XerC et XerD, deux recombinases impliquées dans la recombinaison site spécifique, résolvent les multimères d’ADN en monomères. Cette réaction se produit au niveau du site dif du chromosome, et nécessite le domaine C-terminale de la protéine de division cellulaire FtsK. Caulobacter crescentus est une bactérie aquatique de type Gram-négative qui se retrouve dans plusieurs environnements. Elle présente un cycle cellulaire asymétrique avec deux types de cellules distinctes. Cette propriété peut être utilisée pour synchroniser la croissance d’une population bactérienne pour permettre l’étude de l’expression de gènes à travers le temps et les liens entre le cycle cellulaire et le développement de la bactérie. La liaison à l’ADN et la capacité de former des complexes covalents (phosphotyrosyl) avec le site dif de C. crescentus (ccdif) ont été testé pour les recombinases de C. crescentus (ccXerC et ccXerD). Les deux recombinases ont eu une meilleure liaison au demi-site gauche de ccdif et sont incapable d’effectuer une liaison coopérative, contrairement à ce qui se produit au niveau du site dif de E. coli. La formation de complexes covalents a été testé en utilisant des «substrats suicides avec bris» marqués à la fluorescence ainsi que des protéines de fusion (marquées ou non à la fluorescence). Des complexes ADN-protéines résistants à la chaleur et au SDS ont été observé lors de la réaction de ccXerC et ccXerD de type sauvage avec ccdif, mais pas lors de la réaction de mutants avec le même ADN. Des complexes covalents phosphotyrosine sont formés de façon plus efficace sur les substrats suicides avec un bris au niveau du brin supérieur que ceux ayant un bris au niveau du brin inférieur. Dans les deux cas, c’est ccXerC qui est resté lié de façon covalente à l’ADN de ccdif. / In most bacteria, the chromosomal dimer resolution process is mediated by two tyrosine recombinases, XerC and XerD, which bind cooperatively and perform the recombination reaction at the dif site near the terminus of replication. This reaction also requires the C-terminal domain of the cell division protein FtsK. Caulobacter crescentus is an aquatic Gram-negative bacterium found in various environments. This bacterium has an asymmetric cell cycle which can be used to synchronize cell growth in order to study the temporal expression of a gene and the interconnection between the cell cycle and development. The binding activity and the formation of phosphotyrosyl complex of the C. crescentus recombinases, ccXerC and ccXerD, were tested on the C. crescentus dif (ccdif) site. Both ccXerC and ccXerD bound preferentially to the left half-site of ccdif and showed reduced cooperative binding, unlike what was found with the E. coli dif site. Covalent complex formation activity was tested by using fluorescently labelled linear “nicked suicide substrates” and labelled proteins. Heat and SDS-resistant protein-DNA complexes were formed when both wild-type ccXerC and ccXerD reacted with ccdif but not in the presence of active-site tyrosine mutant proteins. Phosphotyrosine complexes formed on the top-nicked suicide substrate were found to be more efficient than on the bottom-nicked suicide substrates and surprisingly ccXerC remained bound to both top and bottom-nicked ccdif suicide substrates.

Le cancer épithélial de l’ovaire (EOC) est le plus mortel des cancers gynécologiques. Cette maladie complexe progresse rapidement de façon difficilement décelable aux stades précoces. De plus, malgré une chirurgie cytoréductive et des traitements de chimiothérapie le taux de survie des patientes diagnostiquées aux stades avancées demeurt faible. Dans le but d’étudier l’EOC dans un contexte ex vivo, l’utilisation de modèles cellulaires est indispensable. Les lignées cellulaires d’EOC sont un outil pratique pour la recherche cependant, la façon dont l'expression des gènes est affectée en culture par comparaison à la tumeur d'origine n'est pas encore bien élucidée. Notre objectif était donc de développer et de caractériser de nouveaux modèles de culture in vitro qui réflèteront plus fidèlement la maladie in vivo. Nous avons tout d’abord utiliser des lignées cellulaires disponibles au laboratoire afin de mettre au point un modèle 3D de culture in vitro d’EOC. Des sphéroïdes ont été générés à l’aide de la méthode des gouttelettes inversées, une méthode pionnière pour la culture des cellules tumorales. Nous avons ensuite procédé à une analyse des profils d’expression afin de comparer le modèle sphéroïde au modèle de culture en monocouche et le modèle xénogreffe in vivo. Ainsi, nous avons identifié des gènes stratifiant les modèles tridimensionnels, tant in vivo qu’in vitro, du modèle 2D monocouche. Parmi les meilleurs candidats, nous avons sélectionné S100A6 pour une caractérisation ultérieure. L’expression de ce gène fût modulée afin d’étudier l’impact de son inhibition sur les paramètres de croissance des sphéroïdes. L’inhibition de ce gène a comme effet de réduire la motilité cellulaire mais seulement au niveau du modèle sphéroïde. Finalement, toujours dans l’optique de développer des modèles d’EOC les plus représentatifs de la maladie in vivo, nous avons réussi à développer des lignées cellulaires uniques dérivées de patientes atteintes d’EOC du type séreux, soit le plus commun des EOC. Jusque là, très peu de lignées cellulaires provenant de ce type de cancer et de patientes n’ayant pas reçu de chimiothérapie ont été produites. De plus, nous avons pour la première fois caractérise des lignées d’EOC de type séreux provenant à la fois de l’ascite et de la tumeur solide de la même patiente. / The epithelial ovarian cancer (EOC) is the most lethal of gynecological cancers. This complexe and heterogenous disease progresses rapidly and is almost asymptomatic in early stages. The survival rate of patients with late stage diagnosis remains low albeit cytoreductive surgery and chemotherapy. In order to study the EOC disease in an ex vivo context, the use of different cellular models is necessary. EOC cell lines derived from long-term passages of malignant ovarian cancers are useful tools for molecular and cellular research but it is not clear how culture conditions affect overall gene expression and oncogenic potential as compared to the original tumor. The main goal of this research was to develo and characterize new in vitro model systems that will recapitulate more closely some of the growth conditions encountered by tumor cells in vivo. In order to develop an in vitro tridimensional EOC spheroid model, we have used cell lines previously established in our laboratory. Spheroids were generated using the hanging droplet method, which was innovative for the culture of cancer cells. Comparative gene expression profile analysis of monolayer cultures, 3D spheroids and in vivo xenografts were performed and we have shown that the spheroid transcriptome more closely reflects expression patterns of the in vivo model compared to that of monolayer cultures. Among the best candidates, S100A6 gene over-expressed in the 3D models versus monolayer cultures was chosen for further analysis. To begin to address how S100A6 might affect EOC growth parameters, we have inhibited its expression in our in vitro models. The loss of S100A6 in the spheroid model results in an reduction of cellular migration, which seems to be in line with previous in vivo results published by other researchers. Always with the objective of developing the most relevant to the in vivo disease model systems, we have also succeeded in developing a unique EOC cell lines derived from patients with the most frequently diagnosed serous type of cancer. Very few cell lines derived from this type of cancers and from chemotherapy naïve patients are available. Moreover, we characterize for the first time EOC serous type cell lines derived from the ascites and the solid tumor of the same patient.

L’inflammation est un procédé complexe qui vise l’élimination de l’agent causal de dommages tissulaires en vue de faciliter la réparation du tissu affecté. La persistance de l’agent causal ou l’incapacité à résoudre l’inflammation mène à un dérèglement homéostatique chronique qui peut avoir une incidence sur la morbidité et la mortalité. L’athérosclérose est une condition inflammatoire chronique des vaisseaux sanguins dont l’origine est multifactorielle. L’hypertension et l’état infectieux représentent respectivement des facteurs de risque classiques et émergents du développement de cette maladie. Les fondements initiaux de l’inflammation font intervenir l’immunité innée, la première ligne de défense dont disposent les cellules pour répondre à un signal de danger. Le but de cette thèse est d’examiner le rôle pro-inflammatoire d’une famille de kinases essentielles à l’immunité innée, soit celle des kinases de IkappaB (IKK) et des kinases IKK-related. Les kinases IKKalpha et IKKbeta forment le complexe IKK avec la molécule adaptatrice NEMO/IKKgamma. Ce complexe est chargé d’effectuer la phosphorylation de l’inhibiteur de NF-kappaB, IkappaBalpha, ce qui mène à sa dégradation et à la libération du facteur de transcription NF-kappaB. Nous montrons que le peptide vasoactif angiotensine II (AngII) induit l’activité phosphotransférase d’IKKbeta dans les VSMC par immunoprécipitation de NEMO puis essai kinase in vitro. Grâce à une approche ARN interférence (ARNi) dirigée contre IKK, nous montrons que cette kinase est responsable de la phosphorylation de p65/RelA. Nous montrons que le mécanisme d’induction de NF-kappaB par l’AngII est atypique, puisqu’il ne module pas IkappaBalpha, et montrons à l’aide d’inhibiteurs pharmacologiques que l’activation de p65 est indépendante des voies MEK-ERK-RSK, PI3K et de la transactivation du récepteur de l’EGF. Les kinases IKK-related Tank-binding kinase 1 (TBK1) et IKK-i sont quant à elles principalement activées suite à une infection bactérienne ou virale. Ces kinases phosphorylent directement le facteur de transcription interferon regulatory factor (IRF)-3. Nous montrons que le cytomégalovirus humain, un pathogène associé à l’athérosclérose, a la capacité d’induire l’activation de TBK1 dans les VSMC. L’usage d’ARNi dirigé contre TBK1 et IKKi montre que les 2 kinases sont impliquées dans l’activation d’IRF-3. De plus, nous montrons à l’aide d’une lignée de VSMC exprimant une version dominante négative d’IRF-3 que ce dernier est essentiel à la synthèse des chimiokines RANTES et IP-10, tel qu’analysé par RT-PCR. Par ailleurs, il a récemment été montré que les kinases IKK-related étaient étroitement liées à la transformation oncogénique, et que TBK1 était pro-angiogénique. Or, l’angiogenèse est le plus souvent modulée par la réponse hypoxique qui est d’ailleurs commune à la majorité des processus inflammatoires. Le facteur de transcription hypoxia inducible factor (HIF)-1 module l’angiogenèse, l’inflammation et la survie cellulaire. Nous montrons à l’aide de cellules Tbk1 et Ikbke -/- et d’une approche lentivirale que TBK1 est spécifiquement impliquée dans l’induction traductionnelle de HIF-1alpha en condition de stress hypoxique. L’expression de TBK1 est induite sous ces conditions, et cette kinase module la phosphorylation de ERK, RSK, Akt et TSC1. Les résultats originaux présentés dans cette thèse montrent donc que les kinases IKK et IKK-related exercent leurs actions pro-inflammatoires par des mécanismes distincts. / Inflammation is a complex process that allows elimination of tissular damaging agents and thus facilitates wound repair. Persistance of a damaging agent or the incapacity to resolve the inflammatory state leads to chronic homeostatic deregulation with putative incidence on morbidity and mortality. Atherosclerosis is an inflammatory state of blood vessels which origins are multifactorial. Hypertension and the infectious state represent classical and emerging factors of atherosclerosis development, respectively. The innate immune response takes place in the initial steps of inflammation, and represents the first cellular line of defense against danger signals. The goal of this thesis is to examine the pro-inflammatory roles of the IkB kinases (IKK) and the IKK-related kinases, which are essential innate immune response protein kinases. IKKalpha and IKKbeta form, together with NEMO/IKKgamma, the IKK complex. This complex is responsible of the phosphorylation of the inhibitor of NF-kappaB, IkappaBalpha, a process that leads to its degradation and NF-kappaB release. By immunoprecipitation of NEMO and assessment of the IKK complex activity in vitro, we show that the vasoactive peptide angiotensin II (AngII) induces IKKbeta phosphotransferase activity in vascular smooth muscle cells (VSMC). The use of RNA interference (RNAi) against IKKbeta reveals that this kinase is responsible for p65/RelA phosphorylation. AngII modulation of NF-kappaB is atypical since it does not modulate IkappaB. Moreover, the use of pharmacological inhibitors shows that p65 induction is independent of both MEK-ERK-RSK and PI3K pathways, and that it does not involve EGF receptor transactivation. IKK-related kinases Tank-binding kinase 1 (TBK1) and IKK-i are known to be induced by bacterial and viral infections. These kinases are able to phosphorylate directly interferon regulatory factor (IRF)-3 transcription factor. Human cytomegalovirus (HCMV) seropositivity was shown to be linked to atherosclerosis development. We show that TBK1 activity is induced in HCMV-infected VSMC. RNAi directed against TBK1 and IKK-i reveals that both kinases are required for IRF-3 activation. The use of a VSMC line that express a dominant negative version if IRF-3 shows that this transcription factor is involved in the induction of RANTES and IP-10 chemokines, as assessed by RT-PCR. In addition, IKK-related kinases were recently shown to be implicated in oncogenic transformation. TBK1 was also shown to be pro-angiogenic. Angiogenesis is known to be regulated by the hypoxic response, a common condition of inflammatory processes. Hypoxia-inducible factor (HIF)-1 is a transcription factor that modulates angiogenesis, inflammation and cell survival. We show with the use of Tbk1 and Ikbke -/- cells combined with the use of a lentiviral approach that TBK1 is specifically involved in HIF-1alpha translational induction under hypoxic stress. We also show that TBK1 expression is enhanced under theses conditions, and that this kinase modulates the phosphorylation of ERK, RSK, Akt and TSC1. In conclusion, the results presented in this thesis show that the IKK and IKK-related kinases are both pro-inflammatory, and exert their actions by distinct mechanisms.

L’ubiquitin-fold modifier (UFM1) fait partie de la classe 1 de la famille de protéine ubiquitin-like (Ubl). UFM1 et Ub ont très peu d’homologie de séquence, mais partagent des similarités remarquables au niveau de leur structure tertiaire. Tout comme l’Ub et la majorité des autres Ubls, UFM1 se lie de façon covalente à ses substrats par l’intermédiaire d’une cascade enzymatique. Il est de plus en plus fréquemment rapporté que les protéines Ubls sont impliquées dans des maladies humaines. Le gène Ufm1 est surexprimé chez des souris de type MCP développant une ischémie myocardique et dans les îlots de Langerhans de patients atteints du diabète de type 2. UFM1 et ses enzymes spécifiques, UBA5, UFL1 et UFC1, sont conservés chez les métazoaires et les plantes suggérant un rôle important pour les organismes multicellulaires. Le Caenorhabditis elegans est le modèle animal le plus simple utilisé en biologie. Sa morphologie, ses phénotypes visibles et ses lignées cellulaires ont été décrits de façon détaillée. De plus, son cycle de vie court permet de rapidement observer les effets de certains gènes sur la longévité. Ce modèle nous permet de facilement manipuler l’expression du gène Ufm1 et de mieux connaître ses fonctions. En diminuant l’expression du gène ufm-1 chez le C.elegans, par la technique de l’ARN interférence par alimentation, nous n’avons observé aucun problème morphologique grave. Les vers ressemblaient aux vers sauvages et possédaient un nombre de progéniture normal. Cependant, les vers sauvage exposés à l’ARNi d’ufm-1 vivent significativement moins longtemps que les contrôles et ce, de façon indépendante de la voie de signalisation de l’insuline/IGF. Chez le C. elegans la longévité et la résistance au stress cellulaire sont intimement liées. Nous n’avons remarqué aucun effet d’ufm-1 sur le stress thermal, osmotique ou oxydatif, mais il est requis pour la protection contre le stress protéotoxique. Il est également nécessaire au maintien de l’intégrité neuronale au cours du vieillissement des animaux. L’ensemble de nos données nous renseigne sur les fonctions putatives du gène Ufm1. / The ubiquitin-fold modifier (UFM1) is part of the type 1 class of the family of ubiquitin-like protein (Ubl). UFM1 and Ub have very little sequence homology but share remarkable similarities in their tertiary structure. Like Ub and most other UBLS, UFM1 binds covalently to its substrates through an enzymatic cascade. It is frequently reported that UBLs are involved in human diseases. UFM-1 is overexpressed in mice developing a myocardial ischemia and in the islets of patients suffering from type 2 diabetes. UFM1 and its specific enzymes, UBA5, UFL1, and UFC1 are conserved in metazoans and plants suggesting an important role in multicellular organisms. Caenorhabditis elegans is one of the the simplest animal models used in biology. Some features such as morphology, visible phenotypes and cell lineage have completely been described. The short lifecycle of C. elegans makes it easy to observe gene effects on longevity. This model allows us to easily manipulate the expression of the Ufm1 gene and learn more about its putative functions. To study putative functions of Ufm1, we decreased the expression of ufm-1 using RNA interference introduces through feeding. No gross morphological disturbances were observed; worms resembled wild type and had a normal brood size. However, worms exposed to ufm-1 RNAi had a significantly shorter lifespan than the controls. This effect is independent of the insulin/IGF pathway, which is a major axis of longevity genetics. In C. elegans longevity and cellular stress resistance are intimately linked. We have observed no effect of ufm-1 on thermal, osmotic or oxidative stress, but it is required for protection against proteotoxic stress. It is also necessary to maintain neuronal integrity during aging. Together, our results shed light on putative functions of Ufm1 gene.

La régulation transcriptionnelle des gènes est cruciale pour permettre le bon fonctionnement des cellules. Afin que les cellules puissent accomplir leurs fonctions, les gènes doivent être exprimés adéquatement dans le bon type cellulaire et au stade de développement et de différenciation approprié. Un dérèglement dans l’expression de un ou plusieurs gènes peut entraîner de graves conséquences sur le destin de la cellule. Divers éléments en cis (ex : promoteurs et enhancers) et en trans (machinerie transcriptionnelle et facteurs de transcription) sont impliqués dans la régulation de la transcription. Les gènes du locus humain beta-globine (hub) sont exprimés dans les cellules érythroïdes et sont finenement régulés lors du développement et de la différenciation. Des mutations dans différentes régions du locus causent entre autres les beta-thalassémies. Nous avons utilisé ce modèle bien caractérisé afin d’étudier différents mécanismes de régulation favorisés par les facteurs de transcription qui sont exprimés dans les cellules érythroïdes. Nous nous sommes intéressés à l’importance de l’élément en cis HS2 du Locus control region. Cet élément possède plusieurs sites de liaison pour des facteurs de transcription impliqués dans la régulation des gènes du locus hub. Nos résultats montrent que HS2 possède un rôle dans l’organisation de la chromatine du locus qui peut être dissocié de son rôle d’enhancer. De plus, HS2 n’est pas essentiel pour l’expression à haut niveau du gène beta alors qu’il est important pour l’expression des gènes gamma. Ceci suggère que le recrutement des différents facteurs au site HS2 lors du développement influence différement les gènes du locus. Dans un deuxième temps, nous avons investigué l’importance de HS2 lors de la différenciation des cellules érythroïdes. Il avait été rapporté que l’absence de HS2 influence grandement la potentialisation de la chromatine du gène beta. La potentialisation dans les cellules progénitrices favorise l’activation transcriptionnelle du gène dans les cellules matures. Nous avons caractérisé le recrutement de différents facteurs de transcription au site HS2 et au promoteur beta dans les cellules progénitrices hématopoïétiques (CPH) ainsi que dans les cellules érythroïdes matures. Nos résultats montrent que le facteur EKLF est impliqué dans la potentialisation de la chromatine et favorise le recrutement des facteurs BRG1, p45 et CBP dans les CPH. L’expression de GATA-1 dans les cellules érythroïdes matures permet le recrutement de GATA-1 au locus hub dans ces cellules. Ces données suggèrent que la combinaison de EKLF et GATA-1 est requise pour permettre une activation maximale du gène beta dans les cellules érythroïdes matures. Un autre facteur impliqué dans la régulation du locus hub est Ikaros. Nous avons étudié son recrutement au locus hub et avons observé que Ikaros est impliqué dans la répression des gènes gamma. Nos résultats montrent aussi que GATA-1 est impliqué dans la répression de ces gènes et qu’il interagit avec Ikaros. Ensemble, Ikaros et GATA-1 favorisent la formation d’un complexe de répression aux promoteurs gamma. Cette étude nous a aussi permis d’observer que Ikaros et GATA-1 sont impliqués dans la répression du gène Gata2. De façon intéressante, nous avons caractérisé le mécanisme de répression du gène Hes1 (un gène cible de la voie Notch) lors de la différenciation érythroïde. Similairement à ce qui a été observé pour les gènes gamma, Hes1 est aussi réprimé par Ikaros et GATA-1. Ces résultats suggèrent donc que la combinaison de Ikaros et GATA-1 est associée à la répression de plusieurs de gènes dans les cellules érythroïdes. Globalement cette thèse rapporte de nouveaux mécanismes d’action de différents facteurs de transcription dans les cellules érythroïdes. Particulièrement, nos travaux ont permis de proposer un modèle pour la régulation des gènes du locus hub lors du développement et de la différenciation. De plus, nous rapportons pour la première fois l’importance de la collaboration entre les facteurs Ikaros et GATA-1 dans la régulation transcriptionnelle de gènes dans les cellules érythroïdes. Des mutations associées à certains des facteurs étudiés ont été rapportées dans des cas de beta-thalassémies ainsi que de leucémies. Nos travaux serviront donc à avoir une meilleure compréhension des mécanismes d’action de ces facteurs afin de potentiellement pouvoir les utiliser comme cibles thérapeutiques. / Gene transcriptional regulation is crucial for appropriate cell functioning. Genes must be properly expressed in the right cell type as well as at the right developmental and differenciation stage in order to allow the cells to accomplish their functions. Abnormal expression of one or many genes can dramatically influence cell fate. Diverse cis (ex : promoters and enhancers) and trans (transcriptional machinery and transcription factors) elements are involved in transcriptional regulation. Genes of the human beta-globin (hub) locus are expressed in erythroid cells and are thightly regulated during development and differentiation. Mutations in several regions of the locus are involved in beta-thalassemia. We used this well characterized model in order to study different regulation mechanisms that are mediated by transcription factors expressed in erythroid cells. We were interested in the important role of the cis element HS2 from the Locus control region. This region contains several binding sites for transcription factors that are involved in hub locus gene regulation. Our results show that HS2 has a role in chromatin organization of the locus which is distinct from its enhancer function. Moreover, HS2 is not essential for high level beta gene expression while it is important for gamma gene expression. This suggest that the influence of transcription factors recruited to HS2 varies during development. Secondly, we investigated HS2 importance during erythroid differentiation. It was reported the HS2 deletion strongly influences chromatin potentiation of beta gene. Potentiation in progenitor cells favors gene transcriptional activation in mature cells. We characterized transcription factor recruitment to HS2 and b promoter in hematopoietic progenitor cells (HPC). Our results show that EKLF is involved in chromatin potentiation and favors the recruitment of BRG1, p45 and CBP in HPC. GATA-1 expression in mature erythroid cells allows GATA-1 recruitment to hub locus in these cells. These data suggest that EKLF and GATA-1 combination is required to allow maximal beta gene activation in mature erythroid cells. Another factor involved in hub locus regulation is Ikaros. We studied its recruitment to hub locus and found that Ikaros is involved in gamma gene repression. Our data also shows that GATA-1 is involved in the repression of these genes and that it interacts with Ikaros. Together, Ikaros and GATA-1 favors the formation of a repressive complex to gamma promoters. In this study, we also observed that Ikaros and GATA-1 are involved in Gata2 gene repression. Interestingly, we have also characterized the repression mechanism of Hes1 gene (a Notch target gene) during erythroid differentiation. Similar to what is observed for gamma genes, Hes1 is also repressed by Ikaros and GATA-1. Collectivelly, our data suggest that Ikaros and GATA-1 combination is associated with the repression of several genes in erythroid cells. Globally, this thesis reports new mechanisms of action for different transcription factors in erythroid cells. Particularly, our work allows us to propose a model for hub locus gene regulation during development and differentiation. Moreover, we show for the first time that the combination of Ikaros and GATA-1 is relevant for gene regulation in erythroid cells. Several mutations in the transcription factors that we studied were associated with beta-thalassemia or leukemia. Our work will thus help to better understand mechanisms of action of these transcription factors in order to potentially use them as therapeutical targets.

L'axe hypothalamo-hypophyso-surrénalien (HPA) permet de maintenir l'homéostasie de l'organisme face à divers stress. Qu'ils soient de nature psychologique, physique ou inflammatoire/infectieux, les stress provoquent la synthèse et la libération de CRH par l'hypothalamus. Les cellules corticotropes hypophysaires perçoivent ce signal et en réaction, produisent et sécrètent l'ACTH. Ceci induit la synthèse des glucocorticoïdes (Gc) par le cortex surrénalien; ces stéroïdes mettent le système métabolique en état d’alerte pour la réponse au stress et à l’agression. Les Gc ont le rôle essentiel de contrôler les défenses de l'organisme, en plus d'exercer une rétro-inhibition sur l'axe HPA. L'ACTH est une petite hormone peptidique produite par le clivage d'un précurseur: la pro-opiomélanocortine (POMC). À cause de sa position critique dans la normalisation de l'homéostasie, le contrôle transcriptionnel du gène Pomc a fait l'objet d'études approfondies au cours des dernières décennies. Nous savons maintenant que la région promotrice du gène Pomc permet une expression ciblée dans les cellules POMC hypophysaires. L'étude du locus Pomc par des technologies génomiques m'a permis de découvrir un nouvel élément de régulation qui est conservé à travers l'évolution des mammifères. La caractérisation de cet enhancer a démontré qu'il dirige une expression restreinte à l'hypophyse, et plus particulièrement dans les cellules corticotropes. De façon intéressante, l'activité de cet élément dépend d'un nouveau site de liaison recrutant un homodimère du facteur de transcription Tpit, dont l'expression est également limitée aux cellules POMC de l'hypophyse. La découverte de cet enhancer ajoute une toute nouvelle dimension à la régulation de l'expression de POMC. Les cytokines pro-inflammatoires IL6/LIF et les Gc sont connus pour leur antagonisme sur la réaction inflammatoire et sur le promoteur Pomc via l'action des facteurs de transcription Stat3 et GR respectivement. L'analyse génomique des sites liés ii par ces deux facteurs nous a révélé une interrelation complexe et a permis de définir un code transcriptionnel entre ces voies de signalisation. En plus de leur action par interaction directe avec l’ADN au niveau des séquences régulatrices, ces facteurs interagissent directement entre eux avec des résultats transcriptionnels différents. Ainsi, le recrutement de GR par contact protéine:protéine (tethering) sur Stat3 étant lié à l'ADN provoque un antagonisme transcriptionnel. Inversement, le tethering de Stat3 sur GR supporte une action synergique, tout comme leur co-recrutement à l'ADN sur des sites contigus ou composites. Lors d'une activation soutenue, ce synergisme entre les voies IL6/LIF et Gc induit une réponse innée de défense cellulaire. Ainsi lors d'un stress majeur, ce mécanisme de défense est mis en branle dans toutes les cellules et tissus. En somme, les travaux présentés dans cette thèse définissent les mécanismes transcriptionnels engagés dans le combat de l'organisme contre les stress. Plus particulièrement, ces mécanismes ont été décrits au niveau de la réponse globale des corticotropes et du gène Pomc. Il est essentiel pour l'organisme d'induire adéquatement ces mécanismes afin de faire face aux stress et d'éviter des dérèglements comme les maladies inflammatoires et métaboliques. / The hypothalamo-pituitary-adrenal (HPA) axis regulates homeostasis in various conditions of stress contributing to both the stress response and its termination. Psychological, physical or inflammatory/infectious stresses all prompt the synthesis and secretion of hypothalamic CRH. The pituitary corticotrope cells receive this signal and in turn, secrete ACTH which triggers the synthesis of glucocorticoids (Gc) by the adrenal cortex; these steroids induce a general state of alertness in order to fight or flight aggressions and stresses. Glucocorticoids have the critical role to restrict the stress response by exerting a negative feedback on the HPA axis. ACTH is a small peptidic hormone produced after cleavage of a precursor protein: pro-opiomelanocortin (POMC). Due to its critical role in homeostasis, transcriptional control of the Pomc gene has been intensely studied during the last decades. Previous investigations identified a promoter region that is sufficient for expression of Pomc in the appropriate pituitary cells. Genome-wide studies of the Pomc locus led me to discover a novel regulatory element that is conserved throughout mammalian evolution. The activity of this enhancer is restricted to the pituitary, and more precisely to the corticotrope lineage. Interestingly, its activity depends on a novel transcription factor binding motif that binds homodimers of Tpit, a transcription factor that is only found in pituitary POMC cells. The discovery of this enhancer adds a new dimension in the control of pituitary Pomc expression. The IL6/LIF pro-inflammatory cytokines and the glucocorticoids are well known for their antagonism in control of the inflammatory response; at the Pomc promoter, their action is mediated by the transcription factors Stat3 and GR, respectively. The analysis of genomic sites bound by these two factors revealed a complex relationship and led us to define a transcription regulatory code linking these signalling pathways. In addition to their direct DNA interaction with cognate regulatory sequences, these factors iv interact with each other with different outcomes. Thus, the recruitment of GR on DNAbound Stat3 through protein:protein contacts (tethering) results in transcriptional antagonism. Conversely, Stat3 tethering to GR produces synergism; this is also the case when the two factors are co-recruited to DNA on contiguous or composite binding sites. Prolonged activation of the IL6/LIF and Gc pathways elicits a synergistic innate cell defense response in all cells and tissues. In summary, this doctoral work has defined transcriptional mechanisms that mediate and control the stress response. In particular, pituitary components of the stress response were defined at the level of the Pomc gene and as a global response of corticotrope cells. This response is critical for appropriate organism defense during stresses such as those produced in inflammatory and metabolic diseases.

Les mélanomes malins (MM) constituent le deuxième type de cancer le plus fréquent chez les jeunes adultes canadiens (entre 20 et 44 ans) ainsi qu’un des rares cancers dont l’incidence augmente annuellement. À moins que les MM ne soient excisés à temps par chirurgie, les chances de survie des patients sont pratiquement nulles puisque ce type de tumeur est très réfractaire aux traitements conventionnels. Il est bien connu que l’exposition aux rayons ultraviolets (UV), induisant des photoproduits génotoxiques, est une déterminante majeure dans l’acquisition de MM. À cet effet, la réparation par excision de nucléotides (NER) est la ligne de défense principale contre le développement des mélanomes puisqu’elle est la voie de réparation prépondérante en ce qui a trait aux dits photoproduits. Malgré cela, la contribution potentielle de défauts de la NER au développement des MM dans la population normale n’est toujours pas bien établie. Notre laboratoire a précédemment développé une méthode basée sur la cytométrie de flux qui permet de mesurer la NER en fonction du cycle cellulaire. Cette méthode a déjà mise en évidence qu’une déficience de l’activité de la protéine ATR peut mener à une déficience de la NER exclusive à la phase S dans des fibroblastes humains. Pareillement, nous avons démontré que plusieurs lignées cellulaires cancéreuses modèles comportent une déficience en NER en phase S, suggérant qu’une telle déficience puisse caractériser certains types de cancers. Nous avons voulu savoir si une déficience en NER en phase S pouvait être associée à une proportion significative de mélanomes et si le tout pouvait être attribuable à une diminution de l’activité d’ATR. Nos objectifs ont donc été de : (i) mesurer l’efficacité de la NER en fonction du cycle cellulaire dans les MM en comparaison avec les mélanocytes primaires, (ii) vérifier si le niveau d’activité d’ATR corrèle avec l’efficacité de la NER en phase S dans les lignées de MM et (iii) voir si un gène fréquemment muté dans les mélanomes (tels PTEN et BRAF) pouvait coopérer avec ATR pour réguler la NER en phase S dans les mélanomes. Nous avons démontré que 13 lignées de MM sur 16 ont une capacité grandement diminuée à réparer les photoproduits induits par UV spécifiquement en phase S. De plus, cette déficience corrèle fortement avec une réduction de l’activation d’ATR et, dans plusieurs lignées de MM, avec une phosphorylation d’Akt plus importante. L’utilisation d’ARN interférent ou d’un inhibiteur du suppresseur de tumeurs PTEN, a permis, en plus d’augmenter la phosphorylation d’Akt, de réduire la réparation des photoproduits et l’activation d’ATR dans les cellules en phase S. En addition, (i) l’expression ectopique de la protéine PTEN sauvage dans des lignées déficientes en PTEN (mais pas d’une protéine PTEN sans activité phosphatase) ou (ii) l’inhibition pharmacologique d’Akt a permis d’augmenter la réparation en phase S ainsi que l’activation d’ATR. En somme, cette étude démontre qu’une signalisation d’ATR dépendante de PTEN/Akt amenant à une réparation déficiente des photoproduits génomiques causés par les UV en phase S peut être déterminante dans le développement des mélanomes induits par UV. / Malignant melanoma (MM) is the second most frequent neoplasia among young Canadian adults (aged 20-44); moreover the incidence of this disease continues to rise annually at an alarming rate. Unless primary melanoma is diagnosed early and promptly resected the patient prognosis is dismal since this deadly tumour type metastasizes extremely aggressively and is highly refractory to conventional treatment protocols. It is well established that exposure to UV light, and subsequent induction of genotoxic DNA photoproducts, is a primary determinant in the initiation of MM. Furthermore nucleotide excision repair (NER) clearly represents a critical frontline defence against MM because it is the only human pathway designed to remove the aforementioned DNA photoproducts. Despite this, the potential contribution of NER defects to sporadic MM development in the general population has remained unclear. Our laboratory previously developed a novel flow cytometry-based assay to evaluate the efficiency of NER as a function of cell cycle. This method was employed to demonstrate that functional ATR kinase is strictly required for NER during S phase in primary human fibroblasts. Intriguingly we also reported that many model tumour cell lines are deficient in NER uniquely in S phase populations, raising the possibility that such a defect might be characteristic of certain types of cancers. We therefore hypothesized that a significant proportion of human MM cell lines may exhibit reduced NER capacity specifically during S phase, and that this in turn might be attributeable to reduced ATR signaling. To test this hypothesis, three major specific aims were proposed: (i) To measure the efficiency of NER as a function of cell cycle among a panel of human MM cell lines and in primary melanocytes; (ii) To investigate whether any correlation exists between NER status and ATR activity during S phase in human MM cell lines; (iii) To investigate whether frequently mutated genes in melanoma (eg., PTEN, BRAF) might cooperate with ATR to regulate S phase-specific NER in MM cell lines. We were able to demonstrate that, in fact, 13/16 MM cell lines display remarkably diminished capacity to remove UV-induced DNA photoproducts specifically during S phase. Furthermore this defect correlates strongly with reduced activation of ATR kinase and, for a majority of MM, higher Akt phosphorylation levels. RNAi-mediated knockdown of the PTEN tumour suppressor, while stimulating Akt phosphorylation as expected, also engenders reductions in both photoproducts repair and ATR activation in S phase cells. In addition, (i) ectopic expression in PTEN-null strains of wild type PTEN but not of PTEN variants deficient in phosphatase activity, or (ii) pharmacological inhibition of Akt, significantly rescue S phase-specific repair as well as ATR activation. Our data indicate that reduced PTEN/Akt-dependent ATR signaling leading to defective repair of UV DNA photoproducts uniquely during S phase may represent an heretofore unrecognized major determinant in sunlight-induced melanoma development.

Nous avons identifié l’expression du récepteur des angiopoïétines, le récepteur Tie2, à la surface des neutrophiles humains. De plus, nous avons démontré qu’Ang1 et Ang2 induisent des activités pro-inflammatoires sur les neutrophiles, comme l’adhésion aux cellules endothéliales (CEs) et la synthèse du facteur d’activation plaquettaire (PAF). Puisque le PAF augmente la viabilité des neutrophiles et que les angiopoïétines modulent la survie des CEs, nous avons voulu évaluer l’effet des angiopoïétines sur la survie des neutrophiles. Des neutrophiles humains ont été isolés à partir du sang de donneurs sains en accord avec le comité d’éthique de l’Institut de cardiologie de Montréal. La viabilité des neutrophiles a été mesurée par cytométrie en flux à l’aide de marqueurs d’apoptose et de nécrose. Un traitement avec des témoins positifs, soit l’interleukine 8 (IL-8; 25 nM) ou le PAF (100 nM), a augmenté la survie basale des neutrophiles de 34 et 27%, respectivement. De plus, un traitement avec Ang1 (1 pM – 10 nM) a augmenté la survie des neutrophiles jusqu’à 35%, alors qu’Ang2 n’a eu aucun effet. La combinaison de l’IL-8 ou du PAF avec Ang1 (10 nM) a eu un effet additif sur la viabilité des neutrophiles et a augmenté la survie de 56 et 60%, respectivement. Un prétraitement avec des anticorps bloquants contre l’IL-8 a permis d’inhiber l’activité anti-apoptotique de l’IL-8 et d’Ang1 de 92 et 80%, respectivement. Ainsi, notre étude est la première à démontrer la capacité d’Ang1 à prolonger la viabilité des neutrophiles, qui est principalement causée par la relâche d’IL-8. / We reported the expression of angiopoietin receptor Tie2 on the surface of human neutrophils. In addition, we reported that Ang1 and Ang2 are both capable to promote pro-inflammatory activities in neutrophils, namely their adhesion onto endothelial cells (ECs) and platelet-activating factor (PAF) synthesis. PAF is known to promote pro-survival activity on neutrophils and since both angiopoietins can modulate ECs viability, we addressed whether Ang1 and/or Ang2 could modulate neutrophil viability. Human neutrophils were isolated from blood of healthy volunteers in accordance with the guidelines of the Montreal Heart Institute’s ethical committee. Neutrophil viability was assessed by flow cytometry using apoptotic and necrotic markers. Treatment with anti-apoptotic mediators such as interleukin 8 (IL-8; 25 nM) and PAF (100 nM) increased neutrophil basal viability by 34 and 27%, respectively. In addition, treatment with Ang1 (1 pM – 10 nM) increased neutrophil viability by up to 35%, while Ang2 had no effect. Combination of IL-8 or PAF with Ang1 (10 nM) provided an additive effect on neutrophil viability and further increased viability by 56 and 60%, respectively. Pretreatment of the neutrophils with blocking anti-IL-8 antibodies inhibited the anti-apoptotic effect of IL-8 and Ang1 by 92 and 80%, respectively. In summary, our data are the first one to report Ang1 pro-survival activity on neutrophils, which is mainly driven through IL-8 release.

Chez les animaux à vision binoculaire, la vision tridimensionnelle permet la perception de la profondeur grâce à l'intégration de l'information visuelle en provenance des deux yeux. La première étape de cette intégration est rendue possible anatomiquement par la ségrégation des axones controlatéraux et ipsilatéraux des cellules ganglionnaires de la rétine (CGR) au niveau du chiasma optique. Les axones controlatéraux croisent la ligne médiane au chiasma en route du nerf optique vers le cerveau. À l’inverse, les axones ipsilatéraux s'écartent du chiasma et continuent dans le tractus optique ipsilatéral, en évitant la ligne médiane vers leurs cibles cérébrales. Les mécanismes moléculaires à la base de ce phénomène ne sont pas complètement compris. Les études présentées dans cette thèse montrent que Boc, le récepteur de Sonic Hedgehog (Shh) dans le guidage axonal, est enrichi dans les CGRs ipsilatérales de la rétine en développement. La présence de Shh sur la ligne médiane, et le mode d'expression complémentaire du récepteur nous ont conduit à émettre l'hypothèse que Shh pourrait repousser les axones ipsilatéraux au niveau du chiasma en activant le récepteur Boc. Conformément à cette hypothèse, nous avons constaté que seulement les CGR exprimant Boc se rétractent in vitro en réponse à Shh et que cette réponse est perdue dans les CGR mutantes pour Boc. In vivo, nous démontrons que Boc est requis pour la ségrégation normale des axones ipsilatéraux au niveau du chiasma optique et, inversement, que l'expression ectopique de Boc dans les CGR contralatérales empêche leurs axones de traverser le chiasma optique. Dans l’ensemble, ces résultats suggèrent que Shh repousse les axones ipsilatéraux au niveau du chiasma optique par son récepteur Boc. Cette première partie de notre travail identifie un nouveau couple ligand-récepteur requis pour la ségrégation des axones au niveau du chiasma optique. Une interaction moléculaire impliquée dans cette ségrégation implique l’éphrine-B2 et ses récepteurs EphB (EphB1). Dans la deuxième partie de notre travail, nous montrons, in vivo, en utilisant des souris doubles et quadruples mutantes pour les récepteurs Boc, EphB1 ou les trois récepteurs EphB, que l’abrogation des deux voies de signalisation Shh et éphrine-B2 conduit à l'absence de projections ipsilatérales. Ceci indique que les deux signalisations agissent de façon indépendante dans des voies parallèles. De manière intéressante, ces souris mutantes ont été utilisées comme modèle génétique pour démontrer des défauts dans la perception de la profondeur de champs chez des animaux dépourvus de projections visuelles ipsilatérales. Ainsi, les travaux présentés dans cette thèse démontrent pour la première fois que la formation des projections rétiniennes ipsilatérales est essentielle à l’établissement de la vision binoculaire et dépend des voies induites par les récepteurs d’éphrine-B2 et Shh. / In animals with binocular vision, three dimensional vision allows perception of depth through the integration of visual information from both eyes. The first step of this integration is possible anatomically with the segregation of contralateral and ipsilateral axons at the optic chiasm. Contralateral axons cross the chiasm midline as they progress from the optic nerve to the optic tract. In contrast, ipsilateral axons deviate from the chiasm and continue in the ipsilateral optic tract. The molecular mechanism underlying this phenomenon is not completely understood. The studies presented in this thesis show that the Sonic Hedgehog (Shh) receptor Boc is enriched in ipsilateral RGCs of the developing retina. Together with the presence of Shh at the midline, this complementary expression pattern led us to hypothesize that Shh might repel ipsilateral RGC axons at the chiasm. Consistent with this hypothesis, we found that only Boc positive RGC axons retract in vitro in response to Shh and that this response is lost in Boc mutant RGCs. In vivo, we show that Boc is required for the normal segregation of ipsilateral axons at the optic chiasm and, conversely, that Boc expression in contralateral RGCs prevents their axons from crossing the optic chiasm. Taken together, these results suggest that Shh repels ipsilateral RGC axons at the optic chiasm via its receptor Boc. This first part of this thesis identifies a novel receptor required for the segregation of axons at the optic chiasm. The other couple ligand-receptor involved in this segregation is the Ephrin-B2/EphB signalling. In the second part of this thesis, I show that in vivo, the abrogation of both signalling pathways using quadruple knockout mice of the receptor Boc and three EphB receptors led to the absence of ipsilateral projections, indicating that Shh and ephrinB2 signalling act independently in two parallel pathways. More importantly, these animals, used as a new genetic model to perform visual tests, had a diminished ability to perceive depth. Thus, this thesis demonstrates for the first time that the establishment of ipsilateral retinal projections, essential for accurate binocular vision and perception of depth, is made possible by the combination of EphB and Shh signalling.

Les expansions du codon CAG (polyQ) sont impliquées dans neuf maladies neurodégénératives. Notre groupe a démontré que, lors de la traduction de la protéine ataxine-3 (Atx3) mutée qui est impliquée dans l’ataxie spinocérébelleuse de type 3 (SCA3), un changement du cadre de lecture vers un cadre décalé -1 (GCA) se produit. La traduction dans ce nouveau cadre de lecture entraine la production de polyalanine et ceci amplifierait la toxicité des polyQ. Le changement de cadre de lecture (ccl) ribosomique peut se produire des virus aux mammifères mais peu de choses sont connues sur son impact chez l’humain. Afin d’étudier ce phénomène dans la protéine Atx3 avec expansion de polyQ, nous avons établi un modèle de Drosophile transgénique et testé si c’était l’ARNm ou la protéine mutée qui était toxique. Nous avons aussi employé un essai de toeprinting (TP) afin d’identifier l’emplacement précis où les ribosomes changent de cadre de lecture sur l’ARNm. Nos résultats indiquent que la toxicité est due à la présence de polyalanines faisant suite au ccl et que l’ARNm en soi n’est pas la cause directe de la toxicité. De plus, nous avons observé que les ribosomes s’arrêtent au 48ième codon glutamine et que cet arrêt est spécifique aux polyQ. L’arrêt des ribosomes a d’ailleurs aussi été observé dans d’autres maladies avec expansions de polyQ. Puisque ces maladies ont des caractéristiques communes, un blocage de ce ccl pourrait atténuer les symptômes des patients SCA3 et d’autres maladies à expansions de polyQ / Coding CAG repeat disorders have been associated with nine neurodegenerative disorders. Our group has previously shown that during the translation of mutant ataxine-3 (Atx3), the protein involved in Spinocerebellar Ataxia type 3 (SCA3), a ribosomal frameshift occurs and leads to the reading of a GCA frame rather than a CAG frame. This new reading frame causes the production of polyalanine in the polyglutamine peptide which increases its toxicity. Ribosomal frameshifts are known to occur in all organisms but little is known about this phenomenon in human. To study ribosomal frameshift along the ATXN3 transcript, we generated a transgenic Drosophila model in which we looked at the toxicity of the mRNA. Also, we developed a toeprinting assay to precisely evaluate where the change of reading frame occurs along the mRNA. Our results suggest that the toxicity observed in our Drosophila model results from the production of polyalanine and not from the presence of the mRNA per se. Moreover, the change in reading frame seems to occur at the 48th CAG codon and this pausing of the ribosome also occurs in other polyQ tracts. Because CAG repeat disorders share many characteristics, an alteration of the frameshift could alleviate symptoms of SCA3 patients as well as of many other diseases with coding CAG repeats.