimento de P. brasiliensis em meios de cultura com pH ácido, neutro e básico, revelou a presença do transcrito nas três condições de cultivo., por meio de experimento de RT-PCR. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Environmental pH is important for several microorganisms physiology, intervening at the transcriptional level of gene products which act at the cellular surface or outside the cell. In the ascomycete Aspergillus nidulans, cellular adaptation to different pH values is provided by the PacC transcriptional factor, which is activated by a signal transduction pathway triggered by neutral or basic pH. Homologues to the pacC gene were isolated from different fungi. In Candida albicans and Fusarium oxysporum, the PacC factor is related to pathogenicity mechanisms. Paracoccidioides brasiliensis is a dimorphic fungus, endemic in Latin America, and cause a severe systemic mycosis in humans. In this work, a P. brasiliensis gene, homologous to A. nidulans pacC, was isolated and sequenced. DNA sequence was evaluated, in silico, concerning its structural organization. P. brasiliensis pacC gene presents 2937 nucleotides and four introns. The predicted protein is composed of 676 amino acid residues, with a molecular mass of 72.4 kDa. The putative PacC protein presents motifs conserved in the majority of the published homologous sequences. The highest identity is with Trichophyton rubrum PacC (50.2%). Expression analyses of P. brasiliensis pacC gene, after fungal growth in acidic, neutral and alkaline pH, demonstrated that it is transcribed in all the conditions assayed.
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Produção de proteínas de interesse terapêutico em células de mamíferos em cultura

Sousa, Thiago Machado Mello de January 2006 (has links)
Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2006. / Submitted by wesley oliveira leite (leite.wesley@yahoo.com.br) on 2009-11-25T16:14:58Z No. of bitstreams: 1 Dissert Thiago Machado Mello de Sousa.pdf: 1918195 bytes, checksum: 76ffa4fe871a3a0f8ce3aff26c2c0b09 (MD5) / Approved for entry into archive by Carolina Campos(carolinacamposmaia@gmail.com) on 2010-01-14T19:06:01Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissert Thiago Machado Mello de Sousa.pdf: 1918195 bytes, checksum: 76ffa4fe871a3a0f8ce3aff26c2c0b09 (MD5) / Made available in DSpace on 2010-01-14T19:06:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissert Thiago Machado Mello de Sousa.pdf: 1918195 bytes, checksum: 76ffa4fe871a3a0f8ce3aff26c2c0b09 (MD5) Previous issue date: 2006 / As proteínas recombinantes de interesse terapêutico vêm ganhando cada vez mais espaço na indústria farmacêutica e atualmente já movimentam um mercado anual de cerca de 50 a 60 bilhões de dólares em todo o mundo. As células de mamíferos são as hospedeiras de expressão preferencialmente escolhidas no caso de proteínas que requerem um grau sofisticado de processamento pós-traducional, sendo crescente a iniciativa de identificação de novas linhagens de células, especialmente humanas, como sistemas alternativos de expressão às células utilizadas. Nosso grupo de pesquisa tem interesse na produção de antígenos para seleção de anticorpos com potencial neutralizante, especialmente os antígenos de superfície do envelope viral de HIV-1, agente etiológico da pandemia mundial de AIDS, que atualmente apresenta mais de 40 milhões de infectados. O presente trabalho teve por objetivo a avaliação preliminar das células de ducto de glândula submandibular humana (HSG) como sistema de expressão heteróloga alternativo às células de ovário de hamster chinês (CHO-K1). Comparativamente, foi avaliada a eficiência de transfecção, assim como a de expressão transiente do anticorpo quimérico anti-Z-DNA Z22, na forma recombinante de fragmento FvFc pelas duas linhagens celulares. Outro objetivo foi a produção de versões recombinantes das glicoproteínas virais de HIV-1. Os resultados apontaram as células HSG como um bom sistema alternativo para a produção de proteínas heterólogas secretadas, especialmente quando transfectadas por co-precipitação com fosfato de cálcio, sendo ainda necessários alguns ajustes, uma vez que os choques osmóticos com glicerol e DMSO, considerados pontencializadores da transfecção, mostraram-se tóxicos da forma como foram executados. Foram amplificados e clonados em vetor de expressão para células de mamíferos os segmentos gênicos correspondentes a quatro versões recombinantes das glicoproteínas do envelope viral de HIV-1 (gp160, gp140, gp120 e gp41+PS), subtipo C que, de acordo com as nossas análises, utiliza CCR5 como co-receptor. Até o presente momento, não foi possível a detecção das glicoproteínas recombinantes, expressas de forma transiente em células CHO-K1, sendo necessários ajustes, principalmente na etapa de transfecção. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Recombinant therapeutic proteins have become more and more important in the pharmaceutical industry, and nowadays they are responsible for an injection of about 50 to 60 million dollar a year into the worldwide market. Animal cell cultures are the preferential expression systems for those proteins which require extensive posttranslational modifications. In this view, the identification of alternative expression systems is an issue of increasing concern, specially considering human cell lines. Our research group has been interested in the production of antigens to be used for the selection of neutralizing antibodies, particularly those antigens derived from the envelope surface of HIV-1, the etiologic agent of the pandemic infection of AIDS, which nowadays affects more than 40 million people. This work aimed the preliminary evaluation of the human salivary gland duct cells (HSG) as a heterologous expression system alternative to the Chinese hamster ovary cells (CHO-K1). The transfection efficiency for both cell lines was comparatively evaluated, as well as the transient expression of the anti-Z-DNA Z22 chimeric antibody, as a recombinant FvFc fragment. Another objective was the production of recombinant versions of HIV-1 glycoproteins. Our results pointed out to the HSG cells as a good alternative system for the production of secreted heterologous proteins, specially when transfected by co-precipitation with calcium phosphate. Some adjusts are still needed, considering that the glycerol and DMSO osmotic shocks, generally considered as transfection pontentializers, proved to be toxic in the employed protocol. The genic fragments corresponding to four recombinant versions of the HIV-1 envelope glycoproteins (gp160, gp140 gp120 and gp41+PS), subtype C, were amplified and cloned in a mammal cells expression vector. According to our analysis, this virus subtype uses CCR5 as co-receptor. So far, it was not possible to detect the recombinant glycoproteins expressed in a transient form in the CHO-K1 cells. In order to achieve this objective, some adjustments are still necessary, specially concerning the transfection protocol.
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Avaliação de parâmetros operacionais e remoção de congêneres secundários tóxicos para melhoria da qualidade da cachaça de alambique / Systematic evaluation of the physical-chemical parameters implicated on the fermentation and distillation process of cachaça and remove secundaries toxics compounds of spirits

Marra, Brener Magnabosco 08 1900 (has links)
Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2008. / Submitted by Rosane Cossich Furtado (rosanecossich@gmail.com) on 2010-03-03T14:23:27Z No. of bitstreams: 1 2008_BrenerMagnabascoMarra.pdf: 1168530 bytes, checksum: f2cbd8d826ef9dd77b8ddcd4f3fea9d8 (MD5) / Approved for entry into archive by Lucila Saraiva(lucilasaraiva1@gmail.com) on 2010-03-03T22:10:34Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2008_BrenerMagnabascoMarra.pdf: 1168530 bytes, checksum: f2cbd8d826ef9dd77b8ddcd4f3fea9d8 (MD5) / Made available in DSpace on 2010-03-03T22:10:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2008_BrenerMagnabascoMarra.pdf: 1168530 bytes, checksum: f2cbd8d826ef9dd77b8ddcd4f3fea9d8 (MD5) Previous issue date: 2008-08 / Cachaça é o destilado genuinamente brasileiro produzido a partir da fermentação e destilação do caldo de cana-de-açúcar, cuja importância econômica vem crescendo aceleradamente. Dessa forma; o manejo, controle e sistematização das operações unitárias da fermentação e destilação são fatores fundamentais no desenvolvimento de estratégias de melhoria físico-química, sensorial e rendimento industrial da cachaça comercial de qualidade. Neste trabalho, avaliamos e sistematizamos os principais parâmetros físico-químicos envolvidos no processo de fermentação e destilação durante safras seguidas (2005, 2006 e 2007), sob condições operacionais práticas conduzidas na maioria das unidades produtoras do País. O controle do tempo e temperatura da alimentação da dorna de fermentação, teor alcoólico, velocidade e fracionamento da destilação, entre outros, demonstraram-se fundamentais para a produção e produtividade da cachaça de qualidade. Adicionalmente, foi desenvolvido um processo tecnológico de remoção de congêneres secundários tóxicos (aldeídos, furfural, hidroximetilfurfural, cobre, etc) e redução de valor calórico de destilados, especialmente a cachaça, através da utilização do abrandador quitosana. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Cachaça is genuinely a Brazilian spirit produced from fermentation and distillation of sugar cane, whose economic importance has been growing apace. Thus, the management, control and systematization of fermentation and distillation operations are fundamental factors to develop strategies for improvement of physico chemical and sensorial charactetistics as well as performance industrial cachaça of commercial quality. In the present study we have performed a long term systematic evaluation of the physico-chemical parameters implicated in the fermentation and distillation processes during three seasons(2005, 2006, 2007). We have shown that controlling the time and temperature of fermentation vat feeding, alcohol level, distillation speed, distillation division, among others, are crucial for higher production and productivity of cachaça. In addition, we developed a technological process for removal of related toxic compounds and reducing the calorific value of total spirits using chitosan.
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Interações moleculares de peptídeos com membranas fosfolipídicas

Pinheiro, Cristiano Guimarães do Amaral January 2009 (has links)
Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2009. / Submitted by Allan Wanick Motta (allan_wanick@hotmail.com) on 2010-03-10T15:57:18Z No. of bitstreams: 1 2009_CristianoGuimaraesdoAmaralPinheiro.pdf: 6022850 bytes, checksum: de87af154e58c83712757d3e3e0faa67 (MD5) / Approved for entry into archive by Lucila Saraiva(lucilasaraiva1@gmail.com) on 2010-04-30T21:16:41Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2009_CristianoGuimaraesdoAmaralPinheiro.pdf: 6022850 bytes, checksum: de87af154e58c83712757d3e3e0faa67 (MD5) / Made available in DSpace on 2010-04-30T21:16:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2009_CristianoGuimaraesdoAmaralPinheiro.pdf: 6022850 bytes, checksum: de87af154e58c83712757d3e3e0faa67 (MD5) Previous issue date: 2009 / A inserção de peptídeos na membrana plasmática é um dos principais paradigmas do processo geral de interação entre a célula e o ambiente. O entendimento físico-químico desse processo, sobretudo nos aspectos estruturais e energéticos da matéria, no nível das interações atômicas, é de particular interesse para novas aplicações na medicina e farmacologia. Podemos destacar o desenho racional de peptídeos antibacterianos, que por meio de interações com a membrana causam lise celular e conseqüente morte desses microorganismos. Além disso, a compreensão do processo de inserção peptídica é de igual interesse para o desenvolvimento de novos produtos voltados para o tratamento clínico de doenças humanas, como o Mal de Alzheimer relacionado à inserção e agregação de placas peptídicas na membrana. Dada à relevância biológica da inserção peptídica, o estudo desse processo têm sido de interesse científico e tecnológico para diversos grupos de pesquisa no mundo, entretanto, a sua completa descrição microscópica permanece ainda não elucidada. Nesse contexto atual, como um esforço adicional, esse trabalho visa caracterizar as propriedades microscópicas dirigentes do fenômeno de inserção de peptídeos utilizando simulações computacionais de Dinâmica Molecular, conjugadas a métodos de cálculo de energia livre. Um tempo total de simulação de 1,2 microsegundos foi requerido para estudar a partição de dois peptídeos com natureza físico-química distintas, isto é, um hidrofóbico e o outro hidrofílico carregado. O estudo revela uma estabilidade energética global para o peptídeo hidrofílico estruturalmente associado à região interfacial água/membrana, e inclusão do hidrofóbico no centro da bicamada. Em ambos os casos, o passo limitante para o processo de inserção é a transposição peptídica através da região polar do lipídio. Via manipulações biotecnológicas, essa informação é de especial valor para a maior estabilização de moléculas no interior da membrana, aumento da velocidade de inserção ou estabilização de agregados na superfície celular. Finalmente, a metodologia aqui desenvolvida permitirá estudar uma série de outras moléculas que se particionem e efetivamente atravessem diferentes modelos de membranas, contribuindo para o entendimento geral sobre o transporte de peptídeos pela membrana. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Peptide insertion through the plasmatic membrane is a major paradigm for the cellular-environment communications. At the level of atomic interactions, the structural and energetic knowledge about this process is of particular interest for novel applications in the fields of medicine and pharmacology. We can highlight the rational design of antimicrobial peptides that induce the microorganism death by causing cellular lysis and further developments applied to human dysfunctions, such as the Alzheimer’s disease related to peptide insertion and aggregation on the membrane surface. Given the broad biological significance of peptide insertion through membranes, this process has been of scientific and technological interests for several worldwide research groups, its complete microscopic description remains however to be clarified. Here, as an additional effort, the present contribution aims to the characterization of major microscopic properties controlling the process of peptide insertion, using advanced methods of free-energy Molecular Dynamics simulations. A total simulation time of 1.2 microseconds was required to study the membrane partition of two peptides with distinct physical and chemical properties, e.g., one hydrophobic and the other hydrophilic (charged). The study reveals a global energy minimum for the hydrophilic peptide adsorbed on the water-membrane interface, and the burying of the hydrophobic one in the lipid-bilayer main core. For both peptides, the rate-limiting step for molecule partition is the displacement across the lipid headgroups. By means of biotechnological manipulations, these findings are worth to enhance the stability of molecules in the bilayer-tail region, to speed up the insertion process or even to stabilize peptide aggregate forms on the membrane surface. Finally, the methodology herein developed allows one to study another set of molecules that interacts or permeates different lipid bilayer models, contributing therefore to a general understanding concerning the transport of peptides across membranes.
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Análise da região promotora dos genes 1,3-ß-glicana sintase e quitina sintase 4 de Paracoccidioides brasiliensis

Moraes, Daniella de Sousa January 2009 (has links)
Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2009. / Submitted by Allan Wanick Motta (allan_wanick@hotmail.com) on 2010-03-10T18:11:30Z No. of bitstreams: 1 2009_DanielladeSousaMoraes.pdf: 1854028 bytes, checksum: a3cd31cb45bfc1c91939808ab2cc1175 (MD5) / Approved for entry into archive by Daniel Ribeiro(daniel@bce.unb.br) on 2010-05-12T13:47:56Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2009_DanielladeSousaMoraes.pdf: 1854028 bytes, checksum: a3cd31cb45bfc1c91939808ab2cc1175 (MD5) / Made available in DSpace on 2010-05-12T13:47:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2009_DanielladeSousaMoraes.pdf: 1854028 bytes, checksum: a3cd31cb45bfc1c91939808ab2cc1175 (MD5) Previous issue date: 2009 / Paracoccidioides brasiliensis, o agente etiológico da paracoccidioidomicose (PCM), é um fungo termodimórfico que cresce como micélio à temperatura ambiente e se diferencia para levedura em culturas a 37°C e no tecido do hospedeiro. A transição dimórfica de P. brasiliensis está associada com alterações na parede celular. Quando o fungo se diferencia de micélio para levedura, o conteúdo de quitina é aumentado e a composição de glicana é alterada, reduzindo o conteúdo de 1,3-b-glicana e aumentando o conteúdo de 1,3-a-glicana. Em P. brasiliensis, um homólogo do gene de 1,3-b-glicana sintase (Pbfks1) e seis genes de quitina sintase (Pbchs1, Pbchs2, Pbchs3, Pbchs4, Pbchs5 e Pbchs6) foram identificados. Em nosso estudo, nós investigamos a região promotora dos genes Pbfks1 e Pbchs4. Por meio de ensaio de retardo da mobilidade eletroforética (EMSA), analisamos sondas referentes aos promotores desses dois genes e identificamos prováveis sítios regulatórios. A análise da região promotora do gene Pbfks1 indica um TATA Box que pode ser funcional, e sugerimos que o promotor do gene Pbchs4 possa estar sendo regulado pelo elemento de resposta ao estresse (STRE). Além disso, demonstramos também que o domínio de ligação ao DNA de PacC de P. brasiliensis reconhece um sítio descrito para PacC de A. nidulans, porém, a proteína não reconheceu uma variação na seqüência consenso presente no promotor do gene Pbchs4. Observamos que uma sonda referente ao promotor do gene Pbchs4 que contém um sítio para o fator de transcrição CreA não interage com o domínio de ligação ao DNA de CreA de Humicola grisea, mas apresenta interações DNA-proteína específicas nas fases de micélio e levedura. Adicionalmente, resultados de RT-PCR em tempo real revelaram que o gene Pbfks1 é mais expresso em meio com acetato do que em meio com glicose como fonte de carbono. Portanto, o trabalho desenvolvido em nosso grupo de pesquisa fornece dados que podem contribuir para a compreensão da regulação dos promotores dos genes 1,3-b-glicana sintase e quitina sintase 4 em P. brasiliensis. _________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Paracoccidioides brasiliensis, the etiological agent of paracoccidioidomycosis (PCM), is a thermal dimorphic fungus which grows as a mycelium at room temperature and differentiates to yeast in cultures at 37°C and in the host tissue. The dimorphic transition of P. brasiliensis is associated with changes in the cell wall. When the fungus differentiates from mycelium to yeast, the chitin content is increased and the composition of glucan changes, reducing the 1,3-β-glucan content and enhancing the content of 1,3-α-glucan. In P. Brasiliensis, one homologous of 1,3-β-glucan synthase gene (Pbfks1) and six genes of chitin synthase (Pbchs1, Pbchs2, Pbchs3, Pbchs4, Pbchs5 e Pbchs6) were identified. In our study, we investigated the promoter region of Pbfks1 and Pbchs4 genes. By means of Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA), we analyzed probes referring to promoters of these two genes and we identified probable regulatory sites. The analysis of the promoter region of the Pbfks1 gene indicates one TATA Box that could be functional, and we propose that the Pbchs4 promoter may be regulated by the stress responsive elements (STRE). Furthermore, we also demonstrated that the PacC DNA binding-domain of P. brasiliensis recognizes one A. nidulans’s PacC described site, nevertheless, the protein didn’t recognize one variation in the consensus sequence in the Pbchs4 promoter. We observed one Pbchs4 promoter probe with one CreA transcription factor site doesn’t interact with the CreA DNA bind-domain of Humicola grisea, but shows specific DNA-protein interactions in mycelium and yeast phases. Additionally, results of Real Time RT-PCR disclosed that Pbfks1 gene is more expressed in medium with acetate then in medium with glucose as a carbon source. Therefore, the work developed in our research group provides data which may contribute for the comprehension of 1,3-β-glucan synthase and chitin synthase 4 promoters’ regulation in P. brasiliensis.
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Contribuição do segmento VH e da CDRH3 no reconhecimento antigênico de ácidos nucléicos

Guedes, Leonardo January 2009 (has links)
Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2009. / Submitted by Larissa Ferreira dos Angelos (ferreirangelos@gmail.com) on 2010-03-30T15:15:38Z No. of bitstreams: 1 2009_LeonardoGuedes.pdf: 5624272 bytes, checksum: 75f7b4a1facc94065376aad00f058fb4 (MD5) / Approved for entry into archive by Daniel Ribeiro(daniel@bce.unb.br) on 2010-05-12T14:36:37Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2009_LeonardoGuedes.pdf: 5624272 bytes, checksum: 75f7b4a1facc94065376aad00f058fb4 (MD5) / Made available in DSpace on 2010-05-12T14:36:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2009_LeonardoGuedes.pdf: 5624272 bytes, checksum: 75f7b4a1facc94065376aad00f058fb4 (MD5) Previous issue date: 2009 / As imunoglobulinas são moléculas com capacidade de ligação a uma grande diversidade de antígenos. Estudos de variabilidade mostram que três regiões em cada cadeia variável, leve (L) e pesada (H), apresentam um maior grau de variabilidade, sendo por isso denominadas Regiões Determinantes de Complementaridade (CDR). Dentre essas, a CDR3 de ambas cadeias (H e L) é a que apresenta maior variabilidade. O objetivo deste trabalho é estudar anticorpos com capacidade de reconhecimento de ácidos nucléicos. Análises em bancos de dados revelaram que dentre as diversas famílias de genes que codificam as cadeias variáveis pesadas de camundongos, a pequena família VH10 destaca-se por ter sido identificada principalmente em anticorpos anti-DNA. Essa observação nos levou a postular que determinantes estruturais codificados por segmentos da família VH10 poderiam estar envolvidos nesse reconhecimento. Assim, nesse trabalho, construíu-se bibliotecas de scFvs de camundongos apresentadas na superfície de fagos filamentosos, contendo CDRH3s variáveis, no contexto de segmentos gênicos germinais da família VH10 e da família VH4 (que não apresenta nenhum Ac descrito como ligante a ácidos nucléicos depositado em banco de dados). A abordagem experimental consistiu basicamente na comparação do grau de variabilidade das CDRH3s selecionadas pela capacidade de reconhecimento a DNA de fita simples utilizando-se o procedimento de seleção (biopanning) preconizado na técnica de Phage Display As bibliotecas apresentavam tamanhos na ordem de 107 diferentes scFvs. Elas eram selecionadas pela capacidade de ligação a oligodT - celulose e os títulos de entrada e de saída foram obtidos em três ciclos de seleção. Foram realizados imunoensaios com as partículas virais selecionadas dos ciclos 2 e 3, tanto para a detecção da expressão dos scFvs como também para a verificação da capacidade de reconhecimento ao antígeno (oligodT - biotinilado). Os resultados obtidos com a análise de clones aleatoriamente escolhidos do ciclo 2 e 3 revelaram 12 sequências de CDR3Hs associadas a ligação a ácidos nucléicos e dessas, 9 são provenientes da família VH10 e 3 da família VH4. As três sequências obtidas no contexto de VH4 também estão presentes no contexto VH10. Os resultados sugerem que scFvs no contexto da família VH10, podem apresentar uma maior variabilidade CDR3Hs para o reconhecimento de ácidos nucléicos do que aqueles que apresentam o segmento da famíliaVH4, corroborando a hipótese de que determinantes estruturais codificados pelo segmento gênico VH10 participam do processo de reconhecimento antigênico. _________________________________________________________________________________ ABSTRACT / The immunoglobulins are molecules with the capacity to recognize a variety of antigens. Variability studies show that three regions in each variable chain, light (L) and heavy (H), have a greater degree of variability and is therefore called Complementarity Determinants Regions (CDR). Among these, the CDR3 of both chains (H and L) are the ones that show the greatest variabilities. The aim of this work is study the antibodies able to recognize nucleic acids. Analysis in databases revealed that among the different families that are gene that encode the murine variable heavy chains, the small VH10 family stands out in terms of such kind of antigen recognition. This observation led us to postulate that structural determinants encoded by the V segment of the VH10 family could be specially involved in this binding ability. Thus, we built two scFvs phage display libraries, containing variable CDRH3, in the context of germinal V gene from family VH10 and the family VH4 (which presents no antibody described as ligand to nucleic acid in databank). The experimental approach was basically the biopanning of phages from those two libraries, using oligo-dT celulose as ligand. After three selection rounds, phages from round 2 and 3 were analyzed in terms of CDR3H composition and the ability to bind to the antigen in immunoassays.The analysis of randomly selected clones revealed 12 sequences of CDR3Hs able to bind to nucleic acids. From these, 9 were from the VH10 family and 3 were VH4 phages. The three sequences obtained in the context of VH4 were also present in VH10 phages. The results suggested that VH10 scFvs may allow greater CDR3H variability than VH4 ones, corroborating the hypothesis that structural determinants encoded by the V gene segment from VH10 contributes significatively for the recognition of nucleic acids.
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Construção de um vetor integrativo em múltiplas cópias para Saccharomyces cerevisiae utilizando seqüências delta

Borges, Theyssa Fernanda Barbosa 13 February 2009 (has links)
Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2009. / Submitted by Jaqueline Ferreira de Souza (jaquefs.braz@gmail.com) on 2010-04-16T11:48:41Z No. of bitstreams: 1 2009_TheyssaFernandaBarbosaBorges.pdf: 1589278 bytes, checksum: 9ed964216329f161a08ac2c9b4fd1e06 (MD5) / Approved for entry into archive by Lucila Saraiva(lucilasaraiva1@gmail.com) on 2010-04-19T20:06:53Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2009_TheyssaFernandaBarbosaBorges.pdf: 1589278 bytes, checksum: 9ed964216329f161a08ac2c9b4fd1e06 (MD5) / Made available in DSpace on 2010-04-19T20:06:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2009_TheyssaFernandaBarbosaBorges.pdf: 1589278 bytes, checksum: 9ed964216329f161a08ac2c9b4fd1e06 (MD5) Previous issue date: 2009-02-13 / Atualmente, o mercado tornou-se favorável para a produção de etanol a partir de biomassa. E o Brasil já tem considerável experiência na produção de bioetanol a partir de cana-de-açúcar, no entanto ela é uma planta sazonal e requer terra de plantio de alta qualidade para seu crescimento. Como substrato alternativo para produção de etanol no Brasil a baixo custo, temos a mandioca. O grupo de biotecnologia molecular da UnB possui uma linha de pesquisa que visa diminuir os custos da produção de etanol a partir de amido de mandioca. Em 1995, Moraes et al. construiu oito linhagens de Saccharomyces cerevisiae capazes de converter amido a etanol, no entanto o vetor utilizado nas construções é epissomal e por não ser estável pode ser facilmente perdido durante o processo industrial onde há o stress ambiental e competição entre as linhagens. Para reverter este quadro, este trabalho visou a construção de um vetor integrativo baseado na seqüência δ do transposon Ty de Saccharomyces cerevisiae no qual foram inseridos os cassetes de expressão de α-amilase de Bacillus subtilis e glicoamilase de Aspergillus awamori, gerando três diferentes vetores: pTA (contendo o cassete da α-amilase), pTGA (contendo o cassete da glicoamilase) e pTAGA (contendo ambos os cassetes). A linhagem semi-industrial MFL e a linhagem industrial JP1 foram transformadas com os vetores construídos. Foram encontrados cinco clones positivos para atividade amilolítica nas transformações da MFL e dois na JP1, a baixa eficiência de seleção de transformantes deve-se ao fato de a marca de seleção não estar inserida no vetor integrativo. As curvas de crescimento dos clones positivos mostraram que não houve alterações no crescimento das linhagens após integração dos vetores e os testes de atividade enzimática mostraram que os clones estão produzindo as enzimas de interesse. Além disso, os testes de estabilidade mitótica mostraram alta estabilidade do vetor nos clones positivos da linhagem JP1, o que torna este sistema de expressão atrativo para produção industrial. ________________________________________________________________________________ ABSTRACT / At present, the market became favorable for ethanol production from biomass. And Brazil already has considerable experience in the bioethanol production from sugar-cane, however it is a seasonal plant and it requires land of planting of high quality for his growth. As alternative substrate for low cost ethanol production in Brazil, we have the cassava. The molecular biotechnology group of UnB has a line of research that aims to reduce the costs of ethanol production from cassava starch . In 1995, Moraes et al. built eight Saccharomyces cerevisiae strains able to convert starch to ethanol, however the vector used in this constructions is epissomal and because of not being stable it can be easily lost during the industrial process where there is the environmental stress and competition between strains. To revert this picture, this work aimed the construction of an integrative vector based on sequence δ of the Saccharomyces cerevisiae transposon Ty in which the cassettes of expression of Bacillus subtilis α-amilase and Aspergillus awamori glicoamilase were inserted, resulting three different vectors: pTA (containing the cassette of α-amilase), pTGA (containing the cassette of the glicoamilase) and pTAGA (containing both cassettes). The semi-industrial strain MFL and the industrial strain JP1 were transformed by these vectors. Five positive clones were found with amylolytic activity in the MFL transformations and two in the JP1, the low selection efficiency of positive clones is due to the fact that the selection mark wasnt inserted in the integrative vector. The positive clones growth curves showed that there were no alterations in the strains growth after vectors integration and the tests of enzymatic activity showed that the clones are producing the enzymes of interest. Moreover, the mitotic stabilitys tests showed high stability of the vector in the positive clones of the strain JP1, which makes this system of expression attractive for industrial production.
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Clonagem, expressão heteróloga e caracterização molecular de um gene de lacase de Pycnoporus sanguineus

Lima, Priscila da Silva 07 1900 (has links)
Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2009. / Submitted by Larissa Ferreira dos Angelos (ferreirangelos@gmail.com) on 2010-04-19T17:39:44Z No. of bitstreams: 1 2009_PrisciladaSilvaLima.pdf: 1572149 bytes, checksum: 33500bc789c2fabbdcfba622796b2d27 (MD5) / Approved for entry into archive by Lucila Saraiva(lucilasaraiva1@gmail.com) on 2010-05-03T20:34:55Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2009_PrisciladaSilvaLima.pdf: 1572149 bytes, checksum: 33500bc789c2fabbdcfba622796b2d27 (MD5) / Made available in DSpace on 2010-05-03T20:34:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2009_PrisciladaSilvaLima.pdf: 1572149 bytes, checksum: 33500bc789c2fabbdcfba622796b2d27 (MD5) Previous issue date: 2009-07 / Lacases são enzimas de ampla aplicação biotecnológica, como na remoção de lignina da polpa de celulose e biorremediação de compostos fenólicos de indústrias farmacêuticas e têxteis. Em um estudo iniciado por Garcia e colaboradores (2006), o fungo filamentoso Pycnoporus sanguineus foi descrito como produtor de lacases aplicadas no tratamento de efluentes fenólicos industriais. Dando continuidade a este estudo, um gene de lacase de P. sanguineus foi isolado, clonado e expresso na levedura metilotrófica Pichia pastoris, visando a produção desta enzima em larga escala para aplicação na biorremediação de efluentes fenólicos industriais, assim como, no branqueamento de papel e delignificação de biomassa lignocelulósica para produção de bioetanol. O cDNA da lacase foi obtido através de uma reação de RT-PCR utilizando primes específicos desenhados com base na seqüência de uma lacase de P. sanguineus depositada no banco de dados de seqüências no Genbank. Como produto da RT-PCR foi amplificado um segmento de DNA com 1500 pb. O cDNA foi, clonado no vetor PGEM-T e utilizado na transformação de células de Escherichia coli, sendo obtidos 18 clones positivos. Destes o clone denominado PGLac 1 foi utilizado para a obtenção das construções 1 e 2. Na construção1 o inserto obtido na clonagem em pGEM-T foi subclonado em pPICZA e utilizado na transformação de Pichia pastoris. Para esta construção, não foram detectados clones de P. pastoris produtores de lacases. Na construção 2, o cDNA foi subclonado utilizando-se o vetor de expressão pPIC9. Em seguida, foi realizada a transformação de P. pastoris GS115. Os transformantes foram plaqueados em meio seletivo sólido (MD) contendo o substrato AzBTS, sendo observados clones com a atividade enzimática de interesse. O cDNA clonado no vetor pPICZA10 foi seqüenciado. A seqüência obtida apresentou identidade de 97% com as lacases de P. sanguineus e P. cinnabarinus e 79% com uma lacase de Trametes sp. Além disto, a seqüência protéica predita possui 502 aminoácidos, 3 domínios conservados de cobre-oxidases, massa molecular de 58,8 KDa e ponto isoelétrico de 5,7. A seqüência predita foi modelada utilizando-se a ferramenta SPDBV, tendo como base a estrutura de uma lacase de C. cinereus. A lacase heteróloga tem 57% de identidade com a seqüência molde e uma estrutura semelhante a de outras lacases de fungos da podridão branca. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Lacases are enzymes with potential application in a set of industrial processes. Some authors described their use in bioremediation of phenolic compounds of pharmaceutical and dyes industries and in the removal of lignin of the cellulose pulp. In this study a laccase from Pycnoporus sanguineus previously described by Garcia and co-workers 2006), was expressed in the metylhothrofic yeast Pichia pastoris, aiming their production for biotechnological purposes. The laccase cDNA was obtained by RT-PCR and cloned using the vector PGEM-T. Escherichia coli harbouring the construction were selected and the clone called PGLac 1 was used for further experiments (subcloning and sequencing). Two different vectors were used for P. pastoris transformation, pPIC9 e pPICZ-A. The laccase activity was detected only for P. pastoris harbouring the construction 2 (pPIC9/laccase cDNA). The heterologous laccase presents identity with lacases from P. sanguineus, P. cinnabarinus (97%) and Trametes sp. (79%). Moreover, the predicted protein has 502 amino acids, 3 cupric-oxidase conserveddomains, molecular mass of 58,8 KDa and isoelectric point of 5,7. The molecular modelling revelead a globular protein with a active site containing copper atoms, coordinated by histidin and cistein residues.

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